KR101497868B1

KR101497868B1 - 리모닌을 유효성분으로 포함하는 혈관근육세포의 증식과 관련된 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR101497868B1
Application number: KR20140006725A
Authority: KR
Inventors: 유승우; 윤정연
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2014-01-20
Filing date: 2014-01-20
Publication date: 2015-03-04

Abstract

본 발명은 혈관근육세포의 증식과 관련된 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 리모닌(limonin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈관근육세포의 증식과 관련된 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 리모닌 화합물은 농도 의존적으로 아르기나아제 활성을 억제하고, 저밀도지질단백질(Low-density lipoprotein)에 의해 유도된 혈관평활근세포의 증식을 직접적으로 억제하며, 저밀도지질단백질(Low-density lipoprotein)에 의해 자극된 세포 내 활성산소종 생성을 억제할 뿐만 아니라, 아르기나아제의 활성 억제를 통해 L-아르기닌의 생산 농도를 효과적으로 증대시킬 수 있다. 따라서 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 혈관 내 동맥경화반 형성 및 혈관 재협착을 억제/방지하는 효과가 우수하여 고혈압, 동맥경화증, 뇌졸중, 심근경색 또는 혈관협착증과 같은 혈관근육세포의 증식과 관련된 질환의 예방 및 치료를 위한 의약품으로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

리모닌을 유효성분으로 포함하는 혈관근육세포의 증식과 관련된 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물{A pharmaceutical composition comprising limonin for prevention and treatment of vascular smooth muscle cells proliferation related disease}

본 발명은 혈관근육세포의 증식과 관련된 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 리모닌(limonin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈관근육세포의 증식과 관련된 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

관상 동맥성 심혈관 질환은 현재 사망 원인의 30% 이상을 차지하고 있어 미국, 유럽 등 선진국에서 심각한 문제가 되고 있으며, 개발도상국에서도 식생활의 서구화, 운동 부족 등의 영향을 받아 증가하고 있는 추세이다.

그 중 동맥경화증은 죽상경화(atherosclerosis), 중막경화(medial calcification), 및 세동맥경화(arteriosclerosis)의 3 가지 질환으로 나눌 수 있으며, 흔히 동맥경화증이라고 부르는 질환은 죽상동맥경화증을 지칭하는 것으로 쓰인다. 동맥경화증을 유발에는 수많은 인자가 관여하고 있다. 그 중에서도 혈소판 응집과 혈관근육세포 증식은 뇌졸중, 심근경색 및 혈관형성 수술 후 재협착과 같은 죽상 동맥 혈전의 병리에서 필수적으로 나타난다.

혈관근육세포(vascular smooth muscle cells)는 혈관을 형성하는 핵심세포로 수축과 이완을 통해 혈압을 조절하는 데 필수적인 역할을 하며 혈관평활근세포라고도 불린다. 이러한 혈관근육세포의 비정상적 증식은 고혈압, 동맥경화 등 심혈관질환의 원인이 되며, 또한 혈관형성 수술 후 재협착의 주원인이 된다. 혈관근육세포의 증식은 평활근세포 자체 및 내막세포, 대식세포, 혈소판 등에서 분비되는 자가분비(autocrine)와 측분비 성장인자(paracrine growth factor)에 의해 조절된다. 혈관근육세포의 증식에 관련된 성장인자로서는 대표적으로 platelet-derived growth factor(PDGF), basic fibroblast growth factor(bFGF)가 있으며, 혈관근육세포의 이상증식을 억제할 수 있다면 고혈압, 동맥경화, 심혈관계 질환, 이의 합병증 및 혈관재협착증과 같은 질환의 치료와 예방에 우수한 효과를 얻을 것으로 예상되며 현재 이에 대한 많은 연구가 진행되고 있다.

한편, 리모닌(limonin)은 감귤류의 쓴맛 성분인 리모노이드(limonoid)의 주요성분의 하나로 1960년 Arigoni 등에 의해 구조식이 결정되었다. 이 화합물의 분자식은 C₂₃H₃₀O₆이며, 분자량은 417이다. 리모닌과 관련된 최근 연구에 따르면, 생쥐의 피질세포(cortical cell)에서의 글루타메이트 독성완화를 통한 뇌신경 보호 효과(Yoon et al., 2010), 레트로바이러스인 HIV-1의 증식을 억제하는 항바이러스 효과(Balestrieri et al., 2011) 및 직장암세포의 성장을 억제하는 항암효과가 있음이 보고되었다(Murthy et al., 2011).

그러나 리모닌의 혈관근육세포의 증식 억제 효과를 통한 동맥경화 및 혈관 재협착을 효과적으로 억제한다는 사실은 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 리모닌 화합물의 혈관근육세포의 증식과 관련된 약제학적 치료제로서의 가능성을 알아보기 위하여, 리모닌 처리에 따른 아르기나아제 효소 활성 억제; 혈관평활근세포의 증식 억제; 활성산소종 생산 억제; 및 L-아르기닌 생산 농도 증가 활성 실험을 진행하였으며, 이들 실험 결과 리모닌 화합물이 다양한 활성 및 기작을 통해 혈관근육세포의 증식을 효과적으로 억제시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

한국등록특허 제10-1118773호 한국공개특허 제10-2012-0114501호

따라서 본 발명의 목적은 장기간 사용에도 인체에 안정하면서 혈관근육세포의 증식 억제 기능이 우수하여 혈관근육세포의 증식과 관련된 질환의 예방 및 치료에 효과적인 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 장기간 사용에도 인체에 안정하면서 혈관근육세포의 증식 억제 기능이 우수하여 혈관 재협착 방지에 효과적인 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 장기간 사용에도 인체에 안정하면서도 혈관 재협착 방지에 효과적인 스텐트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동맥경화증 또는 혈관 재협착증을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리모닌(limonin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈관근육세포의 증식과 관련된 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 0.1 내지 1000mg/ml의 농도로 조성물에 포함될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 아르기나아제 효소 활성 억제; 혈관평활근세포의 증식 억제; 활성산소종 생산 억제; 및 L-아르기닌 생산 농도 증가 활성을 통해, 혈관 내 동맥경화반 형성 및 혈관 재협착을 억제하는 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 혈관근육세포의 증식과 관련된 질환은 고혈압, 동맥경화증, 뇌졸중, 심근경색 또는 혈관협착증일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 동맥경화증은 죽상경화증(atherosclerosis), 중피층 석회화경화증(medialcalcific sclerosis) 또는 세동맥경화증(arteriolosclerosis)일 수 있다.

