JP7224303B2 - 薬剤、組成物、及びそれに関連する方法 - Google Patents
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Description
優先権の主張
本出願は、２０１７年５月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／５０８，７３０号の優先権を主張する。この優先権出願の全内容は参照により本明細書に援用する。
本出願は、２０１７年５月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／５０８，７３０号の優先権を主張する。この優先権出願の全内容は参照により本明細書に援用する。
糖尿病は、長期間にわたって高血糖値を呈する代謝性疾患の一群である。糖尿病には様々な種類がある。Ｉ型糖尿病は、膵臓が十分なインスリンを産生できないことに起因する。ＩＩ型糖尿病はインスリン抵抗性から始まるが、これは、細胞がインスリンに適切に反応できず、疾患の進行に伴ってインスリンの不足を引き起こし得る病態のことである。世界には約４億人の糖尿病患者が存在し、ＩＩ型糖尿病が症例の約９０％を占めている。インスリンまたはインスリン類似体は、一般的にＩ型糖尿病の治療に使用される。メトホルミンは、一般的にＩＩ型糖尿病の第一選択治療薬として推奨されている。
先行研究（それぞれ参照により本明細書に援用する、ＷＯ２０１５／１３７９８３、ＵＳ２０１６／００４５５３３（米国特許第９，６４２，８７４号で発行）、及びＵＳ２０１６／００８２０３３参照）では、特定の疾患モデル系において、興味深く、価値の高い活性を示す特定のセレノオーガニック化合物が定義されている。特に、本研究では、以下に示す式Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩの化合物を定義する：
本研究において、以下を報告する：
１．以下の３つの化合物の組み合わせ：５’－メチルセレノアデノシン（化合物Ｃ、式Ｉの化合物）、Ｓｅ－アデノシル－Ｌ－ホモシステイン（化合物Ｄ、式ＩＩの化合物）、及びγ－グルタミル－メチルセレノ－システイン（化合物Ｅ、式ＩＩＩの化合物）
は、Ｇ６ｐｃ発現を有意に減弱させることができるが、個々の化合物ではそれができないため、本方法は、肝臓のグルコース出力を低下させる新規方法となる（ＷＯ２０１５／１３７９８３参照）；
２．化合物Ｃ及びＤは、それぞれ個々に、マウス骨格筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞のミトコンドリア（ＭＴ）の潜在能力を高めることができ、このことは、化合物Ｃ及びＤがＴ２ＤＭの研究及び制御の分野で有用であり得る可能性を示唆している（ＷＯ２０１５／１３７９８３参照）；
３．化合物Ｃ、Ｄ、及びＥの組み合わせは、インスリン抵抗性糖尿病マウスモデルにおいて肝臓のグルコース出力を低下させ、耐糖能を向上させることができるため、化合物Ｃ、Ｄ、及びＥの組み合わせは、肥満、高血糖症、及び糖尿病の治療に有用であり得る（ＵＳ２０１６００４５５３３参照）；
４．化合物Ｃ及びＤは、腎臓または骨格筋のＭＴ機能の進行性の喪失によって引き起こされる筋肉減少症の治療に有用である可能性がある（ＷＯ２０１５／１３７９８３参照）；
５．化合物Ｃは、脳細胞の糖新生を増強することができ、これはＡＤの脳細胞の生存に有効である可能性がある（ＵＳ２０１６００８２０３３参照）；ならびに
６．化合物Ｃ及びＤは、ＡＤ脳のタウ過剰リン酸化を阻害することができる（ＵＳ２０１６００８２０３３参照）。
本研究において、以下を報告する：
１．以下の３つの化合物の組み合わせ：５’－メチルセレノアデノシン（化合物Ｃ、式Ｉの化合物）、Ｓｅ－アデノシル－Ｌ－ホモシステイン（化合物Ｄ、式ＩＩの化合物）、及びγ－グルタミル－メチルセレノ－システイン（化合物Ｅ、式ＩＩＩの化合物）
は、Ｇ６ｐｃ発現を有意に減弱させることができるが、個々の化合物ではそれができないため、本方法は、肝臓のグルコース出力を低下させる新規方法となる（ＷＯ２０１５／１３７９８３参照）；
２．化合物Ｃ及びＤは、それぞれ個々に、マウス骨格筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞のミトコンドリア（ＭＴ）の潜在能力を高めることができ、このことは、化合物Ｃ及びＤがＴ２ＤＭの研究及び制御の分野で有用であり得る可能性を示唆している（ＷＯ２０１５／１３７９８３参照）；
３．化合物Ｃ、Ｄ、及びＥの組み合わせは、インスリン抵抗性糖尿病マウスモデルにおいて肝臓のグルコース出力を低下させ、耐糖能を向上させることができるため、化合物Ｃ、Ｄ、及びＥの組み合わせは、肥満、高血糖症、及び糖尿病の治療に有用であり得る（ＵＳ２０１６００４５５３３参照）；
４．化合物Ｃ及びＤは、腎臓または骨格筋のＭＴ機能の進行性の喪失によって引き起こされる筋肉減少症の治療に有用である可能性がある（ＷＯ２０１５／１３７９８３参照）；
５．化合物Ｃは、脳細胞の糖新生を増強することができ、これはＡＤの脳細胞の生存に有効である可能性がある（ＵＳ２０１６００８２０３３参照）；ならびに
６．化合物Ｃ及びＤは、ＡＤ脳のタウ過剰リン酸化を阻害することができる（ＵＳ２０１６００８２０３３参照）。
したがって、先行研究は、化合物Ｃ、Ｄ、及びＥが特定の状況で有用であり得ることを示しており；具体的には、いくつかの状況（例えば、ＡＤ脳でのタウ過剰リン酸化の阻害、及び脳細胞での糖新生の増強）で、化合物Ｃまたは化合物Ｄが単独で有用である可能性があることを示している。他の状況（例えば、肝臓のグルコース出力の減少、耐糖能の向上、及び／または肥満、高血糖症、及び／または糖尿病の効果的な治療）では、これらの化合物は個々には有用ではなく、組み合わせることで有効であることが示されている。
本開示は、上記の式Ｉ及びＩＩの化合物（ならびに特に化合物Ｃ及びＤ）といくつかの構造的関係を共有し、様々な状況で驚異的に強力な活性を単独で示す新規セレン含有化合物を提供する。
本開示は、とりわけ、インスリン抵抗性糖尿病の被験体の肝臓のグルコース出力の低減及び／または耐糖能の向上において、提供する化合物が、ＣＤＥの組み合わせと同等以上の生物活性を示すことを示す。また、本開示は、糖新生の増強（例えば、脳細胞内で）及び／またはタウ過剰リン酸化の阻害（例えば、ＡＤ脳内で）において、提供する化合物が、化合物Ｃ及び／またはＤと同等以上の生物活性を有する可能性が高いことを示す。
本開示は、そのような化合物（及び／またはその１つ以上の分解物及び／または活性代謝産物）を含む及び／または送達する組成物、ならびにそのような提供する化合物に関連する様々な方法（例えば、製造、特徴決定、及び／または使用）及び／または物質（例えば、中間体、分解物、代謝産物［特に、活性代謝産物］など）を提供する。いくつかの実施形態では、提供する技術は、グルコース代謝の調節；グルコース取り込みのための細胞質小胞から細胞膜へのグルコース輸送体タンパク質（ＧＬＵＴ）移行のためのＡＳ１６０リン酸化の増強；及び／または肝臓と骨格筋の両方でのグルコース取り込みの増強に関連し、及び／またはそれらにおいて特に有用である。いくつかの実施形態では、提供する技術は、高インスリン血症、肥満、糖尿病、高血糖、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、及び／または筋肉減少症の治療に関連し、及び／またはそれらにおいて特に有用である。いくつかの実施形態では、提供する技術は、糖尿病性網膜症、腎症、神経障害、及び血管障害などのＩＩ型糖尿病関連障害の治療に関連し、及び／またはそれらにおいて特に有用である。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（１）の化合物：
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を提供し、式中、
Ｒ２及びＲ３のそれぞれは、独立して、Ｈまたは－Ｃ（Ｏ）－Ｒであり、各Ｒは、独立して、Ｃ１－６アルキルまたは３～８員の炭素環もしくは複素環であり、Ｒ２及びＲ３は、両方ともＨであってはならず；
あるいは、Ｒ２とＲ３は一緒になって－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｍ－を形成し、式中、ｎ及びｍは、それぞれ独立して０～３であり、ｎ＋ｍ≦３であり；
Ｒ５は、－Ｃ１－６アルキルまたは－Ｃ１－６アルキル－ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨであり；
Ｒ８は、Ｈまたはハロゲンであり；ならびに
Ｘは、Ｈまたはハロゲンであり、
炭素環、複素環、－（ＣＨ２）ｎ－、及び－（ＣＨ２）ｍ－部分のそれぞれは、独立して、場合により、－ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＣＮ、またはＣ１－６アルキルで１～３回置換されていてもよく；ならびに
各Ｃ１－６アルキル部分は、独立して、場合により、－ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、またはＣＮで１～３回置換されていてもよい。
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を提供し、式中、
Ｒ２及びＲ３のそれぞれは、独立して、Ｈまたは－Ｃ（Ｏ）－Ｒであり、各Ｒは、独立して、Ｃ１－６アルキルまたは３～８員の炭素環もしくは複素環であり、Ｒ２及びＲ３は、両方ともＨであってはならず；
あるいは、Ｒ２とＲ３は一緒になって－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｍ－を形成し、式中、ｎ及びｍは、それぞれ独立して０～３であり、ｎ＋ｍ≦３であり；
Ｒ５は、－Ｃ１－６アルキルまたは－Ｃ１－６アルキル－ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨであり；
Ｒ８は、Ｈまたはハロゲンであり；ならびに
Ｘは、Ｈまたはハロゲンであり、
炭素環、複素環、－（ＣＨ２）ｎ－、及び－（ＣＨ２）ｍ－部分のそれぞれは、独立して、場合により、－ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＣＮ、またはＣ１－６アルキルで１～３回置換されていてもよく；ならびに
各Ｃ１－６アルキル部分は、独立して、場合により、－ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、またはＣＮで１～３回置換されていてもよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（２）の化合物：
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を提供し、
式中、Ｒ８は、Ｈまたはハロゲンであり；
Ｘは、Ｈまたはハロゲンであり；
各Ｒ５’は、独立して、Ｈまたはハロゲンであり；ならびに
各Ｒは、独立して、Ｃ１－６アルキルであり、そのそれぞれは、独立して、場合によりハロゲンで１～３回置換されていてもよい。
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を提供し、
式中、Ｒ８は、Ｈまたはハロゲンであり；
Ｘは、Ｈまたはハロゲンであり；
各Ｒ５’は、独立して、Ｈまたはハロゲンであり；ならびに
各Ｒは、独立して、Ｃ１－６アルキルであり、そのそれぞれは、独立して、場合によりハロゲンで１～３回置換されていてもよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（３）の化合物：
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を提供し、
式中、Ｒ８は、Ｈまたはハロゲンであり；
Ｘは、Ｈまたはハロゲンであり；ならびに
各Ｒ’は、独立して、Ｈまたはハロゲンである。
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を提供し、
式中、Ｒ８は、Ｈまたはハロゲンであり；
Ｘは、Ｈまたはハロゲンであり；ならびに
各Ｒ’は、独立して、Ｈまたはハロゲンである。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物を含むか、または送達する組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物の活性部分を送達する組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の化合物または組成物を投与することによる、疾患、障害、または病態の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、提供する方法は、グルコース取り込みのための細胞質小胞から細胞膜へのグルコース輸送体タンパク質（ＧＬＵＴ）移行のためのＡＳ１６０リン酸化を増強する。いくつかの実施形態では、提供する方法は、肝臓及び骨格筋の両方におけるグルコース取り込みを増強する。いくつかの実施形態では、提供する方法は、腎機能を損なうことなく、及び／または肝臓損傷をもたらすことなく、高インスリン血症を軽減する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、インスリン関連障害の治療方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、インスリン抵抗性障害の治療方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、グルコース代謝障害の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、グルコース代謝障害は、正常範囲内にない血糖値を伴う。いくつかの実施形態では、グルコース代謝障害は、グルコースの取り込み及び／または輸送の欠陥に関連する。いくつかの実施形態では、グルコース代謝障害は、真性糖尿病、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、糖尿症、高血糖症、高インスリン症、または低血糖症である。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、グルコース輸送障害の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、グルコース輸送障害は、グルコース－ガラクトース吸収不良症、ファンコニー－ビッケル症候群、またはＤｅ Ｖｉｖｏ病（ＧＬＵＴ１欠損症候群（ＧＬＵＴ１ＤＳ））である。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、肥満の治療方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、糖尿病の治療方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、高血糖の治療方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）の治療方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、アルツハイマー病（ＡＤ）の治療方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、筋肉減少症の治療方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、グルコース産生の阻害方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、耐糖能の増加方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、インスリン抵抗性状態の被験体におけるインスリン受容体機能及びその下流シグナル伝達の活性化及び／または回復方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、ミトコンドリア関連疾患（例えば、機能不全ミトコンドリアによって引き起こされる）の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、ミトコンドリア関連疾患は、変性疾患（例えば、がん、心血管疾患及び心不全、２型糖尿病、アルツハイマー病及びパーキンソン病、脂肪肝疾患、白内障、骨粗鬆症、筋肉減少症などの筋消耗、睡眠障害ならびに炎症性疾患、例えば、乾癬、関節炎及び大腸炎）であり得る。いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、ミトコンドリア機能の増強方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、脳の糖新生の増強方法を提供する。いくつかの実施形態では、提供する方法は、脳におけるグルコース取り込みを増加させる。いくつかの実施形態では、提供する方法は、記憶及び学習を含む脳機能を維持または回復するためのものである。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体の調製方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体の特徴決定方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の組成物の調製方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の組成物の特徴決定方法を提供する。
定義
特定の官能基及び化学用語の定義を、より詳細に以下に記載する。本開示の目的のために、化学元素を、元素周期表ＣＡＳ方式、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ，７５ｔｈ Ｅｄ．の内部カバーに従って識別し、特定の官能基は、そこに記載されているように一般的に定義するものとする。さらに、有機化学の一般的な原理、及び特定の機能的部分及び反応性は、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｈｏｍａｓ Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ：１９９９に記載されており、その全内容は参照により本明細書に援用する。
特定の官能基及び化学用語の定義を、より詳細に以下に記載する。本開示の目的のために、化学元素を、元素周期表ＣＡＳ方式、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ，７５ｔｈ Ｅｄ．の内部カバーに従って識別し、特定の官能基は、そこに記載されているように一般的に定義するものとする。さらに、有機化学の一般的な原理、及び特定の機能的部分及び反応性は、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｈｏｍａｓ Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ：１９９９に記載されており、その全内容は参照により本明細書に援用する。
本明細書及び特許請求の範囲で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈によってそうでないことが明確に示されない限り、複数の参照を含むものとする。したがって、例えば、「化合物」への言及には、複数のそのような化合物が包まれる。
約：用語「約」とは、値に関して本明細書中で使用する場合、言及する値に関する類似の値を指す。一般的に、内容に精通している当業者であれば、その内容における「約」に包含される関連する分散の程度を理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、用語「約」は、言及する値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内、またはそれ未満の値の範囲を包含し得る。
投与：本明細書中で使用する場合、用語「投与」とは、一般的には、被験体または系への組成物の投与を指す。当業者であれば、適切な状況において、例えばヒトなどの被験体への投与に利用できる様々な経路を知っているであろう。例えば、いくつかの実施形態では、投与は、眼、経口、非経口、局所などであってもよい。いくつかの特定の実施形態では、投与は、気管支（例えば、気管支点滴による）、頬、皮膚（例えば、真皮、皮内、皮間、経皮などの１つ以上の局所であるか、またはそれらを含む場合があり）、経腸、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、くも膜下腔内、静脈内、脳室内、特定の器官内（例えば、肝臓内）、粘膜、経鼻、経口、直腸、皮下、舌下、局所、気管（例えば、気管内投与による）、経膣、硝子体などであってもよい。いくつかの実施形態では、投与は、間欠的（例えば、時間的に分離された複数回の投与）及び／または定期的（例えば、共通の期間によって分離された個々の投与）投与である投与を含み得る。いくつかの実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間の連続投与（例えば、灌流）を含み得る。
アルツハイマー病：本明細書中で使用する場合、用語「アルツハイマー病」または「ＡＤ」とは、ヒト中枢神経系の進行性疾患を指す。脳のインスリンシグナル伝達は学習と記憶に重要であり、脳のインスリン抵抗性はＡＤの主要な危険因子である。インスリンシグナル伝達の回復は、ＡＤの潜在的な治療法として注目されている（Ｗｈｉｔｅ ＭＦ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３；３０２：１７１０－１；Ｄｅ Ｆｅｌｉｃｅ ＤＧ ｅｔ ａｌ，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＆ Ｄｅｍｅｎｔｉａ ２０１４；１０：Ｓ２６－Ｓ３２）。特定の実施形態では、それは、高齢者に典型的な認知症によって、見当識障害、記憶喪失、言語障害、計算障害、または視空間失認によって、及び精神医学的徴候によって顕在化する。特定の実施形態では、それは、脳のいくつかの領域の変性ニューロンに関連している。本明細書中で使用する用語「認知症」とは、精神医学的症状を伴うまたは伴わないアルツハイマー型認知症が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本明細書中で提供する治療方法は、被験体の軽度、中程度及び重度のアルツハイマー病の治療に有効である。アルツハイマー病の段階には、さらに、「中程度または中期アルツハイマー病」とも呼ばれる「中程度に重度の認知機能低下」、「中程度に重度または中期アルツハイマー病」とも呼ばれる「重度の認知機能低下」、及び「重度または末期アルツハイマー病」とも呼ばれる「極めて重度の認知機能低下」が含まれる。中程度に重度の認知機能低下は、記憶の大きな欠落及び認知機能不全の表出が特徴である。この段階では、日々の活動に対する何らかの支援が不可欠となる。重度の認知機能低下では、記憶障害が悪化し続け、重大な性格の変化が現れる場合があり、影響を受けた個体は、日常的な日常活動で広範な支援を必要とする。末期アルツハイマー病または非常に重度の認知機能低下は、個体が環境に反応する能力、会話能力、そして最終的には運動を制御する能力を失う、この疾患の最終段階である。
生物学的活性：本明細書中で使用する場合、用語「生物学的活性」とは、目的の薬剤または実体によって達成される、観察可能な生物学的効果または結果を指す。例えば、いくつかの実施形態では、特異的結合相互作用は生物活性である。いくつかの実施形態では、生物学的経路または事象の調節（例えば、誘導、増強、または阻害）は生物学的活性である。いくつかの実施形態では、生物学的活性の存在または程度を、目的の生物学的経路または事象によって産生される直接的または間接的な産物の検出を通じて評価する。
併用療法：本明細書中で使用する場合、用語「併用療法」とは、被験体を、２つ以上の治療レジメン（例えば、２つ以上の治療薬）に同時に曝露させる状況を指す。いくつかの実施形態では、２つ以上のレジメンを同時に投与してもよく；いくつかの実施形態では、そのようなレジメンを連続して投与してもよい（例えば、第１のレジメンのすべての「用量」を、任意の用量の第２のレジメンの投与の前に投与する）。いくつかの実施形態では、そのような薬剤を重複した投薬レジメンで投与する。いくつかの実施形態では、併用療法の「投与」は、他の薬剤または治療法を受ける被験体に対する１つ以上の薬剤または治療法を組み合わせた投与を含み得る。明確にするために、併用療法では、個々の薬剤を単一の組成物で（または必然的に同時に）投与する必要はないが、いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤またはその活性部分を、組み合わせ組成物、または組み合わせ化合物（例えば、単一の化学複合体または共有結合体の一部として）で、一緒に投与してもよい。
比較可能：本明細書中で使用する場合、用語「比較可能」とは、互いに同一ではないが、それらの間の比較を可能にするのに十分類似している２つ以上の薬剤、実体、状況、条件セットなどを指し、それにより、当業者は、観察された相違点または類似点に基づいて結論を合理的に引き出し得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、条件、状況、個体、または集団の比較可能なセットは、複数の実質的に同一の特徴及び１つまたは少数の多様な特徴によって特徴付けられる。当業者であれば、文脈において、比較可能とみなされる２つ以上のそのような薬剤、実体、状況、条件のセットなどについて、所与の状況においてどの程度の同一性が必要であるかを理解するであろう。例えば、当業者であれば、異なる状況、個体、または集団のもとで、またはそれを用いて得られる結果または観察される現象における相違が、様々なそれらの特徴の変化によって引き起こされるか、またはそれらの特徴の変化を示すという合理的な結論を保証するのに十分な数及び種類の実質的に同一の特徴によって特徴付けられる場合、状況、個体、または集団のセットは、互いに比較可能であることを理解するであろう。
糖尿病：糖尿病の中心的な特徴は、β細胞機能の障害である。Ｉ型及びＩＩ型糖尿病の両方で疾患の進行の初期に発生する１つの異常は、摂食誘発性の急速なインスリン反応の喪失である。その結果、肝臓はグルコースを生成し続け、それが食事の基本的な成分から摂取され吸収されるグルコースに追加される。
ＩＩ型糖尿病：ＩＩ型糖尿病の１つの特徴は、インスリン抵抗性と呼ばれるインスリン作用の障害である。インスリン抵抗性は、最大グルコース除去率（ＧＥＲｍａｘ）の低下及びＧＥＲｍａｘを達成するために必要なインスリン濃度の増加の両方として現れる。したがって、所定のグルコース負荷を処理するには、より多くのインスリンが必要であり、そのインスリン濃度の増加をより長期間維持する必要がある。その結果、糖尿病患者は長時間にわたってグルコース濃度の上昇にさらされ、インスリン抵抗性がさらに悪化する。さらに、長期にわたる血糖値の上昇は、それ自体がβ細胞に対して有毒である。ＩＩ型糖尿病の別の特徴は、血糖値の上昇に対する反応の遅延である。正常な個体は、通常、食物摂取後２～３分以内にインスリンを放出し始めるが、ＩＩ型糖尿病の場合、血糖が上昇し始めるまで内在性インスリンを分泌することができず、その後、長いプラトーへの緩やかな濃度上昇である第二相動態を伴う。結果として、内在性グルコース産生は遮断されず、摂取後も継続し、患者は高血糖症（血糖値の上昇）を経験する。ＩＩ型糖尿病は、様々な、及びあまりよく理解されていない状況から発生する。早期インスリン放出の早期の喪失、及び結果としての継続的なグルコース放出は、グルコース濃度の上昇に寄与する。高グルコースレベルはインスリン抵抗性を促進し、インスリン抵抗性は血清グルコース濃度の長期にわたる上昇を引き起こす。この状況は、自己増幅サイクルにつながる可能性があり、これにより、インスリン濃度が高くなると血糖値を制御する効果が低下する。さらに、上記のように、グルコースレベルの上昇はβ細胞に対して毒性を有し、機能的なβ細胞の数を低下させる。膵島に栄養を与える微小血管の成長または維持を損なう遺伝的欠損も、その劣化に役割を果たし得る（Ｇｌｅｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３８：６８８－６９３，２００６）。最終的に、膵臓は不全となり、個体は、Ｉ型糖尿病の人々と同様のインスリン欠乏症の発症へと進行する。
Ｉ型糖尿病：Ｉ型糖尿病は、身体の固有の免疫系による膵臓のインスリン産生細胞（β細胞）の破壊の結果として生じる。これは最終的に完全なインスリンホルモン欠乏症をもたらす。
剤形または単位剤形：本明細書中で使用する場合、用語「剤形または単位剤形」とは、被験体への投与のための活性薬剤（例えば、治療剤または診断剤）の物理的に別個の単位を指す。いくつかの実施形態では、そのような各単位は、所定量の活性薬剤を含む。いくつかの実施形態では、そのような量は、関連する集団に投与する場合に所望のまたは有益な結果と相関すると判断された投薬レジメンに従った（すなわち、治療的投薬レジメンを用いた）投与に適した単位投与量（またはその全体の割合）である。当業者であれば、特定の被験体に投与する治療用組成物または薬剤の総量は、１人以上の担当医によって決定され、また、複数の剤形の投与を含み得ることを理解している。
投薬レジメン：本明細書中で使用する場合、用語「投薬レジメン」とは、一般的には期間によって分けられ、被験体に個別に投与する単位用量のセット（一般的には複数）を指す。いくつかの実施形態では、所定の治療薬は、推奨される投薬レジメンを有し、それは１つ以上の用量を含み得る。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、それぞれが他の用量から時間的に分離された複数の投与を含む。いくつかの実施形態では、個々の投与は、同じ長さの期間だけ互いに分離され；いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、複数の投与と、個々の投与を分離する少なくとも２つの異なる期間を含む。いくつかの実施形態では、投薬レジメン内のすべての投与は同じ単位投与量である。いくつかの実施形態では、投薬レジメン内の異なる投与は異なる量である。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、第１の用量での第１の投与と、それに続く第１の用量とは異なる第２の用量での１回以上の追加投与とを含む。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、第１の用量での第１の投与と、それに続く第１の用量と同じ第２の用量での１回以上の追加投与を含む。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、関連する集団に投与する場合、所望の、または有益な結果と関連付けられる（すなわち、治療的投薬レジメンである）。
賦形剤：本明細書中で使用する場合、用語「賦形剤」とは、例えば、所望の粘稠性または安定化効果を提供するか、またはそれらに寄与するために、医薬組成物に含まれ得る非治療薬を指す。いくつかの実施形態では、適切な薬学的賦形剤として、例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられ得る。
ハネムーン期：本明細書中で使用する場合、１型糖尿病の用語「ハネムーン期」とは、早期インスリン放出の喪失を特徴とする疾患の初期段階を指し、残されたβ細胞機能がいくらかのインスリンを産生し、それは第二相動態により放出される。
高血糖症：本明細書中で使用する場合、用語「高血糖症」とは、通常より高い空腹時血糖濃度を特徴とする疾患、障害、または病態を指す。いくつかの実施形態では、高血糖症は、１２６ｍｇ／ｄＬ以上の血糖濃度を特徴とする。いくつかの実施形態では、高血糖症は、２８０ｍｇ／ｄＬ（１５．６ｍＭ）以上の血糖濃度を特徴とする。
低血糖症：本明細書中で使用する場合、用語「低血糖症」とは、通常よりも低い血糖濃度を特徴とする疾患、障害、または病態を指す。いくつかの実施形態では、低血糖症は、６３ｍｇ／ｄＬ（３．５ｍＭ）以下の血糖濃度を特徴とする。いくつかの実施形態では、低血糖症は、低血糖症の症状として認識される、認知障害、行動変化、蒼白、発汗低血圧症、紅潮及び衰弱などの症状を引き起こし、適切なカロリー摂取により解消する。いくつかの実施形態では、低血糖症は重度であり、それにより、グルカゴン注射、グルコース注入、または別の関係者による支援が必要である。
改善、増加、阻害または減少：本明細書中で使用する場合、用語「改善」、「増加」、「阻害」、及び「減少」、またはそれらの文法的均等物は、ベースラインまたは他の基準測定値に対する値を示す。いくつかの実施形態では、適切な基準測定値は、特定の薬剤または処置が存在せず（例えば、前及び／または後に）、その他の点では比較可能な条件下での、または適切な比較可能な基準薬剤の存在下での、特定の系における（例えば、単一の個体における）測定値であり得るか、または測定値を含み得る。いくつかの実施形態では、適切な基準測定値は、関連する薬剤または処置の存在下で、特定の方法で応答することが知られているか、または予想される、比較可能な系における測定値であり得るか、または測定値を含み得る。
インスリン関連障害：本明細書中で使用する場合、用語「インスリン関連障害」とは、哺乳類におけるインスリンの産生、調節、代謝、及び作用に関する障害を指す。インスリン関連障害として、糖尿病前症、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、低血糖症、高血糖症、インスリン抵抗性、分泌機能障害、筋肉減少症、膵臓β細胞機能の喪失、及び膵臓β細胞の喪失が挙げられるが、これらに限定されない。
インスリン関連障害を有する非インスリン依存性患者：本明細書中で使用する場合、用語「インスリン関連障害を有する非インスリン依存性患者」とは、外因的に提供するインスリンによる治療が、診断時の現在の標準的な治療ではない障害を有する患者を指す。外因的に投与するインスリンで治療しないインスリン関連障害を有するインスリン非依存患者には、早期ＩＩ型糖尿病、ハネムーン期Ｉ型糖尿病、糖尿病前症及びインスリン産生細胞移植レシピエントが含まれる。
インスリン抵抗性：本明細書中で使用する場合、用語「インスリン抵抗性」とは、患者の細胞がインスリンに適切にまたは効率的に応答できないことを指す。膵臓は、より多くのインスリンを産生することにより、細胞レベルでこの問題に応答する。最終的に、インスリンに対する身体のニーズに膵臓が追いつくことができず、血流中に過剰なグルコースが蓄積する。インスリン抵抗性の患者は、多くの場合、高レベルの血糖値と血中を循環する高レベルのインスリンを同時に有する。
インスリン抵抗性障害：本明細書中で使用する場合、用語「インスリン抵抗性障害」とは、インスリン抵抗性によって引き起こされるか、またはインスリン抵抗性が寄与する任意の疾患または病態を指す。例として：糖尿病、肥満、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性症候群、シンドロームＸ、インスリン抵抗性、血圧上昇、高血圧、高血中コレステロール、脂質異常症、高脂血症、脂質異常症、脳卒中、冠動脈疾患または心筋梗塞を含む動脈硬化性疾患、高血糖症、高インスリン血症及び／または高プロインスリン血症、耐糖能障害、インスリン放出遅延、冠動脈心疾患を含む糖尿病合併症、狭心症、うっ血性心不全、脳卒中、認知症の認知機能、網膜症、神経障害、腎症、糸球体腎炎、糸球体硬化症、ネフローゼ症候群、高血圧性腎硬化症、いくつかの種類のがん（例えば、子宮内膜、乳房、前立腺、及び結腸）、妊娠の合併症、女性の生殖機能の低下（例えば、月経不順、不妊、排卵不順、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ））、脂肪異栄養症、コレステロール関連障害、例えば、胆石、胆嚢炎及び胆石症、痛風、閉塞性睡眠時無呼吸及び呼吸器系の問題、骨関節炎、ならびに例えば骨粗鬆症などの骨量減少の予防及び治療が挙げられる。
異性体：当技術分野で知られているように、多くの化学物質（特に多くの有機分子及び／または多くの小分子）は、様々な構造（例えば、幾何、立体配座、同位体）及び／または光学異性体で存在することができる。例えば、任意のキラル中心がＲ及びＳ配置で存在することができ、二重結合はＺ及びＥ立体配座異性体で存在することができ、特定の構造要素は２つ以上の互変異性体を採用することができ、特定の構造は１つ以上の同位体濃縮原子で置換することができる（例えば、水素の場合は重水素またはトリチウム、１３Ｃの場合は１２Ｃまたは１４Ｃ、１２９Ｉの場合は１３１Ｉなど）。いくつかの実施形態では、文脈から当業者には明らかであるように、本明細書中の特定の化合物構造の描写または参照は、そのすべての構造異性体及び／または光学異性体を代表し得る。いくつかの実施形態では、文脈から当業者には明らかであるように、本明細書中の特定の化合物構造の描写または参照は、描写または参照する異性体形態のみを包含することを意図している。いくつかの実施形態では、様々な異性体形態で存在することができる化学物質を含む組成物は、複数のそのような形態を含み；いくつかの実施形態では、そのような組成物は単一の形態のみを含む。例えば、いくつかの実施形態では、様々な光学異性体（例えば、立体異性体、ジアステレオマーなど）として存在することができる化学物質を含む組成物には、そのような光学異性体のラセミ集団が含まれ；いくつかの実施形態では、そのような組成物は、単一の光学異性体のみを含み、及び／または一緒に光学活性を保持する複数の光学異性体を含む。
非経口：本明細書中で使用する場合、用語「非経口投与」及び「非経口で投与する」とは、通常は注射による、経腸及び局所投与以外の投与様式を指す。いくつかの実施形態では、非経口投与は、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内及び胸骨内注射及び／または注入であり得るか、またはそれらを含み得る。
部分的に不飽和：本明細書中で使用する場合、用語「部分的に不飽和」とは、少なくとも１つの二重結合または三重結合を含む環部分を指す。用語「部分的に不飽和」は、複数の不飽和部位を有する環を包含することを意図しているが、本明細書中で定義するように、アリールまたはヘテロアリール部分を含むことを意図していない。
医薬組成物：本明細書中で使用する場合、用語「医薬組成物」とは、活性薬剤を１つ以上の薬学的に許容される担体とともに製剤化した組成物を指す。いくつかの実施形態では、活性薬剤は、関連のある集団に投与する場合に所定の治療効果を達成する統計的に有意な確率を示す治療レジメンでの投与に適した単位用量で存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物を、以下に適合するものを含む固体または液体形態での投与のために特別に製剤化してもよい：経口投与、例えば、水薬（水性または非水性の溶液または懸濁液）、錠剤、例えば、頬、舌下、及び全身吸収を標的とするもの、ボーラス、散剤、顆粒剤、舌に塗布するためのペースト；非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射による、例えば、滅菌溶液もしくは懸濁液、または徐放性製剤として；局所塗布、例えば、皮膚、肺、または口腔に塗布する、クリーム、軟膏、または徐放性パッチもしくはスプレーとして；膣内または直腸内、例えば、ペッサリー、クリーム、または発泡体として；舌下；眼内；経皮；または経鼻、肺内、及び他の粘膜表面へ。当業者であれば、一般的に、いくつかの実施形態では、ヒトまたは動物被験体への投与のために製剤化する任意の組成物は、その投与が処方箋を必要とするかどうかにかかわらず、医薬組成物と見なされ得ることを理解するであろう。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、食物または食物サプリメント組成物（例えば、シェイクまたはスポーツドリンクまたは栄養サプリメント粉末などの液体または固体の消費可能組成物）は、医薬組成物とみなされ得る。代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、医薬組成物は、例えば米国の食品医薬品局などの適切な政府機関による関連する被験体への投与のために特に調節及び承認される製剤であってもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、免許を有する医師の処方箋なしでは法的に投与できない組成物である。
薬学的に許容される：本明細書中で使用する場合、本明細書において開示する組成物を製剤化するために使用する担体、希釈剤、または賦形剤に対して適用する用語「薬学的に許容される」とは、その担体、希釈剤、または賦形剤が組成物の他の成分と適合しなければならず、また、そのレシピエントに有害であってはならないことを意味する。
薬学的に許容される担体：本明細書中で使用する用語「薬学的に許容される担体」とは、薬学的に許容される物質、組成物またはビヒクル、例えば、対象化合物を、ある器官、または身体の一部から、別の器官または身体の一部へ運搬または輸送することに関与する、物質をカプセル化する液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、または溶媒を指す。各担体は、製剤の他の成分と適合性があり、患者に有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容される担体として機能することができる物質のいくつかの例として：糖質、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース：デンプン類、例えば、コーンスターチ及びジャガイモデンプン；セルロース、及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、カカオバター及び坐薬ワックス；油類、例えば、落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及びダイズ油；グリコール類、例えば、プロピレングリコール；ポリオール類、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール；エステル類、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩水；リンガー液；エチルアルコール；ｐＨ緩衝液；ポリエステル類、ポリカーボネート類及び／またはポリ無水物；ならびに医薬製剤に使用される他の非毒性適合物質が挙げられる。
糖尿病前症：本明細書中で使用する場合、用語「糖尿病前症」とは、患者が空腹時高血糖及び／または耐糖能障害を有する疾患、障害、または病態を指す。いくつかの実施形態では、糖尿病前症患者の空腹時血糖値は、１００ｍｇ／ｄＬ（５．５ｍｍｏｌ／Ｌ）～１２６ｍｇ／ｄＬ（７．０ｍｍｏｌ／Ｌ）である。いくつかの実施形態では、糖尿病前症患者は、食後２時間の血糖値が、１４０ｍｇ／ｄＬ（７．８ｍｍｏｌ／Ｌ）～２００ｍｇ／ｄＬ（１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ）である。
プロドラッグ：本明細書中で使用する場合、用語「プロドラッグ」とは、代謝変換により薬理学的に活性な薬剤に変換される、薬理学的に活性な、またはより一般的には不活性な化合物を指す。本明細書に記載の式のいずれかの化合物のプロドラッグは、式のいずれかの化合物に存在する官能基を、ｉｎ ｖｉｖｏで切断して親化合物を放出し得るように修飾することにより調製される。ｉｎ ｖｉｖｏでは、プロドラッグは生理学的条件下で化学変化を容易に受け（例えば、天然酵素（複数可）により加水分解されるか、または作用を受け）、薬理学的に活性な薬剤の遊離をもたらす。プロドラッグとして、本明細書に記載の式の化合物が挙げられ、その化合物においては、ヒドロキシル基、アミノ基、またはカルボキシル基が、ｉｎ ｖｉｖｏで切断されて遊離ヒドロキシル基、アミノ基、またはカルボキシル基をそれぞれ再生し得る基に結合している。プロドラッグの例として、本明細書に記載の式のいずれかの化合物のエステル類（例えば、酢酸塩、ギ酸塩、及び安息香酸塩誘導体）、または生理学的ｐＨに至らせるか酵素作用により活性な親薬物に変換される他の誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。適切なプロドラッグ誘導体の選択及び調製の従来の手順は、当技術分野で説明されている（例えば、Ｂｕｎｄｇａａｒｄ． Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５参照）。
増殖性病態：本明細書中で使用する場合、用語「増殖性病態」とは、細胞増殖に関連する疾患または障害を指す。いくつかの実施形態では、増殖性疾患または障害は、がんであるか、がんを含む。いくつかの実施形態では、増殖性疾患または障害は、炎症性疾患または障害である。いくつかの実施形態では、増殖性疾患または障害は、自己免疫疾患または障害である。いくつかの実施形態では、増殖性疾患または障害は、微生物感染症（例えば、細菌感染症）である。
参照：本明細書中で使用する場合、用語「参照」とは、比較を実行する基準または対照を指す。例えば、いくつかの実施形態では、目的の薬剤、動物、個体、集団、試料、配列または値を、参照または対照の薬剤、動物、個体、集団、試料、配列または値と比較する。いくつかの実施形態では、参照または対照を、目的の試験または測定と実質的に同時に試験及び／または測定する。いくつかの実施形態では、参照または対照は、場合により有形の媒体で具現化される履歴参照または対照である。一般的には、当業者であれば理解するように、参照または対照は、評価中のものと比較可能な条件または状況の下で測定または特徴付けられる。当業者であれば、特定の可能な参照または対照への依存及び／または比較を正当化するのに十分な類似性が存在する場合を認識するであろう。