본 발명의 일시예에 있어서, 상기 혈관협착증은 경피 경관 관상동맥성형술후 발생하는 혈관재협착증, 경피 경관 혈관성형술후 발생하는 혈관재협착증, 혈관재건술후 발생하는 혈관협착증, 혈관내 스텐트 삽입술후 발생하는 혈관협착증 및 기관이식후 발생하는 혈관협착증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종일 수 있다.

또한, 본 발명은 리모닌(limonin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈관 재협착 방지용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일시예에 있어서, 상기 화합물은 아르기나아제 효소 활성 억제; 혈관평활근세포의 증식 억제; 활성산소종 생산 억제; 및 L-아르기닌 생산 농도 증가 활성을 통해, 혈관 내 동맥경화반 형성 및 혈관 재협착 방지 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 스텐트를 혈관부위에 삽입 시, 스텐트에 코팅되거나 혈관부위에 직접 도포될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 혈관부위는 동맥경화반일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물이 코팅된 혈관 재협착 방지 효과를 갖는 스텐트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동맥경화증 또는 혈관 재협착증을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 리모닌 화합물은 농도 의존적으로 아르기나아제 활성을 억제하고, 저밀도지질단백질(Low-density lipoprotein)에 의해 유도된 혈관평활근세포의 증식을 직접적으로 억제하며, 저밀도지질단백질(Low-density lipoprotein)에 의해 자극된 세포 내 활성산소종 생성을 억제할 뿐만 아니라, 아르기나아제의 활성 억제를 통해 L-아르기닌의 생산 농도를 효과적으로 증대시킬 수 있다. 따라서 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 혈관 내 동맥경화반 형성 및 혈관 재협착을 억제/방지하는 효과가 우수하여 고혈압, 동맥경화증, 뇌졸중, 심근경색 또는 혈관협착증과 같은 혈관근육세포의 증식과 관련된 질환의 예방 및 치료를 위한 의약품으로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 정상적인 사람의 혈장에서 분리한 nLDL 및 산화된 LDL(oxLDL)의 아가로스 젤 전기영동에서의 이동속도를 비교한 사진(좌측)과, nLDL 및 산화된 LDL(oxLDL)의 산패도를 측정하여 그래프(우측)로 나타낸 것이다.
도 2는 Sprague-Dawley rat과 C57BL/6J mouse의 대동맥에서 분리한 혈관평활근세포를 α-smooth muscle actin로 염색하여 cy3파장에서 확인한 사진이다.
도 3a는 생쥐의 간 파쇄 액에 리모닌의 농도별(0, 2, 4, 8, 16, 32, 50μg/ml) 처리에 따른 아르기나아제 I의 활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 3b는 생쥐의 신장 파쇄 액에 리모닌의 농도별(0, 2, 4, 8, 16, 32, 50μg/ml) 처리에 따른 아르기나아제 Ⅱ의 활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 3c는 혈관평활근세포에 리모닌(25μg/ml)을 처리한 후 시간 경과에 따른 아르기나아제 Ⅱ의 발현 수준을 나타낸 웨스턴 블랏 결과이다.
도 3d는 혈관평활근세포에 리모닌(25μg/ml)을 처리한 후 시간 경과에 따른 아르기나아제 Ⅱ의 활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다. 아르기나아제 Ⅱ의 활성도는 DMSO(10μM)을 기준으로 하여 이에 대한 상대적인 %로서 나타내었다.
도 4a는 혈관평활근세포에 리모닌(5, 10μg/ml)의 30분간 전처리가 있거나 없는 조건에서 nLDL(100μg/ml)을 24시간 처리하여 세포증식 유도에 따른 혈관평활근세포의 증식 정도를 WST-1 에세이로 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 4b는 혈관평활근세포에 리모닌(25μg/ml)의 30분간 전처리가 있거나 없는 조건에서 nLDL(100μg/ml)을 3시간 처리한 다음 발현되는 p21 단백질의 양을 나타낸 웨스턴 블랏 결과이다.
도 5a는 혈관평활근세포에 리모닌(25μg/ml)의 전처리가 있거나 없는 조건에서 nLDL(100μg/ml)을 24시간 처리한 후, 혈관평활근세포에서 생성되는 활성산소종 생성 정도를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 5b는 혈관평활근세포에 리모닌(25μg/ml)의 전처리가 있거나 없는 조건에서 nLDL(100μg/ml)을 24시간 처리한 후, 혈관평활근세포를 멤브레인 분획과 시토졸 분획으로 나누어 각각의 분획에서 발현된 p47^phox 단백질의 양을 나타낸 웨스턴 블랏 결과이다.
도 6a는 혈관평활근세포에 리모닌(25μg/ml)의 전처리가 있거나 없는 조건에서 nLDL(100μg/ml)을 10분과 24시간 처리한 후, 인산화된 pErk1/2 단백질의 양을 나타낸 웨스턴 블랏 결과이다.
도 6b는 혈관평활근세포에 리모닌(25μg/ml)의 전처리가 있거나 없는 조건에서 nLDL(100μg/ml)을 10분과 24시간 처리한 후, 인산화된 PKCβⅡ 단백질의 양을 나타낸 웨스턴 블랏 결과이다.
도 7은 혈관평활근세포에 리모닌(25μg/ml)을 18시간 동안 처리한 후 파쇄하여 폴리아민(spermine, spermidine, putrescine) 및 L-아르기닌의 농도를 HPLC로 분석한 결과이다.
도 8a는 혈관평활근세포에 L-아르기닌(1mM)의 3시간 전처리가 있거나 없는 조건에서 nLDL(100μg/ml)을 10분과 24시간 처리한 후, 인산화된 PKCβⅡ 및 Erk1/2 단백질의 양을 나타낸 웨스턴 블랏 결과이다.
도 8b는 혈관평활근세포에 스퍼민(spermine, 1mM)의 3시간 전처리가 있거나 없는 조건에서 nLDL(100μg/ml)을 10분과 24시간 처리한 후, 인산화된 PKCβⅡ 및 Erk1/2 단백질의 양을 나타낸 웨스턴 블랏 결과이다.
도 8c는 혈관평활근세포에 스퍼미딘(spermidine, 1mM)의 3시간 전처리가 있거나 없는 조건에서 nLDL(100μg/ml)을 10분과 24시간 처리한 후, 인산화된 PKCβⅡ 및 Erk1/2 단백질의 양을 나타낸 웨스턴 블랏 결과이다.
도 8d는 혈관평활근세포에 푸트레신(putrescine, 1mM)의 3시간 전처리가 있거나 없는 조건에서 nLDL(100μg/ml)을 10분과 24시간 처리한 후, 인산화된 PKCβⅡ 및 Erk1/2 단백질의 양을 나타낸 웨스턴 블랏 결과이다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 리모닌(limonin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈관근육세포의 증식과 관련된 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

<화학식 1>

본 명세서에서 용어리모닌(limonin)은 감귤류의 쓴맛 성분인 리모노이드(limonoid)의 주요성분의 하나로 1960년 Arigoni 등에 의해 구조식이 결정되었으며, 분자식은 C₂₃H₃₀O₆이며, 분자량은 417인 화합물을 의미한다. 리모닌과 관련된 연구로는 뇌신경 보호 효과, 항바이러스 효과 및 직장암세포의 성장을 억제하는 항암효과 등이 알려져 있다.