リスク：本明細書中で使用する場合、疾患、障害、及び／または病態の「リスク」とは、特定の個体が、疾患、障害、及び／または病態を発症する可能性を指す。いくつかの実施形態では、リスクをパーセンテージとして表す。いくつかの実施形態では、リスクは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０～最大１００％までである。いくつかの実施形態では、リスクは、参照試料または参照試料群に関連するリスクに相対するリスクとして表される。いくつかの実施形態では、参照試料または参照試料群は、疾患、障害、病態、及び／または事象の既知のリスクを有する。いくつかの実施形態では、参照試料または参照試料群は、特定の個体と比較可能な個体に由来する試料である。いくつかの実施形態では、相対リスクは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上である。
固体形態：当技術分野で公知のように、多くの化学物質（特に多くの有機分子及び／または多くの小分子）は、例えば、アモルファス形態及び／または結晶形態などの様々な異なる固体形態をとることができる（例えば、多形体、水和物、溶媒和物など）。いくつかの実施形態では、そのような物質を、そのような単一の形態として（例えば、単一の多形体の純粋な調製物として）利用してもよい。いくつかの実施形態では、そのような物質を、そのような形態の混合物として利用してもよい。
被験体：本明細書中で使用する場合、用語「被験体」とは、生物、一般的には哺乳類（例えば、ヒト、いくつかの実施形態では出生前のヒトの形態を含む）を指す。いくつかの実施形態では、被験体は、関連する疾患、障害または病態に罹患している。いくつかの実施形態では、被験体は、疾患、障害、または病態に高感受性である。いくつかの実施形態では、被験体は、疾患、障害または病態の１つ以上の症状または特徴を示す。いくつかの実施形態では、被験体は、疾患、障害、または病態の症状または特徴をまったく示さない。いくつかの実施形態では、被験体は、疾患、障害、または病態に対する感受性またはリスクに特徴的な１つ以上の特徴を有する被験体である。いくつかの実施形態では、被験体は患者である。いくつかの実施形態では、被験体は、診断及び／または療法を施す及び／または施している個体である。
高感受性：疾患、障害、または病態（例えば、インフルエンザ）に「高感受性」である個体は、疾患、障害、または病態を発症するリスクを有する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、または病態に高感受性の個体は、疾患、障害、または病態の症状をまったく示さない。いくつかの実施形態では、疾患、障害、または病態に高感受性の個体は、疾患、障害、及び／または病態を有すると診断されていない。いくつかの実施形態では、疾患、障害、または病態に高感受性の個体は、疾患、障害、または病態の発症に関連する条件にさらされている個体である。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／または病態を発症するリスクは、集団ベースのリスクである（例えば、疾患、障害、または病態に罹患している個体の家族）。
治療有効量：本明細書中で使用する場合、用語「治療有効量」とは、それを投与する対象に所望の効果を生じさせる量を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、治療的投薬レジメンに従って、疾患、障害、及び／または病態に罹患しているかまたは罹患しやすい集団に投与する場合に、疾患、障害、及び／または病態を治療するのに十分な量を指す。いくつかの実施形態では、治療有効量は、疾患、障害、及び／または病態の１つ以上の症状の発症率及び／または重症度を低下させ、及び／または発症を遅らせる量である。当業者であれば、用語「治療有効量」が、実際に特定の個体において治療の成功を達成することが必ずしも必要でないことを理解するであろう。むしろ、治療有効量は、そのような治療を必要とする患者に投与する場合に、有意な数の被験体において特定の望ましい薬理学的応答を提供する量であり得る。いくつかの実施形態では、治療有効量への言及は、１つ以上の特定の組織（例えば、疾患、障害または病態に影響を受ける組織）または体液（例えば、血液、唾液、血清、汗、涙、尿など）において測定されるような量への言及であり得る。当業者であれば、いくつかの実施形態において、治療有効量の特定の薬剤または療法を単回用量で製剤化及び／または投与することができることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、治療的に有効な薬剤を、例えば投与レジメンの一部として、複数の用量で製剤化及び／または投与してもよい。
治療：本明細書中で使用する場合、用語「治療」（同様に「治療する」または「処置」）とは、特定の疾患、障害、及び／または病態の１つ以上の症状、特徴、及び／または原因を、部分的にまたは完全に、軽減、寛解、緩和、阻害、発症遅延させ（例えば、確立された開始時間または期間に関して）、重症度を低下させ、及び／または発生率を低下させる治療の投与を指す。いくつかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、及び／または病態の徴候または症状を示さない被験体の、及び／または関連する疾患、障害、及び／または病態に罹患していると診断されていない被験体の、及び／または疾患、障害、及び／または病態の初期徴候のみを示す被験体の治療であってもよい。代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害及び／または病態の１つ以上の確立された徴候を示す被験体に対する治療であってもよい。いくつかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、及び／または病態に罹患していると診断された被験体の治療であってもよい。いくつかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、及び／または病態の発症リスクの増加と統計的に相関する１つ以上の感受性因子を有することが知られている被験体に対する治療であってもよい。いくつかの実施形態では、そのような治療は、疾患、障害、及び／または病態を発症するリスクを減らすこと、及び／または疾患、障害、または病態の１つ以上の特徴または症状の発症を遅らせることを指す。いくつかの実施形態では、治療は、関連する集団または系（例えば、モデル系）に適用する場合の統計的有意性とともに、適切な結果を達成すること（例えば、特定の疾患、障害、及び／または病態の１つ以上の症状、特徴、及び／または原因を、部分的にまたは完全に、軽減、寛解、緩和、阻害、発症遅延、重症度の低減、及び／または発生率の低減をすること）が実証されたレジメンによる治療の投与である。いくつかの実施形態では、１つ以上の症状の診断及び／または発症後に施す処置は「治療的」処置とみなされ、一方、診断及び／または症状の発症前に施す処置は「予防的」処置とみなされる。
単位用量：本明細書中で使用する場合、用語「単位用量」とは、医薬組成物の単回用量として及び／または物理的に別個の単位で投与する量を指す。多くの実施形態では、単位用量は所定量の活性薬剤を含む。いくつかの実施形態では、単位用量には、薬剤の単回用量の全体が含まれる。いくつかの実施形態では、全体の単回用量を達成するために、複数の単位用量を投与する。いくつかの実施形態では、意図する効果を達成するために、複数の単位用量の投与が必要であるか、または必要であることが予想される。単位用量は、例えば、所定量の１つ以上の治療薬を含む液体（例えば、許容される担体）の量、所定量の１つ以上の固体形態の治療薬、所定量の１つ以上の治療薬を含む徐放性の製剤または薬物送達装置などであってもよい。治療薬（複数可）に加えて様々な成分のいずれかを含む製剤中に単位用量が存在し得ることが理解されよう。以下に記載するように、例えば、許容される担体（例えば、薬学的に許容される担体）、希釈剤、安定剤、緩衝剤、防腐剤などを含ませてもよい。多くの実施形態では、特定の治療薬の適切な合計日用量に、一部または複数の単位用量を含ませてもよく、例えば担当医が健全な医学的判断の範囲内でそれを決定してもよいことは、当業者であれば理解するであろう。いくつかの実施形態では、任意の特定の被験体または生物に対する具体的な有効量レベルは、治療する障害及び障害の重症度；使用する特定の活性化合物の活性；使用する特定の組成物；被験体の年齢、体重、一般的な健康状態、性別及び食事；投与時間、及び使用する特定の活性化合物の排出速度；治療期間；使用する特定の化合物（複数可）と組み合わせてまたは同時に使用する薬物及び／または追加の療法、ならびに医学分野で周知の同様の要因を含む、様々な要因に依存し得る。
アルキル：本明細書中で使用する場合、用語「アルキル」とは、直鎖または分枝アルキル基を指す。例示的なＣ１－６アルキル基として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、及びヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。
ヘテロ原子：本明細書中で使用する場合、用語「ヘテロ原子」とは、酸素、硫黄、窒素、リン、またはケイ素（窒素、硫黄、リン、もしくはケイ素の任意の酸化形態；任意の塩基性窒素の四級化形態または；複素環の置換可能な窒素、例えばＮ（３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピロリルなど）、ＮＨ（ピロリジニルなど）もしくはＮＲ＋（Ｎ置換ピロリジニルなど）を含む）の１つ以上を含む。
炭素環式：本明細書中で使用する場合、用語「炭素環式」とは、完全に飽和しているか、または１つ以上の不飽和単位を含むが芳香族ではなく分子の残りの部分に単一の結合点を有する、単環式炭化水素を指す。
複素環式：本明細書中で使用する場合、用語「複素環式」とは、上記で定義したように、飽和または部分不飽和であり、炭素原子に加えて、１個以上、好ましくは１～４個のヘテロ原子を有する安定な単環式複素環部分を指す。複素環の環原子に関して使用する場合、用語「窒素」には置換窒素が含まれる。例として、酸素、硫黄、または窒素から選択される０～３個のヘテロ原子を含む飽和または部分不飽和環において、窒素は、Ｎ（３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピロリルなど）、ＮＨ（ピロリジニルなど）、または＋ＮＲ（Ｎ置換ピロリジニルなど）であってもよい。複素環式環を、任意のヘテロ原子または炭素原子においてそのペンダント基に結合することができ、それにより安定な構造がもたらされ、場合により、環原子のいずれかを置換することができる。３～８員複素環の例として、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピロリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、及びモルホリニルが挙げられる。
ハロゲン：本明細書中で使用する場合、用語「ハロゲン」及び「ハロ」とは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩを指す。
化合物Ｃ：本明細書中で使用する場合、用語「化合物Ｃ」とは、５’－メチルセレノアデノシンを指し；これは、（２Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－２－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－５－（（メチルセラニル）メチル）テトラヒドロフラン－３，４－ジオール、ＣＡＳ登録番号５１３５－４０－０としても知られており、その薬学的に許容される塩が含まれる。
化合物Ｄ：本明細書中で使用する場合、用語「化合物Ｄ」とは、５’－セレノアデノシルホモシステインを指し；これは、（２Ｒ）－２－アミノ－４－（（（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メチル）セラニル）ブタン酸、ＣＡＳ登録番号４０５３－９１－２としても知られており、その薬学的に許容される塩が含まれる。
化合物Ｅ：本明細書中で使用する場合、用語「化合物Ｅ」とは、γ－グルタミル－メチルセレノ－システインまたはγ－Ｌ－グルタミル－Ｓｅ－メチル－Ｌ－システインを指し；これは、Ｎ５－（１－カルボキシ－２－（メチルセラニル）エチル）－Ｌ－グルタミン、またはその薬学的に許容される塩としても知られる。
化合物ＣＤＥ：本明細書中で使用する場合、用語「化合物ＣＤＥ」とは、化合物Ｃ、化合物Ｄ、及び化合物Ｅの混合物、またはその薬学的に許容される塩を指す。
化合物
本開示は、単一化合物の処置後、糖尿病マウス、培養した肝細胞及び／または骨格筋細胞において、グルコースレベルを低下させ、耐糖能を向上させ、インスリン受容体機能及びその下流のシグナル伝達を回復または活性化し、グルコース取り込みのための細胞質小胞から細胞膜へのグルコース輸送体タンパク質（ＧＬＵＴ）移行のためのＡＳ１６０リン酸化を増強し、グルコース取り込みを刺激し、腎機能障害及び／または肝臓損傷を伴わずに高インスリン血症を軽減することができる多くの例示的な化合物を提供する。例えば、実施例２は、化合物４３、５０、５３、６９、及び７０のそれぞれがＨｅｐＧ２細胞のグルコース産生を低下させたことを示している。特に、化合物４３は化合物ＣＤＥよりも高い効力を示した。ＨｅｐＧ２及びラットＨ４ＩＩＥ細胞の抗糖尿病薬メトホルミンと比較した場合、化合物４３はより高い効力とより低い細胞毒性を示した。また、化合物＃４３は、糖尿病マウスの肝臓におけるＧ６ｐｃ（肝グルコース産生の重要な酵素遺伝子）の発現の阻害において化合物５０よりも強力であり、マウス肝臓ＡＭＬ－１２細胞において化合物ＣＤＥ、化合物Ｃ、化合物Ｄ及び化合物５０よりも強力であることも示した（実施例４）。さらに、本開示は、化合物４３が、糖尿病マウスの高血糖症に対して化合物Ｃ、化合物５０、化合物６９及び化合物７０よりも強力であること（実施例３）；化合物４３が耐糖能を有意に向上させ（実施例３）、インスリン抵抗性糖尿病Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓及び骨格筋におけるインスリン受容体機能及びその下流シグナル伝達を増強／回復すること（実施例５及び７～８）；ならびに、化合物４３が、野生型マウスの応答に類似した糖尿病マウスのグルコースチャレンジに対する応答を誘発すること（実施例３）を示す。さらに、本開示は、肝臓及び骨格筋細胞の両方でのグルコース取り込みについて、化合物＃４３処置がＡＳ１６０のリン酸化を促進し（細胞内小胞から細胞膜へのＧＬＵＴの移行を促進するために）（実施例８）、糖尿病マウスの肝臓及び培養マウス肝細胞においてＧＬＵＴ４発現を刺激し（実施例６）、肝細胞及び骨格筋細胞においてインスリン作用を促進及び／または増強してグルコース取り込みを刺激し（実施例６～７）、インスリン抵抗性糖尿病マウスにおいて腎機能障害及び／または肝臓損傷を伴わずに高インスリン血症を軽減する（実施例９）ことができることを示す。
本開示は、単一化合物の処置後、糖尿病マウス、培養した肝細胞及び／または骨格筋細胞において、グルコースレベルを低下させ、耐糖能を向上させ、インスリン受容体機能及びその下流のシグナル伝達を回復または活性化し、グルコース取り込みのための細胞質小胞から細胞膜へのグルコース輸送体タンパク質（ＧＬＵＴ）移行のためのＡＳ１６０リン酸化を増強し、グルコース取り込みを刺激し、腎機能障害及び／または肝臓損傷を伴わずに高インスリン血症を軽減することができる多くの例示的な化合物を提供する。例えば、実施例２は、化合物４３、５０、５３、６９、及び７０のそれぞれがＨｅｐＧ２細胞のグルコース産生を低下させたことを示している。特に、化合物４３は化合物ＣＤＥよりも高い効力を示した。ＨｅｐＧ２及びラットＨ４ＩＩＥ細胞の抗糖尿病薬メトホルミンと比較した場合、化合物４３はより高い効力とより低い細胞毒性を示した。また、化合物＃４３は、糖尿病マウスの肝臓におけるＧ６ｐｃ（肝グルコース産生の重要な酵素遺伝子）の発現の阻害において化合物５０よりも強力であり、マウス肝臓ＡＭＬ－１２細胞において化合物ＣＤＥ、化合物Ｃ、化合物Ｄ及び化合物５０よりも強力であることも示した（実施例４）。さらに、本開示は、化合物４３が、糖尿病マウスの高血糖症に対して化合物Ｃ、化合物５０、化合物６９及び化合物７０よりも強力であること（実施例３）；化合物４３が耐糖能を有意に向上させ（実施例３）、インスリン抵抗性糖尿病Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓及び骨格筋におけるインスリン受容体機能及びその下流シグナル伝達を増強／回復すること（実施例５及び７～８）；ならびに、化合物４３が、野生型マウスの応答に類似した糖尿病マウスのグルコースチャレンジに対する応答を誘発すること（実施例３）を示す。さらに、本開示は、肝臓及び骨格筋細胞の両方でのグルコース取り込みについて、化合物＃４３処置がＡＳ１６０のリン酸化を促進し（細胞内小胞から細胞膜へのＧＬＵＴの移行を促進するために）（実施例８）、糖尿病マウスの肝臓及び培養マウス肝細胞においてＧＬＵＴ４発現を刺激し（実施例６）、肝細胞及び骨格筋細胞においてインスリン作用を促進及び／または増強してグルコース取り込みを刺激し（実施例６～７）、インスリン抵抗性糖尿病マウスにおいて腎機能障害及び／または肝臓損傷を伴わずに高インスリン血症を軽減する（実施例９）ことができることを示す。
本開示はまた、その活性に寄与し得るセレン化合物の特徴も提供する。例えば、セレン化合物＃４３はグルコース産生の阻害において高い効力を有するが、その硫黄類似体化合物６８は効力が低いこと（実施例２）；ならびに化合物＃４３は、インスリン抵抗性糖尿病マウスの血糖値及びＨｂＡ１ｃレベルを低下させ、耐糖能を向上させる際に、化合物＃６８よりも強力であること（実施例３）が示された。また、２’及び３’位にジアセチルエステル（＃４３）、環状炭酸塩（化合物＃５０）、モルホリノカルボキシレート（＃５３）、ジプロパノイルエステル（＃６９）、またはジブタノイルエステル（＃７０）を含むセレン化合物の処置後にグルコース産生の阻害が観察され、化合物４３の処置後に最大の効力が観察されたことが示された（実施例２）。さらに、５’メチルセレノ基及び５’セレノホモシステイン基を含む化合物は、ＨｅｐＧ２細胞におけるグルコース産生の阻害において同様の効力を有することが示された（実施例２の化合物Ｃ対化合物Ｄ）。また、ｉｎ ｖｉｖｏ研究により、インスリン抵抗性糖尿病マウスの血糖値を低下させ、耐糖能を向上させる際に、化合物＃４３が化合物＃６９及び＃７０に比べてより強力であることを明らかにした（実施例３）。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（１）の化合物：
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体に関し、式中、
Ｒ２及びＲ３のそれぞれは、独立して、Ｈまたは－Ｃ（Ｏ）－Ｒであり、各Ｒは、独立して、Ｃ１－６アルキルまたは３～８員の炭素環式または複素環式であり、Ｒ２及びＲ３は、両方ともＨであってはならず；
あるいは、Ｒ２とＲ３は一緒になって－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｍ－を形成し、式中、ｎ及びｍのそれぞれは、独立して０～３であり、ｎ＋ｍ≦３であり；
Ｒ５は、－Ｃ１－６アルキルまたは－Ｃ１－６アルキル－ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨであり；
Ｒ８は、Ｈまたはハロゲンであり；ならびに
Ｘは、Ｈまたはハロゲンであり；
式中、炭素環、複素環、－（ＣＨ２）ｎ－、及び－（ＣＨ２）ｍ－部分のそれぞれは、独立して、場合により、－ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＣＮ、またはＣ１－６アルキルで１～３回置換されていてもよく；ならびに
各Ｃ１－６アルキル部分は、独立して、場合により、－ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、またはＣＮで１～３回置換されていてもよい。
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体に関し、式中、
Ｒ２及びＲ３のそれぞれは、独立して、Ｈまたは－Ｃ（Ｏ）－Ｒであり、各Ｒは、独立して、Ｃ１－６アルキルまたは３～８員の炭素環式または複素環式であり、Ｒ２及びＲ３は、両方ともＨであってはならず；
あるいは、Ｒ２とＲ３は一緒になって－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｍ－を形成し、式中、ｎ及びｍのそれぞれは、独立して０～３であり、ｎ＋ｍ≦３であり；
Ｒ５は、－Ｃ１－６アルキルまたは－Ｃ１－６アルキル－ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨであり；
Ｒ８は、Ｈまたはハロゲンであり；ならびに
Ｘは、Ｈまたはハロゲンであり；
式中、炭素環、複素環、－（ＣＨ２）ｎ－、及び－（ＣＨ２）ｍ－部分のそれぞれは、独立して、場合により、－ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＣＮ、またはＣ１－６アルキルで１～３回置換されていてもよく；ならびに
各Ｃ１－６アルキル部分は、独立して、場合により、－ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、またはＣＮで１～３回置換されていてもよい。
式（１）のいくつかの実施形態では、Ｒ８はＨである。式（１）のいくつかの実施形態では、式（１）のＲ８はハロゲンである。式（１）のいくつかの実施形態では、式（１）のＲ８はＦである。
式（１）のいくつかの実施形態では、ＸはＨである。式（１）のいくつかの実施形態では、Ｘはハロゲンである。式（１）のいくつかの実施形態では、ＸはＦである。
式（１）のいくつかの実施形態では、Ｒ５は－Ｃ１－６アルキルであり、これは、場合により、－ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、またはＣＮにより１～３回置換されていてもよい。式（１）のいくつかの実施形態では、Ｒ５は－Ｃ１－６アルキルであり、場合により、ハロゲンにより１～３回置換されていてもよい。式（１）のいくつかの実施形態では、Ｒ５は非置換－Ｃ１－６アルキルである。式（１）のいくつかの実施形態では、Ｒ５は非置換の直鎖－Ｃ１－６アルキルである。式（１）のいくつかの実施形態では、Ｒ５はメチルである。式（１）のいくつかの実施形態では、Ｒ５はエチルである。式（１）のいくつかの実施形態では、Ｒ５はプロピルである。
式（１）のいくつかの実施形態では、Ｒ５は－Ｃ１－６アルキル－ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨであり、式中、Ｃ１－６アルキルは、場合により、－ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、またはＣＮにより１～３回置換されていてもよい。式（１）のいくつかの実施形態では、Ｒ５は－Ｃ１－６アルキル－ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨであり、式中、Ｃ１－６アルキルは、場合により、ハロゲンにより１～３回置換されていてもよい。式（１）のいくつかの実施形態では、Ｒ５は－Ｃ１－６アルキル－ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨであり、式中、Ｃ１－６アルキルは非置換である。式（１）のいくつかの実施形態では、Ｒ５は－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨである。式（１）のいくつかの実施形態では、Ｒ５は－ＣＨ２－ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨである。式（１）のいくつかの実施形態では、Ｒ５は－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨである。
式（１）のいくつかの実施形態では、Ｒ２はＨであり、Ｒ３は－Ｃ（Ｏ）－Ｒであり、式中、Ｒは、Ｃ１－６アルキルまたは３～８員の炭素環式または複素環式であり、炭素環式部分及び複素環式部分のそれぞれは、独立して、場合により、－ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＣＮ、またはＣ１－６アルキルで１～３回置換されていてもよく；各Ｃ１－６アルキルは、独立して、場合により、－ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、またはＣＮで１～３回置換されていてもよい。
式（１）のいくつかの実施形態では、Ｒ３はＨであり、式（１）のＲ２は－Ｃ（Ｏ）－Ｒであり、式中、Ｒは、Ｃ１－６アルキルまたは３～８員の炭素環式または複素環式であり、炭素環式部分及び複素環式部分は、独立して、場合により、－ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＣＮ、またはＣ１－６アルキルで１～３回置換されていてもよく；各Ｃ１－６アルキルは、独立して、場合により、－ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、またはＣＮで１～３回置換されていてもよい。
式（１）のいくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３のそれぞれは、独立して、Ｃ（Ｏ）－Ｒであり、式中、各Ｒは、独立してＣ１－６アルキルまたは３～８員の炭素環式または複素環式であり、炭素環式部分及び複素環式部分のそれぞれは、独立して、場合により、－ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＣＮ、またはＣ１－６アルキルで１～３回置換されていてもよく；各Ｃ１－６アルキルは、独立して、場合により、－ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、またはＣＮで１～３回置換されていてもよい。
式（１）のいくつかの実施形態では、各Ｒは、独立して、３～８員の炭素環式または複素環式であり、炭素環式部分及び複素環式部分のそれぞれは、独立して、場合により、－ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＣＮ、またはＣ１－６アルキルにより１～３回置換されていてもよく；各Ｃ１－６アルキルは、独立して、場合により、－ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、またはＣＮで１～３回置換されていてもよい。式（１）のいくつかの実施形態では、各Ｒは、独立して、３～８員の炭素環式または複素環式であり、炭素環式部分及び複素環式部分のそれぞれは、独立して、場合により、ハロゲンで１～３回置換されていてもよい。式（１）のいくつかの実施形態では、各Ｒは、独立して、３～８員の炭素環式または複素環式であり、炭素環式部分及び複素環式部分のそれぞれは、独立して、場合により、ハロゲンで１～３回置換されていてもよい。式（１）のいくつかの実施形態では、各Ｒは、独立して、３～８員の非置換炭素環式または非置換複素環式である。式（１）のいくつかの実施形態では、各Ｒは、独立して、６員の非置換炭素環式または非置換複素環式である。式（１）のいくつかの実施形態では、各Ｒは、独立して非置換複素環である。式（１）のいくつかの実施形態では、Ｒは
である。
である。
式（１）のいくつかの実施形態では、各Ｒは、独立してＣ１－６アルキルであり、各Ｃ１－６アルキルは、独立して、場合により、－ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、またはＣＮにより１～３回置換されていてもよい。式（１）のいくつかの実施形態では、各Ｒは、独立してＣ１－６アルキルであり、各Ｃ１－６アルキルは、独立して、場合によりハロゲンにより１～３回置換されていてもよい。式（１）のいくつかの実施形態では、各Ｒは、独立して非置換Ｃ１－６アルキルである。式（１）のいくつかの実施形態では、各Ｒは、独立して非置換直鎖Ｃ１－６アルキルである。式（１）のいくつかの実施形態では、各Ｒは、独立して、メチル、エチル、またはプロピルである。式（１）のいくつかの実施形態では、ＲはＣＨ３である。
式（１）のいくつかの実施形態では、Ｒ２とＲ３は一緒になって－（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｍ－を形成し、式中、ｎ及びｍのそれぞれは、独立して０～３であり、ｎ＋ｍ≦３であり、－（ＣＨ２）ｎ－及び－（ＣＨ２）ｍ－部分のそれぞれは、独立して、場合により、－ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＣＮ、またはＣ１－６アルキルで１～３回置換されていてもよく；各Ｃ１－６アルキルは、独立して、場合により、－ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、またはＣＮで１～３回置換されていてもよい。式（１）のいくつかの実施形態では、－（ＣＨ２）ｎ－及び－（ＣＨ２）ｍ－部分のそれぞれは、独立して、場合によりハロゲンで１～３回置換されていてもよい。式（１）のいくつかの実施形態では、－（ＣＨ２）ｎ－及び－（ＣＨ２）ｍ－部分は非置換である。いくつかの実施形態では、ｎ＝ｍ＝０である。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（２）の化合物：
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体に関し、
式中、Ｒ８は、Ｈまたはハロゲンであり；
Ｘは、Ｈまたはハロゲンであり；
各Ｒ５’は、独立して、Ｈまたはハロゲンであり；ならびに
各Ｒは、独立してＣ１－６アルキルであり、そのそれぞれは、独立して、場合によりハロゲンで１～３回置換されていてもよい。
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体に関し、
式中、Ｒ８は、Ｈまたはハロゲンであり；
Ｘは、Ｈまたはハロゲンであり；
各Ｒ５’は、独立して、Ｈまたはハロゲンであり；ならびに
各Ｒは、独立してＣ１－６アルキルであり、そのそれぞれは、独立して、場合によりハロゲンで１～３回置換されていてもよい。
式（２）のいくつかの実施形態では、Ｃ（Ｒ５’）３は、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨ２Ｆ、またはＣＨ３である。
式（２）のいくつかの実施形態では、化合物は式（２’）の化合物である：
式（２）または（２’）のいくつかの実施形態では、Ｒ８はＨである。式（２）または（２’）のいくつかの実施形態では、Ｒ８はハロゲンである。式（２）または（２’）のいくつかの実施形態では、Ｒ８はＦである。
式（２）または（２’）のいくつかの実施形態では、ＸはＨである。式（２）または（２’）のいくつかの実施形態では、Ｘはハロゲンである。式（２）または（２’）のいくつかの実施形態では、ＸはＦである。
式（２）または（２’）のいくつかの実施形態では、Ｒは、それぞれ独立して非置換Ｃ１－６アルキルである。式（２）または（２’）のいくつかの実施形態では、Ｒは、それぞれ独立して、Ｃ１－３アルキルであり、そのそれぞれは、独立して、場合によりハロゲンにより１～３回置換されていてもよい。式（２）または（２’）のいくつかの実施形態では、Ｒは、それぞれ独立して、非置換Ｃ１－３アルキルである。式（２）または（２’）のいくつかの実施形態では、Ｒは、それぞれ独立して、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３である。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（３）の化合物：
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体に関し、
式中、Ｒ８は、Ｈまたはハロゲンであり；
Ｘは、Ｈまたはハロゲンであり；ならびに
各Ｒ’は、独立してＨまたはハロゲンである。
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体に関し、
式中、Ｒ８は、Ｈまたはハロゲンであり；
Ｘは、Ｈまたはハロゲンであり；ならびに
各Ｒ’は、独立してＨまたはハロゲンである。
式（３）のいくつかの実施形態では、－Ｓｅ－Ｃ（Ｒ’）３は、－Ｓｅ－ＣＨ３、－Ｓｅ－ＣＨＦ２、－Ｓｅ－ＣＨ２Ｆ、または－Ｓｅ－ＣＦ３である。
式（３）のいくつかの実施形態では、化合物は式（３’）の化合物である：
式（３）または（３’）のいくつかの実施形態では、Ｒ８はＨである。式（３）または（３’）のいくつかの実施形態では、Ｒ８はハロゲンである。式（３）または（３’）のいくつかの実施形態では、Ｒ８はＦである。
式（３）または（３’）のいくつかの実施形態では、ＸはＨである。式（３）または（３’）のいくつかの実施形態では、Ｘはハロゲンである。式（３）または（３’）のいくつかの実施形態では、ＸはＦである。
式（３）または（３’）のいくつかの実施形態では、各Ｃ（Ｒ’）３は、独立して、ＣＦ３、ＣＨＦ２、またはＣＨ２Ｆ、またはＣＨ３である。式（３）または（３’）のいくつかの実施形態では、各Ｃ（Ｒ’）３は、独立して、ＣＨ２ＦまたはＣＨ３である。式（３）または（３’）のいくつかの実施形態では、各Ｃ（Ｒ’）３は、ＣＨ３である。
いくつかの実施形態では、本開示は、式：
の化合物、
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体に関する。
の化合物、
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体に関する。
製剤
いくつかの実施形態では、本開示は、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくはその異性体を含み、及び／または送達する（すなわち、系または被験体への投与時に）組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、式（１）～（３）のいずれか１つの単一の化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体のみを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体、及び本開示による、ヒトまたは動物被験体への投与に適した１つ以上の担体または賦形剤を含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくはその異性体を含み、及び／または送達する（すなわち、系または被験体への投与時に）組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、式（１）～（３）のいずれか１つの単一の化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体のみを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体、及び本開示による、ヒトまたは動物被験体への投与に適した１つ以上の担体または賦形剤を含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物の活性部分を送達する組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物の活性代謝物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、前記組成物の投与時に式（１）～（３）のいずれかの化合物の代謝産物を形成する化合物を含み、その代謝産物は関連する生物活性を維持している。
いくつかの実施形態では、本開示は、活性医薬成分（ＡＰＩ）及び１つ以上の薬学的に許容される担体または賦形剤を含むという点で医薬組成物である組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＰＩは、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＡＰＩは、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物からなる。いくつかの実施形態では、ＡＰＩは、式（１）～（３）のいずれか１つの単一化合物からなる。
いくつかの実施形態では、本開示は、例えば、１つ以上の適切な（すなわち、薬学的に許容される）担体または賦形剤を式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体と組み合わせることによる、提供する組成物の製造方法を提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の薬学的に許容される担体または賦形剤は経口投与に適しており、混合物を経口製剤に製剤化する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は固体剤形である。いくつかの実施形態では、固体剤形は、錠剤、カプセル剤、またはロゼンジである。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、液体剤形（例えば、飲料）である。
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）は、医薬組成物の製剤化に使用する様々な担体及びその調製のための公知の技術を開示している。いくつかの実施形態では、本開示は、薬学的に許容される量の本明細書に記載の化合物を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、単一剤形を生成するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、治療する宿主、及び／または特定の投与様式に応じて異なり得る。単一の剤形を生成するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、通常、治療効果を生成する化合物の量となる。一般的に、この量は、有効成分の約１％～約９９％、約５％～約７０％、または約１０％～約３０％の範囲である。
いくつかの実施形態では、湿潤剤、乳化剤、及び潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味料、香味料及び芳香剤、防腐剤及び抗酸化剤も、組成物中に存在させてよい。
薬学的に許容される抗酸化剤の例として：水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α－トコフェロールなど；及び金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明の製剤には、経口、経鼻、局所（頬及び舌下を含む）、直腸内、膣内及び／または非経口投与に適した製剤が含まれる。いくつかの実施形態では、製剤を、単位剤形で簡便に提示してもよく、薬学の技術分野で周知の任意の方法によって調製してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の製剤は、シクロデキストリン、リポソーム、ミセル形成剤、例えば胆汁酸、ならびにポリマー担体、例えばポリエステル及びポリ無水物からなる群から選択される賦形剤；ならびに本明細書に記載の化合物を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の製剤は、本明細書に記載の化合物を、経口で生体利用可能にする。
いくつかの実施形態では、そのような製剤の調製方法は、本明細書に記載の化合物を、１つ以上の薬学的に許容される担体または賦形剤、及び場合により１つ以上の補助成分と会合させる工程を含み得る。いくつかの実施形態では、製剤は、本明細書に記載の化合物を、液体担体、もしくは微粉化固体担体、またはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで必要に応じて製品を成形することにより調製する。
いくつかの実施形態では、経口投与に適した本明細書に記載の製剤は、それぞれ有効成分として所定量の本明細書に記載の化合物を含む、カプセル、カシェ、丸薬、錠剤、ロゼンジ（フレーバーベース、通常、スクロース及びアカシアまたはトラガカントを使用）、散剤、顆粒の形態、または水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油型もしくは油中水型液体エマルジョンとして、またはエリキシル剤またはシロップ剤として、またはトローチとして（ゼラチン及びグリセリン、またはスクロース及びアカシアなどの不活性基剤を使用して）及び／または口内洗浄剤、飲料などとしてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物を、代替的または追加的に、ボーラス、舐剤またはペーストとして投与してもよい。
いくつかの実施形態では、経口投与用の本明細書に記載の固体剤形（カプセル、錠剤、丸薬、糖衣錠、散剤、顆粒など）では、有効成分を、ナトリウムなどの１つ以上の薬学的に許容される担体、例えば、クエン酸塩またはリン酸二カルシウム、及び／または以下のいずれかと混合する：充填剤または増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び／またはケイ酸；結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び／またはアカシア；保湿剤、例えばグリセロール；崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム；溶解遅延剤、例えば、パラフィン；吸収促進剤、例えば、四級アンモニウム化合物；湿潤剤、例えば、セチルアルコール、グリセロールモノステアレート、及び非イオン性界面活性剤；吸収剤、例えば、カオリン及びベントナイト粘土；潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びそれらの混合物；ならびに着色剤。いくつかの実施形態では、カプセル、錠剤、及び丸薬の場合、医薬組成物は緩衝剤も含み得る。また、いくつかの実施形態では、同様のタイプの固体組成物を、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの担体を使用して、軟質及び硬質ゼラチンカプセルにおいて充填剤として使用してもよい。
いくつかの実施形態では、錠剤を、場合により１つ以上の補助成分とともに、圧縮または成形によって作製してもよい。いくつかの実施形態では、圧縮錠剤を、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤を使用して調製してもよい。いくつかの実施形態では、成形錠剤を、粉末化合物の混合物を不活性液体希釈剤で湿らせる適切な機械において作製してもよい。
いくつかの実施形態では、錠剤、及び本明細書に記載の医薬組成物の他の固体剤形、例えば、糖衣錠、カプセル、丸薬及び顆粒は、場合により、コーティング及びシェル、例えば、腸溶コーティング及び医薬製剤分野で周知の他のコーティングで刻み目を付けるかまたは調製してもよい。いくつかの実施形態では、それらを、例えば、所望の放出特性を提供するようにヒドロキシプロピルメチルセルロースを様々な割合で、他のポリマーマトリックス、リポソーム及び／またはミクロスフェアを使用して、内部の有効成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化してもよい。いくつかの実施形態では、それらを、急速放出用に、例えば凍結乾燥により製剤化してもよい。いくつかの実施形態では、それらを、例えば、細菌保持フィルターによる濾過により、または滅菌水に溶解可能な滅菌固体組成物の形態の滅菌剤、もしくは使用直前に他の滅菌注射用媒体を組み込むことにより滅菌してもよい。いくつかの実施形態では、これらの組成物に場合により乳白剤を含ませてもよく、これらの組成物は、有効成分（複数可）を、胃腸管の特定の部分でのみ、またはそこにおいて優先的に、場合により遅延様式で放出する組成物であってもよい。使用できる包埋組成物の例として、高分子物質及びワックスが挙げられる。いくつかの実施形態では、有効成分は、適切な場合、上記の賦形剤の１つ以上を有するマイクロカプセル化形態であってもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物の経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシル剤が含まれる。いくつかの実施形態では、有効成分に加えて、液体剤形は、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油（特に、綿実、落花生、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物を含み得る。
いくつかの実施形態では、不活性希釈剤に加えて、経口組成物に、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味料、香味料、着色剤、芳香剤ならびに防腐剤などのアジュバントを含ませることができる。
いくつかの実施形態では、活性化合物に加えて、懸濁液には、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカントなどの懸濁剤、ならびにそれらの混合物を含ませてもよい。
いくつかの実施形態では、直腸内または膣内投与用の本明細書に記載の製剤を坐薬として提示してもよく、本明細書に記載の１つ以上の化合物を、１つ以上の適切な非刺激性賦形剤または担体、例えば、カカオバター、ポリエチレングリコール、坐薬ワックスまたはサリチル酸塩と混合することによりこれを調製してもよく、この坐薬は、室温で固体であるが、体温では液体であり、それゆえに、直腸または膣腔内で溶けて活性化合物を放出する。
いくつかの実施形態では、膣内投与に適した本明細書に記載の製剤には、適切であることが当技術分野で知られている担体を含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレー製剤が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物の局所または経皮投与用の剤形には、散剤、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤が含まれる。いくつかの実施形態では、活性化合物を、無菌条件下で、薬学的に許容される担体、及び必要とされ得る保存剤、緩衝液、または噴射剤と混合してもよい。
いくつかの実施形態では、軟膏、ペースト、クリーム、及びゲルは、本明細書に記載の化合物に加えて、賦形剤、例えば、動物性及び植物性脂肪、油類、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛、またはそれらの混合物を含み得る。
いくつかの実施形態では、散剤及びスプレーに、本明細書に記載の化合物に加えて、賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を含ませることができる。いくつかの実施形態では、スプレーに、慣習的な噴射剤、例えば、クロロフルオロ炭化水素、ならびに揮発性非置換炭化水素、例えば、ブタン及びプロパンをさらに含ませることができる。
いくつかの実施形態では、経皮パッチは、本明細書に記載の化合物の身体への制御された送達を提供するという追加の利点を有する。いくつかの実施形態では、化合物を適切な媒体に溶解または分散させることにより、そのような剤形を作ることができる。いくつかの実施形態では、吸収促進剤を使用して、皮膚を通過する化合物のフラックスを増加させることができる。いくつかの実施形態では、速度制御膜を提供するか、化合物をポリマーマトリックスまたはゲルに分散させることにより、そのようなフラックスの速度を制御することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、眼科用製剤、眼軟膏、散剤、溶液などを提供する。
いくつかの実施形態では、非経口投与に適した本明細書に記載の医薬組成物は、本明細書に記載の１つ以上の化合物と、１つ以上の薬学的に許容される無菌の等張水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液またはエマルジョン、または無菌粉末とを組み合わせて含み、これを、使用直前に滅菌注射用溶液または分散液に再構成してもよく、これには、目的のレシピエントの血液または懸濁剤または増粘剤の存在下で、製剤を等張にする糖、アルコール、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、溶質が含まれ得る。
本明細書に記載の医薬組成物に使用し得る適切な水性及び非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物性油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。いくつかの実施形態では、例えば、レシチンなどのコーティング物質の使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物に、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤などのアジュバントを含ませてもよい。いくつかの実施形態では、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの様々な抗菌剤及び抗真菌剤を含めることにより、対象化合物に対する微生物の作用の予防を確保し得る。いくつかの実施形態では、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を含めることにより、注射可能な医薬形態の長期吸収をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、例えば、薬物の効果を長引かせるために、皮下または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅延させることが望ましい。いくつかの実施形態では、これは、水への溶解度が低い結晶性または非晶質物質の液体懸濁液の使用により達成され得る。いくつかの実施形態では、薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、溶解速度は結晶サイズ及び結晶形態に依存し得る。いくつかの実施形態では、非経口投与する薬物形態の遅延吸収は、薬物を油性ビヒクルに溶解または懸濁することにより達成される。
いくつかの実施形態では、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に対象化合物のマイクロカプセルマトリックスを形成することにより、注射可能なデポー形態を作製する。いくつかの実施形態では、薬物とポリマーの比、及び使用する特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例として、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。いくつかの実施形態では、体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬物を閉じ込めることにより、デポー注射製剤を調製する。
いくつかの実施形態では、薬物溶出形態には、コーティングまたは薬物添加ステント及び埋込装置が含まれる。いくつかの実施形態では、薬物溶出ステント及び他の装置に、化合物または医薬製剤をコーティングしてもよく、さらに徐放用に設計されたポリマーを含めてもよい。
いくつかの実施形態では、化合物または医薬製剤を経口投与する。いくつかの実施形態では、化合物または医薬製剤を静脈内投与する。いくつかの実施形態では、化合物を、切断可能なリンカーを介して、カテーテルとともに投与する固体支持体に付着させる。いくつかの実施形態では、投与経路には、舌下、筋肉内、及び経皮投与が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物を、医薬品としてヒト及び動物に投与し、それらは、それ自体で、または例えば０．１％～９９．５％、もしくは０．５％～９０％の有効成分を含む医薬組成物として薬学的に許容される担体と組み合わせて、投与することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物を、経口、非経口、局所、または直腸内投与してもよい。いくつかの実施形態では、それらを、当然ながら各投与経路に適した形で与える。いくつかの実施形態では、それらを、注射、吸入、目薬、軟膏、坐薬などにより錠剤またはカプセルの形態で、注射、注入または吸入による投与で；ローションまたは軟膏により局所に；及び坐薬により直腸内に投与する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物を、例えばエアロゾル、スプレーによって経口、経鼻で、散剤、軟膏または点滴によって直腸内、膣内、非経口、大槽内及び局所的に、ならびに頬側及び舌下を含む、任意の適切な投与経路による治療のために、ヒト及び他の動物に投与してもよい。
いくつかの実施形態では、適切な水和形態で使用し得る本明細書に記載の化合物、及び／または本明細書に記載の医薬組成物を、当業者に公知の従来の方法により薬学的に許容可能な剤形に製剤化する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物中の有効成分の実際の用量レベルは、患者に毒性を与えずに、特定の患者、組成物、及び投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効な量の有効成分を得るために、様々に異なっていてもよい。
いくつかの実施形態では、選択する用量レベルは、本明細書に記載の特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、使用する特定の化合物の排出速度または代謝速度、治療期間、使用する特定の化合物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物及び／または物質、治療中の患者の年齢、性別、体重、病態、健康全般及び以前の病歴、ならびに医学分野で周知の類似の要因、を含む様々な要因に依存する。
当技術分野の通常の技術を有する医師または獣医であれば、必要な医薬組成物の有効量を決定及び処方することができる。いくつかの実施形態では、医師または獣医は、医薬組成物中の本明細書に記載の化合物の投与を、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルで開始し、次いで所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物または医薬組成物を、被験体に慢性的に提供する。いくつかの実施形態では、慢性処置には、１か月以上、１か月～１年、１年以上、またはそれ以上の繰り返し投与など、長期間にわたる任意の形態の繰り返し投与が含まれる。いくつかの実施形態では、慢性処置には、本明細書に記載の化合物または医薬組成物を、被験体の生涯にわたって繰り返し投与することが含まれる。いくつかの実施形態では、慢性処置には、例えば、１日１回以上、１週間に１回以上、または１か月に１回以上の定期的な投与が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物の日用量などの適切な用量は、治療効果を生じさせるのに有効な最低用量となる化合物の量である。そのような有効量は一般的に、本明細書に記載の要因に依存する。いくつかの実施形態では、患者に対する本明細書に記載の化合物の用量は、示す効果のために使用する場合、１日あたり体重１ｋｇあたり約０．０００１～約１００ｍｇの範囲である。いくつかの実施形態では、日用量は、体重１ｋｇあたり化合物０．００１～５０ｍｇの範囲である。いくつかの実施形態では、日用量は、体重１ｋｇあたり化合物０．０１～１０ｍｇの範囲である。しかしながら、より低いまたはより高い用量を使用することができる。いくつかの実施形態では、年齢、疾患の進行、体重、または他の要因によって被験体の生理機能が変化するにつれて、被験体に投与する用量を修正してもよい。
いくつかの実施形態では、活性化合物の有効な日用量を、１日の間に、場合により単位投与形態で、適切な間隔で別々に投与する、２、３、４、５、６回、またはそれ以上の部分用量として投与してもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物を単独で投与する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物を、本明細書に記載の医薬製剤（組成物）として投与する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物を、他の医薬品と同様に、ヒトまたは獣医学で使用するための任意の簡便な方法で投与するために製剤化してもよい。
化合物及び／または組成物の調製
いくつかの実施形態では、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を、全体的または部分的に化学合成により調製してもよく；いくつかの実施形態では、部分的に化学合成によって調製する式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を、半合成的方法を用いて調製する。いくつかの実施形態では、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を、単離により調製してもよい。
いくつかの実施形態では、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を、全体的または部分的に化学合成により調製してもよく；いくつかの実施形態では、部分的に化学合成によって調製する式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を、半合成的方法を用いて調製する。いくつかの実施形態では、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を、単離により調製してもよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の試料をアッセイして、例えば試料中の生物活性を検出することを含む、本明細書に記載の化合物及び／または組成物の調製方法を提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の試料は、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を含む。いくつかの実施形態では、本明細書において提供する方法は、１つ以上の試料中の検出可能な生物活性の存在を検出及び／または確認する工程を含む。いくつかの実施形態では、本明細書において提供する方法は、１つ以上の試料に検出可能な生物活性が存在しないことを確認する工程を含む。
いくつかの実施形態では、生物活性はグルコース産生の阻害である。いくつかの実施形態では、生物活性をＨｅｐＧ２細胞で試験する。いくつかの実施形態では、生物活性をＨ４ＩＩＥ細胞で試験する。
いくつかの実施形態では、生物活性は、血清ＨｂＡ１ｃレベルの低下である。いくつかの実施形態では、生物活性を、インスリン抵抗性糖尿病マウスで試験する。
いくつかの実施形態では、生物活性は耐糖能の増強である。いくつかの実施形態では、生物活性を、インスリン抵抗性糖尿病マウスで試験する。
いくつかの実施形態では、生物活性はＧ６ｐｃ発現の阻害である。いくつかの実施形態では、生物活性を、ＡＭＬ－１２細胞で試験する。いくつかの実施形態では、生物活性を、糖尿病刺激で刺激したＡＭＬ－１２細胞で試験する。いくつかの実施形態では、生物活性を、ヒトＨｅｐＧ２細胞で試験する。いくつかの実施形態では、生物活性を、インスリン抵抗性糖尿病マウスの肝臓で試験する。
いくつかの実施形態では、生物活性は、Ｐｄｋ１、Ａｋｔ、Ｆｏｘｏ１及びＡＳ１６０のリン酸化の増強である。いくつかの実施形態では、生物活性を肝臓で試験する。いくつかの実施形態では、生物活性を骨格筋で試験する。
いくつかの実施形態では、生物活性はＧｌｕｔ４発現の増強である。いくつかの実施形態では、生物活性を、マウス肝臓ＡＭＬ－１２細胞で試験する。いくつかの実施形態では、生物活性を、インスリン抵抗性糖尿病マウスの肝臓で試験する。
いくつかの実施形態では、生物活性は、インスリン抵抗性状態の被験体におけるインスリンシグナル伝達の活性化及び／または回復である。いくつかの実施形態では、被験体は、有意なレベルの循環インスリンを特徴とする。いくつかの実施形態では、インスリン抵抗性状態は、被験体におけるリン酸化インスリン受容体のレベル及び／または活性の低下を特徴とする。いくつかの実施形態では、被験体は、糖尿病、及び／または糖尿病関連の疾患、障害、または病態を有する。
いくつかの実施形態では、生物活性はグルコース取り込みの増強である。いくつかの実施形態では、細胞は肝細胞及び骨格筋細胞である。いくつかの実施形態では、生物活性は血清インスリンレベルの低下である。いくつかの実施形態では、生物活性を、インスリン抵抗性糖尿病マウスで試験する。
化合物及び／または組成物の同定及び／または特徴決定
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の化合物及び／または組成物の同定及び／または特徴決定の方法を提供する。いくつかの実施形態では、そのような方法は、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体をそれぞれ含む複数の試料を、その試料中の生物活性について試験し；及び、１つ以上のそのような試料中の前記生物活性の存在及び／またはレベルを決定する工程を含む。いくつかの実施形態では、提供する方法は、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体の存在及び／またはレベルに関連する前記生物活性を検出することを含む。いくつかの実施形態では、提供する方法は、式（１）～（３）のいずれか１つの特定の化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を、その化合物の前記生物活性を検出することにより、同定及び／または特徴決定する工程を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の化合物及び／または組成物の同定及び／または特徴決定の方法を提供する。いくつかの実施形態では、そのような方法は、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体をそれぞれ含む複数の試料を、その試料中の生物活性について試験し；及び、１つ以上のそのような試料中の前記生物活性の存在及び／またはレベルを決定する工程を含む。いくつかの実施形態では、提供する方法は、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体の存在及び／またはレベルに関連する前記生物活性を検出することを含む。いくつかの実施形態では、提供する方法は、式（１）～（３）のいずれか１つの特定の化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を、その化合物の前記生物活性を検出することにより、同定及び／または特徴決定する工程を含む。
いくつかの実施形態では、生物活性はグルコース産生の阻害である。いくつかの実施形態では、生物活性をＨｅｐＧ２細胞で試験する。いくつかの実施形態では、生物活性をＨ４ＩＩＥ細胞で試験する。
いくつかの実施形態では、生物活性は、血清ＨｂＡ１ｃレベルの低下である。いくつかの実施形態では、生物活性を、インスリン抵抗性糖尿病マウスで試験する。
いくつかの実施形態では、生物活性は耐糖能の向上である。いくつかの実施形態では、生物活性を、インスリン抵抗性糖尿病マウスで試験する。
いくつかの実施形態では、生物活性はＧ６ｐｃ発現の阻害である。いくつかの実施形態では、生物活性を、ＡＭＬ－１２細胞で試験する。いくつかの実施形態では、生物活性を、糖尿病刺激で刺激したＡＭＬ－１２細胞で試験する。いくつかの実施形態では、生物活性をヒトＨｅｐＧ２細胞で試験する。いくつかの実施形態では、生物活性を、インスリン抵抗性糖尿病マウスの肝臓で試験する。
いくつかの実施形態では、生物活性は、Ｐｄｋ１、Ａｋｔ、Ｆｏｘｏ１、及びＡＳ１６０のリン酸化の増強である。いくつかの実施形態では、生物活性を、肝臓で試験する。いくつかの実施形態では、生物活性を、骨格筋で試験する。
いくつかの実施形態では、生物活性はＧｌｕｔ４発現の増強である。いくつかの実施形態では、生物活性を、マウス肝臓ＡＭＬ－１２細胞で試験する。いくつかの実施形態では、生物活性を、インスリン抵抗性糖尿病マウスの肝臓で試験する。
いくつかの実施形態では、生物活性は、インスリン抵抗性状態の被験体におけるインスリンシグナル伝達の活性化及び／または回復である。いくつかの実施形態では、被験体は、有意なレベルの循環インスリンを特徴とする。いくつかの実施形態では、インスリン抵抗性状態は、被験体におけるリン酸化インスリン受容体のレベル及び／または活性の低下を特徴とする。いくつかの実施形態では、被験体は、糖尿病、及び／または糖尿病関連の疾患、障害、または病態を有する。
いくつかの実施形態では、生物活性は、被験体の細胞へのグルコース取り込みの増強である。いくつかの実施形態では、生物活性は、肝細胞及び骨格筋細胞へのグルコース取り込みの増強である。いくつかの実施形態では、生物活性は、血清インスリンレベルの低下である。いくつかの実施形態では、生物活性を、インスリン抵抗性糖尿病マウスで試験する。
使用
本開示は、本明細書に記載の化合物、例えば化合物４３が、インスリンを模倣して、グルコース産生を阻害し（例えば、実施例２参照）；インスリン抵抗性糖尿病の被験体の血糖値及びＨｂＡ１ｃレベルを低下させ、高血糖症の発症を軽減し、耐糖能を向上させ（例えば、実施例３参照）；インスリン抵抗性糖尿病の被験体の肝臓でのＧ６ｐｃ発現を抑制し、インスリンを模倣するが迂回して、培養マウス及びヒト肝細胞でのＧ６ｐｃ発現を抑制し、インスリン作用を増強し（例えば、実施例４参照）；インスリンを模倣するが迂回して、Ｐｄｋ１及びＡｋｔを活性化し、肝臓でのＦｏｘｏ１のリン酸化を増強し（例えば、実施例５参照）；インスリン抵抗性糖尿病の被験体の肝臓でのＧｌｕｔ４発現を増強し、インスリンを模倣するが迂回して、マウス肝細胞でのＧｌｕｔ４発現を増強し（例えば、実施例６参照）、ヒト肝細胞でのＡＳ１６０のリン酸化（グルコース取り込みを増強するための、細胞質小胞から細胞膜へのＧＬＵＴ４輸送への重要な事象）（例えば、実施例８参照）、及びマウス肝細胞でのグルコース取り込み（例えば、実施例６参照）；インスリン抵抗性糖尿病の被験体の骨格筋のインスリンシグナル伝達Ｐｄｋ１／Ａｋｔ／Ｆｏｘｏ１を増強及び／または回復させ（例えば、実施例７参照）、インスリンを模倣するが迂回して、Ａｋｔを活性化し、骨格筋細胞でのＡＳ１６０のリン酸化を増強し（細胞質小胞から細胞膜へのＧＬＵＴ４輸送への重要な事象）（例えば、実施例８参照）、及びインスリン作用を増強して骨格筋細胞でのグルコース取り込みを刺激し（例えば、実施例７参照）；インスリン抵抗性糖尿病の被験体の骨格筋及び肝臓、ならびに培養マウス骨格筋細胞及びヒト肝細胞のインスリン受容体（Ｉｎｓｒ）機能を活性化及び／または回復させ（例えば、実施例８参照）；ならびに腎機能を損なうことなく、及び／または肝臓損傷を引き起こすことなく、高インスリン血症を軽減する（実施例９）ことができることを提供する。したがって、本開示は、本明細書に記載の化合物が、グルコース代謝を調節し、本明細書に記載のインスリン関連障害を治療することに有用であることを明確に示す。
本開示は、本明細書に記載の化合物、例えば化合物４３が、インスリンを模倣して、グルコース産生を阻害し（例えば、実施例２参照）；インスリン抵抗性糖尿病の被験体の血糖値及びＨｂＡ１ｃレベルを低下させ、高血糖症の発症を軽減し、耐糖能を向上させ（例えば、実施例３参照）；インスリン抵抗性糖尿病の被験体の肝臓でのＧ６ｐｃ発現を抑制し、インスリンを模倣するが迂回して、培養マウス及びヒト肝細胞でのＧ６ｐｃ発現を抑制し、インスリン作用を増強し（例えば、実施例４参照）；インスリンを模倣するが迂回して、Ｐｄｋ１及びＡｋｔを活性化し、肝臓でのＦｏｘｏ１のリン酸化を増強し（例えば、実施例５参照）；インスリン抵抗性糖尿病の被験体の肝臓でのＧｌｕｔ４発現を増強し、インスリンを模倣するが迂回して、マウス肝細胞でのＧｌｕｔ４発現を増強し（例えば、実施例６参照）、ヒト肝細胞でのＡＳ１６０のリン酸化（グルコース取り込みを増強するための、細胞質小胞から細胞膜へのＧＬＵＴ４輸送への重要な事象）（例えば、実施例８参照）、及びマウス肝細胞でのグルコース取り込み（例えば、実施例６参照）；インスリン抵抗性糖尿病の被験体の骨格筋のインスリンシグナル伝達Ｐｄｋ１／Ａｋｔ／Ｆｏｘｏ１を増強及び／または回復させ（例えば、実施例７参照）、インスリンを模倣するが迂回して、Ａｋｔを活性化し、骨格筋細胞でのＡＳ１６０のリン酸化を増強し（細胞質小胞から細胞膜へのＧＬＵＴ４輸送への重要な事象）（例えば、実施例８参照）、及びインスリン作用を増強して骨格筋細胞でのグルコース取り込みを刺激し（例えば、実施例７参照）；インスリン抵抗性糖尿病の被験体の骨格筋及び肝臓、ならびに培養マウス骨格筋細胞及びヒト肝細胞のインスリン受容体（Ｉｎｓｒ）機能を活性化及び／または回復させ（例えば、実施例８参照）；ならびに腎機能を損なうことなく、及び／または肝臓損傷を引き起こすことなく、高インスリン血症を軽減する（実施例９）ことができることを提供する。したがって、本開示は、本明細書に記載の化合物が、グルコース代謝を調節し、本明細書に記載のインスリン関連障害を治療することに有用であることを明確に示す。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、グルコース代謝の調節方法及び／またはグルコース代謝障害の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、グルコース代謝障害は、正常範囲内にない血糖値を伴う。いくつかの実施形態では、グルコース代謝障害は、グルコースの取り込み及び／または輸送の欠陥に関連する。いくつかの実施形態では、グルコース代謝障害は、真性糖尿病、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、糖尿症、高血糖症、高インスリン症、または低血糖症である。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、グルコース輸送障害の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、グルコース輸送障害は、グルコース－ガラクトース吸収不良症、ファンコニー－ビッケル症候群、またはＤｅ Ｖｉｖｏ病（ＧＬＵＴ１欠損症候群（ＧＬＵＴ１ＤＳ））である。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、グルコース取り込みのための細胞質小胞から細胞膜へのグルコース輸送体タンパク質（ＧＬＵＴ）移行のためのＡＳ１６０リン酸化の増強方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、肝臓及び骨格筋の両方におけるグルコース取り込みの増強方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、インスリン関連障害の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、インスリン関連障害は、糖尿病前症、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、低血糖症、高血糖症、インスリン抵抗性、分泌機能不全、膵臓β細胞機能の喪失、及び膵臓β細胞の喪失からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、インスリン関連障害の患者は、インスリン関連障害を有するインスリン非依存患者である。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、インスリン抵抗性障害の治療方法を提供する。インスリン抵抗性障害の特定の例は上記に記載されている。いくつかの実施形態では、提供する方法は、ＩＩ型糖尿病、高インスリン血症、高プロインスリン血症、網膜症、神経障害、または腎障害を治療するための方法である。いくつかの実施形態では、提供する方法は、腎機能を損なうことなく、及び／または肝臓損傷をもたらすことなく、高インスリン血症を軽減する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、肥満の治療方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、糖尿病の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、糖尿病はＩ型糖尿病である。いくつかの実施形態では、糖尿病はＩＩ型糖尿病である。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、高血糖症の治療方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、グルコース産生の阻害方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、血清ＨｂＡ１ｃレベルの低下方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、耐糖能の増加方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、Ｇ６ｐｃ発現の抑制方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、肝臓及び／または骨格筋におけるＰｄｋ１、Ａｋｔ、及びＦｏｘｏ１のリン酸化の増強方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、Ｇｌｕｔ４発現の増加方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、インスリン抵抗性状態の被験体におけるインスリンシグナル伝達の活性化及び／または回復方法を提供する。いくつかの実施形態では、被験体は、有意なレベルの循環インスリンを特徴とする。いくつかの実施形態では、インスリン抵抗性状態は、被験体におけるリン酸化インスリン受容体のレベル及び／または活性の低下を特徴とする。いくつかの実施形態では、被験体は、糖尿病、及び／または糖尿病関連疾患、障害、または病態を有する。いくつかの実施形態では、被験体はＩＩ型糖尿病を患っている。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、被験体の細胞へのグルコース取り込みの増強方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は骨格筋細胞である。
化合物＃４３は、インスリンを模倣するが迂回して、肝臓及び骨格筋のインスリン受容体シグナル伝達を活性化し、インスリン抵抗性糖尿病の被験体においてもインスリン受容体機能を回復させることができることが示されている。これらの所見は、化合物＃４３が多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋肉減少症などのインスリンシグナル伝達の欠陥を特徴とする疾患または症候群の治療に使用することができることを示唆している。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）の治療方法を提供する。ＰＣＯＳはホルモンの不均衡であり、不規則な期間、望ましくない発毛、ざ瘡を引き起こす可能性がある。ＰＣＯＳを患っている若い女性では、インスリンレベルが上昇していることが多く、これにより卵巣がより多くのアンドロゲンホルモンを産生し、不規則な期間またはわずかな期間、体毛、ざ瘡が増加する。ＰＣＯＳを患うと、インスリン抵抗性及び２型糖尿病の発症を引き起こし得る。メトホルミンは、インスリン感受性を改善し、２型糖尿病の発症を予防するために、ＰＣＯＳを患っている女性に処方されることが多い薬剤である。結果は、化合物＃４３が培養肝細胞のグルコース産生の阻害においてメトホルミンよりも強力であり、インスリン抵抗性糖尿病マウスのインスリン受容体機能を回復させることができることを示している。したがって、化合物＃４３はＰＣＯＳの治療に潜在的に有用であり得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、アルツハイマー病（ＡＤ）の治療方法を提供する。脳のインスリンシグナル伝達は学習と記憶に重要であり、脳のインスリン抵抗性はＡＤの主要な危険因子である。インスリンシグナル伝達の回復は、ＡＤの潜在的な治療法として注目されている（Ｗｈｉｔｅ ＭＦ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３；３０２：１７１０－１；Ｄｅ Ｆｅｌｉｃｅ ＤＧ ｅｔ ａｌ，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＆ Ｄｅｍｅｎｔｉａ ２０１４；１０：Ｓ２６－Ｓ３２）。化合物＃４３がインスリン様活性を示し、インスリン抵抗性の被験体のインスリン受容体機能を回復させることができたことを示す上記の結果を考慮すると、化合物＃４３はＡＤの治療に潜在的に有用であり得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、筋肉減少症の治療方法を提供する。筋肉減少症は、年齢の増加に伴う骨格筋量の進行性の喪失を特徴とし、筋力の低下、可動性及び機能の低下、疲労の増加、転倒に関連する傷害のリスクの増加、そして多くの場合虚弱（Ｃａｎｄｏｗ ａｎｄ Ｃｈｉｌｉｂｅｃｋ，２００５；Ｓａｋｕｍａ ａｎｄ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，２０１２）をもたらす。筋肉生物学の最近の進歩により、インスリンシグナル伝達（Ｉｎｓｒ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ）が筋肉タンパク質の合成、及び筋肉タンパク質分解の阻害（Ａｋｔ／Ｆｏｘｏ１を介した２つの萎縮症遺伝子Ｆｂｘｏ３２及びＴｒｉｍ６３の発現の阻害を介して）に重要であることが明らかとなっている。最適なインスリンシグナル伝達は、筋肉減少症を含む筋消耗プロセスを軽減する（Ｇｌａｓｓ ａｎｄ Ｒｏｕｂｅｎｏｆｆ，２０１０；Ｒｙａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｓａｋｕｍａ ａｎｄ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，２０１２）。そのため、筋肉減少症の治療のための新規戦略として、インスリンシグナル伝達の刺激剤、アミノ酸サプリメント（タンパク質合成を向上させるための）及びプロテアソームタンパク質分解の阻害剤が注目されている。本明細書に記載するように、インスリン抵抗性糖尿病マウスにおいてさえ、骨格筋におけるＩｎｓｒ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔ／Ｆｏｘｏ１シグナル伝達を活性化する、化合物＃４３のインスリン様活性は、筋肉の萎縮状態を治療するためのこの化合物の潜在的な用途を示唆している。
本開示はまた、提供する化合物がミトコンドリア機能を増強する可能性が高く、したがって、ミトコンドリア疾患及び／または機能不全の治療に有用であることを示す。いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）の化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、ミトコンドリア関連疾患（例えば、機能不全ミトコンドリアによって引き起こされる）の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、ミトコンドリア関連疾患は、変性疾患（例えば、がん、心血管疾患及び心不全、２型糖尿病、アルツハイマー病及びパーキンソン病、脂肪肝疾患、白内障、骨粗鬆症、筋消耗、睡眠障害及び炎症性疾患、例えば、乾癬、関節炎及び大腸炎）であり得る。いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、ミトコンドリア機能の増強方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む、脳の糖新生の増強方法を提供する。いくつかの実施形態では、提供する方法は、脳内のグルコース取り込みを増加させる。いくつかの実施形態では、提供する方法は、記憶及び学習を含む脳機能を維持または回復させるための方法である。
併用療法
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の疾患、障害、または病態の併用療法のための本明細書に記載の化合物及び／または組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、前記疾患、障害、または病態の１つ以上の異なる治療を受けた、受けている、または受けるであろう疾患、障害、または病態の患者の治療方法を提供し、この方法は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の疾患、障害、または病態の併用療法のための本明細書に記載の化合物及び／または組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、前記疾患、障害、または病態の１つ以上の異なる治療を受けた、受けている、または受けるであろう疾患、障害、または病態の患者の治療方法を提供し、この方法は、治療有効量の式（１）～（３）のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは異性体を投与することを含む。
いくつかの実施形態では、インスリン関連障害を有する患者のための１つ以上の療法は、例えば、Ｉ型糖尿病の場合、インスリン療法；例えば、初発性ＩＩ型糖尿病の場合、食事及び運動；例えば、早期ＩＩ型糖尿病の場合、経口抗糖尿病薬；メトホルミン；インスリン分泌促進薬、例えば、スルホニル尿素；グリタゾン；長時間作用型基礎インスリン；中間作用インスリン；及び短期（急速）作用インスリンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、インスリン療法は、皮下（ＳＣ）、静脈内、及び／または吸入による投与を伴う。いくつかの実施形態では、インスリン関連障害を有する患者のための１つ以上の療法は、現在開発中の療法、例えばインスリン－フマリルジケトピペラジン（ＦＤＫＰ）であってもよい。
実施例１：化合物＃４３、＃５０、＃５３、＃６９、＃７０、及び＃６８の合成
１ａ．アデノシン，５’－Ｓｅ－メチル－５’－セリノ－，２’，３’－ジアセテート（化合物＃４３）の合成
スキーム：
合成手順：滴下漏斗、不活性ガス入口／出口及び温度計を備え、オーブン乾燥した５０ｍｌ三口フラスコに、５’－Ｓｅ－メチル－５’－セレノ－アデノシン（１．０グラム、０．００２９モル、１．０モル当量）及び無水ピリジン（１０ｍｌ）を入れた。反応セットを氷／塩浴に入れ、撹拌を開始した。溶液の温度が０℃に下がった時点で、無水酢酸（１０ｍｌ、０．１０５モル、３６．４７モル当量）を１５分間滴下し、無水酢酸の添加中、反応混合物の温度を５℃以下に維持した。反応混合物を５～１０℃で６時間撹拌した。氷冷水（１００ｍｌ）を加えて過剰の無水酢酸をクエンチし、１０ｗｔ％のＮａＨＣＯ３水溶液を加えてｐＨを７に調整した。水性混合物を酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で抽出した。合わせた酢酸エチル抽出物を無水Ｎａ２ＳＯ４（１グラム）で乾燥させ、２５０ｍｌの丸底フラスコに濾過する。濾液を減圧下、３５～４０℃で乾燥するまで濃縮し、粗生成物を淡黄色のシロップ状の液体として得た後、酢酸エチルとヘキサンの混合物（１：３ ｖ／ｖ）を使用してシリカゲルカラムに通すことによって、高純度の生成物をオフホワイトの結晶として得た（１．１２グラム、収率：９０．３％、ＨＰＬＣによる純度：＞９９％）。
１ａ．アデノシン，５’－Ｓｅ－メチル－５’－セリノ－，２’，３’－ジアセテート（化合物＃４３）の合成
スキーム：
合成手順：滴下漏斗、不活性ガス入口／出口及び温度計を備え、オーブン乾燥した５０ｍｌ三口フラスコに、５’－Ｓｅ－メチル－５’－セレノ－アデノシン（１．０グラム、０．００２９モル、１．０モル当量）及び無水ピリジン（１０ｍｌ）を入れた。反応セットを氷／塩浴に入れ、撹拌を開始した。溶液の温度が０℃に下がった時点で、無水酢酸（１０ｍｌ、０．１０５モル、３６．４７モル当量）を１５分間滴下し、無水酢酸の添加中、反応混合物の温度を５℃以下に維持した。反応混合物を５～１０℃で６時間撹拌した。氷冷水（１００ｍｌ）を加えて過剰の無水酢酸をクエンチし、１０ｗｔ％のＮａＨＣＯ３水溶液を加えてｐＨを７に調整した。水性混合物を酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で抽出した。合わせた酢酸エチル抽出物を無水Ｎａ２ＳＯ４（１グラム）で乾燥させ、２５０ｍｌの丸底フラスコに濾過する。濾液を減圧下、３５～４０℃で乾燥するまで濃縮し、粗生成物を淡黄色のシロップ状の液体として得た後、酢酸エチルとヘキサンの混合物（１：３ ｖ／ｖ）を使用してシリカゲルカラムに通すことによって、高純度の生成物をオフホワイトの結晶として得た（１．１２グラム、収率：９０．３％、ＨＰＬＣによる純度：＞９９％）。
１ｂ．アデノシン，５’－Ｓ－メチル－５’－チオ－，２’，３’－ジアセテート（化合物＃６８）の合成：
スキーム：
合成手順：滴下漏斗、不活性ガス入口／出口及び温度計を備え、オーブン乾燥した５０ｍｌ三口フラスコに、５’－Ｓ－メチル－５’－チオ－アデノシン（１．０グラム、０．００３３モル、１．０モル当量）及び無水ピリジン（１０ｍｌ）を入れた。反応セットを氷／塩浴に入れ、撹拌を開始した。溶液の温度が０℃に下がった時点で、無水酢酸（１０ｍｌ、０．１０５モル、３１．８モル当量）を１５分間滴下し、無水酢酸の添加中、反応混合物の温度を５℃以下に維持した。反応混合物を５～１０℃で６時間撹拌した。氷冷水（１００ｍｌ）を加えて過剰の無水酢酸をクエンチし、１０ｗｔ％のＮａＨＣＯ３水溶液を加えてｐＨを７に調整した。水性混合物を酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で抽出した。合わせた酢酸エチル抽出物を無水Ｎａ２ＳＯ４（１グラム）で乾燥させ、２５０ｍｌの丸底フラスコに濾過する。濾液を減圧下、３５～４０℃で乾燥するまで濃縮して、粗生成物を淡黄色のシロップ状の液体として得た後、酢酸エチルとヘキサンの混合物（１：３ ｖ／ｖ）を使用してシリカゲルカラムに通すことによって、高純度の生成物をオフホワイトの結晶として得た（１．０８グラム、収率：８７％、ＨＰＬＣによる純度：＞９９％）。
スキーム：
合成手順：滴下漏斗、不活性ガス入口／出口及び温度計を備え、オーブン乾燥した５０ｍｌ三口フラスコに、５’－Ｓ－メチル－５’－チオ－アデノシン（１．０グラム、０．００３３モル、１．０モル当量）及び無水ピリジン（１０ｍｌ）を入れた。反応セットを氷／塩浴に入れ、撹拌を開始した。溶液の温度が０℃に下がった時点で、無水酢酸（１０ｍｌ、０．１０５モル、３１．８モル当量）を１５分間滴下し、無水酢酸の添加中、反応混合物の温度を５℃以下に維持した。反応混合物を５～１０℃で６時間撹拌した。氷冷水（１００ｍｌ）を加えて過剰の無水酢酸をクエンチし、１０ｗｔ％のＮａＨＣＯ３水溶液を加えてｐＨを７に調整した。水性混合物を酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で抽出した。合わせた酢酸エチル抽出物を無水Ｎａ２ＳＯ４（１グラム）で乾燥させ、２５０ｍｌの丸底フラスコに濾過する。濾液を減圧下、３５～４０℃で乾燥するまで濃縮して、粗生成物を淡黄色のシロップ状の液体として得た後、酢酸エチルとヘキサンの混合物（１：３ ｖ／ｖ）を使用してシリカゲルカラムに通すことによって、高純度の生成物をオフホワイトの結晶として得た（１．０８グラム、収率：８７％、ＨＰＬＣによる純度：＞９９％）。
１ｃ．アデノシン，５’－Ｓｅ－メチル－５’－セリノ－，２’，３’－ジプロピオネート（化合物＃６９）の合成：
スキーム：
合成手順：滴下漏斗、不活性ガス入口／出口及び温度計を備え、オーブン乾燥した５０ｍｌの三口フラスコに、５’－Ｓｅ－メチル－５’－セレノ－アデノシン（１．０グラム、０．００２９モル、１．０モル当量）及び無水ピリジン（１０ｍｌ）を入れた。反応セットを氷／塩浴に入れ、撹拌を開始した。溶液の温度が０℃に下がった時点で、プロピオン酸無水物（１０ｍｌ、０．０７８モル、２７．０モル当量）を１５分間滴下し、プロピオン酸無水物の添加中、反応混合物の温度を５℃以下に維持した。反応混合物を５～１０℃で６時間撹拌した。氷冷水（１００ｍｌ）を加えて過剰のプロピオン酸無水物をクエンチした後、１０ｗｔ％のＮａＨＣＯ３水溶液を加えてｐＨを７に調整した。水性混合物を酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で抽出した。合わせた酢酸エチル抽出物を無水Ｎａ２ＳＯ４（１グラム）で乾燥させ、２５０ｍｌの丸底フラスコに濾過する。濾液を減圧下、３５～４０℃で乾燥するまで濃縮して、粗生成物を淡黄色のシロップ状の液体として得た後、酢酸エチルとヘキサンの混合物（１：３ ｖ／ｖ）を使用してシリカゲルカラムに通すことによって、高純度の生成物をオフホワイトの結晶として得た（１．１８グラム、収率：８９．３％、ＨＰＬＣによる純度：＞９９％）。
スキーム：