그러나 아직까지 상기 화합물의 혈관근육세포의 증식 억제 활성을 통한 동맥경화 및 혈관 재협착을 효과적으로 억제한다는 사실은 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 리모닌 화합물의 혈관근육세포의 증식과 관련된 질환 치료제로서의 가능성을 알아보기 위하여, 혈관근육세포의 증식에 영향을 미칠 수 있는 다양한 지표인자를 이용하여 연구를 반복적으로 수행한 결과, 상기 화합물이 아르기나아제 활성 억제하고, 저밀도지질단백질(Low-density lipoprotein, 이하 간략하게 ‘nLDL’라 함)에 의해 유도된 혈관평활근세포의증식을 직접적으로 억제하며, 저밀도지질단백질에 의해 자극된 세포 내 활성산소종 생성을 억제할 뿐만 아니라, 아르기나아제의 활성 억제를 통해 L-아르기닌의 생산 농도를 효과적으로 증대시킬 수 있다는 사실을 최초로 규명하였다.

본 명세서에서 용어 '혈관근육세포의 증식과 관련된 질환'이란 혈관근육세포(혈관평활근세포)의 비정상적인 증식에 의해 발생되는 질환으로서, 자세하게는 고혈압, 동맥경화증, 뇌졸중, 심근경색 또는 혈관협착증과 같은 질환을 예시할 수 있으나, 특별히 그 종류를 한정하는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 '동맥경화증’이란 동맥의 내층이 비후하여 혈관벽의 탄력성이 감소하여 혈류에 대한 저항이 증대하고 혈압상승과 좌심실의 비대를 가져오는 혈관질환을 의미하며, 죽상경화(atherosclerosis), 중막경화(medial calcification), 및 세동맥경화(arteriosclerosis)의 3 가지 질환으로 나눌 수 있으며, 흔히 동맥경화증이라고 부르는 질환은 죽상 동맥 경화증을 지칭하는 것으로 쓰인다.

동맥경화의 특징은 내피에 지질이 축적되고 염증반응이 일어나 죽상 플라크(atherosclerotic plaque)가 형성되는 것인데, 플라크는 동맥을 협소화시키고 좁아진 동맥은 혈전에 의해 막히는 경우 쉽게 파열되어 심혈관질환을 일으킬 수 있다.

이러한 동맥경화의 초기단계에서 중요한 역할을 하는 것은 단핵구에서 유래하는 대식세포이다. 고지혈증으로 인해 혈액 내의 nLDL 농도가 너무 높거나 nLDL이 산화에 변형되는 경우 대식세포는 청소수용체(scavenger receptor)를 이용하여 산화된 LDL(oxLDL: oxidized LDL)을 이입하게 되는데, 산화된 LDL을 이입한 대식세포를 거품세포(foam cells)라 한다. 일반적으로 병원체를 탐식한 대식세포는 다른 곳으로 이동하지만, 거품세포는 산화된 LDL을 이입한 후에도 그 자리를 떠나지 않기 때문에 정상적인 생물학적 기능을 상실하게 되고, 혈관 내피세포로 침투되어 동맥경화반(atherosclerotic plaque) 형성을 통해 평활근을 비후시킨다. 더욱이 거품세포가 동맥의 내피에 포획되는 경우 국지적 염증반응을 촉발한다고 알려져 있다.

본 명세서에서 용어 ‘저밀도지질단백질(Low-density lipoprotein: nLDL)’은 비중 1.019~1.063 사이에 분리되는 혈장리포단백질을 의미하며, 콜레스테롤을 운반하며 동맥경화를 유발시키는 대표적인 물질로 혈관세포에 작용하여 세포증식을 유도하는 것으로 알려져 있다.

본 명세서에서 용어 ‘혈관협착증’은 혈관근육세포(혈관평활근세포)의 비정상적인 증식에 의해 발생되는 협착증으로서, 자세하게는 경피 경관 관상동맥성형술후 발생하는 혈관재협착증, 경피 경관 혈관성형술후 발생하는 혈관재협착증, 혈관재건술후 발생하는 혈관협착증, 혈관내 스텐트 삽입술후 발생하는 혈관협착증 또는 기관이식후 발생하는 혈관협착증을 예시할 수 있으나, 특별히 그 종류를 한정하는 것은 아니다.

먼저, 본 발명자들은 하기 실시예 1에서 리모닌의 아르기나아제(arginase) 활성 억제 효과를 살펴보기 위하여, 생쥐의 신장과 간 조직 및 혈관평활근세포를 이용 리모닌의 농도별 처리에 따른 아르기나아제 활성을 측정하였다. 아르기나아제는 혈관근육세포 증식과 혈관내피세포의 NO 생성을 조절하여 혈관 항상성 유지에 중요한 역할을 하는 인자로 작용한다. nLDL로 세포를 자극하는 경우 아르기나아제 효소 활성이 증대되는데, 본 실험에서는 리모닌의 아르기나아제 활성 억제가 nLDL에 의한 혈관근육세포의 증식을 억제할 수 있는지를 살펴보기 위하여 상기 실험을 진행하였으며, 그 결과 리모닌 처리 농도 및 시간에 의존적으로 아르기나아제 활성이 억제·감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 3a 내지 3d 참고).

또한, 본 발명자들은 하기 실시예 2에서 리모닌의 직접적인 혈관평활근세포 증식 억제 효과를 살펴보기 위하여, 혈관평활근세포에 리모닌을 일정시간 전처리한 후 nLDL을 처리하여 세포증식을 유도하는 경우 혈관평활근세포의 증식 정도를 측정하였으며, 그 결과 nLDL 자극에 의해 유도된 세포증식이 리모닌 전처리에 의해 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 4a 참조). 상기 실험과 더불어 본 발명자들은, 세포증식 억제에 중심 역할을 하는 사이클린 의존성 키나아제 억제자인 p21의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 분석하였으며, 그 결과 혈관평활근세포에 리모닌을 일정시간 전처리한 경우 nLDL에 의해 감소되었던 p21의 발현이 회복되는 것을 확인할 수 있었다(도 4b 참조). 이러한 결과를 통해, 리모닌은 p21의 발현을 증가시킬 수 있으며, 이에 따라 nLDL에 의한 혈관평활근세포 증식을 억제할 수 있으리라 판단된다.

또한, 본 발명자들은 하기 실시예 3에서 리모닌의 활성산조성 생성 억제 효과를 살펴보기 위하여, 혈관평활근세포에 리모닌을 일정시간 전처리한 후 nLDL 자극에 따른 활성산소종 생산에 미치는 영향을 조사하였으며, 그 결과 리모닌(25μg/ml)을 전처리한 경우 nLDL에 의한 혈관평활근세포에서의 활성산소종 생성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 5a 참조). 상기 실험과 더불어 본 발명자들은 NADPH oxidase 활성화에 중요한 p47phox의 시토졸(cytosol)에서 멤브레인(membrane)으로의 이동을 살펴보았으며, 그 결과 nLDL이 유도한 p47phox 이동이 리모닌의 전처리에 의해 억제되는 것으로 나타났다(도 5b 참조). 이러한 결과를 통해, 리모닌이 nLDL자극으로 유도한 p47phox의 이동을 억제하여 활성산소종 생성을 감소시켰음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 하기 실시예 4에서 리모닌의 p47phox 이동 억제효과가 어떤 기작을 통해 일어나는지를 확인하기 위해, p47 phox 이동에 필요한 Erk1/2와 PKCβII의 인산화를 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인하였으며, 그 결과 리모닌은 nLDL자극에 의한 Erk1/2의 인산화에는 큰 영향이 없는 반면(도 6a 참조), PKCβII의 인산화는 완벽하게 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 6b 참조). 이러한 결과를 통해, 리모닌이 nLDL에 의한 PKCβII의 인산화를 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 하기 실시예 5에서 리모닌의 PKCβII 인산화 억제 기작을 알아보기 위해, 혈관평활근세포에 리모닌(25μg/ml) 처리에 따른 폴리아민과 L-아르기닌의 농도 변화를 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 방법을 이용하여 분석하였으며, 그 결과 스퍼민(spermine), 스퍼미딘(spermidine), 푸트레신(putrescine)과 같은 폴리아민의 농도는 감소하는 반면, L-아르기닌 농도는 증가함을 확인할 수 있었다(도 7 참조).

참고로, L-아르기닌은 콜레스테롤 수준이 높고 동맥경화를 앓고 있는 환자의 혈관벽 두께의 증가를 막아주며, 고혈압 환자 및 심혈관계 환자의 콜레스테롤 수준을 낮춰주는 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한, L-아르기닌을 규칙적으로 복용하는 경우 콜레스테롤 수준이 감소되고, 활성산소에 의한 저밀도지단백(LDL)의 피해를 예방하고 혈관내피세포의 기능을 회복시켜주며, 혈관의 확장기능을 정상화시켜주고, 혈소판 점도를 약화시킴에 따라 전반적으로 심혈관계 환경을 개선시켜주는 효과가 있음이 보고되고 있다. 따라서 L-아르기닌 농도 증대 활성을 갖는 의약 소재의 경우, 고혈압, 동맥경화증, 뇌졸중, 심근경색, 혈관협착증 및 기타 심혈관계 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명자들은 하기 실시예 6에서 폴리아민 농도감소, L-아르기닌 농도 증가가 PKCβII 인산화에 미치는 영향을 웨스턴 블랏을 통해 분석하였으며, 그 결과 L-아르기닌은 nLDL에 의한 PKCβII 인산화를 억제시키는 것을 확인할 수 있었다(도 8a 참조).

그러므로 본 발명의 리모닌 화합물은 농도 의존적으로 아르기나아제 활성을 억제하고, nLDL에 의해 유도된 혈관평활근세포의 증식을 직접적으로 억제하며, nLDL에 의해 자극된 세포 내 활성산소종 생성을 억제할 뿐만 아니라, 아르기나아제의 활성 억제를 통해 L-아르기닌의 생산 농도를 효과적으로 증대시킬 수 있음을 실험에 의해 객관적으로 입증하였는바, 이러한 효과를 갖는 리모닌을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 혈관근육세포의 증식과 관련된 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 리모닌 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 리모닌은 시중에서 판매되는 것을 사용할 수도 있으며, 또는 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 리모닌을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물로서 이러한 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 리모닌은 조성물에 0.1 내지 10000mg/ml의 농도로 포함될 수 있으며, 또한 본 발명의 리모닌 화합물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 95중량%로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 혈관근육세포의 증식과 관련된 질환의 예방 및 치료용 의약의 제조를 위한 리모닌을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 리모닌을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 혈관근육세포의 증식과 관련된 질환의 예방 및 치료용 의약의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 포유동물에게 리모닌을 투여하는 것을 포함하는 혈관근육세포의 증식과 관련된 질환의 예방 및 치료방법을 제공한다.

본 명세서에서 용어 '포유동물‘은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

본 명세서에서 용어 '치료상 유효량‘은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약제학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 리모닌을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.01㎎/kg~250㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 리모닌을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명은 또한, 리모닌(limonin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈관 재협착 방지용 약제학적 조성물을 제공한다.

일반적으로 동맥경화증 및 허혈성 심질환자를 치료하기 위하여 경피적 관상동맥성형술이 치료방법으로 임상에서 시술되고 있다. 상기 경피적 관상동맥성형술은 좁아진 관상동맥을 수술에 의하지 않고 확장시키는 방법으로, 시술방법으로는 경피적 관상동맥 풍선 확장술, 경피적 관상동맥 스텐트 삽입술 등이 있다.

본 명세서에서 용어 '스텐트(stent)’는 혈관이나 카테터(catheter)에 삽입시켜 관의 내경을 열어놓은 상태로 유지하면서 유체의 흐름을 원활하도록 하기 위해서 사용되는 튜브로, 그 관이 외부로부터 가해지는 압력이나 협착으로 인해 폐쇄되는 것을 방지하기 위한 의료 용구이다. 이러한 스텐트는 스테인리스 스틸, 코발트-크롬, 백금-크롬, 탄탈륨, 티타늄, 니티놀, 금, 백금, 은 및 그의 합금과 같은 금속 재질을 많이 사용하나, 담관 또는 췌관 등에 사용하는 비혈관계 의료용 스텐트는 대부분 폴리에틸렌 소재의 플라스틱 스텐트를 사용하고 있다.

이와 같이 관상동맥 성형술 시술의 경우 손상에 의해 유도되는 혈관 재협착증은 혈관평활근세포의 증식, 이동 그리고 세포외 기질(extracellular matrix)의 분비 등에 기인한다고 알려지고 있다(Circulation, 1997, 95, 1998-2002; J. Clin. Invest. 1997, 99, 2814-2816; Cardiovasc. Res. 2002, 54, 499-502).