合成手順：滴下漏斗、不活性ガス入口／出口及び温度計を備え、オーブン乾燥した５０ｍｌの三口フラスコに、５’－Ｓｅ－メチル－５’－セレノ－アデノシン（１．０グラム、０．００２９モル、１．０モル当量）及び無水ピリジン（１０ｍｌ）を入れた。反応セットを氷／塩浴に入れ、撹拌を開始した。溶液の温度が０℃に下がった時点で、プロピオン酸無水物（１０ｍｌ、０．０７８モル、２７．０モル当量）を１５分間滴下し、プロピオン酸無水物の添加中、反応混合物の温度を５℃以下に維持した。反応混合物を５～１０℃で６時間撹拌した。氷冷水（１００ｍｌ）を加えて過剰のプロピオン酸無水物をクエンチした後、１０ｗｔ％のＮａＨＣＯ３水溶液を加えてｐＨを７に調整した。水性混合物を酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で抽出した。合わせた酢酸エチル抽出物を無水Ｎａ２ＳＯ４（１グラム）で乾燥させ、２５０ｍｌの丸底フラスコに濾過する。濾液を減圧下、３５～４０℃で乾燥するまで濃縮して、粗生成物を淡黄色のシロップ状の液体として得た後、酢酸エチルとヘキサンの混合物（１：３ ｖ／ｖ）を使用してシリカゲルカラムに通すことによって、高純度の生成物をオフホワイトの結晶として得た（１．１８グラム、収率：８９．３％、ＨＰＬＣによる純度：＞９９％）。
１ｄ．アデノシン，５’－Ｓｅ－メチル－５’－セリノ－，２’，３’－ジブタノエート（化合物＃７０）の合成：
スキーム：
合成手順：滴下漏斗、不活性ガス入口／出口及び温度計を備え、オーブン乾燥した５０ｍｌの三口フラスコに、５’－Ｓｅ－メチル－５’－セレノ－アデノシン（１．０グラム、０．００２９モル、１．０モル当量）及び無水ピリジン（１０ｍｌ）を入れた。反応セットを氷／塩浴に入れ、撹拌を開始した。溶液の温度が０℃に下がった時点で、無水酪酸（１０ｍｌ、０．０７８モル、２７．０モル当量）を１５分間滴下し、無水酪酸の添加中、反応混合物の温度を５℃未満に維持した。反応混合物を５～１０℃で６時間撹拌した。氷冷水（１００ｍｌ）を加えて過剰の無水酪酸をクエンチし、１０ｗｔ％のＮａＨＣＯ３水溶液を加えてｐＨを７に調整した。水性混合物を酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で抽出した。合わせた酢酸エチル抽出物を無水Ｎａ２ＳＯ４（１グラム）で乾燥させ、２５０ｍｌの丸底フラスコに濾過する。濾液を減圧下、３５～４０℃で乾燥するまで濃縮し、粗生成物を淡黄色のシロップ状の液体として得た後、酢酸エチルとヘキサンの混合物（１：３ ｖ／ｖ）を使用してシリカゲルカラムに通すことによって、高純度の生成物をオフホワイトの結晶として得た（１．２０グラム、収率：８５．７％、ＨＰＬＣによる純度：＞９９％）。
スキーム：
合成手順：滴下漏斗、不活性ガス入口／出口及び温度計を備え、オーブン乾燥した５０ｍｌの三口フラスコに、５’－Ｓｅ－メチル－５’－セレノ－アデノシン（１．０グラム、０．００２９モル、１．０モル当量）及び無水ピリジン（１０ｍｌ）を入れた。反応セットを氷／塩浴に入れ、撹拌を開始した。溶液の温度が０℃に下がった時点で、無水酪酸（１０ｍｌ、０．０７８モル、２７．０モル当量）を１５分間滴下し、無水酪酸の添加中、反応混合物の温度を５℃未満に維持した。反応混合物を５～１０℃で６時間撹拌した。氷冷水（１００ｍｌ）を加えて過剰の無水酪酸をクエンチし、１０ｗｔ％のＮａＨＣＯ３水溶液を加えてｐＨを７に調整した。水性混合物を酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で抽出した。合わせた酢酸エチル抽出物を無水Ｎａ２ＳＯ４（１グラム）で乾燥させ、２５０ｍｌの丸底フラスコに濾過する。濾液を減圧下、３５～４０℃で乾燥するまで濃縮し、粗生成物を淡黄色のシロップ状の液体として得た後、酢酸エチルとヘキサンの混合物（１：３ ｖ／ｖ）を使用してシリカゲルカラムに通すことによって、高純度の生成物をオフホワイトの結晶として得た（１．２０グラム、収率：８５．７％、ＨＰＬＣによる純度：＞９９％）。
１ｅ．アデノシン，５’－Ｓｅ－メチル－５’－セレノ－，環状２’，３’－カーボネート（化合物＃５０）の合成：
スキーム：
合成手順：滴下漏斗、不活性ガス入口／出口及び温度計を備え、オーブン乾燥した５０ｍｌ三口フラスコに、５’－Ｓｅ－メチル－５’－セレノ－アデノシン（１．０グラム、０．００２９モル、１．０モル当量）及び無水ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）を入れた。反応セットを氷／塩浴に入れ、撹拌を開始した。溶液の温度が０℃に下がった時点で、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、０．５７グラム、０．００３５モル、１．２１モル当量）を５℃未満で加えた。反応混合物をゆっくりと室温まで温め、次いでアルゴンガス雰囲気下、同じ温度で反応混合物を４時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去して残渣を取得し、それをクロロホルム（５ｍｌ）とエタノール（数滴）の混合物に溶解して透明な溶液を取得し、有機層を１％の酢酸水溶液（２×１ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４（１グラム）で乾燥させ、２５０ｍｌ丸底フラスコに濾過した。濾液を２５～３０℃の減圧下で乾燥するまで濃縮し、粗生成物を淡黄色のシロップ状の液体として得た。粗生成物を、エタノール／水混合物（１：１ ｖ／ｖ）の混合物に溶かし、減圧下、４５～５０℃で乾燥するまで濃縮して残渣を取得し、ヘキサン（２５ｍｌ）を加え、１０分間撹拌し、その後、減圧下、３０～３５℃で乾燥するまで濃縮して、所望の生成物をオフホワイトの結晶として得た（１．０２グラム、収率：９５．３％、ＨＰＬＣによる純度：＞９９％）。
スキーム：
合成手順：滴下漏斗、不活性ガス入口／出口及び温度計を備え、オーブン乾燥した５０ｍｌ三口フラスコに、５’－Ｓｅ－メチル－５’－セレノ－アデノシン（１．０グラム、０．００２９モル、１．０モル当量）及び無水ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）を入れた。反応セットを氷／塩浴に入れ、撹拌を開始した。溶液の温度が０℃に下がった時点で、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、０．５７グラム、０．００３５モル、１．２１モル当量）を５℃未満で加えた。反応混合物をゆっくりと室温まで温め、次いでアルゴンガス雰囲気下、同じ温度で反応混合物を４時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去して残渣を取得し、それをクロロホルム（５ｍｌ）とエタノール（数滴）の混合物に溶解して透明な溶液を取得し、有機層を１％の酢酸水溶液（２×１ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４（１グラム）で乾燥させ、２５０ｍｌ丸底フラスコに濾過した。濾液を２５～３０℃の減圧下で乾燥するまで濃縮し、粗生成物を淡黄色のシロップ状の液体として得た。粗生成物を、エタノール／水混合物（１：１ ｖ／ｖ）の混合物に溶かし、減圧下、４５～５０℃で乾燥するまで濃縮して残渣を取得し、ヘキサン（２５ｍｌ）を加え、１０分間撹拌し、その後、減圧下、３０～３５℃で乾燥するまで濃縮して、所望の生成物をオフホワイトの結晶として得た（１．０２グラム、収率：９５．３％、ＨＰＬＣによる純度：＞９９％）。
１ｆ．アデノシン，５’－Ｓｅ－メチル－５’－セレノ－，２’－モルホリノカルバメート及びアデノシン，５’－Ｓｅ－メチル－５’－セレノ－，３’－モルホリノカルバメートの領域異性体混合物（化合物＃５３）の合成：
スキーム：
合成手順：滴下漏斗、不活性ガス入口／出口、及び温度計を備え、オーブン乾燥した５０ｍｌの三口フラスコに、アデノシン，５’－Ｓｅ－メチル－５’－セレノ－，環状２’，３’－カルボネート（１．０グラム、０．００２７モル、１．０モル当量）及び無水ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）を入れた。モルホリン（０．２６グラム、０．００２９モル、１．１モル当量）を２０～２５℃で添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで４５～５０℃で減圧下、乾燥するまで濃縮して残渣を取得し、ヘキサン（２５ｍｌ）を加え、１０分間撹拌して所望の領域異性体混合生成物をオフホワイトの固体として沈殿させた（１．１２グラム、収率：９１％、ＨＰＬＣによる純度：＞９９％）。
スキーム：
合成手順：滴下漏斗、不活性ガス入口／出口、及び温度計を備え、オーブン乾燥した５０ｍｌの三口フラスコに、アデノシン，５’－Ｓｅ－メチル－５’－セレノ－，環状２’，３’－カルボネート（１．０グラム、０．００２７モル、１．０モル当量）及び無水ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）を入れた。モルホリン（０．２６グラム、０．００２９モル、１．１モル当量）を２０～２５℃で添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで４５～５０℃で減圧下、乾燥するまで濃縮して残渣を取得し、ヘキサン（２５ｍｌ）を加え、１０分間撹拌して所望の領域異性体混合生成物をオフホワイトの固体として沈殿させた（１．１２グラム、収率：９１％、ＨＰＬＣによる純度：＞９９％）。
実施例２．
表１に挙げる合成化合物を、本明細書に記載の実施例におけるグルコース産生及び細胞生存率に対する効果について細胞培養（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で試験した。特に、試験した細胞は、ヒト肝細胞癌ＨｅｐＧ２及びラット肝臓Ｈ４ＩＩＥ肝細胞であった。
表１に挙げる合成化合物を、本明細書に記載の実施例におけるグルコース産生及び細胞生存率に対する効果について細胞培養（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で試験した。特に、試験した細胞は、ヒト肝細胞癌ＨｅｐＧ２及びラット肝臓Ｈ４ＩＩＥ肝細胞であった。
材料及び方法
細胞株及び化合物
ヒト肝癌ＨｅｐＧ２及びラット肝癌Ｈ４ＩＩＥ細胞は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から購入した。ＨｅｐＧ２細胞及びＨ４ＩＩＥ細胞は、１０％ＦＢＳを添加したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）で培養した。
細胞株及び化合物
ヒト肝癌ＨｅｐＧ２及びラット肝癌Ｈ４ＩＩＥ細胞は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から購入した。ＨｅｐＧ２細胞及びＨ４ＩＩＥ細胞は、１０％ＦＢＳを添加したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）で培養した。
化合物＃４３及び表１に挙げた他の化合物は、合成するか、市販品供給元から入手した（入手可能な場合）。すべての被験化合物の純度は、ＨＰＬＣで測定して≧９９％であることを確認した。これらすべての化合物をＤＭＳＯまたは水に溶解して、実験用に１２６．７または１２．６７ｍＭのストック溶液を得た。メトホルミン及びインスリンはシグマから購入した。
グルコース産生アッセイ
等しい数のヒトＨｅｐＧ２細胞またはラットＨ４ＩＩＥ細胞（１～１．５×１０５細胞／ウェル）を、２４時間、１０％ＦＢＳ含有培地中の９６ウェルプレートに播種した。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌのグルコース産生培地（２０ｍＭ乳酸ナトリウム、２ｍＭピルビン酸ナトリウム及び５ｍＭ ＨＥＰＥＳを補充したグルコースフリー、フェノールレッドフリーＤＭＥＭ培地中の様々な濃度の化合物、メトホルミンまたはインスリンで、３７℃、２４時間（Ｈ４ＩＩＥ細胞のみ）または４８時間（ＨｅｐＧ２細胞のみ）処置した。また、細胞を０．２４％ＤＭＳＯ（実験で使用したＤＭＳＯ溶媒の最大量）存在下でインキュベートした。
等しい数のヒトＨｅｐＧ２細胞またはラットＨ４ＩＩＥ細胞（１～１．５×１０５細胞／ウェル）を、２４時間、１０％ＦＢＳ含有培地中の９６ウェルプレートに播種した。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌのグルコース産生培地（２０ｍＭ乳酸ナトリウム、２ｍＭピルビン酸ナトリウム及び５ｍＭ ＨＥＰＥＳを補充したグルコースフリー、フェノールレッドフリーＤＭＥＭ培地中の様々な濃度の化合物、メトホルミンまたはインスリンで、３７℃、２４時間（Ｈ４ＩＩＥ細胞のみ）または４８時間（ＨｅｐＧ２細胞のみ）処置した。また、細胞を０．２４％ＤＭＳＯ（実験で使用したＤＭＳＯ溶媒の最大量）存在下でインキュベートした。
上記の処置の後、５０μｌの培養培地を回収し、製造元のプロトコールに従ってＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄグルコースアッセイキット（カタログ番号Ａ２２１８９）を使用してグルコース分析に供した。上記の化合物処置後の培養プレートの細胞数または生存率は、製造元のプロトコール及び指示に従って、ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイキットを使用して測定した。簡潔に述べると、グルコースアッセイのために５０μｌの培地を除去した後、細胞をＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ溶液（２５μｌのストック溶液及び５０μｌの予熱ＰＢＳ／ウェルあたり）で３７℃、１時間インキュベートし、各試料におけるＯＤ４９０ｎｍの吸光度をＢｉｏ－Ｔｅｋマイクロプレートリーダーで測定した。培養ウェルの細胞生存率を、培養細胞のＯＤ４９０ｎｍからプレーン培養培地（細胞の播種なし）のＯＤ４９０ｎｍを差し引くことにより測定した。培養細胞におけるグルコース産生は、培養培地のグルコース濃度を各ウェルの細胞生存率で正規化することにより取得した。上記の分析のために、各処置あたり少なくとも３つの試料を調べた。データは、これらの試料の平均値±ＳＥＭとして提示する。実験は少なくとも２回繰り返した。
グルコース産生の阻害に関する化合物＃４３またはメトホルミンの半数最大阻害濃度（ＩＣ５０値）は、ＥＤ５０Ｐｌｕｓ ｖ１．０オンラインソフトウェアを使用して測定した。
結果及び考察
１．ＨｅｐＧ２細胞のグルコース産生に対するインスリン及び化合物溶媒ＤＭＳＯの効果
図１の左パネルに示すように、それぞれ１０ｎＭ及び１００ｎＭのインスリン処置により、ＨｅｐＧ２細胞におけるグルコース産生が２０％及び３０％減少したが、一方、最大体積を使用した化合物溶媒ＤＭＳＯは、培養ＨｅｐＧ２細胞のグルコースレベルに影響を及ぼさなかった。これらの結果は、ＨｅｐＧ２細胞がグルコース産生の阻害においてインスリンに応答し、グルコース産生に対する被験化合物の観察された効果がＤＭＳＯの潜在的な効果によるものではないことを示唆している。これらの結果は、インスリン様活性を有し、肝細胞においてグルコース産生を阻害することができる化合物のスクリーニングのための適切な細胞系をＨｅｐＧ２細胞が構成することを確立する。
１．ＨｅｐＧ２細胞のグルコース産生に対するインスリン及び化合物溶媒ＤＭＳＯの効果
図１の左パネルに示すように、それぞれ１０ｎＭ及び１００ｎＭのインスリン処置により、ＨｅｐＧ２細胞におけるグルコース産生が２０％及び３０％減少したが、一方、最大体積を使用した化合物溶媒ＤＭＳＯは、培養ＨｅｐＧ２細胞のグルコースレベルに影響を及ぼさなかった。これらの結果は、ＨｅｐＧ２細胞がグルコース産生の阻害においてインスリンに応答し、グルコース産生に対する被験化合物の観察された効果がＤＭＳＯの潜在的な効果によるものではないことを示唆している。これらの結果は、インスリン様活性を有し、肝細胞においてグルコース産生を阻害することができる化合物のスクリーニングのための適切な細胞系をＨｅｐＧ２細胞が構成することを確立する。
２．化合物＃４３はインスリンを模倣して、ＨｅｐＧ２細胞のグルコース産生を阻害することができる
図１に示すように、無血清条件下、試験した用量の化合物＃４３の存在下でのＨｅｐＧ２細胞のインキュベーションにより、培地中のグルコースレベルが低下した。化合物＃４３（３．８μＭ）で処置した後に観察されたＨｅｐＧ２細胞によるグルコース産生の減少は、インスリン（１００ｎＭ）を使用した場合に達成されたものと比較可能であったが、より高い用量の化合物＃４３（７．６、１５．２及び３０．４μＭ）は、１００ｎＭインスリンよりもさらに強力であった。さらに、試験したすべての用量での化合物＃４３処置後、ＨｅｐＧ２細胞において細胞生存率の有意な減少は観察されなかった（データは示さず）。これらの結果は、化合物＃４３がＨｅｐＧ２細胞のグルコース産生を阻害することができるインスリン模倣薬であることを示唆している。
図１に示すように、無血清条件下、試験した用量の化合物＃４３の存在下でのＨｅｐＧ２細胞のインキュベーションにより、培地中のグルコースレベルが低下した。化合物＃４３（３．８μＭ）で処置した後に観察されたＨｅｐＧ２細胞によるグルコース産生の減少は、インスリン（１００ｎＭ）を使用した場合に達成されたものと比較可能であったが、より高い用量の化合物＃４３（７．６、１５．２及び３０．４μＭ）は、１００ｎＭインスリンよりもさらに強力であった。さらに、試験したすべての用量での化合物＃４３処置後、ＨｅｐＧ２細胞において細胞生存率の有意な減少は観察されなかった（データは示さず）。これらの結果は、化合物＃４３がＨｅｐＧ２細胞のグルコース産生を阻害することができるインスリン模倣薬であることを示唆している。
３．化合物＃４３自体は、ＨｅｐＧ２細胞でのグルコース産生の阻害において、３つの化合物の組み合わせであるＣＤＥよりも高いエンドポイント効力を示した
試験したすべての用量での化合物ＣＤＥによるＨｅｐＧ２細胞の処置（１：１：１のＣ／Ｄ／Ｅ比）によってもグルコース産生は阻害され、それらは１００ｎＭインスリンと比較可能な効力を有していた。３．８μＭの用量の化合物＃４３は、ＨｅｐＧ２細胞でのグルコース産生の阻害において、ＣＤＥの組み合わせ製品（３．８μＭの各個々の化合物を含む）と同じくらい強力であった。しかしながら、７．６μＭ以上の用量の化合物＃４３は、ＨｅｐＧ２細胞でのグルコース産生の阻害においてＣＤＥよりも強力であった。これらの結果は、ＨｅｐＧ２細胞でのグルコース産生の阻害において、化合物＃４３自体が３つの化合物の組み合わせであるＣＤＥよりも高いエンドポイント効力を示したことを示した。化合物ＣＤＥにおけるセレン濃度は各投与点で化合物＃４３の３倍であることに留意すると、これらの結果は、セレン分子に加えて化合物＃４３の１つ以上の構造的特徴が、少なくとも特定の状況において、その活性に寄与し得ることを示唆している可能性がある。
試験したすべての用量での化合物ＣＤＥによるＨｅｐＧ２細胞の処置（１：１：１のＣ／Ｄ／Ｅ比）によってもグルコース産生は阻害され、それらは１００ｎＭインスリンと比較可能な効力を有していた。３．８μＭの用量の化合物＃４３は、ＨｅｐＧ２細胞でのグルコース産生の阻害において、ＣＤＥの組み合わせ製品（３．８μＭの各個々の化合物を含む）と同じくらい強力であった。しかしながら、７．６μＭ以上の用量の化合物＃４３は、ＨｅｐＧ２細胞でのグルコース産生の阻害においてＣＤＥよりも強力であった。これらの結果は、ＨｅｐＧ２細胞でのグルコース産生の阻害において、化合物＃４３自体が３つの化合物の組み合わせであるＣＤＥよりも高いエンドポイント効力を示したことを示した。化合物ＣＤＥにおけるセレン濃度は各投与点で化合物＃４３の３倍であることに留意すると、これらの結果は、セレン分子に加えて化合物＃４３の１つ以上の構造的特徴が、少なくとも特定の状況において、その活性に寄与し得ることを示唆している可能性がある。
４．化合物＃４３のセレン分子の代わりに硫黄を使用すると、ＨｅｐＧ２でのグルコース産生の阻害が抑止される
図１の右側のパネルに示すように、硫黄含有化合物である化合物＃６８（化合物＃４３の硫黄類似体）または化合物＃６４（ＳＡＭ）、ならびにリストに挙げた他の非セレン化合物による細胞の処置は、ＨｅｐＧ２細胞でのグルコース産生の低下にほとんど影響を与えなかった。グルコース産生の阻害における化合物＃４３と＃６８の顕著な違いは、ＨｅｐＧ２細胞でのグルコース産生の阻害において、化合物＃４３のセレン分子がその機能に寄与していることを示している。
図１の右側のパネルに示すように、硫黄含有化合物である化合物＃６８（化合物＃４３の硫黄類似体）または化合物＃６４（ＳＡＭ）、ならびにリストに挙げた他の非セレン化合物による細胞の処置は、ＨｅｐＧ２細胞でのグルコース産生の低下にほとんど影響を与えなかった。グルコース産生の阻害における化合物＃４３と＃６８の顕著な違いは、ＨｅｐＧ２細胞でのグルコース産生の阻害において、化合物＃４３のセレン分子がその機能に寄与していることを示している。
５．ＨｅｐＧ２細胞におけるグルコース産生の阻害に対するセレン化合物の異なる効果
上記のように、セレン含有化合物Ｃ、Ｄ、及びＥの等モル混合物（ＣＤＥ）は、示した用量でヒトＨｅｐＧ２細胞のグルコース産生を阻害した。図１のＸ軸に示す化合物の濃度は、混合物中の各Ｓｅ含有化合物のＳｅ濃度を指しており、合計Ｓｅ濃度は、実際にはＸ軸上に示す濃度の３倍であることに留意されたい。これは、これらの実験で試験した単一分子候補のそれぞれと混合物成分の直接比較を容易にするために行った。
上記のように、セレン含有化合物Ｃ、Ｄ、及びＥの等モル混合物（ＣＤＥ）は、示した用量でヒトＨｅｐＧ２細胞のグルコース産生を阻害した。図１のＸ軸に示す化合物の濃度は、混合物中の各Ｓｅ含有化合物のＳｅ濃度を指しており、合計Ｓｅ濃度は、実際にはＸ軸上に示す濃度の３倍であることに留意されたい。これは、これらの実験で試験した単一分子候補のそれぞれと混合物成分の直接比較を容易にするために行った。
グルコース産生の阻害がセレンのみによるものである場合、ＣＤＥは化合物＃４３よりも３倍多いセレンを含むため、後者よりもよりロバストな応答を生じるであろうと予想され得る。その点については、明らかにそうではない。
図１（左側のパネル）は、化合物Ｃ、Ｄ、４３、５０、５３、６９及び７０のそれぞれがグルコース産生を阻害し、その中で化合物４３が最も強力であったことを示している。さらに、化合物ＥはＨｅｐＧ２細胞のグルコース産生を刺激することがわかった。
まとめると、これらの結果は以下のことを示唆している：
（ｉ）化合物中のセレン分子は、グルコース産生の効果的な阻害に必要である（図１の左パネルの化合物＃４３を、その正確な硫黄類似体である右パネルの化合物＃６８と比較されたい）。
（ｉｉ）しかしながら、セレン分子だけではグルコース産生の阻害には不十分な場合がある（いくつかの場合では、セレンを含有する構造的に類似した化合物は、より低いまたは反対の効果を示した）。
（ｉｉｉ）セレン分子の濃度だけを高めても効力は増強されない場合がある（ＣＤＥのセレン濃度は化合物＃４３のセレン濃度の３倍であるが、それほど強力ではない）。
（ｉｖ）試験した化合物の中で、化合物＃４３は、肝細胞のグルコース産生の阻害において最も高い効力を示した。
（ｉ）化合物中のセレン分子は、グルコース産生の効果的な阻害に必要である（図１の左パネルの化合物＃４３を、その正確な硫黄類似体である右パネルの化合物＃６８と比較されたい）。
（ｉｉ）しかしながら、セレン分子だけではグルコース産生の阻害には不十分な場合がある（いくつかの場合では、セレンを含有する構造的に類似した化合物は、より低いまたは反対の効果を示した）。
（ｉｉｉ）セレン分子の濃度だけを高めても効力は増強されない場合がある（ＣＤＥのセレン濃度は化合物＃４３のセレン濃度の３倍であるが、それほど強力ではない）。
（ｉｖ）試験した化合物の中で、化合物＃４３は、肝細胞のグルコース産生の阻害において最も高い効力を示した。
６．リストに挙げたセレン化合物の構造的特徴の分析により、それらの活性に寄与し得る化学基を決定する
化合物ＣとＤとの比較は、５’メチルセレノ基と５’セレノホモシステインが同様のグルコース産生阻害を提供し得ることを示している。化合物４３、５０、５３、６９、及び７０の比較は、２’及び３’位のジアセチルエステル（＃４３）が環状カルボネート（化合物＃５０）、モルホリノカルボキシレート（＃５３）、ジプロパノイルエステル（＃６９）、及びジブタノイルエステル（＃７０）に比べて、より高いグルコース産生阻害を提供することを示している。アデニン、アデノシン及びアデノシンのいくつかの化学的バリアントは、ＨｅｐＧ２細胞におけるグルコース産生を阻害しなかった。さらに、２つのアデニリルシクラーゼ阻害剤（＃５９及び６１）もグルコース産生を阻害しなかったが、このことは、グルコース産生の阻害における化合物＃４３の作用が、細胞のＡＭＰレベルの低下によるものではないと思われることを示している（Ｈａｒｄｉｅ ＤＧ． Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２０１３：１７（３）：３１３－３１４）。同時に、この結果は、アデニンとセレン分子に加えて１つ以上の特徴が、少なくとも特定の状況において活性に寄与し得ることを示唆している。
化合物ＣとＤとの比較は、５’メチルセレノ基と５’セレノホモシステインが同様のグルコース産生阻害を提供し得ることを示している。化合物４３、５０、５３、６９、及び７０の比較は、２’及び３’位のジアセチルエステル（＃４３）が環状カルボネート（化合物＃５０）、モルホリノカルボキシレート（＃５３）、ジプロパノイルエステル（＃６９）、及びジブタノイルエステル（＃７０）に比べて、より高いグルコース産生阻害を提供することを示している。アデニン、アデノシン及びアデノシンのいくつかの化学的バリアントは、ＨｅｐＧ２細胞におけるグルコース産生を阻害しなかった。さらに、２つのアデニリルシクラーゼ阻害剤（＃５９及び６１）もグルコース産生を阻害しなかったが、このことは、グルコース産生の阻害における化合物＃４３の作用が、細胞のＡＭＰレベルの低下によるものではないと思われることを示している（Ｈａｒｄｉｅ ＤＧ． Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２０１３：１７（３）：３１３－３１４）。同時に、この結果は、アデニンとセレン分子に加えて１つ以上の特徴が、少なくとも特定の状況において活性に寄与し得ることを示唆している。
７．ＨｅｐＧ２及びラットＨ４ＩＩＥ細胞でのグルコース産生の阻害における化合物＃４３とメトホルミン（周知の抗糖尿病薬）の比較研究
上記のように、ＨｅｐＧ２細胞におけるロバストなグルコース産生阻害が、化合物＃４３処置後に観察された。この化合物の効果を、周知の抗糖尿病薬メトホルミンと比較した。上記及び図２の上部パネルに示すように、化合物＃４３処置後のＨｅｐＧ２細胞におけるグルコースレベルの用量依存的な低下が観察され、ＩＣ５０（半数最大阻害濃度）値は１５．５μＭであった。図からわかるように、５００μＭの用量のメトホルミンは、ＨｅｐＧ２細胞のグルコース産生を阻害しなかったが、代わりにいくつかの刺激効果を示した。高用量のメトホルミン（０．５～４ｍＭ）は、これらの細胞に対する細胞毒性を示した（データは示さず）。これらの結果は、インスリンと同様に、化合物＃４３がＨｅｐＧ２細胞のグルコース産生を阻害することができることを示している。
上記のように、ＨｅｐＧ２細胞におけるロバストなグルコース産生阻害が、化合物＃４３処置後に観察された。この化合物の効果を、周知の抗糖尿病薬メトホルミンと比較した。上記及び図２の上部パネルに示すように、化合物＃４３処置後のＨｅｐＧ２細胞におけるグルコースレベルの用量依存的な低下が観察され、ＩＣ５０（半数最大阻害濃度）値は１５．５μＭであった。図からわかるように、５００μＭの用量のメトホルミンは、ＨｅｐＧ２細胞のグルコース産生を阻害しなかったが、代わりにいくつかの刺激効果を示した。高用量のメトホルミン（０．５～４ｍＭ）は、これらの細胞に対する細胞毒性を示した（データは示さず）。これらの結果は、インスリンと同様に、化合物＃４３がＨｅｐＧ２細胞のグルコース産生を阻害することができることを示している。
ラットＨ４ＩＩＥ肝細胞は、メトホルミンに応答してグルコース産生を低下させることが報告されている。したがって、このラット肝細胞株を使用して、グルコース産生に対する化合物＃４３の阻害活性をさらに確認し、化合物＃４３の効力をメトホルミンと比較した。図２に示すように、それぞれ化合物＃４３及びメトホルミンで処置すると、無血清条件下でＨ４ＩＩＥ細胞のグルコース産生が用量依存的に減少した。これらの化合物の毒性効果は、試験した用量において細胞生存率に対して観察されなかった（データは示さず）。化合物＃４３のＩＣ５０は１７．８μＭであり、これはＨｅｐＧ２細胞におけるＩＣ５０とほぼ同一である。対照的に、３６．２５μＭの用量のメトホルミンは阻害活性をほとんどまたはまったく示さず、この実験におけるメトホルミンのＩＣ５０は２７５μＭであった。これらの結果は、培養ラット肝細胞におけるグルコース産生の阻害において、化合物＃４３がメトホルミンよりも強力（少なくとも１５倍強力）であることを示唆している。
まとめると、化合物＃４３、５０、５３、６９及び７０はすべて、培養肝細胞におけるグルコース産生阻害において活性を示した。しかしながら、化合物＃４３は、グルコース産生に対する阻害剤活性を試験した中で、はるかに最も強力な単一化合物であり、その活性は、ＨｅｐＧ２細胞における高インスリン用量（１００ｎＭ）の活性を上回るものであった。
さらに、化合物＃４３は、試験した両方の肝細胞株において、ビグアナイド薬であるメトホルミンよりもはるかに強力であることが示された。メトホルミンは現在、２型糖尿病の治療に使用される第一選択薬である。
実施例３：インスリン抵抗性及び糖尿病性レプチン受容体（Ｌｅｐｒ）偶発ヌル変異マウスの血流中のグルコース及び／またはＨｂＡ１ｃレベルの調節ならびに耐糖能の向上における、化合物＃４３及び密接に関連するセレノ有機化合物（＃Ｃ、＃５０、＃６９及び＃７０）、ならびに化合物＃４３の硫黄類似体（化合物＃６８）を用いた研究
材料及び方法
化合物
化合物＃４３、＃Ｃ、＃５０、＃６８、＃６９及び＃７０を、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｉｎｃにおいて合成した。試験したすべての化合物の純度は、ＨＰＬＣによる測定で、≧９９％であることが確認された。
材料及び方法
化合物
化合物＃４３、＃Ｃ、＃５０、＃６８、＃６９及び＃７０を、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｉｎｃにおいて合成した。試験したすべての化合物の純度は、ＨＰＬＣによる測定で、≧９９％であることが確認された。
動物
５～１０週齢の雄の糖尿病性偶発変異（レプチン受容体変異）Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から購入し、病原体フリーの飼育室に収容し、餌と水を自由に摂取させた。
５～１０週齢の雄の糖尿病性偶発変異（レプチン受容体変異）Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から購入し、病原体フリーの飼育室に収容し、餌と水を自由に摂取させた。
化合物＃４３及びその他の化合物による慢性処置
３８日齢の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、０．２％ＤＭＳＯ、化合物＃Ｃ、化合物＃５０、化合物＃６８、及び／または化合物＃４３（体重１キログラムあたり２５μｇセレンまたは硫黄当量の各化合物、滅菌生理食塩水で希釈）を含有する生理食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）を、４３～９０日間の範囲の期間、毎日腹腔内（ｉｐ）注射した。上記の処置マウスの体重を、天秤を使用して毎日記録し、目に見える異常な動物の肉眼的形態及び歩行行動を毎日モニタリングした。処置後、動物を一晩絶食させ、その後、血糖値アッセイまたはＨｂＡ１ｃアッセイ、糖負荷試験または組織採取に供した。
３８日齢の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、０．２％ＤＭＳＯ、化合物＃Ｃ、化合物＃５０、化合物＃６８、及び／または化合物＃４３（体重１キログラムあたり２５μｇセレンまたは硫黄当量の各化合物、滅菌生理食塩水で希釈）を含有する生理食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）を、４３～９０日間の範囲の期間、毎日腹腔内（ｉｐ）注射した。上記の処置マウスの体重を、天秤を使用して毎日記録し、目に見える異常な動物の肉眼的形態及び歩行行動を毎日モニタリングした。処置後、動物を一晩絶食させ、その後、血糖値アッセイまたはＨｂＡ１ｃアッセイ、糖負荷試験または組織採取に供した。
化合物＃４３、＃６９及び＃７０の潜在的な抗糖尿病効果の比較研究のために、４１日齢の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、０．２％ＤＭＳＯ、化合物＃４３、化合物＃６９、または化合物＃７０（体重１キログラムあたり２５μｇセレンの各化合物、滅菌生理食塩水で希釈）を含有する生理食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）を、毎日腹腔内（ｉｐ）注射した。４３日間の処置後、動物を一晩絶食させ、その後、血糖値試験及び糖負荷試験に供した。これらの化合物を９０日間毎日処置した後、これらの動物の血清を収集し、次いで血中ＨｂＡ１ｃアッセイに供した。
化合物＃４３の急性処置
一晩の絶食後、８～１０週齢のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、０．２％ＤＭＳＯまたは化合物＃４３（体重１キログラムあたり、０．００５４、０．０５４、０．５４、または５．４ｍｇの化合物＃４３（化合物のストックを滅菌生理食塩水中に希釈した）を含有する生理食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）を腹腔内注射した。生理食塩水または化合物の注射後、マウスをケージに戻し、１、２、３、５、及び８時間にわたって、水を自由に摂取させたが、餌は与えなかった。注射後の各時点で、グルコースアッセイのために各マウスの尾から少量の血液を採取した。
一晩の絶食後、８～１０週齢のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、０．２％ＤＭＳＯまたは化合物＃４３（体重１キログラムあたり、０．００５４、０．０５４、０．５４、または５．４ｍｇの化合物＃４３（化合物のストックを滅菌生理食塩水中に希釈した）を含有する生理食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）を腹腔内注射した。生理食塩水または化合物の注射後、マウスをケージに戻し、１、２、３、５、及び８時間にわたって、水を自由に摂取させたが、餌は与えなかった。注射後の各時点で、グルコースアッセイのために各マウスの尾から少量の血液を採取した。
非絶食条件下の追加の６週齢Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、０．２％ＤＭＳＯを含有する生理食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）、または化合物＃４３の単回投与（５．４ｍｇ化合物／ｋｇ体重）を腹腔内注射した。注射後、動物をケージに戻し、水と餌を自由に摂取させた。２４時間後、グルコースアッセイのためにマウスの尾から少量の血液を採取した。
血糖値アッセイ
生理食塩水または化合物で処置した後、またはグルコースのボーラスを注射した後、マウスの尾の先端を切り取ることにより、各マウス由来の少量の血液を採取した。血糖値は、６００ｍｇ／ｄＬのグルコース測定の最大能力を有する血糖値測定器を使用して測定した。
生理食塩水または化合物で処置した後、またはグルコースのボーラスを注射した後、マウスの尾の先端を切り取ることにより、各マウス由来の少量の血液を採取した。血糖値は、６００ｍｇ／ｄＬのグルコース測定の最大能力を有する血糖値測定器を使用して測定した。
糖負荷試験
糖負荷試験は、以前に記載されたように実施した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ ２００８；４：２９－３６）。簡潔に述べると、生理食塩水または化合物で処置した後、一晩絶食させたＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに２グラム／ｋｇ体重の２０％Ｄ－グルコースを腹腔内注射した。最大グルコース測定能力６００ｍｇ／ｄＬの血糖値測定器を使用して、グルコースを注射してから時間０（グルコース注射の直前）、０．２５、０．５、１、及び２時間後の血糖値を測定した。このため、データ分析では、６００ｍｇ／ｄＬを超える血糖値は６００ｍｇ／ｄＬとしてカウントした。
糖負荷試験は、以前に記載されたように実施した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ ２００８；４：２９－３６）。簡潔に述べると、生理食塩水または化合物で処置した後、一晩絶食させたＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに２グラム／ｋｇ体重の２０％Ｄ－グルコースを腹腔内注射した。最大グルコース測定能力６００ｍｇ／ｄＬの血糖値測定器を使用して、グルコースを注射してから時間０（グルコース注射の直前）、０．２５、０．５、１、及び２時間後の血糖値を測定した。このため、データ分析では、６００ｍｇ／ｄＬを超える血糖値は６００ｍｇ／ｄＬとしてカウントした。
血中及び血清ＨｂＡ１ｃアッセイ
生理食塩水または化合物での処置後、マウス尾からの少量の血液をＥＤＴＡコーティングしたエッペンドルフチューブ（血液凝固を防ぐため）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に回収し、次いでＣｒｙｓｔａｌ ＣｈｅｍまたはＫａｍｉｙａのマウス糖化ヘモグロビンＡ１ｃ ＥＬＩＳＡキットを使用して、製造元のプロトコールに従ってＨｂＡ１ｃアッセイに供した。また、最終処置後、Ｋａｍｉｙａ Ｂｉｏｍｅｉｄｃａｌ ＣｏｍｐａｎｙのマウスＨｂＡ１ｃキットを使用して、製造元のプロトコールに従ってマウス血清を回収した。
生理食塩水または化合物での処置後、マウス尾からの少量の血液をＥＤＴＡコーティングしたエッペンドルフチューブ（血液凝固を防ぐため）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に回収し、次いでＣｒｙｓｔａｌ ＣｈｅｍまたはＫａｍｉｙａのマウス糖化ヘモグロビンＡ１ｃ ＥＬＩＳＡキットを使用して、製造元のプロトコールに従ってＨｂＡ１ｃアッセイに供した。また、最終処置後、Ｋａｍｉｙａ Ｂｉｏｍｅｉｄｃａｌ ＣｏｍｐａｎｙのマウスＨｂＡ１ｃキットを使用して、製造元のプロトコールに従ってマウス血清を回収した。
統計解析
該当する場合、スチューデントｔ検定を使用して、生理食塩水処置群と化合物処置群との差異の統計的有意性を判定し、０．０５未満のＰ値を有意とみなした。データは、図に示すマウスの数の平均値±ＳＥＭとして提示する。
該当する場合、スチューデントｔ検定を使用して、生理食塩水処置群と化合物処置群との差異の統計的有意性を判定し、０．０５未満のＰ値を有意とみなした。データは、図に示すマウスの数の平均値±ＳＥＭとして提示する。
結果と考察
Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスは、レプチン受容体遺伝子（Ｌｅｐｒ）のすべての既知のアイソフォームを欠損している。このホモ接合性マウスモデルは、耐糖能障害、インスリン感受性の低下、高血糖症、及び高インスリン血症を有する高悪性度ＩＩ型糖尿病マウスモデルである。これらのマウスは、約３～４週齢で肉眼的肥満、１０～１４日で始まる血漿インスリンの上昇、及び約４～８週齢で高血糖症（すなわち、高血糖値）を発症する（Ｃｏｌｅｍａｎ ＤＬ． １９７８ Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ １４：１４１－８）。
Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスは、レプチン受容体遺伝子（Ｌｅｐｒ）のすべての既知のアイソフォームを欠損している。このホモ接合性マウスモデルは、耐糖能障害、インスリン感受性の低下、高血糖症、及び高インスリン血症を有する高悪性度ＩＩ型糖尿病マウスモデルである。これらのマウスは、約３～４週齢で肉眼的肥満、１０～１４日で始まる血漿インスリンの上昇、及び約４～８週齢で高血糖症（すなわち、高血糖値）を発症する（Ｃｏｌｅｍａｎ ＤＬ． １９７８ Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ １４：１４１－８）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究により、化合物＃４３が、インスリンを模倣するが迂回して、化合物＃Ｃまたは＃５０などの密接に関連する化合物よりもはるかに大きな効力でグルコース産生を阻害することが示された。さらに、化合物＃４３の硫黄含有類似体（化合物＃６８）は、ＨｅｐＧ２細胞におけるグルコース産生に対してほとんどまたは全く阻害効果を有していなかった（図１～２）。したがって、インスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスは、血流中のグルコースを潜在的に低下させ、重度の糖尿病的バックグラウンドに対するインスリン感受性及び耐糖能を改善するうえでの実験化合物の使用を調査する理想的なｉｎ ｖｉｖｏモデル系である。
１．慢性処置後のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの高血糖症に対して試験した３つのセレノ有機化合物（＃Ｃ、＃５０、＃４３）の中で最も強力な化合物である化合物＃４３
Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスで示すように、化合物の投与レジメンを採用して、高血糖症の治療における試験化合物の潜在的な役割を調査した。高血糖症の発症（生後約４～８週間で発症）前後に化合物を腹腔内注射することにより、マウスに毎日処置を施した。３つの化合物（すなわち、化合物＃４３、化合物＃Ｃ及び化合物＃５０、同一濃度のセレンを送達）を４３～５２日間毎日注射して、これらのセレノ有機化合物がインスリン抵抗性のマウスの高血糖症に対して測定可能な効果を有するかどうかを調べた。
Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスで示すように、化合物の投与レジメンを採用して、高血糖症の治療における試験化合物の潜在的な役割を調査した。高血糖症の発症（生後約４～８週間で発症）前後に化合物を腹腔内注射することにより、マウスに毎日処置を施した。３つの化合物（すなわち、化合物＃４３、化合物＃Ｃ及び化合物＃５０、同一濃度のセレンを送達）を４３～５２日間毎日注射して、これらのセレノ有機化合物がインスリン抵抗性のマウスの高血糖症に対して測定可能な効果を有するかどうかを調べた。
試験したすべての化合物による処置は、これらの変異マウスの体重増加に影響を与えなかったことがわかり（データは示さず）、このことは、試験したこれらの化合物が、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおいて、表示した食物の消費に対する食欲の異常な増加の阻害効果をほとんどまたは全く有さない可能性が高いことを示している。また、処置期間中に生理食塩水で処置した（対照）マウスと、化合物で処置したＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの間で動物の肉眼的形態及び歩行行動に目に見える差異はなかった（データは示さず）。これらの結果は、試験した用量でのこれらの化合物が、動物の行動または活動に対して毒性作用を及ぼさないことを示している。
化合物＃Ｃ、＃５０、及び＃４３のうち、化合物＃４３で処置したＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血糖値は、同年齢の通常の野生型マウス（約１００ｍｇ／ｄＬ、データは示さず）に比べてなお高かったにもかかわらず、化合物＃４３での処置は、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血流中のグルコースレベルの最も有意な減少、すなわち対照に比べて約４５％の減少をもたらした（図３左パネル参照）。さらに、これらの結果は、化合物＃４３がこの重度のＩＩ型糖尿病マウスモデルの血流中のグルコースレベルを有意に低下させることができることを明らかに示しており、この化合物の高血糖症予防の可能性を示している。さらに、これらの結果は、高血糖症に対するセレノ有機化合物の示差的効果の良いエビデンスを提供しており、化合物＃４３が高血糖症の治療に対する最も強力な化合物（これら３つの試験した化合物の中で）であることを示している。
さらに、化合物＃Ｃ、＃５０及び＃４３で処置したＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスから血清を採取し、ＨｂＡ１ｃ試験に供した。ＨｂＡ１ｃレベルは、過去２～３か月にわたる血糖濃度の長期的な指標であり、糖尿病患者の血糖値の履歴をモニタリングするために臨床医学で広く使用されている。図３に示すように、化合物＃Ｃ、＃５０及び＃４３の中で、化合物＃４３による処置でのみ、生理食塩水処置群と比較した場合の血清ＨｂＡ１ｃレベルの有意な減少（約２０％減少）が生じた。これらの結果は、マウスの空腹時血糖値（図３の左パネル）及びｉｎ ｖｉｔｒｏでのグルコース産生（ＨｅｐＧ２細胞、図１）に対するこれら３つの化合物の上記の観察された示差的効果と符合する。