따라서 혈관 재협착 방지를 위해 레이저 혈관성형술, 고속회전 죽종제거술, 절단풍선을 이용한 관상혈관성형술과 같은 새로운 관상동맥성형술 장비의 도입과 항혈소판제, 항혈전제, 혈관확장제, 세포증식억제제 등의 약제를 이용하여 관상동맥성형술 후 재협착을 예방하는 시도가 있어왔으나, 재협착을 효과적으로 감소시킬 수 있는 방법은 아직까지 확립되지 않았다.

최근 관상동맥성형술을 시행한 부위에 직접 약물을 투여하여 재협착을 방지하기 위해, 장기간 시술부위에 약물을 전달할 수 있는 서방성 미세입자 또는 스텐트에 약물을 입혀 치료하는 시도들이 있다. 현재 사용되는 약물로 라파마이신(rapamycin), 파클리탁셀(paclitaxel), 실로리무스(silorimus), 베라파밀(verapamil) 등이 사용되고 있다.

그러나 이들의 부작용 및 장기 사용에 대한 안정성 등의 문제로 혈관 재협착 예방에 대하여 우수한 효과를 나타내면서 안정성이 높은 의약품 소재의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 상기에서 살펴본 바와 같이, 리모닌 화합물의 아르기나아제 효소 활성 억제 효과; 혈관평활근세포의 증식 억제 효과; 활성산소종 생산 억제 효과; 및 L-아르기닌 생산 증진 효과를 실험에 의해 객관적으로 입증하였는바, 이러한 효과를 갖는 리모닌을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 혈관 재협착 방지를 위한 약제학적 조성물의 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 스텐트를 혈관부위에 삽입 시, 스텐트 표면에 코팅되는 조성물이거나, 또는 혈관부위에 직접 도포될 수 있는 조성물일 수 있다. 본 발명의 조성물을 혈관부위에 직접 도포하는 경우 1 내지 3mm 두께로 직접 도포하여 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물은 본 발명의 효과를 해치지 않는 범위 내에서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피하내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 비경구투여가 바람직하여, 스텐트 내 도포하여 협착 주위에 직접 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에서 혈관 재협착을 억제하기 위한 약물의 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 투여량은 혈관 재협착 방지제의 통상적인 투여량으로, 일례로 성인의 경우 1일 1㎍/스텐트 내지 10,000㎍/스텐트, 바람직하게는 10㎍/스텐트 내지 100㎍/스텐트를 사용할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은, 혈관평활근세포의 증식을 억제하므로 혈관 협착을 방지하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 즉, 풍선 성형술 또는 스텐트 삽입술 등의 경피적 관동맥 성형술 후의 관동맥 재협착, 경피적 뇌혈관 및 말초혈관 중재술 후 혈관 재협착, 각종 혈관 수술 후 혈관협착, 바이패스 수술 및 동정맥루 성형술 후 혈관협착, 자가혈관 및 인공혈관 이식 후의 협착 및 동맥경화증의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물의 바람직한 사용 일례는 스텐트에 코팅하는 것이다.

이러한 약제학적 조성물을 스텐트에 코팅하는 방법은 본 기술분야에서 알려진 모든 방법이 가능하며, 구체적으로 그 종류를 특별히 한정하지는 않는다. 대표적으로 딥 코팅, 스핀 코팅, 바 코팅, 스프레이 코팅 등이 가능하다.

이때 본 발명의 약제학적 조성물을 생분해성 고분자와 함께 스텐트에 부착하거나 생분해성 고분자와 함께 사용할 수 있다.

그러므로 본 발명의 약제학적 조성물은 혈관재협착이 발생한 후에 처리하여 재협착된 부분을 완화시킬 수도 있고, 혈관재협착이 발생하기 전에 처리하여 재협착을 예방할 수도 있다. 특히, 스텐트 시술시 스텐트의 코팅제로서 스텐트에 코팅하고, 본 발명의 조성물로 코팅된 스텐트 시술 후에 발생할 수도 있는 혈관재협착을 예방할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 조성물이 코팅된 혈관 재협착 방지 효과를 갖는 스텐트를 제공한다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 >

재료 및 방법

1. 재료

루시게닌(Lucigenin), 폴리아민(polyamine)은 Sigma社에서 구입하였으며, L-아르기닌은 ROTH社에서 구입하였다. 실험에 사용된 항체 arginase II, actin, α-smooth muscle actin, p21, p47phox는 Santa Cruz社, p-pERK1/2는 Cell signaling 社, p-PKCβII는 Abcam社에서 구입하였다. Mn(III)Tetra(4-benzoic acid) porphyrin chloride(MnTBAP)는 Calbiochem社에서 구입하였다. 그 외 모든 시약은 Sigma社에서 구입하였다.

2. 저밀도지질단백질( Low - Density Lipoprotein , nLDL )의 분리

nLDL은 혈중 콜레스테롤 6.2 mM 미만의 정상적인 콜레스테롤 수치를 가지고 있는 사람의 혈장에서 분리하였다. 비중 1.33 g/ml 의 KBr 용액을 이용하여 혈장 비중을 nLDL의 비중인 1.063 g/ml 으로 맞춘 후 45000 rpm, 8℃ 조건에서 20 시간 동안 원심분리 하였다. 원심분리 후 가장 상층에 위치한 nLDL을 회수하고 KBr을 제거하기 위하여 PBS에 대하여 투석한 후 단백질 량과 산패도를 측정하였다. 단백질정량은 Bradford 법을 이용하였고, 산패도는 malondialdehyde를 표준품으로 이용하여 thiobarbituric acid reactive substance (TBARs) 방법으로 측정하였다.

분리된 nLDL은 아가로오스 겔 전기영동에서 이동속도가 oxLDL보다 느렸으며 TBARs 분석결과 oxLDL에 비하여 산화되지 않은 것으로 나타났다(도 1 참조).

3. 세포배양

실험에 사용한 혈관평활근세포는 Sprague-Dawley rat과 C57BL/6J mouse의 대동맥에서 분리하였다. Rat과 mouse를 isoflurane(aerane, 일성신약)으로 마취하여 대동맥을 적출한 뒤 멸균된 HEPES 버퍼(NaCl 120 mM, KH2PO4 2.6 mM, KCl 4 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 0.6 mM, HEPES 25 mM, glucose 14 mM, pH 7.4)에 담가 결합조직과 지방조직을 제거하였다. 분리된 대동맥은 1.5mm길이의 링 모양으로 자른 뒤 10% 젤라틴으로 코팅한 100 mm dish에 혈관 안쪽부분이 바닥을 향하게 올려놓는다. 10% 소태아혈청과 페니실린(200 U/ml), 스트렙토마이신(200 μg/ml) 을 넣은 DMEM 배지 12 ml을 조심스럽게 넣고 10일간 배양한다. 10일 뒤 혈관에서 세포가 나오면 혈관을 제거한 뒤 트립신을 처리하여 세포를 회수하고 100 mm 디시에 옮겨 37℃, 5% CO2 조건에서 배양한다. 분리된 세포는 α-smooth muscle actin을 이용한 면역염색으로 혈관평활근세포임을 확인하였다. 세포는 passage 3부터 7까지를 실험에 사용하였고, 실험 전 95% confluence에 도달한 세포를 PBS(phosphate buffered saline)로 2회 세척하고 24 시간 동안 0.2% serum starvation(DMEM, 0.2% fetal bovine serum, 100 U/ml penicilin/100 μg/ml streptomycin)하였다.

젤라틴으로 코팅한 디시(dish)에서 분리된 평활근세포를 α-smooth muscle actin으로 면역염색하여 cy3파장에서 확인하였다(도 2 참조).

4. 실험동물

실험에 사용된 동물은 10-30주령의 C57BL/6 생쥐를 사용하였다. Apo- lipoprotein E knockout(ApoE-/-) mouse는 동맥경화 질환 모델로 사용하였고 10주령의 수컷에 4주간 고콜레스테롤 식이를 하여 실험에 사용하였다.

5. 조직에서 아르기나아제 활성도 측정

생쥐의 신장과 간을 용해 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 mM EDTA, 0.1% triton X-100, 0.1 M phenylmethanesulfonyl fluoride(PMSF))로 4℃ 조건에서 호모게나이저(homogenizer)를 이용하여 파쇄하고 음파처리(sonication) 한 뒤 12000 rpm, 4℃에서 20 분간 원심분리하였다. 상층액을 회수하여 25μl에 리모닌 25μg/ml 또는 DMSO를 넣고 트리스 버퍼(Tris HCl, pH 7.5, 50 mM) 35 ul, L-아르기닌 25μl와 섞어 37 ℃에서 1 시간 반응시킨다. Acid solution (H2SO4:H3PO4:D.W.= 1:3:7) 200μl를 넣어 효소반응을 정지시키고 에탄올에 녹인 α-isonitroso- propiophenone 9%를 12.5μl 넣어 95℃에서 45 분간 urea의 발색반응을 유도하였다. 상온에서 10 분간 암반응 한 뒤 550 nm서 흡광도를 측정하였다. 단백질은 Bradford 법을 이용하여 정량하였다. 아르기나아제 활성도는 단백질(mg)이 1 분당 생성하는 urea의 양으로 나타내었다.

6. 혈관평활근 세포에서 아르기나아제 활성도 측정

배양한 세포를 starvation 한 뒤 리모닌 25μg/ml을 시간별로 처리하였다. 용해버퍼 100μl로 회수하여 hand homogenizer로 파쇄하고 4℃, 12000 rpm, 20 분간 원심분리하였다. 상층액을 이용하여 아르기나아제 활성을 측정하였다. 아르기나아제 II 활성 억제 정도는 10μM의 농도의 DMSO를 대조군으로 하여 이에 대한 상대적인 %로서 나타내었다.

7. 세포증식 에세이

96-웰 플레이트에 각 1×10⁴세포를 분주하여 24 시간 동안 배양한 뒤 PBS로 2회 세척 후 serum starvation하였다. 리모닌(5, 10μg/ml)이 있거나 없는 조건에서 nLDL 100 μg/ml을 처리하여 24 시간 동안 배양하고 WST-1 reagent (Daeil lab service)를 사용하여 세포증식을 측정하였다.

8. 활성산소종 ( reactive oxygen species : ROS ) 측정

혈관평활근세포에서의 활성산소종 측정은 광도계(luminometer)를 이용하였다. Starvation된 세포를 회수하고 krebs-HEPES buffer(NaCl 100 mM, KCl 4.69 mM, CaCl₂ 7.5 mM, MgSO₄ 1.2 mM, K₂HPO₄ 1.03 mM, NaHCO₃ 25 mM, NaHEPES 20 mM, D-(+)-glucose 5.6 mM, pH 7.4)에 분산시킨다. 5μM 농도의 루시게닌이 포함된 krebs-HEPES 버퍼에 1×10⁵ 세포를 넣어 리모닌(25μg/ml)이 있거나 없는 조건에서 nLDL 100 μg/ml을 10 분간 처리하여 ROS를 측정하였다.

9. 웨스턴 블랏 분석

<9-1> 혈관평활근세포

혈관평활근세포를 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulphate: SDS) 샘플 버퍼 1×(Tris-HCl 62.5 mM(pH 6.8), SDS 2%, Glycerol 10%, Dithiothreitol(DTT) 50 mM, bromophenol blue 0.01%)로 용해한 후 105℃에서 boiling 하고 10% SDS-PAGE를 수행하였다. PVDF 멤브레인(PALL)으로 이동한 뒤 5% 스킴밀크로 멤브레인을 차단하고 항체와 반응시켰다. 멤브레인은 enhanced-chemiluminescence system을 이용하여 x-ray 필름에 감광하였다.

<9-2> 대동맥

적출한 대동맥은 4℃의 RIPA 버퍼(Tris-HCl 0.5 M(pH 7.4), NaCl 1.5 M, deoxycholic acid 2.5%, NP-40 10%, EDTA 10 mM, Na3VO4 1 mM, NaF 5 mM, PMSF 0.1 M)에서 hand homogenizer와 sonicator를 이용하여 파쇄하고 원심분리하였다(4℃, 12000 rpm, 20 분). 상층액은 2× SDS 샘플 버퍼(Tris-HCl 125 mM (pH 6.8), SDS 4%, glycerol 20%, DTT 100 mM, bromophenol blue 0.02%)와 혼합하여 105℃에서 10분간 boiling하고 SDS-PAGE를 수행하여 위와 동일한 방법으로 감광하였다.

<9-3> 세포막 분리

혈관평활근세포를 membrane fraction buffer(Tris-HCl 25 mM pH 7.4, NaCl 250 mM, 0.1% β-mercaptoethanol, 3 mM EDTA, protease inhibitor) 100μl로 회수한 뒤 hand homogenizer를 이용하여 2분씩 5회 파쇄하였다. 4℃에서 1000g, 10 분 간 원심분리하여 깨지지 않은 세포를 제거해 내고 14,000 rpm 45 분 간 원심분리하여 상층액은 세포질 분획으로 회수하였다. 침전물은 PBS 40μl로 분산시켜 세포막 분획으로 회수하였다. 분획은 2× SDS 샘플 버퍼와 혼합하여 105℃에서 10분간 boiling하고 SDS-PAGE를 수행하여 액틴(actin)에 대한 항체로 세포질과 세포막이 분리되었음을 확인하였다.