したがって、これらの結果は、高血糖症に対するセレノ有機化合物の示差的効果が存在し、化合物＃４３が、これら３つのセレン含有化合物（＃Ｃ、＃５０、及び＃４３）の中で最も強力な化合物であり、インスリン抵抗性の被験体における高血糖症の治療に対して明らかな潜在能力を有することへのｉｎ ｖｉｖｏでのエビデンスを与えるものとなっている。
２．化合物＃４３のセレン分子を試験用量の硫黄分子で置換すると、慢性処置後のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの高血糖症に対して有意な効果はない
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究では、化合物＃６８ではなく化合物＃４３がＨｅｐＧ２細胞におけるグルコース産生をロバストに阻害することが示された（図１）。上記の研究は、化合物＃４３がＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスのグルコース出力及びＨｂＡ１ｃレベルを低下させることができることを示している（図３）。Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける化合物＃４３の抗糖尿病効果をさらに確認し、化合物＃４３のセレン分子がこの抗高血糖症効果に必要かどうかを調べるために、３８日齢の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、等量のセレンまたは硫黄を含有する化合物＃４３及びその直接的な硫黄含有類似体である化合物＃６８を、腹腔内注射により、３か月間、毎日処置した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究では、化合物＃６８ではなく化合物＃４３がＨｅｐＧ２細胞におけるグルコース産生をロバストに阻害することが示された（図１）。上記の研究は、化合物＃４３がＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスのグルコース出力及びＨｂＡ１ｃレベルを低下させることができることを示している（図３）。Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける化合物＃４３の抗糖尿病効果をさらに確認し、化合物＃４３のセレン分子がこの抗高血糖症効果に必要かどうかを調べるために、３８日齢の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、等量のセレンまたは硫黄を含有する化合物＃４３及びその直接的な硫黄含有類似体である化合物＃６８を、腹腔内注射により、３か月間、毎日処置した。
ここでも、３か月間化合物で処置した後、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに目に見える形態学的異常、歩行行動異常または体重変化はなかったが、このことは、試験した用量の化合物＃４３または＃６８が、これらのマウスに対する明白な毒性効果を有していなかったことを示している。しかしながら、化合物＃４３を３か月間注射すると空腹時血糖値が統計的に有意に減少したが、一方、化合物＃６８は血糖値を有意に低下させなかった（図４、左パネル）。さらに劇的に、３か月間の化合物＃４３処置後の空腹時血糖値は、約１３５ｍｇ／ｄＬに低下したが、これは、正常な非糖尿病／肥満マウスで報告されている血糖値（約１００ｍｇ／ｄＬ）に近いものである。これらの血糖値の低下と一致して、３か月間の化合物＃４３処置後のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス由来の血液試料中のＨｂＡ１ｃレベルも、対照（生理食塩水処置）群に比べて有意に減少した（約３０％減少）。しかしながら、化合物＃６８処置は、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血中ＨｂＡ１ｃレベルに影響を及ぼさなかった。化合物＃４３によるこの９０日間の処置後のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスのＨｂＡ１ｃレベルの低下の程度（図４）は、４２日間の化合物＃４３処置後のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに比べて、より顕著であると考えられる（図３）。
総合すると、これらのｉｎ ｖｉｖｏでの結果は、化合物＃４３が高悪性度ＩＩ型糖尿病のマウスモデルにおいて血糖レベル及びＨｂＡ１ｃレベルを有意に低下させることができるという発見をさらに確証付けるものであり、糖尿病患者の高血糖症の治療における化合物＃４３の潜在能力を示している。さらに、結果は、化合物＃４３のセレン原子を硫黄原子で置換した後、化合物＃４３の抗糖尿病性が失われることも確認した。
３．化合物＃４３は、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおいて、慢性処置後、化合物＃６９及び＃７０に比べて、より高い抗高血糖症性を示した
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究では、化合物＃４３の２’，３’位のジアセチル基をジプロパノイル基（化合物＃６９）またはブタノイル基（化合物＃７０）で置換すると、ＨｅｐＧ２細胞におけるグルコース産生の阻害における化合物＃４３の活性が減弱することが示された（図２）。上記の研究は、化合物＃４３がＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスのグルコース出力及びＨｂＡ１ｃレベルを有意に低下させることができることを示している（図３～図４）。Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける化合物＃４３の抗糖尿病効果をさらに確認し、この抗高血糖症効果に対する化合物＃４３のジアセチル基の寄与を調べるために、４１日齢の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、等量のセレンを含有する化合物＃４３、＃６９及び＃７０を、腹腔内注射により、４３日間及び９０日間、毎日処置した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究では、化合物＃４３の２’，３’位のジアセチル基をジプロパノイル基（化合物＃６９）またはブタノイル基（化合物＃７０）で置換すると、ＨｅｐＧ２細胞におけるグルコース産生の阻害における化合物＃４３の活性が減弱することが示された（図２）。上記の研究は、化合物＃４３がＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスのグルコース出力及びＨｂＡ１ｃレベルを有意に低下させることができることを示している（図３～図４）。Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける化合物＃４３の抗糖尿病効果をさらに確認し、この抗高血糖症効果に対する化合物＃４３のジアセチル基の寄与を調べるために、４１日齢の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、等量のセレンを含有する化合物＃４３、＃６９及び＃７０を、腹腔内注射により、４３日間及び９０日間、毎日処置した。
ここでも、これらの３つの化合物で９０日間処置した後、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに目に見える形態学的異常、歩行行動異常または体重変化はなかったが、このことは、試験した用量の化合物＃４３、＃６９または＃７０が、これらのマウスに対する明白な毒性効果を有していなかったことを示している。化合物＃４３を４３日間注射すると、空腹時血糖値が統計的に有意に減少することが明らかとなった（生理食塩水群での約２９０ｍｇ／ｄＬから１８８ｍｇ／ｄＬへの約３５％の減少）（図５左パネル）。化合物＃４３のジアセチル基をジブタノイル基（化合物＃７０）で置換した場合も、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの空腹時血糖値は低下したが、化合物＃４３に比べると有意ではなかった（図５左パネル）。化合物＃４３のジアセチル基をジプロパノイル基（化合物＃６９）に置換すると、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの空腹時血糖値がわずかに増加した（図５左パネル）。上記の観察結果をさらに検証するために、これらのＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、腹腔内注射により、等量のセレンを含有する化合物＃４３、＃６９及び＃７０を、さらに４７日間毎日投与し続け（毎日の化合物処置を合計９０日間）、血清を回収し、血中ＨｂＡ１ｃアッセイに供した。図５の右パネルに示すように、化合物＃４３処置により、ＨｂＡ１ｃレベルが有意に減少した（図５、右パネル）。最初の評価では、化合物＃７０処置でもＨｂＡ１ｃレベルが約５０％減少することが示され（図５、右パネル）、一方、化合物＃６９処置ではＨｂＡ１ｃレベルの有意な減少は生じず（図５、右パネル）；これらのデータをさらに検討した結果、化合物＃６９と化合物＃７０のいずれにも有意な効果は認められなかった（図５、右パネル）。総合すると、これらの結果は、化合物＃４３がインスリン抵抗性の被験体の高血糖症の治療に大きな可能性を秘めていることを示唆している。さらに、結果は、化合物＃４３の２’，３’位のジアセチル基がｉｎ ｖｉｖｏでの抗高血糖症機能に寄与しており、特定の状況では、１つまたは２つの炭素原子によるジアセチル基の延長がグルコース恒常性に対して悪影響を与えることを示している。
４．化合物＃４３の急性処置により、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血糖値が用量依存的に低下した
上記の研究は、化合物＃４３での慢性処置により、血糖値レベル及びＨｂＡ１ｃレベルを有意に低下させることができることを示した。有効量の範囲を決定し、化合物＃４３に対する応答期間を確立するために、８～１０週齢のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂ雄マウスを一晩絶食させ、次いで生理食塩水（化合物＃４３ストック溶媒の最大注入量である０．２％ＤＭＳＯを含有する）、０．００５４、０．０５４、０．５４及び５．４ｍｇ／ｋｇ体重の化合物＃４３（ストック化合物を生理食塩水で希釈して作成）を腹腔内注射した。１、２、３、５及び８時間目の注射の直前と直後のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス（空腹条件ではあるが水は自由に摂取できる）の血糖値を調べ、結果の血糖値を、各時点での個々の動物のそれぞれについてプロットした。
上記の研究は、化合物＃４３での慢性処置により、血糖値レベル及びＨｂＡ１ｃレベルを有意に低下させることができることを示した。有効量の範囲を決定し、化合物＃４３に対する応答期間を確立するために、８～１０週齢のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂ雄マウスを一晩絶食させ、次いで生理食塩水（化合物＃４３ストック溶媒の最大注入量である０．２％ＤＭＳＯを含有する）、０．００５４、０．０５４、０．５４及び５．４ｍｇ／ｋｇ体重の化合物＃４３（ストック化合物を生理食塩水で希釈して作成）を腹腔内注射した。１、２、３、５及び８時間目の注射の直前と直後のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス（空腹条件ではあるが水は自由に摂取できる）の血糖値を調べ、結果の血糖値を、各時点での個々の動物のそれぞれについてプロットした。
上記の用量の化合物＃４３の急性単回注射は、肉眼的形態及び歩行行動に対して目に見える毒性効果を引き起こさなかった。生理食塩水で処置したＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスでは、８時間の試験期間中に血糖値のわずかな低下（約５０～７０ｍｇ／ｄＬ）しかなく（図６）、これは、これらのＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスがグルコース除去能力に欠陥を示すという事実と合致している。しかしながら、試験したすべての用量での化合物＃４３処置は、注射後２時間または３時間の最低用量の化合物＃４３処置（この場合のグルコースレベルの減少は統計的に有意となる間際である）を除いては、血糖値が有意に減少した（各時点での生理食塩水群に比べて）（図６）。結果は、試験したすべての用量の化合物＃４３が、単回注射の１時間後に血糖値を低下させるのに有効であることを示した。これは、化合物＃４３が、グルコース低下効果を引き出すために、短期間（すなわち１時間）以内にｉｎ ｖｉｖｏで関連する標的組織に到達することができることを示している。絶食条件下での血糖値の低下における化合物＃４３の活性は、投与後２～５時間でピークに達し、この効果は少なくともさらに３時間維持された。試験した動物（一晩絶食させ、試験した８時間の間絶食させ続けた）をさらに絶食させることができなかったため、化合物＃４３の作用の最大有効期間はこれらの実験からは決定されなかった。
これらの結果は、１０００倍の濃度範囲にわたる化合物＃４３による急性処置が、インスリン抵抗性及び２型糖尿病の広く使用されている動物モデルにおいて血糖値を有意に低下させることを示している。化合物＃４３は速効性（治療後≦１時間）であり、少なくとも８時間は活性を維持する。
５．化合物＃４３の急性処置は、より若いＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの高血糖症への進行を減弱させる
上述のように、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスは、１０～１４日齢から始まる血漿インスリンの上昇及びおよそ４～８週齢での高血糖症（すなわち、高血糖値）を示す（Ｃｏｌｅｍａｎ ＤＬ． １９７８ Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ １４：１４１－８）。化合物＃４３が高血糖症の発症を減弱させる潜在能力を有するかどうかを試験するために、より若いマウスに化合物＃４３の単回用量を急性注射で投与した。簡潔に述べると、通常の摂食条件下の６週齢のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂ雄マウスに、０．２％ＤＭＳＯまたは化合物＃４３を含有する生理食塩水を５．４ｍｇ／ｋｇ体重の用量で１回腹腔内注射した。処置の２４時間後、これらのマウスに食物及び水を自由に摂取させている間に、これらのマウスの血糖値を測定した。
上述のように、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスは、１０～１４日齢から始まる血漿インスリンの上昇及びおよそ４～８週齢での高血糖症（すなわち、高血糖値）を示す（Ｃｏｌｅｍａｎ ＤＬ． １９７８ Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ １４：１４１－８）。化合物＃４３が高血糖症の発症を減弱させる潜在能力を有するかどうかを試験するために、より若いマウスに化合物＃４３の単回用量を急性注射で投与した。簡潔に述べると、通常の摂食条件下の６週齢のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂ雄マウスに、０．２％ＤＭＳＯまたは化合物＃４３を含有する生理食塩水を５．４ｍｇ／ｋｇ体重の用量で１回腹腔内注射した。処置の２４時間後、これらのマウスに食物及び水を自由に摂取させている間に、これらのマウスの血糖値を測定した。
図７に示すように、生理食塩水処置の２４時間後のこれらの若いＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血糖値は有意に増加したが（約２０％増加）、これは、これらのマウスが依然として高血糖症を発症するプロセス内にあることを示している。対照的に、化合物＃４３を処置すると、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血糖値は有意に減少した（約２０％）（図７）。
これらの結果は、化合物＃４３が高血糖症の発症を減弱させる潜在能力を有することを示唆している。さらに、これらの研究は、グルコース出力の低下における化合物＃４３の有効性が、摂食条件下のこれらの糖尿病マウスにおいて、少なくとも２４時間継続する可能性が高いことも示している。
６．化合物＃４３投与後の糖尿病Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの耐糖能の増強
糖負荷試験は、血糖が高く急速に上昇した後（例えば、通常は食事後）に身体がグルコースを処理する方法における異常を同定する。インスリンは、肝臓におけるグルコース産生の阻害だけでなく、筋肉、肝臓、脂肪細胞でのグルコースの取り込み、貯蔵、代謝でも重要な役割を果たし、血流中のグルコースレベルを低下させる。
糖負荷試験は、血糖が高く急速に上昇した後（例えば、通常は食事後）に身体がグルコースを処理する方法における異常を同定する。インスリンは、肝臓におけるグルコース産生の阻害だけでなく、筋肉、肝臓、脂肪細胞でのグルコースの取り込み、貯蔵、代謝でも重要な役割を果たし、血流中のグルコースレベルを低下させる。
糖尿病患者は、インスリンを産生できないか、またはインスリンに効率的に応答できず、グルコース恒常性を維持できないため、非常に低い耐糖能を有する。本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究は、化合物＃４３がインスリンを模倣できるだけでなく、インスリンを迂回してグルコース産生を阻害することができることを示している（図１～図２）。Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスは、耐糖能障害及びインスリン抵抗性がこれらの変異マウスにおいて提示されるという事実を考慮すると、グルコース恒常性の維持における化合物＃４３の役割を調べる理想的なマウスＩＩ型糖尿病モデルである。したがって、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスへのそれぞれの化合物の腹腔内注射後のマウスの耐糖能の向上に対する化合物＃４３及び他の構造的に類似した関連するセレン及び硫黄化合物の効果を調べた。
これらの雄マウスに、３８日齢で、生理食塩水（０．２％ＤＭＳＯを含む）、化合物＃Ｃ、＃４３、または＃５０（体重１ｋｇあたり２５μｇセレンの各化合物）を、４３日間腹腔内注射した。処置の最後に、これらのマウスを一晩絶食させ、グルコース（２ｇ／ｋｇ体重）を注射し、グルコース注射後０．２５時間（１５分）、０．５時間（３０分）、１時間（６０分）及び２時間（１２０分）時点で、血糖値を測定した。グルコース注射の直前（ゼロ時点と呼ばれる）の血糖値も記録した。
図８Ａに示すように、グルコース注射後、生理食塩水で処置したＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスでは、以下の試験したすべての時点で０．２５時間から始まる血糖値の有意な増加が観察された。本明細書に記載するように、これらの分析に使用した血糖値測定器のグルコース測定限界は６００ｍｇ／ｄＬであった。したがって、この限界を超えるグルコースレベルは６００ｍｇ／ｄＬとして記録した。したがって、特に生理食塩水で処置した動物の場合、グルコース注射後の試験した時点での特定の測定値は、真の血糖濃度の過小評価を十分に表している場合がある。
化合物＃Ｃで処置したマウスでは、生理食塩水処置群と同様に、グルコース注射後の試験したすべての時点での血糖値は非常に高いままであった（図８Ａ）。これらの結果は、試験した用量の化合物＃Ｃがこれらのインスリン抵抗性糖尿病マウスの耐糖能を向上させなかったことを示唆している。
化合物＃５０の処置では、生理食塩水処置群と比較した場合、図８Ａにおけるグルコース注射後０．２５、０．５または１時間において明らかな減少はなかったものの、グルコース注射後２時間時点でグルコースレベルが有意に減少した。これらの結果は、化合物＃５０がこれらの糖尿病マウスの耐糖能を向上させるうえで何らかの効果を有する可能性が高いことを示唆している。
対照的に、化合物＃４３をで処置したＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスでは、グルコース注射後０．２５、０．５及び１時間での血糖値は、生理食塩水、化合物＃Ｃまたは＃５０で処置したマウスよりも明らかに低かった（図８Ａ）。血糖値測定器の測定限界により、グルコース注射後のこれらの時点での、他の処置と比較した化合物＃４３処置マウスにおけるグルコースレベルの低下の程度は、図８Ａに示すものよりもはるかに劇的であったと思われる。グルコース注射の２時間後、化合物＃４３処置Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血糖値は、生理食塩水、化合物＃Ｃまたは化合物＃５０で処置した同腹仔よりもはるかに低く（図８Ａ参照）、注射前の血糖値までほぼ完全に回復していた。グルコース注射後２時間での化合物＃４３処置Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスのグルコースレベルの低下は、生理食塩水または化合物＃Ｃ処置マウスと比較した場合、有意に異なっていた（Ｐ＜０．００１）。これらの結果は、試験した用量での化合物＃Ｃではなく化合物＃４３が、これらのインスリン抵抗性糖尿病マウスのインスリン作用を、耐糖能の向上によって評価されるように、ほぼ完全に回復させることができ、化合物＃５０もまた、グルコースクリアランスの向上においていくつかの有益な効果を有し得ることを示唆している。
Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスのグルコースクリアランスを向上させる化合物＃４３の高い潜在能力をさらに確認し、化合物＃４３のセレン原子がこの効果に必要かどうかを調べるために、３８日齢の雄Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、等量のセレンまたは硫黄をそれぞれ含有する化合物＃４３または＃６８を２か月間、腹腔内注射することにより、毎日処置した。処置の終わりに、これらのマウスを一晩絶食させ、上記のように糖負荷試験に供した。
図８Ｂに示すように、化合物＃６８で処置したＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおいて、グルコースの注射後０．２５時間で始まる以下の試験したすべての時点における血糖値の有意な増加が観察された。グルコース注射後２時間の時点で血糖値の明らかな低下はなかったが（０．２５、０．５、１時間のレベルと比較した場合）、このことは、試験した用量の化合物＃６８が、これらのインスリン抵抗性糖尿病マウスにおける耐糖能の向上効果をほとんど有していないか、またはまったく有していないことを示している。
化合物＃４３で処置したＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスでは、グルコースチャレンジ注射前の血糖値は、化合物＃６８で処置したマウスよりも有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。これらの結果は、この糖尿病マウスモデルにおける空腹時血糖値の低下において、化合物＃４３が化合物＃６８よりも強力であるという上記の観察結果と一致した（図４）。グルコース注射の０．２５、０．５及び１時間後の化合物＃４３処置Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血糖値は、化合物＃６８で処置したマウスよりも低かった。グルコース注射の２時間後、化合物＃４３処置Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血糖値は、化合物＃６８で処置した同腹仔よりも有意に低かった（図８Ｂ参照、Ｐ＜０．００１）。この実験における化合物＃４３処置Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスのグルコースクリアランス曲線（図８Ｂ）は、上記の最初の糖負荷試験で観察された曲線（図８Ａ）とほぼ同一であった。ここでも、血糖値測定器の測定限界により、グルコース注射後のこれらの時点での化合物＃６８処置マウスと比較した化合物＃４３処置マウスのグルコースレベルの減少は、図８Ｂに示すものよりもはるかに劇的であった。いずれにせよ、上記の結果は、試験した用量の化合物＃４３が耐糖能を劇的に向上させ、化合物＃４３のセレン原子を硫黄に置換すると、これらのインスリン抵抗性糖尿病Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおけるグルコースクリアランスの促進能力がほぼ完全に破壊されることをさらに確認するものである。
最後に、化合物＃４３のリボース基の２’及び３’位の両方のアセチル基をプロパノイルまたはブタノイル基で置換することにより、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスのグルコースクリアランスを向上させることができるかどうかを調べた。４１日齢の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、等量のセレンを含有する化合物＃４３、＃６９または＃７０を、それぞれ４３日間、腹腔内注射によって毎日処置した。処置の終わりに、これらのマウスを一晩絶食させ、上記のように糖負荷試験に供した。
図８Ｃに示すように、生理食塩水で処置したＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおいて、グルコースの注射後０．２５時間から開始する以下の試験したすべての時点における血糖値の有意な増加が観察された。グルコース注射後１時間の時点の前には血糖値の明らかな減少はなかったが（０．２５及び０．５時間のグルコースレベルと比較した場合）、これらのインスリン抵抗性糖尿病マウスでは、グルコース注射後２時間においてグルコースレベルがわずかに減少していた。
化合物＃６９処置は、生理食塩水処置群と比較した場合、図８Ｃのグルコース注射後０．２５、０．５または１時間における血糖値の明らかな低下はなかったものの、グルコース注射後２時間の時点でグルコースレベルのわずかであるが有意でない低下をもたらした。これらの結果は、化合物＃６９がこれらの糖尿病マウスの耐糖能を向上させるうえで、ある程度の効果を有し得ることを示唆している。
化合物＃７０処置マウスでは、グルコース注射前の空腹時血糖値は、生理食塩水処置群よりも低かった（図８Ｃ）。グルコース注入後、特に２時間の時点で、生理食塩水処置マウスと比較した場合、化合物＃７０処置マウスでは血糖値にわずかではあるが有意ではない減少があった。これらの結果は、化合物＃６９と同様に、試験した用量の化合物＃７０も、これらのインスリン抵抗性糖尿病マウスの耐糖能を向上させるうえで何らかの効果を有する可能性が高いことを示唆している。
対照的に、化合物＃４３処置Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおけるグルコース注射の０．２５及び０．５時間後の血糖値は、生理食塩水、化合物＃６９または＃７０で処置したマウスよりも明らかに低かった（図８Ｃ）。グルコース注射の１時間後、化合物＃４３処置Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血糖値は、生理食塩水、化合物＃６９または化合物＃７０で処置した同腹仔よりも有意に低かった（図８Ｃ）。グルコース注射の２時間後でも、化合物＃４３処置Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血糖値は、生理食塩水、化合物＃６９または化合物＃７０で処置したマウスよりもはるかに低かった。グルコース注射の２時間後の化合物＃４３処置Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスのグルコースレベルの低下は、生理食塩水処置マウスと比較した場合に有意に異なっていた（Ｐ＜０．０５）。ここでも、血糖値測定器の測定限界のため、グルコース注射後の各時点での、他の処置に比べての化合物＃４３処置マウスにおけるグルコースレベルの減少の程度は、図８Ｃに示すものよりもはるかに劇的である可能性が高かった。いずれにせよ、これらの結果は、試験した用量での化合物＃４３がこれらのインスリン抵抗性糖尿病マウスの耐糖能を劇的に向上させることができることをさらに示している。また、これらの結果は、化合物＃６９及び＃７０がグルコースクリアランスの向上に有益な効果をもたらし得ることを示唆している。化合物＃４３の化学構造を化合物＃６９及び＃７０と比較すると、化合物＃４３のリボース基の２’及び３’位の両方のアセチル基が最適なグルコースクリアランス活性に不可欠であり、化合物＃４３のこれらのジアセチル基をジプロパノイルまたはジブタノイル基に置換すると、これらのインスリン抵抗性糖尿病Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスのグルコースクリアランスを促進する能力が有意に減弱することが明らかである。
まとめると、上記の研究は、試験した用量の化合物＃４３がＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの耐糖能を有意に向上させることができることを示している。このプロセスでの化合物＃４３の作用は、骨格筋、肝臓、及び脂肪組織におけるグルコースのクリアランスにおけるインスリン感受性の向上により媒介される可能性が高い。さらに、セレンは化合物＃４３の作用に不可欠であるが、その存在自体のみでは、糖尿病の被験体にグルコースクリアランス能力を付与するのに十分ではない。セレン原子は、極めて特定の化学形態で提示しなければならない。これは、化合物＃５０の活性が低いことと、化合物Ｃの活性がないことから明らかであり；それらのどちらも化合物＃４３と構造的には非常に類似している。さらに、化合物＃４３のリボース基の２’及び３’位のアセチル基も、グルコースクリアランスにおける活性を維持するために必要である。
実施例４：糖尿病レプチン受容体（Ｌｅｐｒ）偶発ヌル変異マウスの肝臓及び化合物＃４３処置後の培養肝細胞における糖新生酵素遺伝子Ｇ６ｐｃの発現の阻害、ならびに培養肝細胞でのＧ６ｐｃ発現の阻害におけるインスリン作用の増強
肝臓は、グルコースを産生して血流中の正常なグルコースレベルを維持するための主要な器官である。グルコース－６－ホスファターゼ触媒サブユニット（Ｇ６ｐｃ）は、肝臓の糖新生に不可欠な酵素である。Ｇ６ｐｃ発現の調節に対する化合物＃４３の効果を、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で研究した。
肝臓は、グルコースを産生して血流中の正常なグルコースレベルを維持するための主要な器官である。グルコース－６－ホスファターゼ触媒サブユニット（Ｇ６ｐｃ）は、肝臓の糖新生に不可欠な酵素である。Ｇ６ｐｃ発現の調節に対する化合物＃４３の効果を、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で研究した。
材料及び方法
化合物
化合物＃４３、＃Ｃ、＃Ｄ、＃Ｅ、及び＃５０は、Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の化学実験室で合成した。試験したすべての化合物の純度は、ＨＰＬＣによる測定で≧９９％であることが確認された。
化合物
化合物＃４３、＃Ｃ、＃Ｄ、＃Ｅ、及び＃５０は、Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の化学実験室で合成した。試験したすべての化合物の純度は、ＨＰＬＣによる測定で≧９９％であることが確認された。
Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける化合物＃４３及び＃５０のｉｎ ｖｉｖｏ処置
３８日齢の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入）に、０．２％ＤＭＳＯ、化合物＃５０、または化合物＃４３を含有する生理食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）を毎日腹腔内注射した。５２日間（体重１キログラムあたり２５μｇセレン当量の各化合物、滅菌生理食塩水で希釈）。処置後、肝臓を採取し、ＲＮＡ分析を行った。
３８日齢の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入）に、０．２％ＤＭＳＯ、化合物＃５０、または化合物＃４３を含有する生理食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）を毎日腹腔内注射した。５２日間（体重１キログラムあたり２５μｇセレン当量の各化合物、滅菌生理食塩水で希釈）。処置後、肝臓を採取し、ＲＮＡ分析を行った。
細胞株及び細胞増殖
ヒト肝癌ＨｅｐＧ２及びマウス肝臓ＡＭＬ－１２細胞は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から購入した。ＨｅｐＧ２細胞は、１０％ＦＢＳを添加したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）で増殖させた。ＡＭＬ－１２細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、４０ｎｇ／ｍｌデキサメタゾン（Ｄｅｘ，Ｓｉｇｍａ）及び１×ＩＴＳ（０．０１ｍｇ／ｍｌウシインスリン、０．００５５ｍｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウムを含む）溶液（Ｓｉｇｍａ）を添加したダルベッコ改良イーグル培地及びハムＦ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）培地で増殖させた。
ヒト肝癌ＨｅｐＧ２及びマウス肝臓ＡＭＬ－１２細胞は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から購入した。ＨｅｐＧ２細胞は、１０％ＦＢＳを添加したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）で増殖させた。ＡＭＬ－１２細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、４０ｎｇ／ｍｌデキサメタゾン（Ｄｅｘ，Ｓｉｇｍａ）及び１×ＩＴＳ（０．０１ｍｇ／ｍｌウシインスリン、０．００５５ｍｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウムを含む）溶液（Ｓｉｇｍａ）を添加したダルベッコ改良イーグル培地及びハムＦ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）培地で増殖させた。
ＲＮＡ分析のための細胞処置
基底Ｇ６ｐｃ発現（糖尿病刺激：８－ＣＰＴ／Ｄｅｘの非存在下）のＲＮＡ分析のために、増殖させたＡＭＬ－１２細胞及びＨｅｐＧ２細胞を、それぞれ１０％ＦＢＳ ＩＴＳフリー及びＤｅｘフリーのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地及び１０％ＦＢＳ ＥＭＥＭ培地中、２４ウェルプレート（０．５～２×１０５細胞／ウェル）上で一晩培養した。これらの細胞をＰＢＳで２回すすぎ、残留血清を除去した。次いで、ＰＢＳで洗浄したＨｅｐＧ２細胞を、無血清ＥＭＥＭ培地中のインスリンまたは化合物＃４３の非存在下または存在下で４０時間処置した。いくつかの実験では、ＰＢＳで洗浄したＡＭＬ－１２細胞を、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、化合物＃４３または他のセレン化合物の非存在下または存在下で、２４時間インキュベートした。他の実験では、増殖させたＡＭＬ－１２細胞を、１０％ＦＢＳを含むがＩＴＳ／ＤｅｘフリーのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２４時間、化合物＃４３（１５０または３００ｐｐｂ）の非存在下または存在下で前処置した。２４時間処置後、ＡＭＬ－１２細胞をＰＢＳで２回洗浄し（培養液中の残留血清を除去するため）、次いで無血清ＤＭＥＭ／Ｄｅｘ培地中、インスリン、化合物＃４３またはその両方で６時間処置した。
基底Ｇ６ｐｃ発現（糖尿病刺激：８－ＣＰＴ／Ｄｅｘの非存在下）のＲＮＡ分析のために、増殖させたＡＭＬ－１２細胞及びＨｅｐＧ２細胞を、それぞれ１０％ＦＢＳ ＩＴＳフリー及びＤｅｘフリーのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地及び１０％ＦＢＳ ＥＭＥＭ培地中、２４ウェルプレート（０．５～２×１０５細胞／ウェル）上で一晩培養した。これらの細胞をＰＢＳで２回すすぎ、残留血清を除去した。次いで、ＰＢＳで洗浄したＨｅｐＧ２細胞を、無血清ＥＭＥＭ培地中のインスリンまたは化合物＃４３の非存在下または存在下で４０時間処置した。いくつかの実験では、ＰＢＳで洗浄したＡＭＬ－１２細胞を、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、化合物＃４３または他のセレン化合物の非存在下または存在下で、２４時間インキュベートした。他の実験では、増殖させたＡＭＬ－１２細胞を、１０％ＦＢＳを含むがＩＴＳ／ＤｅｘフリーのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２４時間、化合物＃４３（１５０または３００ｐｐｂ）の非存在下または存在下で前処置した。２４時間処置後、ＡＭＬ－１２細胞をＰＢＳで２回洗浄し（培養液中の残留血清を除去するため）、次いで無血清ＤＭＥＭ／Ｄｅｘ培地中、インスリン、化合物＃４３またはその両方で６時間処置した。
糖尿病刺激誘発Ｇ６ｐｃ発現のＲＮＡ分析のために、ＡＭＬ－１２細胞を、１０％ＦＢＳを含むがＩＴＳ／ＤｅｘフリーのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中の化合物＃４３（１５０または３００ｐｐｂ）の非存在下または存在下で２４時間前処置した。次いで、これらの細胞をＰＢＳで２回洗浄して残留血清を除去し、無血清の通常のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、インスリン（１０または１００ｎＭ）、または０．１ｍＭ ８－ＣＰＴ（Ｓｉｇｍａ）及び０．５μＭ Ｄｅｘの存在下または非存在下で化合物＃４３（１５０または３００ｐｐｂ）とともに、さらに６時間インキュベートした。
ＲＮＡの単離及びリアルタイムＰＣＲ分析
生理食塩水またはセレン化合物で処置したＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス由来の全ＲＮＡを、製造元のプロトコールに従ってＱｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙ ＲＮＡ単離キットを使用して単離した。培養細胞由来の全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造元のプロトコールに従って分離し、ＤＮａｓｅ Ｉ存在下でインキュベートして潜在的な混入ゲノムＤＮＡを除去した。以前に記載されたように（Ｌａｎ ｅｔ ａｌ ＥＭＢＯ Ｊ ２００３）、Ａｐｐｌｉｅｄ－ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＲＴキットと事前設計したＴａｑｍａｎプローブ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡ試料をリアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴ－ＰＣＲ）分析に供した。データは、各試料のアクチンＢ（Ａｃｔｂ）ｍＲＮＡレベルによって正規化し、３～５個の試料の平均値±ＳＥＭとして提示する。
生理食塩水またはセレン化合物で処置したＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス由来の全ＲＮＡを、製造元のプロトコールに従ってＱｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙ ＲＮＡ単離キットを使用して単離した。培養細胞由来の全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造元のプロトコールに従って分離し、ＤＮａｓｅ Ｉ存在下でインキュベートして潜在的な混入ゲノムＤＮＡを除去した。以前に記載されたように（Ｌａｎ ｅｔ ａｌ ＥＭＢＯ Ｊ ２００３）、Ａｐｐｌｉｅｄ－ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＲＴキットと事前設計したＴａｑｍａｎプローブ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡ試料をリアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴ－ＰＣＲ）分析に供した。データは、各試料のアクチンＢ（Ａｃｔｂ）ｍＲＮＡレベルによって正規化し、３～５個の試料の平均値±ＳＥＭとして提示する。
統計解析
該当する場合、スチューデントｔ検定を使用して、Ｐ値が０．０５未満である処置群間の統計的有意性を、統計的に有意であると判定した。
該当する場合、スチューデントｔ検定を使用して、Ｐ値が０．０５未満である処置群間の統計的有意性を、統計的に有意であると判定した。
結果：
１．Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓におけるＧ６ｐｃ ｍＲＮＡ発現の分析
以前の実験は、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血糖値及びＨｂＡ１ｃレベルの阻害における化合物＃４３及び＃５０の異なる効果を示した（図３）。特定の仮説に拘泥することを望むものではないが、そのような異なる効果は、少なくとも部分的には、ｉｎ ｖｉｖｏでの糖新生Ｇ６ｐｃ遺伝子の発現に対するこれらの化合物の潜在的な示差的作用によるものである可能性がある。したがって、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスでのＧ６ｐｃ ｍＲＮＡ発現を、これら２つの化合物の慢性処置後に測定した。
１．Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓におけるＧ６ｐｃ ｍＲＮＡ発現の分析
以前の実験は、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血糖値及びＨｂＡ１ｃレベルの阻害における化合物＃４３及び＃５０の異なる効果を示した（図３）。特定の仮説に拘泥することを望むものではないが、そのような異なる効果は、少なくとも部分的には、ｉｎ ｖｉｖｏでの糖新生Ｇ６ｐｃ遺伝子の発現に対するこれらの化合物の潜在的な示差的作用によるものである可能性がある。したがって、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスでのＧ６ｐｃ ｍＲＮＡ発現を、これら２つの化合物の慢性処置後に測定した。
図９に示すように、肝臓のＧ６ｐｃ ｍＲＮＡレベルは、化合物＃５０の処置後、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスでわずかに減少したが、有意ではなかった。しかしながら、化合物＃４３の処置により、生理食塩水で処置した対照と比較した場合、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓のＧ６ｐｃ ｍＲＮＡレベルが劇的に減少（約５６％減少）した（図９）。
総合すると、これらの結果は、Ｇ６ｐｃ発現の阻害においてこれらのセレン化合物の示差的効果があり得ること、及び化合物＃４３がこれらの重度のＩＩ型糖尿病マウスの肝臓におけるＧ６ｐｃ発現の強力な阻害剤であることのｉｎ ｖｉｖｏでのエビデンスを提供する。これらの結果は、化合物＃４３処置後のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血糖値とＨｂＡ１ｃレベルの低下（図３）が、少なくとも部分的にはＧ６ｐｃ ｍＲＮＡ発現の減弱によるものであることを示唆している。さらに、Ｇ６ｐｃの発現はインスリンシグナル伝達に応じて調節され、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスがインスリン抵抗性であるため、これらの結果は、化合物＃４３がインスリンを迂回するか、インスリン作用を回復させてこれらの糖尿病マウスのＧ６ｐｃ発現を調節することができることを示唆している。
２．化合物＃４３処置後のマウス及びヒト肝細胞におけるＧ６ｐｃ ｍＲＮＡ発現の阻害ならびにＧ６ｐｃ発現の阻害におけるインスリン作用の増強