10. HPLC 방법을 이용한 L-아르기닌과 폴리아민 분석

L-아르기닌과 폴리아민 분석은 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 사용하였다. 혈관평활근 세포와 대동맥을 hand homogenizer와 sonicator를 이용하여 100% 메탄올 200μl에 파쇄하고 4℃에서 12000 rpm, 20 분 간 원심분리하여 상층액을 분석에 사용하였다. OPT(phthaldialdehyde 5.4 mg/ml in 0.5 M borate buffer, pH 8.4, 0.4% β-mercaptoethanol)와 파쇄액을 1:1로 섞은 뒤 1 분간 반응하여 50 μl를 컬럼(4.6ｘ150 mm, 5 μm, Eclipe XDB-C18)에 주입하였다. 이동상은 0.1 M 인산 버퍼(0.2 M Na2HPO4, pH 4, DW:methanol=1:1)를 탈기하여 사용하였고 1.5ml/min의 유속으로 ex 340 nm와 em 455 nm의 파장으로 검출하였다.

11. 통계 분석

모든 실험결과는 적어도 3번 독립된 실험을 실시 후, 이들의 평균±표준편차로서 표기하였다. 유의성을 판단하기 위해 student’s t-test를 이용하였다. p값이 0.01 미만인 경우 유의한 것으로 판단하였다.

< 실시예 1>

리모닌의 아르기나아제( arginase ) 활성 억제 효과

리모닌의 아르기나아제 활성 억제 효과를 측정하기 위하여, 생쥐의 신장과 간 조직에서의 리모닌 농도별 처리에 따른 아르기나아제 활성에 미치는 영향 및 혈관평활근 세포에 리모닌 농도별 처리에 따른 아르기나아제 활성을 측정하였다.

그 결과 도 3a에서 나타낸 바와 같이, 간 파쇄 액에서 리모닌은 농도 의존적으로 아르기나아제 I 활성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 자세하게는 리모닌을 처리하지 않은 무처리군을 기준으로 하여, 리모닌을 농도별로 처리하는 경우 (2, 4, 8, 16, 32, 50μg/ml) 아르기나아제 I 활성이 각각 73.2±3%(8μg/ml), 66.1±3%(32μg/ml), 57.9±3%(50μg/ml)로 나타나, 리모닌 처리 농도에 의존적으로 아르기나아제 I의 활성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 리모닌 대신 DMSO를 처리한 경우 아르기나아제 I의 활성은 100±6%로 나타났다.

신장 파쇄 액에서도 리모닌은 농도 의존적으로 아르기나아제 II를 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 자세하게는 도 3b에서 나타낸 바와 같이, 리모닌을 처리하지 않은 무처리군을 기준으로 하여, 리모닌을 농도별로 처리하는 경우 (2, 4, 8, 16, 32, 50μg/ml) 아르기나아제 II의 활성이 각각 80.3±7%(16μg/ml), 69.8±5%(32μg/ml), 64.4±3%(50μg/ml)로 나타나, 리모닌 처리 농도에 의존적으로 아르기나아제 II의 활성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 리모닌 대신 DMSO를 처리한 경우 아르기나아제 II 활성이 100±3%로 나타났다.

또한, 도 3c 및 도 3d에서 나타낸 바와 같이, 혈관평활근세포에서 리모닌(25 μg/ml)을 시간별로 처리하였을 때 아르기나아제 II의 발현에는 영향을 주지 않으면서(도 3c) 활성만을 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 3d). 자세하게는, 리모닌을 처리한 실험군에서 아르기나아제 II 활성이 3시간 처리 시 78 ± 6%, 6시간 처리 시 72±4%로 나타나, 리모닌을 처리한 후 시간 경과에 따라 아르기나아제 II 활성이 감소되는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 2>

리모닌의 혈관평활근세포 증식 억제 효과

본 실험에서는 리모닌의 아르기나아제 억제효과가 nLDL에 의한 혈관평활근 세포증식을 억제할 수 있는지를 확인하고자, WST-1 세포증식 에세이를 수행하였다.

그 결과 도 4a에서 나타낸 바와 같이, nLDL 자극에 의해 유도된 세포증식이 리모닌 처리에 의해 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 자세하게는 리모닌을 5μg/ml 및 10μg/ml 각각의 농도로 30분간 전처리한 후 nLDL 100 μg/ml을 처리한 실험군에서 세포증식이 29.75±13%(5μg/ml), 34.24±13%(10μg/ml) 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 본 실험에서는 리모닌(25μg/ml)의 30분간 전처리에 따른 사이클린 의존성 키나아제 억제자인 p21의 발현을 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인하였으며, 그 결과 도 4b에서 나타낸 바와 같이 nLDL에 의해 감소되었던 p21의 발현이 리모닌에 의해 회복되는 것을 확인할 수 있었다.

이러한 결과를 통해, 리모닌은 p21의 발현을 증가시킬 수 있으며, 이에 따라 nLDL에 의한 혈관평활근 세포증식을 억제할 수 있으리라 판단되었다.

< 실시예 3>

리모닌의 활성산소종 ( reactive oxygen species , ROS ) 생성 억제 효과

상기 실시예 2를 통해 리모닌이 혈관평활근세포 증식 억제능이 있음을 확인하였는바, 본 실험에서는 리모닌이 활성산소종 생성에도 영향을 미치는지 여부를 살펴보기 위하여, 혈관평활근세포에서 생성되는 ROS를 루시게닌과 반응시켜 광도계를 이용하여 측정하였다. 활성산소종 생성 억제 정도는 무처리군을 100% 기준으로 하여 이에 대한 상대적인 %로서 나타내었다. 이때, ROS의 scavenger인 MnTBAP(10μM)은 대조군으로 사용하였다.

그 결과 도 5a에서 나타낸 바와 같이, 혈관평활근세포 내에서의 nLDL자극은 ROS 생성을 증가시키는데, 리모닌(25μg/ml)을 30분간 전처리한 경우 nLDL(100μg/ml)에 의한 ROS 생성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 자세하게는 리모닌의 전처리 없이 nLDL(100μg/ml)만을 처리한 실험군에서 활성산소종 생성이 161.89±10%로 나타난 반면, 본 발명의 리모닌(25μg/ml)을 30분간 전처리한 실험군에서는 활성산소종 생성이 99.75±11%로 나타나, nLDL(100μg/ml) 처리에 따른 활성산소종 생성을 효과적으로 억제할 수 있는 것으로 나타났다.