上記の研究は、化合物＃４３がインスリン抵抗性条件下で糖尿病マウスのＧ６ｐｃ発現を有意に阻害することができることを明らかにした。培養肝細胞を使用して、（ａ）Ｇ６ｐｃ発現に対するセレン化合物の示差的な効果があるかどうか、（ｂ）肝臓のＧ６ｐｃ発現に化合物＃４３が直接影響を及ぼすかどうか、及び（ｃ）Ｇ６ｐｃ発現の調節において化合物＃４３がインスリン作用を向上させることができるかどうかを調べた。化合物の効果を調べるために、２つの治療レジメン（無血清条件下での肝細胞の直接的な化合物処置、及び血清含有培地中の化合物による肝細胞の前処置とそれに続く無血清条件下での化合物の再処置）を実施して、これらの肝細胞におけるＧ６ｐｃ発現に対する化合物＃４３の効果を試験した。
上記の研究は、化合物＃４３がインスリン抵抗性条件下で糖尿病マウスのＧ６ｐｃ発現を有意に阻害することができることを明らかにした。培養肝細胞を使用して、（ａ）Ｇ６ｐｃ発現に対するセレン化合物の示差的な効果があるかどうか、（ｂ）肝臓のＧ６ｐｃ発現に化合物＃４３が直接影響を及ぼすかどうか、及び（ｃ）Ｇ６ｐｃ発現の調節において化合物＃４３がインスリン作用を向上させることができるかどうかを調べた。化合物の効果を調べるために、２つの治療レジメン（無血清条件下での肝細胞の直接的な化合物処置、及び血清含有培地中の化合物による肝細胞の前処置とそれに続く無血清条件下での化合物の再処置）を実施して、これらの肝細胞におけるＧ６ｐｃ発現に対する化合物＃４３の効果を試験した。
最初に、マウス肝臓ＡＭＬ－１２細胞を、無血清、インスリン－トランスフェリン－ナトリウム亜セレン酸サプリメント（ＩＴＳ）及びデキサメタゾン（Ｄｅｘ）フリーの培地中、化合物なし（対照）、化合物ＣＤＥの組み合わせ、化合物＃Ｃ、化合物＃Ｄ、化合物＃５０及び化合物＃４３を、３００十億分率（３００ｐｐｂ）のセレン用量（各化合物３．８μＭに相当）で２４時間処置し、Ｇ６ｐｃ発現に対するこれらのセレン化合物の示差的な効果があるかどうかを調べた。図１０Ａに示すように、化合物ＣＤＥ（３００ｐｐｂの各化合物）は、Ｇ６ｐｃ ｍＲＮＡ発現の有意な減少をもたらした。しかしながら、試験した用量での化合物＃Ｃ、＃Ｄ、または＃５０は、ＡＭＬ－１２細胞におけるＧ６ｐｃ発現を有意に阻害しなかった。対照的に、同じセレン用量の化合物＃４３での処置は、ＡＭＬ－１２細胞におけるＧ６ｐｃ発現のロバストな減少（対照群と比較した場合、約６０％の減少）をもたらした（図１０Ａ）。化合物＃４３処置後のＧ６ｐｃ発現の減少の程度（６０％）は、化合物ＣＤＥ併用処置に比べてより顕著であった（約４０％減少）。これらの結果は、これらのセレノ有機化合物がｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧ６ｐｃ発現の阻害に示差的な影響を与える場合があり、化合物＃４３がプロセス中の試験したすべての化合物の中で最も強力な化合物であることを示唆している。これは、上記のｉｎ ｖｉｖｏマウスでの研究と一致している（図９）。この実験はＡＭＬ－１２細胞において完全に無血清の条件下（すなわち、インスリンまたは任意の他の増殖因子の非存在下）で行われたため、これらの結果は、化合物＃４３がインスリンを模倣するが迂回して、化合物ＣＤＥの組み合わせよりも高い効力で、ＡＭＬ－１２細胞のＧ６ｐｃ発現を直接阻害することができることを示唆している。
次いで、別の肝細胞株であるヒトＨｅｐＧ２細胞を、無血清培地中、１００ｎＭのインスリンまたは６００ｐｐｂの化合物＃４３の存在下で４０時間インキュベートして、Ｇ６ＰＣ発現に対する化合物＃４３の直接的な阻害効果をさらに検証した。図１０Ｂに示すように、インスリン処置はＧ６ＰＣ発現の有意な減少をもたらしたが、このことは、インスリンシグナル伝達がＨｅｐＧ２細胞で機能していることを示している。さらに、完全に無血清の条件下で化合物＃４３で処置した後のＨｅｐＧ２細胞のＧ６ＰＣ ｍＲＮＡレベルは、対照群と比較すると有意に減弱していた（図１０Ｂ）。化合物＃４３処置後のＨｅｐＧ２細胞のＧ６ＰＣ発現の減少は、図１で観察されたグルコース産生の減少と合致する。したがって、これらの結果は、化合物＃４３がインスリンを模倣するが、迂回して、Ｇ６ＰＣ発現を直接下方制御し、それによりＨｅｐＧ２細胞のグルコース産生を阻害することをさらに示唆している。
最後に、ＡＭＬ－１２細胞を、血清を含むがＩＴＳ／Ｄｅｘフリーの培地中、化合物＃４３で２４時間前処置し、続いて、ＦＢＳ／ＩＴＳ／Ｄｅｘフリーの培地中、インスリンの存在下または非存在下でこの化合物を６時間再処置して、化合物＃４３がＧ６ｐｃ発現を阻害することができるかどうか、及びＧ６ｐｃ発現の下方制御においてインスリンと化合物＃４３の間に相加効果または相乗効果があるかどうかをさらに調べた。図１０Ｃに示すように、１０ｎＭのインスリン処置により、対照群（図１０Ｃの第１のバー）と比較した場合、Ｇ６ｐｃ ｍＲＮＡレベルの有意な減少（約６５％）が生じた。インスリンと同様に、化合物＃４３の処置（１５０ｐｐｂと３００ｐｐｂの両方で）も、１０ｎＭインスリンと比較可能な減少レベルでＧ６ｐｃ発現の有意な減少をもたらした。さらに、Ｇ６ｐｃ ｍＲＮＡレベルの減少は、化合物＃４３またはインスリン単独を用いた処置に比べて、化合物＃４３での前処置とそれに続く化合物＃４３及びインスリンの両方の共処置後のＡＭＬ－１２においてより顕著であった。これらの結果は、化合物＃４３がインスリンを模倣するが迂回して、ＡＭＬ－１２細胞のＧ６ｐｃ発現を阻害することができるという上記の観察結果をさらに裏付けている。これらの結果は、化合物＃４３がＡＭＬ－１２細胞のＧ６ｐｃ発現の下方制御においてインスリン作用を増強することができることも示唆している。
３．擬似糖尿病条件下で培養したＡＭＬ－１２細胞での化合物＃４３処置後のＧ６ｐｃ発現の調節におけるＧ６ｐｃ発現の阻害及びインスリン作用の向上（８－ＣＰＴ及びＤｅｘの両方により刺激）
サイクリックＡＭＰ（８－ＣＰＴ）及びＤｅｘは、肝臓におけるＧ６ｐｃ発現及びグルコース産生の周知の刺激剤であり、ｉｎ ｖｉｖｏでの糖尿病状態を模倣する。Ｇ６ｐｃ発現に対する化合物＃４３の効果をさらに調べるために、細胞透過性８－（４－クロロフェニルチオ）ｃＡＭＰ（８－ＣＰＴ）及びデキサメタゾン（Ｄｅｘ）で共処置したＡＭＬ－１２細胞でのＧ６ｐｃ ｍＲＮＡ発現を調べた。簡潔に述べると、ＡＭＬ－１２肝細胞を、１０％ＦＢＳを含むがＩＴＳ／ＤｅｘフリーのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物＃４３の非存在下または存在下で２４時間前処置した。ＰＢＳで２回洗浄した後、これらの細胞を、無血清培地中、１０ｎＭまたは１００ｎＭインスリン、０．１ｍＭ ８－ＣＰＴ、及び０．５μＭ Ｄｅｘの存在下または非存在下、これらのセレン化合物で６時間再処置した。これらの処置後、細胞を回収し、ＱＲＴ－ＰＣＲ分析に供した。
サイクリックＡＭＰ（８－ＣＰＴ）及びＤｅｘは、肝臓におけるＧ６ｐｃ発現及びグルコース産生の周知の刺激剤であり、ｉｎ ｖｉｖｏでの糖尿病状態を模倣する。Ｇ６ｐｃ発現に対する化合物＃４３の効果をさらに調べるために、細胞透過性８－（４－クロロフェニルチオ）ｃＡＭＰ（８－ＣＰＴ）及びデキサメタゾン（Ｄｅｘ）で共処置したＡＭＬ－１２細胞でのＧ６ｐｃ ｍＲＮＡ発現を調べた。簡潔に述べると、ＡＭＬ－１２肝細胞を、１０％ＦＢＳを含むがＩＴＳ／ＤｅｘフリーのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で１５０ｐｐｂまたは３００ｐｐｂの化合物＃４３の非存在下または存在下で２４時間前処置した。ＰＢＳで２回洗浄した後、これらの細胞を、無血清培地中、１０ｎＭまたは１００ｎＭインスリン、０．１ｍＭ ８－ＣＰＴ、及び０．５μＭ Ｄｅｘの存在下または非存在下、これらのセレン化合物で６時間再処置した。これらの処置後、細胞を回収し、ＱＲＴ－ＰＣＲ分析に供した。
図１１に示すように、８－ＣＰＴ／Ｄｅｘで処置したＡＭＬ－１２肝細胞では、Ｇ６ｐｃ ｍＲＮＡの発現が４１．５倍増加した（列＃１対＃２）。両方の用量のインスリン処置は、８－ＣＰＴ／Ｄｅｘ群と比較した場合、ＡＭＬ－１２細胞における８－ＣＰＴ／Ｄｅｘ誘発Ｇ６ｐｃ発現を有意に減少させた（図１１の列＃３～４対列＃２）。さらに、１５０及び３００ｐｐｂの用量での化合物＃４３もまた、８－ＣＰＴ／Ｄｅｘ誘導Ｇ６ｐｃ発現を有意に減弱させ（列＃２の４１．５から列＃５の１３へ、及び列＃８の１３．５へ減少、図１１）、１０ｎＭインスリンと比較可能な効力を有していた（列＃３、図１１）。これらの研究は、インスリンと同様に、試験した用量での化合物＃４３単独で８－ＣＰＴ／Ｄｅｘ誘発Ｇ６ｐｃ発現を阻害することができることを示した（８－ＣＰＴ／Ｄｅｘ群と比較した場合、図１１の列＃５及び＃８対＃２、約６８％の減少）。
さらに、化合物＃４３とインスリンとの併用処置（図１１の列＃６～７及び列＃９～１０）は、インスリン／化合物＃４３処置なし（列＃２）、インスリンのみ（列＃３～４）または化合物＃４３のみ（図１１の列＃５及び＃８）と比較した場合、ＡＭＬ－１２細胞における８－ＣＰＴ／Ｄｅｘ誘発Ｇ６ｐｃ発現をさらに阻害した。より劇的に、１５０ｐｐｂの化合物＃４３と１００ｎＭのインスリン及び８－ＣＰＴ／Ｄｅｘの併用処置（列＃７）、ならびに３００ｐｐｂの化合物＃４３と１００ｎＭのインスリン及び８－ＣＰＴ／Ｄｅｘの併用処置（列＃１０）におけるＧ６ｐｃ ｍＲＮＡレベルは、８－ＣＰＴ／Ｄｅｘ処置単独（列＃２）のレベルから、８－ＣＰＴ／Ｄｅｘなしの対照群（図１１の列＃１）に近いレベル（列＃７、＃１０）まで、ロバストに減少した。言い換えれば、化合物＃４３（１５０または３００ｐｐｂ）と１００ｎＭのインスリンの共処置は、ＡＭＬ－１２細胞における８－ＣＰＴ／Ｄｅｘ誘導Ｇ６ｐｃ発現をほぼ完全に消失させた。
総合すると、これらの結果は、インスリンと同様に、試験した用量において化合物＃４３単独で８－ＣＰＴ／Ｄｅｘ誘導Ｇ６ｐｃ発現を阻害することができ、また、ＡＭＬ－１２細胞における８－ＣＰＴ／Ｄｅｘ処置によるＧ６ｐｃの発現増加を阻害するうえで、インスリンと化合物＃４３の両方の併用が、インスリン単独または化合物＃４３単独に比べてより効果的であることを示している。
上記のセレン化合物に応答したＧ６ｐｃ発現低下の効果は、試験した用量でのこれらの化合物が同じ実験条件下でＡＭＬ－１２細胞またはＨｅｐＧ２細胞の生存率に影響を及ぼさなかったことから、細胞生存に及ぼすこれらのセレン化合物の潜在的な毒性効果によるものではなかった（データは示さず）。
まとめると、これらの結果は、肝臓におけるＧ６ｐｃ発現の阻害に対する化合物＃４３及び＃５０の示差的効果が存在することを示した。少なくとも、データは、化合物＃４３がｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で肝臓のＧ６ｐｃ発現を阻害する強力な化合物であることを示している。研究はさらに、通常の条件及び糖尿病をシミュレートする条件（すなわち、８－ＣＰＴ／Ｄｅｘによる細胞処置）のいずれで培養したマウス肝細胞及びヒト肝細胞においても、化合物＃４３がインスリンを模倣するが迂回して、Ｇ６ｐｃ発現を直接阻害することができることを明らかにした。さらに、化合物＃４３は、インスリン作用を向上させて、通常の条件及び擬似糖尿病条件のいずれで培養したＡＭＬ－１２細胞においても、Ｇ６ｐｃ発現を阻害することができる。総合すると、これらの結果は、化合物＃４３が、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で肝臓におけるＧ６ｐｃ発現を阻害することができ、したがってＩ型及びＩＩ型糖尿病の貴重な治療薬となりうる分子的エビデンスを提供する。
実施例５：化合物＃４３はインスリンを模倣するが迂回して、ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１（ＰＤＫ１）及びプロテインキナーゼＢ（ＡＫＴ）シグナル伝達を活性化し、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで肝臓のフォークヘッドボックスタンパク質Ｏ１（ＦＯＸＯ１）のリン酸化を増強する
フォークヘッド転写因子ＦＯＸＯ１は、肝臓内の代謝、糖新生及びインスリン感受性において重要な役割を果たす。ＦＯＸＯ１の細胞内活性は、翻訳後修飾によって緊密に調節される。特に、ＦＯＸＯ１のリン酸化はＦＯＸＯ１を核から排除し、それにより肝臓内のグルコース産生のためのＧ６ｐｃなどの標的遺伝子へのアクセスを遮断する。インスリン抵抗性または糖尿病の個体では、核からＦＯＸＯ１を排除するシグナルがないため、核内に存在し続け、Ｇ６ｐｃの転写を刺激する。Ｇ６ｐｃの発現増加は糖新生を促進し、高血糖症を引き起こす。
フォークヘッド転写因子ＦＯＸＯ１は、肝臓内の代謝、糖新生及びインスリン感受性において重要な役割を果たす。ＦＯＸＯ１の細胞内活性は、翻訳後修飾によって緊密に調節される。特に、ＦＯＸＯ１のリン酸化はＦＯＸＯ１を核から排除し、それにより肝臓内のグルコース産生のためのＧ６ｐｃなどの標的遺伝子へのアクセスを遮断する。インスリン抵抗性または糖尿病の個体では、核からＦＯＸＯ１を排除するシグナルがないため、核内に存在し続け、Ｇ６ｐｃの転写を刺激する。Ｇ６ｐｃの発現増加は糖新生を促進し、高血糖症を引き起こす。
上記のように、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの結果は、化合物＃４３がインスリン作用を模倣するが迂回してＧ６ｐｃ発現を阻害することができ、そのプロセスにおいてインスリン作用を向上させることができることを示した。ＦＯＸＯ１が肝臓の糖新生及びインスリン感受性の主要なシグナル伝達分子であり、ＰＤＫ１とＡＫＴがＦＯＸＯ１の上流の２つの主要な中間シグナル伝達分子であることから、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス、ヒト肝臓ＨｅｐＧ２細胞及びマウス肝臓ＡＭＬ－１２細胞において、化合物＃４３がインスリンと同様にＦＯＸＯ１とその上流のシグナル伝達分子であるＰＤＫ１及びＡＫＴを標的とするかどうかという疑問について調べた。
材料及び方法
化合物
化合物＃４３は、Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｉｎｃの化学実験室で合成した。試験したこの化合物の純度は、ＨＰＬＣによる測定で≧９９％であることが確認された。
化合物
化合物＃４３は、Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｉｎｃの化学実験室で合成した。試験したこの化合物の純度は、ＨＰＬＣによる測定で≧９９％であることが確認された。
Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける化合物＃４３のｉｎ ｖｉｖｏ処置及び肝臓タンパク質の調製
出生後３８日目の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入）に、０．２％ＤＭＳＯ、化合物＃４３（体重１キログラムあたり２５μｇセレンまたは硫黄当量の各化合物、滅菌生理食塩水で希釈）を含有する生理食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）を５２日間、毎日腹腔内注射した。処置後、肝臓を採取し、－８０℃で保存した。
出生後３８日目の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入）に、０．２％ＤＭＳＯ、化合物＃４３（体重１キログラムあたり２５μｇセレンまたは硫黄当量の各化合物、滅菌生理食塩水で希釈）を含有する生理食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）を５２日間、毎日腹腔内注射した。処置後、肝臓を採取し、－８０℃で保存した。
凍結肝組織を、完全プロテイナーゼ及びホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含有する無菌の氷冷ＰＢＳ中で細かく刻み、組織ホモジナイザー（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて均質化した。これらの組織ホモジネートを、タンパク質を抽出するために、完全プロテイナーゼ／ホスファターゼ阻害剤を含有するＴｈｅｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒの既製ＲＩＰＡ緩衝液（ホモジネート１部／ＲＩＰＡ緩衝液２部）で希釈した。ホモジネート中のタンパク質を、ＲＩＰＡ緩衝液で４℃、一晩抽出した。これらの一晩抽出したタンパク質溶解物を１２０００×ｇで４℃、３０分間遠心分離し、これらの組織溶解物の上清中のタンパク質レベルを、Ｐｉｅｒｃｅ Ｍｉｃｒｏ－ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－Ｐｉｅｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して製造元のプロトコールに従って測定した。
細胞培養
ヒト肝癌ＨｅｐＧ２細胞及びマウス肝臓ＡＭＬ－１２細胞株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から購入した。ＨｅｐＧ２細胞は、１０％ＦＢＳを添加したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）で培養した。ＡＭＬ－１２細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、４０ｎｇ／ｍｌデキサメタゾン（Ｄｅｘ，Ｓｉｇｍａ）及び１×ＩＴＳ（０．０１ｍｇ／ｍｌウシインスリン、０．００５５ｍｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌセレンナトリウムを含有する）溶液（Ｓｉｇｍａ）を添加したダルベッコ改良イーグル培地及びハムＦ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）培地で増殖させた。
ヒト肝癌ＨｅｐＧ２細胞及びマウス肝臓ＡＭＬ－１２細胞株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から購入した。ＨｅｐＧ２細胞は、１０％ＦＢＳを添加したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）で培養した。ＡＭＬ－１２細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、４０ｎｇ／ｍｌデキサメタゾン（Ｄｅｘ，Ｓｉｇｍａ）及び１×ＩＴＳ（０．０１ｍｇ／ｍｌウシインスリン、０．００５５ｍｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌセレンナトリウムを含有する）溶液（Ｓｉｇｍａ）を添加したダルベッコ改良イーグル培地及びハムＦ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）培地で増殖させた。
タンパク質分析のための細胞処置
ＨｅｐＧ２細胞を６ウェルプレートに播種し（７×１０５細胞／ウェル）、１０％ＦＢＳ ＥＭＥＭ培地で３０時間培養した。次いで、これらの細胞をＰＢＳで２回洗浄して残留血清を除去し、通常のＥＭＥＭ培地中で一晩血清飢餓状態にした。これらの血清飢餓状態のＨｅｐＧ２細胞を、化合物＃４３（６００ｐｐｂ）の非存在下または存在下で、０分（処置直前）、３０分、６０分、９０分、２４時間、３０時間及び４０時間処置した。
ＨｅｐＧ２細胞を６ウェルプレートに播種し（７×１０５細胞／ウェル）、１０％ＦＢＳ ＥＭＥＭ培地で３０時間培養した。次いで、これらの細胞をＰＢＳで２回洗浄して残留血清を除去し、通常のＥＭＥＭ培地中で一晩血清飢餓状態にした。これらの血清飢餓状態のＨｅｐＧ２細胞を、化合物＃４３（６００ｐｐｂ）の非存在下または存在下で、０分（処置直前）、３０分、６０分、９０分、２４時間、３０時間及び４０時間処置した。
ＡＭＬ－１２細胞を使用して、糖尿病刺激剤による誘導後に化合物＃４３が肝細胞内のＰｄｋ１／Ａｋｔ／Ｆｏｘｏ１シグナル伝達分子を調節することができるかどうかを調べた。増殖させたＡＭＬ－１２細胞を６ウェル（１×１０６細胞／ウェル）プレートに播種し、１０％ＦＢＳを含むがＩＴＳ／ＤｅｘフリーのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で２４時間培養した。次いで、これらの細胞をＰＢＳで２回洗浄して残留血清を除去し、通常のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で一晩血清飢餓状態にした。これらの血清飢餓状態のＡＭＬ１２細胞を、無血清の通常のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、１０ｎＭインスリンもしくは化合物＃４３（３００ｐｐｂ）の非存在下（対照群）または存在下、糖尿病刺激剤８－ＣＰＴ（０．１ｍＭ）及びＤｅｘ（０．５μＭ）の組み合わせを用いて、それぞれ、６０分間、９０分間、６時間処置した。
上記の処置の後、培養したＨｅｐＧ２細胞及びＡＭＬ－１２細胞を氷冷ＰＢＳで２回すすぎ、完全プロテイナーゼ及びホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含有する氷冷ＲＩＰＡ緩衝液に氷上で３０分間溶解させた。セルスクレーパーとホールピペットを使用して細胞溶解液を回収し、４℃、１２０００×ｇで３０分間遠心分離してＤＮＡペレットを除去し、タンパク質抽出物を取得した。これらの細胞溶解物の上清中のタンパク質レベルを、Ｐｉｅｒｃｅ Ｍｉｃｒｏ－ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－Ｐｉｅｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、製造元のプロトコールに従って測定した。
ウエスタンブロット分析
前述のように、肝組織タンパク質１００マイクログラム、または対照及び化合物（複数可）処置したＨｅｐＧ２細胞もしくはＡＭＬ－１２細胞由来の全タンパク質５マイクログラムをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分離に供し、次いでＰＶＤＦ膜に転写した。（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ． ２００８ Ｓｃｉｅｎｃｅ）。５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で膜をブロックし、特異的な一次抗体の存在下でインキュベートした後、ＨＲＰ結合抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体（１：５０００希釈、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｉｎｃ．）の存在下でインキュベートした。Ｇａｐｄｈ（Ｌｉ－ＣＯＲ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）以外のすべての一次抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｉｎｃから購入した。膜ブロットの陽性シグナルは、Ａｍｅｒｓｈａｍのｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｐｒｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を使用して検出した。膜ブロット上のこれらの発光シグナルの画像を、ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｆｃ Ｉｍａｇｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）を使用してキャプチャした。ＧＥ ＷＢ ＥＣＬ－ｐｒｉｍｅ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎプロトコール（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に記載されているように、同じ膜ブロットを除去し、別の抗体で再ブロットした。ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してウエスタンブロットのタンパク質バンド濃度を測定し、各試料のＧａｐｄｈまたはＡｃｔｂ／ＡＣＴＢレベルで正規化した。データは、群ごとに３つの試料の平均値±ＳＥＭとして提示する。
前述のように、肝組織タンパク質１００マイクログラム、または対照及び化合物（複数可）処置したＨｅｐＧ２細胞もしくはＡＭＬ－１２細胞由来の全タンパク質５マイクログラムをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分離に供し、次いでＰＶＤＦ膜に転写した。（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ． ２００８ Ｓｃｉｅｎｃｅ）。５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で膜をブロックし、特異的な一次抗体の存在下でインキュベートした後、ＨＲＰ結合抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体（１：５０００希釈、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｉｎｃ．）の存在下でインキュベートした。Ｇａｐｄｈ（Ｌｉ－ＣＯＲ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）以外のすべての一次抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｉｎｃから購入した。膜ブロットの陽性シグナルは、Ａｍｅｒｓｈａｍのｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｐｒｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を使用して検出した。膜ブロット上のこれらの発光シグナルの画像を、ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｆｃ Ｉｍａｇｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）を使用してキャプチャした。ＧＥ ＷＢ ＥＣＬ－ｐｒｉｍｅ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎプロトコール（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に記載されているように、同じ膜ブロットを除去し、別の抗体で再ブロットした。ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してウエスタンブロットのタンパク質バンド濃度を測定し、各試料のＧａｐｄｈまたはＡｃｔｂ／ＡＣＴＢレベルで正規化した。データは、群ごとに３つの試料の平均値±ＳＥＭとして提示する。
統計解析
該当する場合、スチューデントｔ検定を実行して、２つの群間の統計的差異を決定した。０．０５未満のＰ値を有意とみなした。
該当する場合、スチューデントｔ検定を実行して、２つの群間の統計的差異を決定した。０．０５未満のＰ値を有意とみなした。
結果：
１．化合物＃４３による慢性処置後のインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓におけるＰｄｋ１、Ａｋｔ、及びＦｏｘｏ１のリン酸化の増強
動物試験により、化合物＃４３が、血糖値及びＨｂＡ１ｃレベルを低下させ、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける肝臓Ｇ６ｐｃ発現を阻害することができることが明らかとなった（図３～図７、図９）。空腹時血糖値及び血中ＨｂＡ１ｃレベルの低下は、少なくとも部分的には、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓における糖新生Ｇ６ｐｃ遺伝子発現の減弱に起因する。肝臓でのＧ６ｐｃ発現は、インスリンシグナル伝達Ｐｄｋ１／Ａｋｔ／Ｆｏｘｏ１カスケードによって制御される。したがって、このアプリケーションでは、これらのインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓で、化合物＃４３の慢性処置が、少なくともある程度、インスリンシグナル伝達を回復させる（すなわち、Ｐｄｋ１／Ａｋｔ／Ｆｏｘｏのリン酸化を増強する）ことができるかどうかを調べた。
１．化合物＃４３による慢性処置後のインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓におけるＰｄｋ１、Ａｋｔ、及びＦｏｘｏ１のリン酸化の増強
動物試験により、化合物＃４３が、血糖値及びＨｂＡ１ｃレベルを低下させ、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける肝臓Ｇ６ｐｃ発現を阻害することができることが明らかとなった（図３～図７、図９）。空腹時血糖値及び血中ＨｂＡ１ｃレベルの低下は、少なくとも部分的には、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓における糖新生Ｇ６ｐｃ遺伝子発現の減弱に起因する。肝臓でのＧ６ｐｃ発現は、インスリンシグナル伝達Ｐｄｋ１／Ａｋｔ／Ｆｏｘｏ１カスケードによって制御される。したがって、このアプリケーションでは、これらのインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓で、化合物＃４３の慢性処置が、少なくともある程度、インスリンシグナル伝達を回復させる（すなわち、Ｐｄｋ１／Ａｋｔ／Ｆｏｘｏのリン酸化を増強する）ことができるかどうかを調べた。
出生後３８日目のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、生理食塩水または化合物＃４３を体重１ｋｇあたり２５μｇセレンの用量で５２日間、毎日腹腔内注射した。上記の処置の後、肝臓組織を採取し、インスリンシグナル伝達分子に対する特異的抗体を使用したウエスタンブロット分析に供した。図１２Ａに示すように、化合物＃４３処置マウスの肝臓におけるリン酸化Ｐｄｋ１、トレオニン３０８でのリン酸化Ａｋｔ、及びセリン２５６でのリン酸化Ｆｏｘｏ１のタンパク質シグナルは、生理食塩水処置マウスのタンパク質シグナルよりも明らかに豊富あった。これらのウエスタンブロットの定量分析は、化合物＃４３での処置後、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓でｐＰｄｋ１、ｐＡｋｔ及びｐＦｏｘｏ１のタンパク質レベルが有意に上昇したことを示した（図１２Ｂ）。対照的に、化合物＃４３処置マウスでは全Ａｋｔレベルに有意な変化はなかった。Ｐｄｋ１、Ａｋｔ、及びＦｏｘｏ１のリン酸化の増加は、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスがインスリンに応答できないことが知られているにもかかわらず、化合物＃４３の慢性処置後のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓においてインスリン下流シグナル伝達カスケードが活性であることを強く示唆している。言い換えれば、これらの結果は、化合物＃４３がインスリン作用を少なくとも部分的に回復させるか、インスリンを迂回するか、またはその両方をして、Ｐｄｋ１／Ａｋｔ／Ｆｏｘｏ１のリン酸化を刺激し、これらのインスリン抵抗性糖尿病マウスの肝臓におけるＧ６ｐｃ発現及びグルコース産生の減弱をもたらすことができることを示している。
２．化合物＃４３はインスリンを模倣するが迂回して、一時的にＰＤＫ１／ＡＫＴを活性化し、その後、無血清培地中で培養したヒトＨｅｐＧ２細胞のＦＯＸＯ１を不活性化する
肝臓内でＰＤＫ１、ＡＫＴ及びＦＯＸＯ１のリン酸化を調節するための化合物＃４３のインスリン非依存性であるがインスリン様の効果があるかどうかを調べるために、血清飢餓状態のヒトＨｅｐＧ２細胞を、無血清培地中、対照及び６００ｐｐｂの化合物＃４３で３０分～４８時間の様々な時間処置した。処置した細胞をウエスタンブロット分析に供した。
肝臓内でＰＤＫ１、ＡＫＴ及びＦＯＸＯ１のリン酸化を調節するための化合物＃４３のインスリン非依存性であるがインスリン様の効果があるかどうかを調べるために、血清飢餓状態のヒトＨｅｐＧ２細胞を、無血清培地中、対照及び６００ｐｐｂの化合物＃４３で３０分～４８時間の様々な時間処置した。処置した細胞をウエスタンブロット分析に供した。
図１３Ａに示すように、３０、６０及び９０分間の化合物＃４３処置後、ＨｅｐＧ２細胞におけるリン酸化ＰＤＫ１のタンパク質シグナルが明らかに増加したが、より長い処置時点（２４時間処置後）ではそれがなかった。定量的研究により、化合物＃４３処置後、ＨｅｐＧ２細胞におけるｐＰＤＫ１の有意かつ一過性の増加が示され、ピーク増加は化合物処置後約６０～９０分であった（図１３Ｂ）。同様に、Ｔ３０８でのリン酸化ＡＫＴの有意かつ一過性の増加は、３０、６０、９０分間及び２４時間の化合物＃４３処置後のＨｅｐＧ２細胞でも観察され、ピーク増加は６０及び９０分であった（図１３Ａ、Ｃ）。対照的に、試験したすべての時点での全ＡＫＴタンパク質レベルは、化合物＃４３処置後のＨｅｐＧ２細胞において有意に変化していなかった（図１３Ａ、Ｄ）。
Ｔ２４でのリン酸化ＦＯＸＯ１のタンパク質レベルは、９０分以上化合物＃４３で処置した後、ＨｅｐＧ２細胞において有意に増加していた（図１３Ａ、Ｅ）。ＦＯＸＯ１のリン酸化の増加は、ｐＰＤＫ１及びｐＡＫＴの増加事象よりも後に観察された（図１３Ａ、１３Ｅ対１３Ｂ～Ｃ）。２４時間未満の化合物＃４３処置後では、ＨｅｐＧ２細胞の全ＦＯＸＯ１タンパク質レベルに有意な変化はなかった（図１３Ａ、１３Ｆ）。しかしながら、化合物＃４３の長期処置（３０時間または４８時間）により、ＨｅｐＧ２細胞の全ＦＯＸＯ１タンパク質がわずかではあるが統計的に有意に減少しており（図１３Ａ、Ｆ）、これは、ＨｅｐＧ２細胞のリン酸化ＦＯＸＯ１の継続的な上昇から生じるＦＯＸＯ１のプロテアソームタンパク質分解の潜在的な増加が原因であり得る。リン酸化ＦＯＸＯ１は核から排除され、これは直接的な結果として核ＦＯＸＯ１及びＧ６ｐｃ発現の減少を意味する。また、化合物＃４３処置したＨｅｐＧ２細胞ではグルコース産生の有意な減少（図１）及びＧ６ＰＣ発現（図１０Ｂ）が、ならびに化合物＃４３処置したＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスでは、高血糖症の軽減及びＧ６ｐｃ発現の低下が観察された（図３～図７、図９）。
総合すると、上記の結果は、化合物＃４３がインスリンを模倣するが迂回して、ＰＤＫ１及びＡＫＴを一時的に活性化し、次いでヒト肝臓ＨｅｐＧ２細胞のＦＯＸＯ１を不活性化することができることを示した。
３．化合物＃４３はインスリンを模倣するが迂回して、Ｐｄｋ１／Ａｋｔを一時的に活性化し、その後、擬似糖尿病条件下で培養したＡＭＬ－１２細胞においてＦｏｘｏ１を不活性化する（８－ＣＰＴとＤｅｘの両方で刺激）
前述の実施例に記載したように、化合物＃４３は、インスリンを模倣するが迂回して、ＡＭＬ－１２細胞における８－ＣＰＴ／Ｄｅｘ誘導Ｇ６ｐｃ発現を阻害することができる（図１１）。この効果は、これらのマウス肝細胞においてＦｏｘｏ１を不活性化する化合物＃４３の潜在的なインスリン様活性によるものであり得る。したがって、このアプリケーションでは、擬似糖尿病条件下で培養したＡＭＬ－１２細胞でのインスリンシグナル伝達分子のタンパク質発現を調べた（８－ＣＰＴ及びＤｅｘで刺激）。
前述の実施例に記載したように、化合物＃４３は、インスリンを模倣するが迂回して、ＡＭＬ－１２細胞における８－ＣＰＴ／Ｄｅｘ誘導Ｇ６ｐｃ発現を阻害することができる（図１１）。この効果は、これらのマウス肝細胞においてＦｏｘｏ１を不活性化する化合物＃４３の潜在的なインスリン様活性によるものであり得る。したがって、このアプリケーションでは、擬似糖尿病条件下で培養したＡＭＬ－１２細胞でのインスリンシグナル伝達分子のタンパク質発現を調べた（８－ＣＰＴ及びＤｅｘで刺激）。
図１４Ａに示すように、インスリン処置は、６０分及び９０分においてＰｄｋ１、Ａｋｔ及びＦｏｘｏ１のリン酸化を増強したが、このことは、擬似糖尿病条件下で培養したＡＭＬ－１２細胞がインスリンに応答性であることを示した。インスリンと同様に、化合物＃４３は、６０分間の化合物処置後、これらの８－ＣＰＴ／Ｄｅｘ処置ＡＭＬ－１２細胞においてＰｄｋ１、Ａｋｔ及びＦｏｘｏ１のリン酸化も有意に誘導した（図１４Ａ～図１４Ｂ）。化合物処置の９０分後に、これらのＡＭＬ－１２細胞でｐＦｏｘｏ１タンパク質レベルの有意な増加が観察されたが、ｐＰｄｋ１、ｐＡｋｔ、Ａｋｔ、及びＦｏｘｏ１を含む他の試験したすべての分子のタンパク質レベルは、化合物＃４３処置後に有意に変化していなかった（図１４Ａ、Ｃ）。化合物＃４３処置の６時間では、依然としてｐＦｏｘｏ１レベルの有意な増加、及び全Ｆｏｘｏ１タンパク質レベルのわずかではあるが有意な減少があった（図１４Ａ、Ｄ）。６時間の処置でのｐＦｏｘｏ１の増加及び全Ｆｏｘｏ１タンパク質レベルのわずかな減少は、１０ｎＭのインスリン処置後のＡＭＬ－１２細胞でも観察された（図１４Ａ、Ｅ）。ここでも、６時間の処置での全Ｆｏｘｏ１のわずかな減少は、糖尿病刺激を受けたこれらのＡＭＬ－１２細胞の細胞質ゾルでのＦｏｘｏ１の連続的なリン酸化に起因するＦｏｘｏ１タンパク質の標的化プロテアソームタンパク質分解によるものであり得る。化合物＃４３処置後のＦｏｘｏ１のリン酸化の増強は、図１１で観察される核Ｆｏｘｏ１の減少及び８－ＣＰＴ／Ｄｅｘ誘導Ｇ６ｐｃ発現の減少をもたらし得る。総合すると、これらの結果は、化合物＃４３は、インスリンと同様に、擬似糖尿病条件下で培養したＡＭＬ－１２細胞において、Ｐｄｋ１及びＡｋｔのリン酸化を一時的に誘導し、次いでＦｏｘｏ１のリン酸化を誘導することができる。
結論として、上記のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの研究により、化合物＃４３はインスリンを模倣するが迂回して、肝臓で一時的にＰｄｋ／Ａｋｔを活性化し、次いでＦｏｘｏ１を不活性化することができることが示された。
実施例６：Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓及び培養肝細胞におけるＧｌｕｔ４（ＳＬＣ２Ａ４）発現の増強、ならびに化合物＃４３処置後の培養肝細胞におけるグルコース取り込みの増強
ｉｎ ｖｉｖｏでの研究により、化合物＃４３は、インスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血糖値を低下させ、グルコースクリアランスを向上させることができることが明らかになった（図３～図８）。これは、部分的には肝臓でのグルコース産生の減弱によるものであるが、血流から肝臓を含む末梢組織へのグルコース取り込みの増加によるものでもあり得る。Ｇｌｕｔ４は、重要なグルコース輸送体であり、全身のインスリン刺激に応答した、肝臓でのグルコース取り込みの間接的なＦｏｘｏ１標的遺伝子である。したがって、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス及び培養マウス肝臓ＡＭＬ－１２細胞を化合物＃４３で処置して、肝臓でのＧｌｕｔ４発現及びグルコース取り込みに対する潜在的な効果を試験した。
ｉｎ ｖｉｖｏでの研究により、化合物＃４３は、インスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血糖値を低下させ、グルコースクリアランスを向上させることができることが明らかになった（図３～図８）。これは、部分的には肝臓でのグルコース産生の減弱によるものであるが、血流から肝臓を含む末梢組織へのグルコース取り込みの増加によるものでもあり得る。Ｇｌｕｔ４は、重要なグルコース輸送体であり、全身のインスリン刺激に応答した、肝臓でのグルコース取り込みの間接的なＦｏｘｏ１標的遺伝子である。したがって、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス及び培養マウス肝臓ＡＭＬ－１２細胞を化合物＃４３で処置して、肝臓でのＧｌｕｔ４発現及びグルコース取り込みに対する潜在的な効果を試験した。
材料及び方法
化合物
化合物＃４３及び化合物＃５０は、Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｉｎｃの化学実験室で合成した。これらすべての化合物の純度は、ＨＰＬＣによる測定で≧９９％であることが確認された。
化合物
化合物＃４３及び化合物＃５０は、Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｉｎｃの化学実験室で合成した。これらすべての化合物の純度は、ＨＰＬＣによる測定で≧９９％であることが確認された。
Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける化合物＃４３及び＃５０のｉｎ ｖｉｖｏ処置
出生後３８日目の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入）に、０．２％ＤＭＳＯ、化合物＃４３、または化合物＃５０を含有する生理食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）を５２日間、毎日腹腔内注射した（体重１キログラムあたり２５μｇセレンの各化合物、滅菌生理食塩水で希釈）。処置後、肝臓を採取し、ＲＮＡ分析に供した。
出生後３８日目の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入）に、０．２％ＤＭＳＯ、化合物＃４３、または化合物＃５０を含有する生理食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）を５２日間、毎日腹腔内注射した（体重１キログラムあたり２５μｇセレンの各化合物、滅菌生理食塩水で希釈）。処置後、肝臓を採取し、ＲＮＡ分析に供した。
細胞培養
マウス肝臓ＡＭＬ－１２細胞は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から購入した。これらの細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、４０ｎｇ／ｍｌデキサメタゾン（Ｄｅｘ，Ｓｉｇｍａ）及び１×ＩＴＳ（０．０１ｍｇ／ｍｌウシインスリン、０．００５５ｍｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌセレンナトリウム）溶液（Ｓｉｇｍａ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地及びハムＦ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）培地で増殖させた。
マウス肝臓ＡＭＬ－１２細胞は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から購入した。これらの細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、４０ｎｇ／ｍｌデキサメタゾン（Ｄｅｘ，Ｓｉｇｍａ）及び１×ＩＴＳ（０．０１ｍｇ／ｍｌウシインスリン、０．００５５ｍｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌセレンナトリウム）溶液（Ｓｉｇｍａ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地及びハムＦ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）培地で増殖させた。
ＲＮＡ分析のための細胞処置
基底Ｇｌｕｔ４（Ｓｌｃ２ａ４）発現（糖尿病刺激剤８－ＣＰＴ／Ｄｅｘの非存在下）のＲＮＡ分析のために、増幅させたＡＭＬ－１２細胞を、１０％ＦＢＳを含むがＩＴＳ及びＤｅｘフリーのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、２４ウェル（１×１０５細胞／ウェル）プレート上で一晩培養した。これらの細胞をＰＢＳで２回洗浄して残留血清を除去した後、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、ビヒクル（０．０２４％ＤＭＳＯ）または化合物＃４３（３００ｐｐｂ）の存在下で２４時間インキュベートした。
基底Ｇｌｕｔ４（Ｓｌｃ２ａ４）発現（糖尿病刺激剤８－ＣＰＴ／Ｄｅｘの非存在下）のＲＮＡ分析のために、増幅させたＡＭＬ－１２細胞を、１０％ＦＢＳを含むがＩＴＳ及びＤｅｘフリーのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、２４ウェル（１×１０５細胞／ウェル）プレート上で一晩培養した。これらの細胞をＰＢＳで２回洗浄して残留血清を除去した後、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、ビヒクル（０．０２４％ＤＭＳＯ）または化合物＃４３（３００ｐｐｂ）の存在下で２４時間インキュベートした。