또한, NADPH oxidase 활성화에 중요한 p47phox의 시토졸(cytosol)에서 멤브레인(membrane)으로의 이동을 보았을 때 nLDL이 유도한 p47phox 이동이 리모닌의 전처리에 의해 억제되는 것으로 나타났다(도 5b 참조). 자세하게는, 세포를 멤브레인 분획과 시토졸 분획으로 나누어 p47phox의 발현을 웨스턴 블랏 분석을 통해 살펴본 결과, nLDL자극으로 p47phox의 시토졸에서 멤브레인으로의 이동이 증가하였으나, 리모닌을 전처리하였을 때는 nLDL자극에도 p47phox의 이동이 일어나지 않았다. 멤브레인과 시토졸이 분리됨은 액틴으로 확인하였다.

이러한 결과를 통해, 리모닌이 nLDL자극이 유도한 p47phox의 이동을 억제하여 ROS생성을 감소시켰음을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

리모닌의 PKC β II 억제효과

본 실험에서는 리모닌의 p47phox 이동 억제효과가 어떤 기작을 통해 일어나는지를 확인하기 위해, p47 phox 이동에 필요한 Erk1/2와 PKCβII의 인산화를 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인하였다.

그 결과 도 6에서 나타낸 바와 같이 리모닌은 nLDL자극에 의한 Erk1/2의 인산화에는 큰 영향이 없는 반면(도 6a), PKCβII의 인산화는 완벽하게 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 6b). 자세하게는 nLDL (100 μg/ml)을 10분, 24시간 처리하였을 때 10분에서 Erk1/2의 인산화가 증가하였으며, 리모닌을(25 μg/ml)을 전처리하였을 때 nLDL이 유도한 Erk1/2의 인산화에는 영향을 주지 않았다. 이에 반해, nLDL을 10분 처리하였을 때 PKCβII의 인산화가 증가하였으며, 리모닌(25 μg/ml)을 전처리하였을 때 nLDL이 유도한 PKCβII의 인산화가 억제되는 것으로 나타났다.

이러한 결과를 통해, 리모닌이 nLDL에 의한 PKCβII의 인산화를 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5>

리모닌에 의한 폴리아민 생성감소 및 L-아르기닌 농도 증가

본 실험에서는 리모닌의 PKCβII 인산화 억제 기작을 알아보기 위해, 혈관평활근세포에 리모닌(25μg/ml) 처리에 따른 폴리아민과 L-아르기닌의 농도 변화를 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 방법을 이용하여 분석하였다. 폴리아민 및 L-아르기닌 생성 농도는 무처리군을 100% 기준으로 하여 이에 대한 상대적인 %로서 나타내었다.

참고로, L-아르기닌은 콜레스테롤 수준이 높고 동맥경화를 앓고 있는 환자의 혈관벽 두께의 증가를 막아주며, 고혈압 환자 및 심혈관계 환자의 콜레스테롤 수준을 낮춰주는 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한, L-아르기닌을 규칙적으로 복용하는 경우 콜레스테롤 수준이 감소되고, 활성산소에 의한 저밀도지단백(LDL)의 피해를 예방하고 혈관내피세포의 기능을 회복시켜주며, 혈관의 확장기능을 정상화시켜주고, 혈소판 점도를 약화시킴에 따라 전반적으로 심혈관계 환경을 개선시켜주는 효과가 있음이 보고되고 있다.

그 결과 도 7에서 나타낸 바와 같이, 리모닌에 의한 아르기나아제 활성억제는 세포 내 폴리아민 농도가 대조군에 비하여 감소되어 있었고(Limonin vs. untreated, 85.6 ± 9.22 spermine, 41.66±15% spermine, 31.09 ± 36% putrescine vs 100 ± 0%, p<0.01, n=2), 아르기나아제 기질인 L-아르기닌의 농도는 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다(Limonin vs. untreated, 116.5 ± 7% vs 100 ± 0%, p<0.01, n=2). 즉, 혈관평활근세포에 리모닌(25 μg/ml)을 18시간 처리한 뒤 파쇄하여 HPLC 분석을 한 결과 spermine, spermidine, putrescine 농도가 감소하는 반면, L-아르기닌 농도는 증가함을 알 수 있었다.

이러한 결과를 통해, 리모닌의 아르기나아제 활성 억제는 L-아르기닌 농도를 증가시키고 폴리아민 농도를 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 6>

L-아르기닌의 PKC β II 억제효과

본 실험에서는 리모닌에 의한 폴리아민 농도감소, L-아르기닌 농도 증가가 PKCβII 인산화에 미치는 영향을 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인하였다.

그 결과 도 8에서 나타낸 바와 같이, 1mM 농도의 L-아르기닌을 3시간 전처리한 후 nLDL(100μg/ml)을 10분간 처리한 실험군의 경우 nLDL 자극에 의한 PKCβII의 인산화가 억제되는 것으로 나타난 반면(도 8a), 폴리아민인 spermine, spermidine, putrescine 각각을 전처리한 실험군의 경우 nLDL에 의한 PKCβII의 인산화에 대한 영향을 주지 못하는 것을 확인할 수 있었다(도 8b 내지 8d 참조). 한편, L-아르기닌과 폴리아민 모두 Erk1/2에 대한 영향은 없는 것으로 나타났다.

이러한 결과를 통해, L-아르기닌은 nLDL에 의한 PKCβII 인산화를 억제시키는 것을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

nLDL: Low-density lipoprotein
ROS: reactive oxygen species

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 리모닌 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈관협착증의 예방 및 치료용 약제학적 조성물;
<화학식 1>

.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 0.1 내지 10000mg/ml의 농도로 조성물에 포함되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 아르기나아제 효소 활성 억제; 혈관평활근세포의 증식 억제; 활성산소종 생산 억제; 및 L-아르기닌 생산 농도 증가 활성을 통해, 혈관 내 동맥경화반 형성 및 혈관 재협착을 억제하는 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 혈관협착증은 경피 경관 관상동맥성형술후 발생하는 혈관재협착증, 경피 경관 혈관성형술후 발생하는 혈관재협착증, 혈관재건술후 발생하는 혈관협착증, 혈관내 스텐트 삽입술후 발생하는 혈관협착증 및 기관이식후 발생하는 혈관협착증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 리모닌 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈관 재협착 방지용 약제학적 조성물;
<화학식 1>

.
제7항에 있어서,
상기 화합물은 아르기나아제 효소 활성 억제; 혈관평활근세포의 증식 억제; 활성산소종 생산 억제; 및 L-아르기닌 생산 농도 증가 활성을 통해, 혈관 내 동맥경화반 형성 및 혈관 재협착 방지 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 조성물은 스텐트를 혈관부위에 삽입 시, 스텐트에 코팅되거나 혈관부위에 직접 도포될 수 있는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 혈관부위는 동맥경화반인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제7항의 조성물이 코팅된 혈관 재협착 방지 효과를 갖는 스텐트.
제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈관 재협착증을 치료하는 방법.