擬似糖尿病条件下で培養したＡＭＬ－１２細胞におけるＧｌｕｔ４発現のＲＮＡ分析のために、増殖させたＡＭＬ－１２細胞を、１０％ＦＢＳを含むがＩＴＳ及びＤｅｘフリーのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、２４ウェル（２×１０５細胞／ウェル）プレート上で一晩培養した。次いで、これらの細胞をＰＢＳで２回洗浄して潜在的な残留血清を除去し、通常のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で一晩血清飢餓状態にした。次いで、これらの血清飢餓状態のＡＭＬ－１２細胞を、無血清の通常のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、糖尿病刺激剤である０．１ｍＭ ８－ＣＰＴ（Ｓｉｇｍａ）及び０．５μＭ Ｄｅｘの存在下で、ビヒクル（０．０２４％ＤＭＳＯ）または化合物＃４３（３００ｐｐｂ）とともに６時間及び２４時間インキュベートした。
ＲＮＡの単離及びリアルタイムＰＣＲ分析
生理食塩水または化合物＃４３で処置したＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス由来の全肝臓ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙ ＲＮＡ単離キットを使用して製造元のプロトコールに従って単離した。培養細胞由来の全ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造元のプロトコールに従って分離し、ＤＮａｓｅ Ｉの存在下でインキュベートして潜在的な混入ゲノムＤＮＡを除去した。以前に説明したように（Ｌａｎ ｅｔ ａｌ ＥＭＢＯ Ｊ ２００３）、Ａｐｐｌｉｅｄ－ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＲＴキット及び事前設計したＴａｑｍａｎプローブ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡ試料をリアルタイムＰＣＲ分析に供した。データは、各試料のアクチンＢ（Ａｃｔｂ）ｍＲＮＡレベルによって正規化し、３～５試料の平均値±ＳＥＭとして提示する。
生理食塩水または化合物＃４３で処置したＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス由来の全肝臓ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙ ＲＮＡ単離キットを使用して製造元のプロトコールに従って単離した。培養細胞由来の全ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造元のプロトコールに従って分離し、ＤＮａｓｅ Ｉの存在下でインキュベートして潜在的な混入ゲノムＤＮＡを除去した。以前に説明したように（Ｌａｎ ｅｔ ａｌ ＥＭＢＯ Ｊ ２００３）、Ａｐｐｌｉｅｄ－ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＲＴキット及び事前設計したＴａｑｍａｎプローブ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡ試料をリアルタイムＰＣＲ分析に供した。データは、各試料のアクチンＢ（Ａｃｔｂ）ｍＲＮＡレベルによって正規化し、３～５試料の平均値±ＳＥＭとして提示する。
グルコース取り込みアッセイ
増殖させた同数のＡＭＬ－１２細胞を９６ウェルプレートに播種し（１．５×１０５／ウェル）、１０％ＦＢＳを含むがＩＴＳ／ＤｅｘフリーのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で一晩培養した。次いで、これらの細胞をＰＢＳで２回洗浄し（潜在的な残留血清を除去するため）、通常のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、一晩血清飢餓状態にした。これらの血清飢餓状態のＡＭＬ－１２細胞を、グルコース／フェノールレッドフリーのＤＭＥＭ培地中、処置なし（基底）、インスリン（１０及び１００ｎＭ）、または化合物＃４３（１５０、３００及び６００ｐｐｂ）で３７℃、１．５時間処置した。処置後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１ｍＭの２－デオキシグルコース（２ＤＧ）の存在下で室温、３０分間インキュベートした。２ＤＧ処置した細胞を、次いで、ＰｒｏｍｅｇａのＧｌｕｃｏｓｅ Ｕｐｔａｋｅ－Ｇｌｏ Ａｓｓａｙキットを使用して製造元のプロトコールに従って、グルコース取り込み測定に供した。Ｂｉｏ－Ｔｅｋルミノメーターを使用して、発光シグナルを記録した。
増殖させた同数のＡＭＬ－１２細胞を９６ウェルプレートに播種し（１．５×１０５／ウェル）、１０％ＦＢＳを含むがＩＴＳ／ＤｅｘフリーのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で一晩培養した。次いで、これらの細胞をＰＢＳで２回洗浄し（潜在的な残留血清を除去するため）、通常のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、一晩血清飢餓状態にした。これらの血清飢餓状態のＡＭＬ－１２細胞を、グルコース／フェノールレッドフリーのＤＭＥＭ培地中、処置なし（基底）、インスリン（１０及び１００ｎＭ）、または化合物＃４３（１５０、３００及び６００ｐｐｂ）で３７℃、１．５時間処置した。処置後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１ｍＭの２－デオキシグルコース（２ＤＧ）の存在下で室温、３０分間インキュベートした。２ＤＧ処置した細胞を、次いで、ＰｒｏｍｅｇａのＧｌｕｃｏｓｅ Ｕｐｔａｋｅ－Ｇｌｏ Ａｓｓａｙキットを使用して製造元のプロトコールに従って、グルコース取り込み測定に供した。Ｂｉｏ－Ｔｅｋルミノメーターを使用して、発光シグナルを記録した。
統計解析
該当する場合、スチューデントｔ検定を使用して、異なる処置群間の差異の統計的有意性を判定し、０．０５未満のＰ値を有意な結果を表すものとみなした。
該当する場合、スチューデントｔ検定を使用して、異なる処置群間の差異の統計的有意性を判定し、０．０５未満のＰ値を有意な結果を表すものとみなした。
結果：
１．化合物＃４３及び化合物＃５０での慢性処置後のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓におけるＧｌｕｔ４ ｍＲＮＡ発現の分析
出生後３８日目の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、０．２％ＤＭＳＯ、化合物＃４３、または化合物＃５０（体重１ｋｇあたり２５μｇセレン当量の各化合物、滅菌生理食塩水で希釈）を含有する生理食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）を５２日間、毎日腹腔内注射した。これらの化合物処置後、肝臓を採取し、Ｇｌｕｔ４及びＡｃｔｂ ｍＲＮＡのＲＮＡ分析に供した。
１．化合物＃４３及び化合物＃５０での慢性処置後のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓におけるＧｌｕｔ４ ｍＲＮＡ発現の分析
出生後３８日目の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、０．２％ＤＭＳＯ、化合物＃４３、または化合物＃５０（体重１ｋｇあたり２５μｇセレン当量の各化合物、滅菌生理食塩水で希釈）を含有する生理食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）を５２日間、毎日腹腔内注射した。これらの化合物処置後、肝臓を採取し、Ｇｌｕｔ４及びＡｃｔｂ ｍＲＮＡのＲＮＡ分析に供した。
図１５に示すように、化合物＃５０処置は、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓におけるＧｌｕｔ４ ｍＲＮＡレベルを数値的に増加させた（生理食塩水処置群と比較した場合）。しかしながら、化合物＃４３処置は、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓におけるＧｌｕｔ４ ｍＲＮＡ発現レベルの大幅で有意な増加（５倍；Ｐ＝０．０４８）を誘発した（図１５）。これらの結果は、肝臓におけるＧｌｕｔ４発現の刺激においてこれら２つのセレン化合物間に明確な差異があり、化合物＃４３がこの器官におけるＧｌｕｔ４発現の強力なエンハンサーであることを示唆している。これらの結果は、化合物＃４３で処置したＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスで観察された血糖値の低下と耐糖能の向上（図３～図８）が、糖尿病の被験体の血流から肝臓へのグルコース取り込みの増加をもたらすＧｌｕｔ４発現の増強に部分的に起因し得るものであったことも示唆している。
２．糖尿病刺激剤（８－ＣＰＴ／Ｄｅｘ）の刺激の存在下または存在下で、マウス肝臓ＡＭＬ－１２細胞における化合物＃４３処置後のＧｌｕｔ４ ｍＲＮＡ発現の増強
上記のｉｎ ｖｉｖｏ研究は、化合物＃４３がインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓におけるＧｌｕｔ４発現を有意に刺激することができることを明らかにした。これは、肝臓組織に対する化合物＃４３の潜在的な全身効果または化合物＃４３の潜在的な直接効果によるものであり得る。後者のシナリオを試験するために、培養肝細胞を使用して、化合物＃４３が肝臓のＧｌｕｔ４発現を直接調節することができるかどうかを調べた。
上記のｉｎ ｖｉｖｏ研究は、化合物＃４３がインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓におけるＧｌｕｔ４発現を有意に刺激することができることを明らかにした。これは、肝臓組織に対する化合物＃４３の潜在的な全身効果または化合物＃４３の潜在的な直接効果によるものであり得る。後者のシナリオを試験するために、培養肝細胞を使用して、化合物＃４３が肝臓のＧｌｕｔ４発現を直接調節することができるかどうかを調べた。
化合物＃４３が正常なＡＭＬ－１２細胞（糖尿病刺激剤の投与なし）で基底Ｇｌｕｔ４発現を調節することができるかどうかを調べた。簡潔に述べると、ＡＭＬ－１２細胞を、無血清及びＩＴＳ／Ｄｅｘフリーの培地中、ビヒクル（０．０２４％ＤＭＳＯ）及び化合物＃４３（３００ｐｐｂ）で２４時間処置し、Ｇｌｕｔ４及びＡｃｔｂ発現のＲＮＡ分析に供した。図１６Ａに示すように、化合物＃４３（３００ｐｐｂ）の処置により、ＡＭＬ－１２細胞におけるＧｌｕｔ４ ｍＲＮＡ発現の有意な増加（約２．１倍の増加）がもたらされた。この実験が完全な無血清条件下で培養したＡＭＬ－１２細胞で行われたことを考慮すると、ＡＭＬ－１２細胞での化合物＃４３処置後のＧｌｕｔ４発現の増強は、インスリン、血清、または増殖因子に依存しないことが示唆された。
化合物＃４３がＧｌｕｔ４発現を調節できるかどうかをさらに試験するために、糖尿病刺激剤にさらしたＡＭＬ－１２細胞を使用した。簡潔に述べると、ＡＭＬ－１２細胞を一晩血清飢餓状態にし、その後、無血清の通常のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、糖尿病刺激剤である０．１ｍＭ ８－ＣＰＴ（Ｓｉｇｍａ）及び０．５μＭ Ｄｅｘの存在下、ビヒクル（０．０２４％ＤＭＳＯ）または化合物＃４３（３００ｐｐｂ）とともに６時間及び２４時間インキュベートした。図１６Ｂに示すように、６時間及び２４時間の両方での化合物＃４３の処置は、糖尿病刺激剤８－ＣＰＴ及びＤｅｘで共処置したこれらのＡＭＬ－１２細胞におけるＧｌｕｔ４ ｍＲＮＡ発現の有意な増加をもたらした。したがって、これらの結果は、化合物＃４３が、擬似糖尿病条件下で培養したＡＭＬ－１２細胞のＧｌｕｔ４発現を直接調節することができることを示している。
３．化合物＃４３はインスリンを模倣するが迂回して、マウス肝臓ＡＭＬ－１２細胞のグルコース取り込みを促進する
Ｇｌｕｔ４発現の増強は、化合物＃４３がインスリンを模倣するが迂回して、肝臓におけるグルコース取り込みを増強する可能性が高いことを示唆している。これを試験するために、マウス肝臓ＡＭＬ－１２細胞でグルコース取り込み実験を実施した。簡潔に述べると、同数のＡＭＬ－１２細胞を９６ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳを含むがＩＴＳ／ＤｅｘフリーのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で２４時間培養し、通常のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で一晩血清飢餓状態にした。これらの血清飢餓状態のＡＭＬ－１２細胞を、グルコース／フェノールレッド／無血清ＤＭＥＭ培地中、インスリン（１０及び１００ｎＭ）または化合物＃４３（１５０、３００及び６００ｐｐｂ）で３７℃、１．５時間処置した。処置後、細胞を１ｍＭの２－デオキシグルコース（２ＤＧ）の存在下で室温、３０分間インキュベートした後、ＰｒｏｍｅｇａのＧｌｕｃｏｓｅ Ｕｐｔａｋｅ－Ｇｌｏアッセイキットを使用して発光分析に供した。検出した発光シグナルは、培養細胞へのグルコース取り込みを表す。
Ｇｌｕｔ４発現の増強は、化合物＃４３がインスリンを模倣するが迂回して、肝臓におけるグルコース取り込みを増強する可能性が高いことを示唆している。これを試験するために、マウス肝臓ＡＭＬ－１２細胞でグルコース取り込み実験を実施した。簡潔に述べると、同数のＡＭＬ－１２細胞を９６ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳを含むがＩＴＳ／ＤｅｘフリーのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で２４時間培養し、通常のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で一晩血清飢餓状態にした。これらの血清飢餓状態のＡＭＬ－１２細胞を、グルコース／フェノールレッド／無血清ＤＭＥＭ培地中、インスリン（１０及び１００ｎＭ）または化合物＃４３（１５０、３００及び６００ｐｐｂ）で３７℃、１．５時間処置した。処置後、細胞を１ｍＭの２－デオキシグルコース（２ＤＧ）の存在下で室温、３０分間インキュベートした後、ＰｒｏｍｅｇａのＧｌｕｃｏｓｅ Ｕｐｔａｋｅ－Ｇｌｏアッセイキットを使用して発光分析に供した。検出した発光シグナルは、培養細胞へのグルコース取り込みを表す。
図１７に示すように、１０ｎＭのインスリン処置は、グルコース取り込みを増強しなかった。しかしながら、１００ｎＭのインスリン処置により、ＡＭＬ－１２細胞のグルコース取り込みが有意に増加した。さらに、試験した３つの用量すべてでの化合物＃４３処置により、グルコース取り込みが有意に増加し、６００ｐｐｂの化合物＃４３で処置したＡＭＬ－１２細胞のグルコース取り込みの増加の程度は、１００ｎＭのインスリンと比較可能なものであった（図１７）。ＡＭＬ－１２細胞を無血清条件下で化合物＃４３処置したため、これらの結果は、インスリンと同様に、化合物＃４３が迅速に（１．５時間未満）作用して肝細胞のグルコース取り込みを直接刺激することができることを示している。肝臓でのグルコース取り込みの増加は、化合物＃４３がインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血糖値を低下させ、グルコースクリアランスを向上させることができる理由の１つであり得る（図３～８）。
実施例７：インスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋におけるインスリンシグナル伝達の重要な下流分子であるリン酸化Ｐｄｋ１、Ａｋｔ及びＦｏｘｏ１の発現の増強、ならびに分化したＣ２Ｃ１２（骨格筋）細胞へのグルコース取り込みの刺激におけるインスリン及び化合物＃４３の両方の協同作用
材料及び方法
化合物
化合物＃４３は、Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｉｎｃの化学実験室で合成した。この試験化合物の純度は、ＨＰＬＣによる測定で≧９９％であることが確認された。
材料及び方法
化合物
化合物＃４３は、Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｉｎｃの化学実験室で合成した。この試験化合物の純度は、ＨＰＬＣによる測定で≧９９％であることが確認された。
Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける化合物＃４３のｉｎ ｖｉｖｏ処置
３８日齢の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入）に、化合物＃４３（０．２％ＤＭＳＯまたは体重１キログラムあたり０．１３６ｍｇ、滅菌生理食塩水で希釈）を含有する生理食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）を５２日間、毎日腹腔内注射した。処置後、腓腹筋の骨格筋試料を採取し、－８０℃で保存した。
３８日齢の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入）に、化合物＃４３（０．２％ＤＭＳＯまたは体重１キログラムあたり０．１３６ｍｇ、滅菌生理食塩水で希釈）を含有する生理食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）を５２日間、毎日腹腔内注射した。処置後、腓腹筋の骨格筋試料を採取し、－８０℃で保存した。
骨格筋タンパク質の調製とウエスタンブロット分析
凍結させた骨格筋を、完全プロテイナーゼ及びホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含有する無菌の氷冷ＰＢＳ中で細かく刻み、組織ホモジナイザー（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して均質化した。これらの組織ホモジネートを、タンパク質を抽出するために、完全プロテイナーゼ／ホスファターゼ阻害剤を含有するＴｈｅｍｏ－ＦｉｓｈｅｒのＲＩＰＡ緩衝液（ホモジネート１部／ＲＩＰＡ緩衝液２部）で希釈した。ホモジネート中のタンパク質を４℃のＲＩＰＡ緩衝液で一晩抽出した。一晩抽出したこれらのタンパク質／組織溶解物を、１２０００×ｇで４℃、３０分間遠心分離し、これらの組織溶解物の上清中のタンパク質レベルを、Ｐｉｅｒｃｅ Ｍｉｃｒｏ－ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－Ｐｉｅｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して製造元のプロトコールに従って測定した。
凍結させた骨格筋を、完全プロテイナーゼ及びホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含有する無菌の氷冷ＰＢＳ中で細かく刻み、組織ホモジナイザー（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して均質化した。これらの組織ホモジネートを、タンパク質を抽出するために、完全プロテイナーゼ／ホスファターゼ阻害剤を含有するＴｈｅｍｏ－ＦｉｓｈｅｒのＲＩＰＡ緩衝液（ホモジネート１部／ＲＩＰＡ緩衝液２部）で希釈した。ホモジネート中のタンパク質を４℃のＲＩＰＡ緩衝液で一晩抽出した。一晩抽出したこれらのタンパク質／組織溶解物を、１２０００×ｇで４℃、３０分間遠心分離し、これらの組織溶解物の上清中のタンパク質レベルを、Ｐｉｅｒｃｅ Ｍｉｃｒｏ－ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－Ｐｉｅｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して製造元のプロトコールに従って測定した。
１００マイクログラムの骨格筋タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分離に供し、次いで、以前に記載されたようにＰＶＤＦ膜に転写した（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ． ２００８ Ｓｃｉｅｎｃｅ）。５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で膜をブロックし、特異的な一次抗体の存在下でインキュベートした後、ＨＲＰ結合抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体（１：５０００希釈、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｉｎｃ．）の存在下でインキュベートした。β－チューブリンに対する抗体（ＬＩ－ＣＯＲ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）以外のすべての一次抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｉｎｃから購入した。アマシャムのｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｐｒｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を使用して、膜ブロットの陽性シグナルを検出した。ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｆｃ Ｉｍａｇｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）を使用して、膜ブロット上のこれらの発光シグナルの画像をキャプチャした。ＧＥ ＷＢ ＥＣＬ－ｐｒｉｍｅ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎプロトコール（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に記載されているように、同じ膜ブロットを除去し、別の抗体で再ブロットした。ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してウエスタンブロットのタンパク質バンド濃度を測定し、各試料のβ－チューブリンレベルで正規化した。データは、５つの動物試料の平均値±ＳＥＭとして提示する。
Ｃ２Ｃ１２細胞培養、Ｃ２Ｃ１２細胞の分化、及びグルコース取り込み分析
マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から購入した。これらの細胞を、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地で増殖させた。次いで、同数のＣ２Ｃ１２細胞を９６ウェルプレートに播種し（５０００細胞／ウェル）、１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地で３７℃、５日間培養した。前述のように、培養５日目に０．５％ウマ血清（Ｓｉｇｍａ）を含有するＤＭＥＭ培地（分化培地）を使用してＣ２Ｃ１２細胞を分化させ、これを７日間、毎日細胞に新鮮な１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地を補充して継続した（Ｍｉｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １２，４８３－４９５，２０１０）。分化後７日目に、分化したＣ２Ｃ１２細胞をＰＢＳで２回すすぎ、無血清のグルコースフリーＤＭＥＭ培地中、０．００６％ＤＭＳＯ（化合物＃４３溶媒）または化合物＃４３（３００または６００ｐｐｂ）の存在下または非存在下で一晩前処置した。次いで、これらの細胞をＰＢＳで１回洗浄し、その後、グルコース／フェノールレッドフリーのＤＭＥＭ培地中、処置なし（基底）またはインスリン（２００ｎＭ）、化合物＃４３（３００及び６００ｐｐｂ）、またはインスリンと化合物＃４３の両方で、３７℃、１．５時間処置した。処置後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１ｍＭ ２－デオキシグルコース（２ＤＧ）の存在下で室温、３０分間インキュベートした。２ＤＧ処置した細胞を、次いで、ＰｒｏｍｅｇａのＧｌｕｃｏｓｅ Ｕｐｔａｋｅ－Ｇｌｏ Ａｓｓａｙキットを使用して、製造元のプロトコールに従って、グルコース取り込みに供した。Ｂｉｏ－Ｔｅｋルミノメーターを使用して、発光シグナルを記録した。
マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から購入した。これらの細胞を、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地で増殖させた。次いで、同数のＣ２Ｃ１２細胞を９６ウェルプレートに播種し（５０００細胞／ウェル）、１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地で３７℃、５日間培養した。前述のように、培養５日目に０．５％ウマ血清（Ｓｉｇｍａ）を含有するＤＭＥＭ培地（分化培地）を使用してＣ２Ｃ１２細胞を分化させ、これを７日間、毎日細胞に新鮮な１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地を補充して継続した（Ｍｉｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １２，４８３－４９５，２０１０）。分化後７日目に、分化したＣ２Ｃ１２細胞をＰＢＳで２回すすぎ、無血清のグルコースフリーＤＭＥＭ培地中、０．００６％ＤＭＳＯ（化合物＃４３溶媒）または化合物＃４３（３００または６００ｐｐｂ）の存在下または非存在下で一晩前処置した。次いで、これらの細胞をＰＢＳで１回洗浄し、その後、グルコース／フェノールレッドフリーのＤＭＥＭ培地中、処置なし（基底）またはインスリン（２００ｎＭ）、化合物＃４３（３００及び６００ｐｐｂ）、またはインスリンと化合物＃４３の両方で、３７℃、１．５時間処置した。処置後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１ｍＭ ２－デオキシグルコース（２ＤＧ）の存在下で室温、３０分間インキュベートした。２ＤＧ処置した細胞を、次いで、ＰｒｏｍｅｇａのＧｌｕｃｏｓｅ Ｕｐｔａｋｅ－Ｇｌｏ Ａｓｓａｙキットを使用して、製造元のプロトコールに従って、グルコース取り込みに供した。Ｂｉｏ－Ｔｅｋルミノメーターを使用して、発光シグナルを記録した。
統計解析
該当する場合、スチューデントｔ検定を使用して、Ｐ値が０．０５未満の異なる処置群間の差異の統計的有意性を判定した。
該当する場合、スチューデントｔ検定を使用して、Ｐ値が０．０５未満の異なる処置群間の差異の統計的有意性を判定した。
結果：
１．化合物＃４３の慢性処置後のインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋におけるインスリン下流シグナル伝達分子Ｐｄｋ１、Ａｋｔ及びＦｏｘｏ１のリン酸化の増加
肝臓に加えて、骨格筋は、全身性インスリンに応答したグルコース恒常性にとって重要な他の主要器官である。骨格筋におけるグルコース取り込みは、血流中の正常なグルコースレベルを維持する上で重要な役割を果たす。動物実験により、化合物＃４３が血糖値及びＨｂＡ１ｃレベルを低下させ、インスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの耐糖能を有意に向上させることができることが明らかになった（図３図８）。これらの効果は、グルコースの取り込みを刺激するための骨格筋におけるインスリンシグナル伝達（すなわちＰｄｋ１／Ａｋｔ）の回復によるものであり得る。したがって、化合物＃４３の慢性処置が、これらのインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋における損傷したインスリンシグナル伝達を部分的に修復することができるかどうかを調べた。
１．化合物＃４３の慢性処置後のインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋におけるインスリン下流シグナル伝達分子Ｐｄｋ１、Ａｋｔ及びＦｏｘｏ１のリン酸化の増加
肝臓に加えて、骨格筋は、全身性インスリンに応答したグルコース恒常性にとって重要な他の主要器官である。骨格筋におけるグルコース取り込みは、血流中の正常なグルコースレベルを維持する上で重要な役割を果たす。動物実験により、化合物＃４３が血糖値及びＨｂＡ１ｃレベルを低下させ、インスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの耐糖能を有意に向上させることができることが明らかになった（図３図８）。これらの効果は、グルコースの取り込みを刺激するための骨格筋におけるインスリンシグナル伝達（すなわちＰｄｋ１／Ａｋｔ）の回復によるものであり得る。したがって、化合物＃４３の慢性処置が、これらのインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋における損傷したインスリンシグナル伝達を部分的に修復することができるかどうかを調べた。
出生後３８日目のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、生理食塩水（０．２％ＤＭＳＯを含有する）または化合物＃４３を、体重１ｋｇあたり０．１３６ｍｇの化合物＃４３の用量で５２日間、毎日腹腔内注射した。上記の処置後、骨格筋を採取し、それらのインスリンシグナル伝達分子に対する特異的抗体を使用してウエスタンブロット分析に供した。
図１８Ａに示すように、リン酸化Ｐｄｋ１、トレオニン３０８のＡｋｔ、及びセリン２５６のＦｏｘｏ１のタンパク質バンド濃度は、生理食塩水処置マウスに比べて化合物＃４３処置マウスの骨格筋で明らかに高かったが、全ＡｋｔまたはＦｏｘｏ１ではそうではなかった。これらのウエスタンブロットの定量分析により、生理食塩水で処置したマウスと比較した場合、化合物＃４３処置後、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋においてｐＰｄｋ１タンパク質レベルが増加したことが示された（図１８Ｂ）。化合物＃４３処置マウスの骨格筋におけるｐＰｄｋ１のレベルの増加は、統計的有意に近いものであった（Ｐ＝０．１１）。さらに、２つのインスリン／Ｐｄｋ１下流シグナル伝達分子ｐＡｋｔ及びｐＦｏｘｏ１のタンパク質レベルは、化合物＃４３処置後、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋において有意に上昇した（図１８Ｂ）。対照的に、化合物＃４３処置マウスの骨格筋の全Ａｋｔ及びＦｏｘｏ１タンパク質レベルの有意な変化はなかった。Ｐｄｋ１のリン酸化の増加とリン酸化Ａｋｔ及びリン酸化Ｆｏｘｏ１の有意な増加は、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスがインスリン不応性であることが知られているにもかかわらず、化合物＃４３の慢性処置後、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋においてインスリン下流シグナル伝達カスケードが活性化していることを示唆している。言い換えれば、これらの結果は、化合物＃４３がインスリン作用を回復させるか、インスリンを迂回するか、またはその両方でＰＩ３Ｋを活性化して骨格筋におけるＰｄｋ１／Ａｋｔのリン酸化を誘導し、これらの重度のインスリン抵抗性のＩＩ型糖尿病マウスにおけるグルコース恒常性の調節において重要な機能を果たすことができることを示している。
２．インスリンと化合物＃４３の両方の処置後の分化マウスＣ２Ｃ１２（骨格筋）細胞におけるグルコース取り込みの増強
ヒト及び他の哺乳類では、骨格筋は、通常、全身のインスリン刺激性グルコース取り込みの７５％を占める。骨格筋のインスリンへの応答能力の低下は、全身のグルコース恒常性を著しく破壊する。骨格筋におけるグルコース取り込みのプロセスは、主にインスリンに応答するＰＩ３Ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達カスケードを介して媒介されることが十分に実証されている。インスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋におけるＰＩ３Ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達分子の活性化（図１８）は、化合物＃４３が骨格筋のグルコース取り込みを直接調節し、そのプロセス中にインスリン作用を増強し得る可能性が高いことを示唆している。これらの可能性を試験するために、分化したマウスＣ２Ｃ１２（骨格筋）細胞でグルコース取り込み実験を実施した。
ヒト及び他の哺乳類では、骨格筋は、通常、全身のインスリン刺激性グルコース取り込みの７５％を占める。骨格筋のインスリンへの応答能力の低下は、全身のグルコース恒常性を著しく破壊する。骨格筋におけるグルコース取り込みのプロセスは、主にインスリンに応答するＰＩ３Ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達カスケードを介して媒介されることが十分に実証されている。インスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋におけるＰＩ３Ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達分子の活性化（図１８）は、化合物＃４３が骨格筋のグルコース取り込みを直接調節し、そのプロセス中にインスリン作用を増強し得る可能性が高いことを示唆している。これらの可能性を試験するために、分化したマウスＣ２Ｃ１２（骨格筋）細胞でグルコース取り込み実験を実施した。
簡潔に述べると、同数のＣ２Ｃ１２細胞を９６ウェルプレートに播種し（５０００細胞／ウェル）、１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５日間培養した。前述のように、これらの細胞を、骨格筋細胞になるように、０．５％ウマ血清（Ｓｉｇｍａ）を含有するＤＭＥＭ培地を使用して７日間分化させた（Ｍｉｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １２，４８３－４９５，２０１０）。完全に分化したＣ２Ｃ１２細胞を、無血清グルコースフリーＤＭＥＭ培地中で０．００６％ＤＭＳＯ（化合物＃４３溶媒）または化合物＃４３（３００または６００ｐｐｂ）の存在下または非存在下で、一晩前処置した。次いで、これらの細胞を、グルコース／フェノールレッドフリーのＤＭＥＭ培地中、処置なし（基底）またはインスリン（２００ｎＭ）、化合物＃４３（３００及び６００ｐｐｂ）、もしくはインスリンと化合物＃４３の両方の存在下で、３７℃、１．５時間インキュベートした。処置後、細胞を１ｍＭ ２－デオキシグルコース（２ＤＧ）の存在下で室温、３０分間インキュベートし、ＰｒｏｍｅｇａのＧｌｕｃｏｓｅ Ｕｐｔａｋｅ－Ｇｌｏアッセイキットを使用して発光分析に供した。検出した発光シグナルは、培養した分化Ｃ２Ｃ１２細胞へのグルコースの取り込みを表す。
図１９に示すように、２００ｎＭのインスリン単独または６００ｐｐｂの化合物＃４３での処置により、これらの培養骨格筋細胞においてグルコース取り込みが１６～１９％増加した（ただし統計的に有意ではない、基底群と比較した場合）が、３００ｐｐｂの化合物＃４３では増加しなかった。２００ｎＭのインスリンと同様の効力を有する高用量（６００ｐｐｂ）の化合物＃４３で処置した後、これらの培養骨格筋細胞のグルコース取り込みが増加する傾向があったことから、６００ｐｐｂを上回る用量での化合物＃４３により、これらの分化した筋肉細胞におけるグルコース取り込みを直接かつ有意に高めることができる可能性がある。いずれにせよ、これらの結果から、試験した用量６００ｐｐｂの化合物＃４３が２００ｎＭインスリンと比較可能な効力でグルコース取り込みを刺激することができることが示された。
インスリン（２００ｎＭ）及び化合物＃４３（３００ｐｐｂ）の両方の共処置は、分化したＣ２Ｃ１２細胞によるグルコース取り込みのロバストかつ有意な増加（６３％）をもたらした（図１９）。２００ｎＭのインスリン及び６００ｐｐｂの化合物＃４３の共処置後、これらの分化した細胞で、より顕著なグルコース取り込みの増加（７９％）が観察された。インスリンと化合物＃４３の両方の共処置後の分化したＣ２Ｃ１２細胞におけるグルコース取り込みの増加の程度は、インスリンまたは化合物＃４３単独よりもはるかに高かったが、このことは、インスリンと化合物＃４３の間に相乗作用があったことを示している。したがって、上記の研究は、化合物＃４３がインスリンと協働して、分化した骨格筋細胞のグルコース取り込みを有意に増強することができることを示している。
総合すると、上記の研究は、化合物＃４３がインスリン抵抗性糖尿病Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋におけるインスリンシグナル伝達を活性化または回復させ（Ｐｄｋ１／Ａｋｔ／Ｆｏｘｏ１のリン酸化の増強によって示される）、インスリン作用を増強して培養骨格筋（分化したＣ２Ｃ１２）細胞のグルコース取り込みを増強することができることを示唆している。これらの結果は、化合物＃４３が血糖値を低下させ、インスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの耐糖能を向上させることができるというさらなる分子的エビデンスを提供する（図３～図８）。
実施例８：化合物＃４３処置後のインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋及び肝臓、ならびに培養したマウス骨格筋細胞及びヒト肝細胞におけるインスリン受容体（Ｉｎｓｒ）シグナル伝達の活性化、ならびに分化マウスＣ２Ｃ１２（骨格筋）細胞及びヒト肝臓ＨｅｐＧ２細胞におけるグルコース取り込みのための細胞内小胞から細胞膜へのＧＬＵＴ４移行のためのＡＳ１６０－ｋｅｙのリン酸化に対する化合物＃４３のインスリン様効果
肝臓と骨格筋において、インスリンがＩｎｓｒのαサブユニットに結合した後、Ｉｎｓｒβは、Ｙ１１４６で始まり、次いでＹ１１５０／５１において、チロシン自己リン酸化を受け、その後、ＰＩ３Ｋ／Ｐｄｋ１を活性化してＡｋｔのリン酸化を誘導することが十分に実証されている。ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー４（ＴＢＣ１Ｄ４）としても知られるＡＳ１６０は、ＧＬＵＴ４タンパク質を細胞質小胞に保持する上で重要な役割を果たすＡｋｔ基質である。インスリンに応答したＩｎｓｒ／ＰＩ３ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達の活性化はＡＳ１６０をリン酸化し、ＧＬＵＴ４タンパク質の細胞質小胞から細胞膜への移行を促進して、骨格筋細胞及び肝細胞へのグルコース取り込みを促進する。したがって、化合物＃４３がＩｎｓｒβのチロシンリン酸化を引き起こす可能性について、インスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋及び肝臓、ならびに分化したマウスＣ２Ｃ１２（骨格筋）細胞及びヒト肝臓ＨｅｐＧ２細胞で調べた。さらに、化合物＃４３がインスリンを模倣するが迂回して、分化したマウスＣ２Ｃ１２細胞のインスリン受容体の下流シグナル伝達分子であるＡｋｔを活性化することができるかどうかを調べた。さらに、Ａｋｔ標的基質であるＡＳ１６０のリン酸化に対する化合物＃４３の効果を、分化したマウスＣ２Ｃ１２細胞とヒト肝臓ＨｅｐＧ２細胞の両方で調べた。
肝臓と骨格筋において、インスリンがＩｎｓｒのαサブユニットに結合した後、Ｉｎｓｒβは、Ｙ１１４６で始まり、次いでＹ１１５０／５１において、チロシン自己リン酸化を受け、その後、ＰＩ３Ｋ／Ｐｄｋ１を活性化してＡｋｔのリン酸化を誘導することが十分に実証されている。ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー４（ＴＢＣ１Ｄ４）としても知られるＡＳ１６０は、ＧＬＵＴ４タンパク質を細胞質小胞に保持する上で重要な役割を果たすＡｋｔ基質である。インスリンに応答したＩｎｓｒ／ＰＩ３ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達の活性化はＡＳ１６０をリン酸化し、ＧＬＵＴ４タンパク質の細胞質小胞から細胞膜への移行を促進して、骨格筋細胞及び肝細胞へのグルコース取り込みを促進する。したがって、化合物＃４３がＩｎｓｒβのチロシンリン酸化を引き起こす可能性について、インスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋及び肝臓、ならびに分化したマウスＣ２Ｃ１２（骨格筋）細胞及びヒト肝臓ＨｅｐＧ２細胞で調べた。さらに、化合物＃４３がインスリンを模倣するが迂回して、分化したマウスＣ２Ｃ１２細胞のインスリン受容体の下流シグナル伝達分子であるＡｋｔを活性化することができるかどうかを調べた。さらに、Ａｋｔ標的基質であるＡＳ１６０のリン酸化に対する化合物＃４３の効果を、分化したマウスＣ２Ｃ１２細胞とヒト肝臓ＨｅｐＧ２細胞の両方で調べた。
材料及び方法
化合物
化合物＃４３は、Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｉｎｃの化学実験室で合成した。試験したこの化合物の純度は、ＨＰＬＣによる測定で≧９９％であることが確認された。
化合物
化合物＃４３は、Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｉｎｃの化学実験室で合成した。試験したこの化合物の純度は、ＨＰＬＣによる測定で≧９９％であることが確認された。
Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおける化合物＃４３のｉｎ ｖｉｖｏ処置
出生後３８日目の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入）に、化合物＃４３（０．２％ＤＭＳＯまたは体重１キログラムあたり０．１３６ｍｇ、滅菌生理食塩水で希釈）を含有する生理食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）を５２日間、毎日腹腔内注射した。処置後、腓腹筋の骨格筋及び肝臓の試料を採取し、－８０℃で保存した。
出生後３８日目の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入）に、化合物＃４３（０．２％ＤＭＳＯまたは体重１キログラムあたり０．１３６ｍｇ、滅菌生理食塩水で希釈）を含有する生理食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）を５２日間、毎日腹腔内注射した。処置後、腓腹筋の骨格筋及び肝臓の試料を採取し、－８０℃で保存した。
骨格筋及び肝臓タンパク質の調製
凍結した骨格筋及び肝臓組織を、完全プロテイナーゼ及びホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含有する無菌の氷冷ＰＢＳ中で細かく刻み、組織ホモジナイザー（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して均質化した。これらの組織ホモジネートを、タンパク質を抽出するために完全プロテイナーゼ／ホスファターゼ阻害剤を含有するＴｈｅｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒの既製ＲＩＰＡ緩衝液（ホモジネート１部／ＲＩＰＡ緩衝液２部）で希釈した。ホモジネート中のタンパク質をＲＩＰＡ緩衝液中で４℃、一晩抽出した。一晩抽出したこれらのタンパク質／組織溶解物を１２０００×ｇで４℃、３０分間遠心分離し、これらの組織溶解物の上清中のタンパク質レベルを、Ｐｉｅｒｃｅ Ｍｉｃｒｏ－ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－Ｐｉｅｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、製造元のプロトコールに従って測定した。
凍結した骨格筋及び肝臓組織を、完全プロテイナーゼ及びホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含有する無菌の氷冷ＰＢＳ中で細かく刻み、組織ホモジナイザー（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して均質化した。これらの組織ホモジネートを、タンパク質を抽出するために完全プロテイナーゼ／ホスファターゼ阻害剤を含有するＴｈｅｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒの既製ＲＩＰＡ緩衝液（ホモジネート１部／ＲＩＰＡ緩衝液２部）で希釈した。ホモジネート中のタンパク質をＲＩＰＡ緩衝液中で４℃、一晩抽出した。一晩抽出したこれらのタンパク質／組織溶解物を１２０００×ｇで４℃、３０分間遠心分離し、これらの組織溶解物の上清中のタンパク質レベルを、Ｐｉｅｒｃｅ Ｍｉｃｒｏ－ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－Ｐｉｅｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、製造元のプロトコールに従って測定した。
ＨｅｐＧ２細胞及びＣ２Ｃ１２細胞の細胞培養、Ｃ２Ｃ１２細胞の分化、細胞処置ならびに培養細胞タンパク質抽出物の調製
ヒト肝癌ＨｅｐＧ２細胞及びマウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から購入した。ＨｅｐＧ２細胞は１０％ＦＢＳを添加したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で培養し、Ｃ２Ｃ１２細胞は１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地中で増殖させた。
ヒト肝癌ＨｅｐＧ２細胞及びマウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から購入した。ＨｅｐＧ２細胞は１０％ＦＢＳを添加したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で培養し、Ｃ２Ｃ１２細胞は１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地中で増殖させた。
ＨｅｐＧ２細胞を６ウェルプレートに播種し（７×１０５細胞／ウェル）、１０％ＦＢＳ ＥＭＥＭ培地中で３０時間培養した。次いで、これらの細胞をＰＢＳで２回洗浄して残留血清を除去し、通常のＥＭＥＭ培地中で一晩血清飢餓状態にした。これらの血清飢餓状態のＨｅｐＧ２細胞を、無血清培地中、化合物の非存在下、または化合物＃４３（６００ｐｐｂ）で、０分間（処置の直前）、３０分間及び６０分間、処置した。
Ｃ２Ｃ１２細胞を分化させるために、同数のこれらの筋芽細胞を最初に１２ウェルプレートに播種し（６０，０００細胞／ウェル）、１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５日間培養した。これらの細胞には、新鮮な１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地を毎日補充した。前述と同様に、培養後５日目に、０．５％ウマ血清（Ｓｉｇｍａ）を含有するＤＭＥＭ培地（分化培地）を使用してＣ２Ｃ１２細胞を７日間分化させた（Ｍｉｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １２，４８３－４９５，２０１０）。分化後７日目に、分化したＣ２Ｃ１２細胞をＰＢＳで２回すすぎ、無血清ＤＭＥＭ培地中で一晩インキュベートした。次いで、これらの血清飢餓状態の細胞を、無血清ＤＭＥＭ培地中、処置なし（基底）またはインスリン（２００ｎＭ）、化合物＃４３（６００ｐｐｂ）、またはインスリンと化合物＃４３の両方で、３７℃、５分間及び６０分間処置した。
上記の処置の後、培養したＨｅｐＧ２細胞または分化したＣ２Ｃ１２細胞を氷冷ＰＢＳで２回すすぎ、氷上で完全プロテイナーゼ及びホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含有する氷冷ＲＩＰＡ緩衝液に氷上で３０分間溶解させた。細胞溶解物を、セルスクレーパー及びホールピペットを使用して回収し、次いで１２０００×ｇで４℃、３０分間遠心分離してＤＮＡペレットを除去し、タンパク質抽出物を取得した。これらの細胞溶解物の上清中のタンパク質レベルは、Ｐｉｅｒｃｅ Ｍｉｃｒｏ－ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－Ｐｉｅｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して製造元のプロトコールに従って測定した。
ウエスタンブロット分析
前述のように、１００マイクログラムの骨格筋または肝臓組織タンパク質、５マイクログラムのＨｅｐＧ２細胞タンパク質抽出物、または８マイクログラムの分化したＣ２Ｃ１２細胞タンパク質抽出物をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分離に供し、次いでＰＶＤＦ膜に転写した（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ． ２００８ Ｓｃｉｅｎｃｅ）。５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で膜をブロックし、特異的な一次抗体の存在下でインキュベートした後、ＨＲＰ結合抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体（１：５０００希釈、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｉｎｃ．）の存在下でインキュベートした。β－チューブリンに対する抗体（ＬＩ－ＣＯＲ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）以外のすべての一次抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｉｎｃから購入した。アマシャムのｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｐｒｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を使用して、膜ブロット上の陽性シグナルを検出した。ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｆｃ Ｉｍａｇｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）を使用して、膜ブロット上のこれらの発光シグナルの画像をキャプチャした。ＧＥ ＷＢ ＥＣＬ－ｐｒｉｍｅ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎプロトコール（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に記載されているように、同じ膜ブロットを除去し、別の抗体で再ブロットした。ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してウエスタンブロットのタンパク質バンド濃度を測定し、各試料のβ－チューブリンまたはＡＣＴＢタンパク質レベルで正規化した。データは、群ごとに３～５個の試料の平均値±ＳＥＭとして提示する。
前述のように、１００マイクログラムの骨格筋または肝臓組織タンパク質、５マイクログラムのＨｅｐＧ２細胞タンパク質抽出物、または８マイクログラムの分化したＣ２Ｃ１２細胞タンパク質抽出物をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分離に供し、次いでＰＶＤＦ膜に転写した（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ． ２００８ Ｓｃｉｅｎｃｅ）。５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で膜をブロックし、特異的な一次抗体の存在下でインキュベートした後、ＨＲＰ結合抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体（１：５０００希釈、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｉｎｃ．）の存在下でインキュベートした。β－チューブリンに対する抗体（ＬＩ－ＣＯＲ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）以外のすべての一次抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｉｎｃから購入した。アマシャムのｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｐｒｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を使用して、膜ブロット上の陽性シグナルを検出した。ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｆｃ Ｉｍａｇｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）を使用して、膜ブロット上のこれらの発光シグナルの画像をキャプチャした。ＧＥ ＷＢ ＥＣＬ－ｐｒｉｍｅ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎプロトコール（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に記載されているように、同じ膜ブロットを除去し、別の抗体で再ブロットした。ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してウエスタンブロットのタンパク質バンド濃度を測定し、各試料のβ－チューブリンまたはＡＣＴＢタンパク質レベルで正規化した。データは、群ごとに３～５個の試料の平均値±ＳＥＭとして提示する。
Ｙ１１４６またはＹ１１５０／５１のホスホＩｎｓｒβの酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
生理食塩水または化合物＃４３で処置したＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス由来の肝臓タンパク質試料を、ＰａｔｈＳｃａｎホスホインスリン受容体β（Ｔｙｒ１１４６またはＴｙｒ１１５０／１１５１）Ｓａｎｄｗｉｓｈ ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を用いたＥＬＩＳＡアッセイに供し、その際、タンパク質抽出物を捕捉するｐＩｎｓｒβＹ１１４６またはｐＩｎｓｒβＹ１１５０／１１５１抗体の存在下で４℃、一晩インキュベートする点（プロトコールに記載されているように３７℃で２時間インキュベートする代わりに）以外は製造元のプロトコールに従った。Ｙ１１４６での蛍光Ｉｎｓｒβの検出には４００マイクログラムの肝臓タンパク質抽出物を使用し、Ｙ１１５０／１１５１での蛍光Ｉｎｓｒβの検出には６００マイクログラムの肝臓タンパク質抽出物を使用した。試験した試料の４５０ｎｍでの吸光度（ＯＤ４５０）を、Ｂｉｏ－ｔｅｋマイクロプレートリーダーを使用して記録した。各試料中の内部タンパク質対照であるβ－チューブリンのレベルを、１００μｇのタンパク質抽出物と特異的なβ－チューブリンモノクローナル抗体を使用したウエスタンブロット分析によって測定し、続いてＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して、ウエスタンブロットにおけるβ－チューブリンタンパク質のバンド濃度の定量分析を行った。次いで、試験した各試料のＯＤ４５０をそのβ－チューブリンタンパク質レベルで正規化し、Ｙ１１４６またはＹ１１５０／１１５１でのホスホＩｎｓｒβのレベルを取得した。
生理食塩水または化合物＃４３で処置したＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス由来の肝臓タンパク質試料を、ＰａｔｈＳｃａｎホスホインスリン受容体β（Ｔｙｒ１１４６またはＴｙｒ１１５０／１１５１）Ｓａｎｄｗｉｓｈ ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を用いたＥＬＩＳＡアッセイに供し、その際、タンパク質抽出物を捕捉するｐＩｎｓｒβＹ１１４６またはｐＩｎｓｒβＹ１１５０／１１５１抗体の存在下で４℃、一晩インキュベートする点（プロトコールに記載されているように３７℃で２時間インキュベートする代わりに）以外は製造元のプロトコールに従った。Ｙ１１４６での蛍光Ｉｎｓｒβの検出には４００マイクログラムの肝臓タンパク質抽出物を使用し、Ｙ１１５０／１１５１での蛍光Ｉｎｓｒβの検出には６００マイクログラムの肝臓タンパク質抽出物を使用した。試験した試料の４５０ｎｍでの吸光度（ＯＤ４５０）を、Ｂｉｏ－ｔｅｋマイクロプレートリーダーを使用して記録した。各試料中の内部タンパク質対照であるβ－チューブリンのレベルを、１００μｇのタンパク質抽出物と特異的なβ－チューブリンモノクローナル抗体を使用したウエスタンブロット分析によって測定し、続いてＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して、ウエスタンブロットにおけるβ－チューブリンタンパク質のバンド濃度の定量分析を行った。次いで、試験した各試料のＯＤ４５０をそのβ－チューブリンタンパク質レベルで正規化し、Ｙ１１４６またはＹ１１５０／１１５１でのホスホＩｎｓｒβのレベルを取得した。
統計解析
適用可能な場合、スチューデントｔ検定を使用して、処置群間の差異の統計的有意性を判定し、０．０５未満のＰ値を有意とみなした。
適用可能な場合、スチューデントｔ検定を使用して、処置群間の差異の統計的有意性を判定し、０．０５未満のＰ値を有意とみなした。
結果：
１．化合物＃４３による慢性処置後のインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋におけるＩｎｓｒβのチロシンリン酸化の増強
上述のように、骨格筋は、全身性インスリンに応答するグルコース恒常性にとって絶対に不可欠である。動物実験では、化合物＃４３が、血糖値及びＨｂＡ１ｃレベルを低下させ、インスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの耐糖能を向上させることができることが明らかになった（図３～図８）。これらの効果は、骨格筋で機能するインスリン受容体の潜在的な回復によるものである可能性があり、それにより、これらのインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおいてグルコース取り込みを生じさせることができる。化合物＃４３で処置したインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋でのＰｄｋ１及びＡｋｔのリン酸化の増強（図１８）は、骨格筋において、化合物＃４３がインスリンを迂回するが模倣するか、またはインスリン作用を回復させて、Ｐｄｋ１／Ａｋｔカスケードの上流のインスリンシグナル伝達カスケード分子を活性化することを示唆している。Ｙ１１４６でのＩｎｓｒβのチロシンリン酸化は、インスリンのＩｎｓｒαへの結合後の活性化インスリン受容体シグナル伝達の最初の工程を反映しており、これは骨格筋におけるＰＩ３Ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達の上流の重要な事象である。したがって、化合物＃４３による慢性処置が、これらのインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋におけるＩｎｓｒβのリン酸化を調節することができるかどうかを調べた。
１．化合物＃４３による慢性処置後のインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋におけるＩｎｓｒβのチロシンリン酸化の増強
上述のように、骨格筋は、全身性インスリンに応答するグルコース恒常性にとって絶対に不可欠である。動物実験では、化合物＃４３が、血糖値及びＨｂＡ１ｃレベルを低下させ、インスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの耐糖能を向上させることができることが明らかになった（図３～図８）。これらの効果は、骨格筋で機能するインスリン受容体の潜在的な回復によるものである可能性があり、それにより、これらのインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおいてグルコース取り込みを生じさせることができる。化合物＃４３で処置したインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋でのＰｄｋ１及びＡｋｔのリン酸化の増強（図１８）は、骨格筋において、化合物＃４３がインスリンを迂回するが模倣するか、またはインスリン作用を回復させて、Ｐｄｋ１／Ａｋｔカスケードの上流のインスリンシグナル伝達カスケード分子を活性化することを示唆している。Ｙ１１４６でのＩｎｓｒβのチロシンリン酸化は、インスリンのＩｎｓｒαへの結合後の活性化インスリン受容体シグナル伝達の最初の工程を反映しており、これは骨格筋におけるＰＩ３Ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達の上流の重要な事象である。したがって、化合物＃４３による慢性処置が、これらのインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋におけるＩｎｓｒβのリン酸化を調節することができるかどうかを調べた。
出生後３８日目のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、生理食塩水（０．２％の化合物溶媒ＤＭＳＯを含有）または化合物＃４３を、体重１ｋｇあたり０．１３６ｍｇの化合物＃４３の用量で５２日間、毎日腹腔内注射した。上記の処置の後、骨格筋試料を回収し、前述のインスリンシグナル伝達分子に対する特異的抗体を使用したウエスタンブロット分析に供した。
図２０Ａに示すように、チロシン１１４６でのリン酸化Ｉｎｓｒβのタンパク質バンド濃度は、化合物＃４３処置Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋において生理食塩水処置マウスよりもはるかに高かったが、全Ｉｎｓｒβではそうではなかった。これらのウエスタンブロットの定量分析により、生理食塩水で処置したマウスと比べた場合、化合物＃４３で処置した後のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋において、リン酸化Ｉｎｓｒβタンパク質レベルがロバストに増加した（約２．５倍増加）ことが示された（図２０Ｂ）。対照的に、化合物＃４３処置マウスの骨格筋の全Ｉｎｓｒβタンパク質レベルの有意な変化はなかった（図２０Ｃ）。これらの結果は、化合物＃４３で処置したＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋におけるＩｎｓｒの重要なインスリンシグナル伝達分子であるＰｄｋ１及びＡｋｔのリン酸化の増加の観察と一致している（図１８）。総合すると、これらの結果は、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスがインスリンに応答できないように設計されているにもかかわらず、化合物＃４３での慢性処置後、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋においてインスリン受容体が活性化されることを明確に示している。言い換えれば、これらの結果は、これらの重度のＩＩ型インスリン抵抗性糖尿病マウスの骨格筋において、化合物＃４３がインスリン作用を回復させるか、インスリンを迂回するか、またはその両方により、Ｉｎｓｒβのチロシンリン酸化を刺激し、次いでＰＩ３Ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達を活性化することができることを示唆している。
これらの知見は、血流からのグルコースクリアランスの増強、空腹時血糖値の低下、ＨｂＡ１Ｃレベルの低下、及びインスリンとの相乗作用による骨格筋のグルコース取り込みの増強の観察とともに、化合物＃４３が、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病のいずれに対しても効果的な治療薬であり得ることを強く示している。
２．化合物＃４３は、インスリンを模倣するが迂回して、分化したマウスＣ２Ｃ１２（骨格筋）細胞のＹ１１４６、Ｐｄｋ１、Ａｋｔ、及びＡＳ１６０のＩｎｓｒβにおけるリン酸化を刺激する
化合物＃４３が骨格筋におけるインスリン受容体シグナル伝達を直接活性化することができるかどうかをさらに調べるため、血清飢餓状態の分化マウスＣ２Ｃ１２（骨格筋）細胞を、無血清及びグルコースフリーのＤＭＥＭ培地中、化合物＃４３（６００ｐｐｂ）、インスリン（２００ｎＭ、陽性対照）、またはその両方の非存在下または存在下で、非常に短い期間（すなわち、５分間）及び６０分間、インキュベートした。次いで、ウエスタンブロット分析を実行して、これらの分化した骨格筋細胞における活性化Ｉｎｓｒ（すなわち、Ｙ１１４６のｐＩｎｓｒ）ならびにリン酸化Ｐｄｋ１、Ａｋｔ及びＡｓ１６０を含むその下流シグナル伝達分子のタンパク質発現レベルを調べた。
化合物＃４３が骨格筋におけるインスリン受容体シグナル伝達を直接活性化することができるかどうかをさらに調べるため、血清飢餓状態の分化マウスＣ２Ｃ１２（骨格筋）細胞を、無血清及びグルコースフリーのＤＭＥＭ培地中、化合物＃４３（６００ｐｐｂ）、インスリン（２００ｎＭ、陽性対照）、またはその両方の非存在下または存在下で、非常に短い期間（すなわち、５分間）及び６０分間、インキュベートした。次いで、ウエスタンブロット分析を実行して、これらの分化した骨格筋細胞における活性化Ｉｎｓｒ（すなわち、Ｙ１１４６のｐＩｎｓｒ）ならびにリン酸化Ｐｄｋ１、Ａｋｔ及びＡｓ１６０を含むその下流シグナル伝達分子のタンパク質発現レベルを調べた。
これらの培養骨格筋細胞における活性化Ｉｎｓｒのタンパク質発現を、インスリンまたは化合物＃４３処置後に測定した。予想通り、分化したＣ２Ｃ１２細胞において、５分間のインスリンでの処置により、Ｙ１１４６でｐＩｎｓｒβが有意に増加したが、全Ｉｎｓｒβはそうではなかった（図２１Ａ～図２１Ｂ）。さらに、６００ｐｐｂの化合物＃４３処置でも、これらの培養骨格筋細胞においてＹ１１４６のｐＩｎｓｒβが有意に増加したが、全Ｉｎｓｒβはそうではなかった（図２１Ａ～図２１Ｂ）。インスリン及び化合物＃４３の５分間の共処置では、これらの分化したＣ２Ｃ１２細胞のｐＩｎｓｒβタンパク質レベルが増加する傾向があったが（図２１Ａ～図２１Ｂ）、このことは、化合物＃４３またはインスリン処置後のＩｎｓｒβの刺激は一過性の事象であることを示している。実際、インスリン、化合物＃４３またはその両方による長期処置（６０分）では、ｐＩｎｓｒβレベルは低下したが（図２１Ｃ～図２１Ｄ）、このことは、骨格筋細胞において、インスリンまたは化合物＃４３処置後のＩｎｓｒの活性化が実際に一過性の事象であり、Ｉｎｓｒβのチロシンリン酸化を調節する負のフィードバックが存在することをさらに示している。いずれにせよ、化合物＃４３の短時間（５分間）の処置後にこれらの培養骨格筋細胞で観察されたＹ１１４６でのＩｎｓｒβのチロシンリン酸化の増強は、上記のインスリン抵抗性のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおけるＩｎｓｒβの活性化と一致している（図２０）。これらの分化したＣ２Ｃ１２細胞を、完全に無血清の条件下で、血清飢餓状態にし、培養し、化合物＃４３で処置したことから、これらの結果は、これらの分化した骨格筋細胞において、化合物＃４３が、インスリンを模倣するが迂回して、Ｉｎｓｒβを直接かつ迅速に活性化することができることを示唆している。
Ｉｎｓｒβのチロシンリン酸化は、インスリンに応答してＰＩ３Ｋ／Ｐｄｋ１シグナル伝達を活性化し、Ａｋｔのリン酸化を増強するため、これらの分化したＣ２Ｃ１２骨格筋細胞において、化合物＃４３が、インスリンを模倣してＡｋｔリン酸化を調節することができるかどうかを調べた。図２１Ａに示すように、５分間のインスリン処置により、リン酸化Ａｋｔタンパク質レベルの有意な増加がもたらされたが、全Ａｋｔタンパク質レベルは有意に増加しなかった。しかしながら、このＡｋｔのリン酸化の増加は、インスリン処置の６０分後のこれらの分化したＣ２Ｃ１２細胞では観察されなかった（図２１Ｃ～図２１Ｄ）。対照的に、化合物＃４３の５分間の処置では、これらのＣ２Ｃ１２細胞においてリン酸化Ａｋｔタンパク質レベルの有意な増加は引き起こされなかったが、化合物＃４３の６０分間の処置後、これらの細胞においてリン酸化Ａｋｔタンパク質レベルのロバストな増加が観察された（図２１Ｃ～図２１Ｄ）。インスリンと化合物＃４３の両方の共処置により、試験した両方の時点（６分及び６０分、図２１）でｐＡｋｔタンパク質レベルが有意に増加した。インスリンと化合物＃４３の共処置群におけるＡｋｔのリン酸化の増加レベルは、５分ではインスリン単独と比較可能であったが、一方、インスリンと化合物＃４３の両方の共処置後６０分でのリン酸化Ａｋｔのタンパク質レベルは、化合物＃４３単独処置後のレベルとほぼ同一であった。これらの結果は、これらの骨格筋細胞でインスリンがＩｎｓｒ下流シグナル伝達分子Ａｋｔを一時的に活性化することができることを示唆している。さらに、これらの結果は、化合物＃４３が、インスリンほど速くはないものの、インスリンを模倣するが迂回して、これらの細胞のＡｋｔを活性化することができることを明らかにした。さらに、これらの結果は、これらの分化した骨格筋細胞におけるＡｋｔリン酸化の刺激においてインスリンと化合物＃４３の間に相乗作用がなかったことも示している。しかしながら、これらの結果は、化合物＃４３とインスリンの両方の共処置により、活性化されたＡｋｔシグナル伝達の期間を引き延ばすことができることを明らかにした。
上述のように、ＡＳ１６０はＡｋｔ標的基質であり、骨格筋細胞内の小胞におけるＧＬＵＴ４タンパク質の保持に必要である。インスリン／Ｉｎｓｒβ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達に応答したＳ５８８でのＡＳ１６０のリン酸化により、細胞質小胞から細胞膜へのＧＬＵＴ４タンパク質の移行が引き起こされ、グルコースの取り込みが促進される。ｉｎ ｖｉｖｏでの研究により、化合物＃４３が、インスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスである糖尿病マウスにおける血糖値を低下させ、耐糖能を向上させることができることが明らかになった（図３～図８）。さらに、培養骨格筋細胞では、化合物＃４３処置後、特にインスリンと化合物＃４３の両方での共処置後に、グルコース取り込みの増加が観察された（図１９）。したがって、化合物＃４３は、ＡＳ１６０のリン酸化によるグルコース取り込みのために骨格筋細胞のＧＬＵＴ４移行を調節することができる可能性がある。したがって、無血清培地中、インスリン、化合物＃４３、またはその両方の５分間及び６０分間の処置後の分化Ｃ２Ｃ１２（骨格筋）細胞において、Ｓ５８８でのリン酸化ＡＳ１６０のタンパク質レベルを測定した。
図２１Ａ～図２１Ｂに示すように、５分間のインスリン処置は、これらの分化したＣ２Ｃ１２細胞において、ＡＳ１６０のタンパク質発現に影響を及ぼさなかったが、Ｓ５８８でのＡＳ１６０のリン酸化の有意な増加（約２倍）をもたらした。しかしながら、６０分間のインスリン処置後、リン酸化ＡＳ１６０の明らかな増加は観察されなかった（図２１Ｃ～図２１Ｄ）。これらの結果は、インスリンが骨格筋細胞におけるＧＬＵＴ４移行のためにＡＳ１６０のリン酸化を一時的に増強することができることを示唆している。
対照的に、化合物＃４３単独での５分間の処置は、これらの分化したＣ２Ｃ１２細胞におけるリン酸化ＡＳ１６０及び全ＡＳ１６０のタンパク質レベルに影響を及ぼさなかった（図２１Ａ～図２１Ｂ）。しかしながら、化合物＃４３で６０分間処置した後の骨格筋細胞において、Ｓ５８８でのリン酸化ＡＳ１６０のレベルのロバストな増加（約６倍）が観察された（図２１Ｃ～図２１Ｄ）。これらの結果は、これらの培養骨格筋細胞において、化合物＃４３が、インスリンほど速くはないものの、インスリンを模倣して、ＧＬＵＴ４移行のためのＡＳ１６０のリン酸化を誘導することができることを示唆している。
試験した両方の時点（５分及び６０分）でのインスリン及び化合物＃４３の両方での共処置は、リン酸化ＡＳ１６０タンパク質レベルの有意な増加をもたらした（図２１）。５分での共処置群におけるＡＳ１６０のリン酸化の増加のレベルはインスリン単独と比較可能であったが（図２１Ａ～図２１Ｂ）、このことは、共処置群で観察されたＡＳ１６０リン酸化が主にこの時点でのインスリンの効果によるものであることを示している。同様に、処置後６０分で、共処置群のリン酸化ＡＳ１６０のタンパク質レベルは、化合物＃４３単独処置後のレベルとほぼ同一であったが（図２１Ｃ～図２１Ｄ）、このことは、観察されたこの時点での共処置群のＡＳ１６０のリン酸化が、主に化合物＃４３単独の効果によるものであることを示している。これらの結果は、これらの分化したインスリン応答性細胞において、化合物＃４３とインスリンの両方の共処置がＡＳ１６０のリン酸化の持続時間を増加させ、グルコース取り込みのためのＧＬＵＴ４移行を促進することができることを示唆している。
総合すると、これらの結果は、化合物＃４３が、分化したＣ２Ｃ１２細胞において、インスリンを模倣するが迂回して、Ｉｎｓｒ（Ｉｎｓｒβのチロシンリン酸化によって示される）を直接かつ迅速に活性化することができることを示している。これは、インスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスの骨格筋で観察されたＩｎｓｒβの活性化と一致する（図２０）。活性化されたＩｎｓｒは、次いで、骨格筋のＰＩ３Ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達を活性化して（図１８に示すｉｎ ｖｉｖｏ研究でさらに裏付けられる）、その後、ＡＳ１６０（公知のＡｋｔ標的基質）をリン酸化し、グルコース取り込みのための細胞質小胞から細胞膜へのＧＬＵＴ４移行を増強することができる。実際、化合物＃４３の処置後、特にインスリンと化合物＃４３の両方の共処置後に、培養骨格筋細胞においてグルコース取り込みの増加が観察された（図１９）。化合物＃４３処置後の骨格筋のグルコース取り込みの増強は、糖尿病マウスの血糖値を低下させ、耐糖能を向上させることができる（図３～図８）。要するに、これらの結果は、化合物＃４３が、骨格筋細胞において、インスリンを模倣するが迂回して、Ｉｎｓｒβ／ＰＩ３Ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナルを直接活性化してＡＳ１６０をリン酸化し、細胞質小胞から細胞膜へのＧＬＵＴ４移行を増強して骨格筋へのグルコース取り込みを促進し、それにより、１型及び２型糖尿病の両方の主要な特徴及び病理に対抗することができることを示している。
３．化合物＃４３での慢性処置後のインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓におけるＩｎｓｒβのチロシンリン酸化の増強
実施例６に記載の研究は、化合物＃４３がｉｎ ｖｉｖｉｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で肝臓のＰｄｋ１／Ａｋｔ／Ｆｏｘｏ１のリン酸化を増強することができることを明らかにした（図１２～図１４）。これらすべての効果は、上記の骨格筋細胞と同様に、化合物＃４３処置後の肝細胞における上流シグナル伝達分子Ｉｎｓｒの活性化に起因し得る。前述のように、Ｙ１１４６及びその後のＹ１１５０／１１５１でのＩｎｓｒβのチロシンリン酸化は、インスリンのＩｎｓｒαへの結合後の活性化インスリン受容体シグナル伝達の最初の数ステップを反映しており、肝臓におけるＰＩ３Ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔ／Ｆｏｘｏ１シグナル伝達の上流の重要な事象である。したがって、化合物＃４３による慢性処置により、これらのインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓におけるＩｎｓｒβのチロシンリン酸化を調節することができるかどうかを調べた。
実施例６に記載の研究は、化合物＃４３がｉｎ ｖｉｖｉｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で肝臓のＰｄｋ１／Ａｋｔ／Ｆｏｘｏ１のリン酸化を増強することができることを明らかにした（図１２～図１４）。これらすべての効果は、上記の骨格筋細胞と同様に、化合物＃４３処置後の肝細胞における上流シグナル伝達分子Ｉｎｓｒの活性化に起因し得る。前述のように、Ｙ１１４６及びその後のＹ１１５０／１１５１でのＩｎｓｒβのチロシンリン酸化は、インスリンのＩｎｓｒαへの結合後の活性化インスリン受容体シグナル伝達の最初の数ステップを反映しており、肝臓におけるＰＩ３Ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔ／Ｆｏｘｏ１シグナル伝達の上流の重要な事象である。したがって、化合物＃４３による慢性処置により、これらのインスリン抵抗性Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓におけるＩｎｓｒβのチロシンリン酸化を調節することができるかどうかを調べた。
出生後３８日目のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、生理食塩水（０．２％化合物溶媒ＤＭＳＯを含有する）または化合物＃４３を、体重１ｋｇあたり０．１３６ｍｇの化合物＃４３の用量で５２日間、毎日腹腔内注射した。上記の処置後、肝臓試料を採取し、Ｙ１１４６の蛍光Ｉｎｓｒβ及びＹ１１５０／１１５１の蛍光Ｉｎｓｒβ（ＯＤ４５０を取得するために）のＥＬＩＳＡアッセイ及び内部対照であるβ－チューブリンのウエスタンブロット分析に供した。各試料のＯＤ４５０をそのβ－チューブリンタンパク質レベルで正規化した後、各試料のＹ１１４６またはＹ１１５０／１１５１の蛍光Ｉｎｓｒβのレベルを取得した。
図２２Ａに示すように、生理食塩水処置マウスと比較した場合、化合物＃４３での処置後、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓において、チロシン１１４６のリン酸化Ｉｎｓｒβのタンパク質レベルが有意に増加した（約２．９倍増加）。同様に、チロシン１１５０／１１５１のリン酸化Ｉｎｓｒβのタンパク質レベルも、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓において、生理食塩水処置マウスと比較した場合、化合物＃４３での慢性処置後、有意に増加した（約２．９５倍増加）（図２２Ｂ）。これらの結果は、化合物＃４３で処置したＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓におけるＩｎｓｒの重要なインスリンシグナル伝達分子であるＰｄｋ１及びＡｋｔのリン酸化の増加の観察と一致する（図１２）。総合すると、これらの結果は、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスがインスリンに応答できないように設計されているにもかかわらず、化合物＃４３での慢性処置後にＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの肝臓においてインスリン受容体が活性化されることを明確に示している。言い換えれば、これらの結果は、化合物＃４３が、これらの重度ＩＩ型インスリン抵抗性糖尿病マウスの肝臓において、インスリン作用を回復させるか、インスリンを迂回するか、またはその両方で、Ｉｎｓｒβのチロシンリン酸化を刺激し、その後、ＰＩ３Ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達を活性化することができることを示唆している。
４．化合物＃４３は、インスリンを模倣するが迂回して、ヒト肝臓ＨｅｐＧ２細胞のＹ１１４６でのＩｎｓｒβ及びＳ５８８でのＡＳ１６０のリン酸化を刺激する
化合物＃４３が、インスリンを模倣するが迂回して、肝細胞のインスリン受容体を直接活性化することができるかどうかをさらに調べるために、ヒト肝臓ＨｅｐＧ２細胞を一晩血清飢餓状態にし、次いで無血清及びグルコースフリーのＤＭＥＭ培地中、化合物＃４３（６００ｐｐｂ）の存在下で３０分間及び６０分間インキュベートした。ウエスタンブロット分析を実施して、これらのヒト肝細胞における活性化ＩＮＳＲ（すなわち、Ｙ１１４６のｐＩＮＳＲβ）のタンパク質発現レベルを調べた。図２３に示すように、６００ｐｐｂの化合物＃４３の３０分及び６０分の処置の両方で、これらの培養肝細胞においてＹ１１４６のリン酸化ＩＮＳＲβが有意に増加したが、全ＩＮＳＲβは増加しなかった。これらの結果は、化合物＃４３を同じ期間処置した後のＨｅｐＧ２細胞におけるＩＮＳＲ下流シグナル伝達分子ＰＤＫ１及びＡＫＴのリン酸化の増加と一致する（図１３）。これらの肝細胞は血清飢餓状態にあり、化合物＃４３の処置は完全に無血清の条件下で行われたことから、これらの結果は、化合物＃４３が、肝細胞において、グルコース産生のためのＧ６ＰＣ発現の阻害、及びグルコース取り込みのためのＧＬＵＴ４発現の刺激のために、インスリンを模倣するが迂回して、ＩＮＳＲβのチロシンリン酸化を直接刺激し、ＰＩ３Ｋ／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴの活性化をもたらし、ＦＯＸＯ１を不活性化することができることを示唆している。
化合物＃４３が、インスリンを模倣するが迂回して、肝細胞のインスリン受容体を直接活性化することができるかどうかをさらに調べるために、ヒト肝臓ＨｅｐＧ２細胞を一晩血清飢餓状態にし、次いで無血清及びグルコースフリーのＤＭＥＭ培地中、化合物＃４３（６００ｐｐｂ）の存在下で３０分間及び６０分間インキュベートした。ウエスタンブロット分析を実施して、これらのヒト肝細胞における活性化ＩＮＳＲ（すなわち、Ｙ１１４６のｐＩＮＳＲβ）のタンパク質発現レベルを調べた。図２３に示すように、６００ｐｐｂの化合物＃４３の３０分及び６０分の処置の両方で、これらの培養肝細胞においてＹ１１４６のリン酸化ＩＮＳＲβが有意に増加したが、全ＩＮＳＲβは増加しなかった。これらの結果は、化合物＃４３を同じ期間処置した後のＨｅｐＧ２細胞におけるＩＮＳＲ下流シグナル伝達分子ＰＤＫ１及びＡＫＴのリン酸化の増加と一致する（図１３）。これらの肝細胞は血清飢餓状態にあり、化合物＃４３の処置は完全に無血清の条件下で行われたことから、これらの結果は、化合物＃４３が、肝細胞において、グルコース産生のためのＧ６ＰＣ発現の阻害、及びグルコース取り込みのためのＧＬＵＴ４発現の刺激のために、インスリンを模倣するが迂回して、ＩＮＳＲβのチロシンリン酸化を直接刺激し、ＰＩ３Ｋ／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴの活性化をもたらし、ＦＯＸＯ１を不活性化することができることを示唆している。
ＦＯＸＯ１に加えて、ＡＳ１６０は、脂肪細胞及び骨格筋などのインスリン標的組織における細胞内小胞から細胞膜へのグルコース移行に重要な役割を果たす別のＡＫＴ標的基質である。ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究により、化合物＃４３が、糖尿病マウスの血糖値を低下させ、耐糖能を向上させることができ（図３～図８）、培養ＡＭＬ－１２肝細胞のグルコース取り込みを増強することができる（図１７）ことが示されたが、このことは、肝臓におけるグルコース取り込みの増加が、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病に対抗して血糖値を下げ、耐糖能を向上させるうえでの化合物＃４３のメカニズムの１つであり得ることを示唆している。化合物＃４３処置後に誘発されるグルコース取り込みの増強は、肝細胞へのグルコース取り込みを刺激するための、ＧＬＵＴ４発現の増強（図１５～図１６で示す）、潜在的なＧＬＵＴ４移行の増強、またはその両方に起因し得る。後者のシナリオに対処するために、化合物＃４３で処置したＨｅｐＧ２細胞のリン酸化ＡＳ１６０（ＡＫＴ標的基質）タンパク質レベルを測定した。
図２３に示すように、これらの培養ヒト肝細胞において、６００ｐｐｂの化合物＃４３による３０分及び６０分の処置の両方で、Ｓ５８８でのリン酸化ＡＳ１６０が有意に増加したが、全ＡＳ１６０タンパク質レベルは増加しなかった。これらの結果は、化合物＃４３で同じ期間処置した後のＨｅｐＧ２細胞におけるＡＳ１６０の上流の２つの重要なシグナル伝達分子であるＰＤＫ１及びＡＫＴのリン酸化の増加と一致する（図１３）。ＡＳ１６０のリン酸化は、グルコース取り込みのために細胞内小胞から細胞膜へのＧＬＵＴ４移行を増強できることから、これらの結果は、化合物＃４３が、ヒト肝細胞において、インスリンを模倣するが迂回して、グルコース取り込みのための細胞質小胞から細胞膜へのＧＬＵＴ４移行を刺激することができることを示唆している。これを裏付けるものとして、培養ＡＭＬ－１２肝細胞において、化合物＃４３を１．５時間処置した後、グルコース取り込みの増強が観察されたことが想起されるであろう（図１７）。したがって、肝細胞では、化合物＃４３は、Ｉｎｓｒ／ＰＩ３ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔ／Ｆｏｘｏ１シグナル伝達を介してＧＬＵＴ４発現を刺激するだけでなく（図１２～図１７に示す）、Ｉｎｓｒ／ＰＩ３Ｋ／Ｐｄｋ１／Ａｋｔ／ＡＳ１６０を介して細胞質小胞から細胞膜へのＧＬＵＴ４移行も増強し（図１２～図１７、図２３で示す）、したがってグルコースの取り込みを増強するであろう。
まとめると、上記の研究はすべて、化合物＃４３が、インスリン抵抗性糖尿病Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋及び肝臓の両方でインスリン受容体機能を回復させることができる（Ｉｎｓｒβのチロシンリン酸化の増強によって示される）ことを明らかにしている。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究は、化合物＃４３が、インスリンを厳密に模倣して、骨格筋細胞及びヒト肝細胞の両方でインスリン受容体を活性化することができることをさらに示している。さらに、これらの結果は、インスリンと同様に、化合物＃４３が、Ｐｄｋ１／Ａｋｔシグナル伝達を活性化して、培養骨格筋細胞とヒト肝細胞の両方でＡＳ１６０（ＡＫＴ標的基質）のリン酸化を誘導することができることを示している。ＡＳ１６０のリン酸化の増強により、肝細胞及び骨格筋細胞の両方において、細胞質小胞から細胞膜へのＧＬＵＴ４移行が促進され、グルコースの取り込みが促進され、糖尿病の状況において血糖値が低下し、耐糖能が向上する。
これら２つの組織、すなわち肝臓及び骨格筋は、ＩＩ型糖尿病の発症及び病因においてはるかに最も重要であることを強調すべきである。化合物＃４３は、これらの組織におけるインスリンシグナル伝達カスケードを回復させる能力により、ＩＩ型糖尿病の治療において非常に大きな治療的価値を有し得る。
さらに、化合物＃４３は、インスリンが添加されていないインスリン応答性細胞においてインスリン模倣薬として機能することができるため、Ｉ型糖尿病の有効な治療薬にもなり得るという強力な可能性が存在する。
実施例９：化合物＃４３の慢性処置は、インスリン抵抗性糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスにおいて血清インスリン及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルの低下をもたらしたが、血清クレアチニンレベルの低下をもたらさなかった
材料及び方法
化合物
化合物＃４３は、Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｉｎｃの化学実験室で合成した。試験したすべての化合物の純度は、ＨＰＬＣによる測定で≧９９％であることが確認された。
材料及び方法
化合物
化合物＃４３は、Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｉｎｃの化学実験室で合成した。試験したすべての化合物の純度は、ＨＰＬＣによる測定で≧９９％であることが確認された。
動物
５週齢の雄の糖尿病偶発変異（レプチン受容体変異）Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から購入し、病原体フリーの飼育室に収容し、餌と水を自由に摂取させた。３か月齢の野生型（非糖尿病）Ｃ５７マウスもＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。
５週齢の雄の糖尿病偶発変異（レプチン受容体変異）Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から購入し、病原体フリーの飼育室に収容し、餌と水を自由に摂取させた。３か月齢の野生型（非糖尿病）Ｃ５７マウスもＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。
化合物＃４３による慢性処置
３８日齢の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、０．２％ＤＭＳＯを含有する生理食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）及び化合物＃４３（体重１キログラムあたり０．１３６ｍｇ、無菌生理食塩水で希釈）を５２日間、毎日腹腔内（ｉｐ）注射した。３か月齢の野生型（非糖尿病）Ｃ５７マウスの血清も採取した。処置後、これらの血清試料を採取し、インスリン、ＡＬＴ及びクレアチニンアッセイに供した。
３８日齢の雄のＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスに、０．２％ＤＭＳＯを含有する生理食塩水（０．０９％ＮａＣｌ）及び化合物＃４３（体重１キログラムあたり０．１３６ｍｇ、無菌生理食塩水で希釈）を５２日間、毎日腹腔内（ｉｐ）注射した。３か月齢の野生型（非糖尿病）Ｃ５７マウスの血清も採取した。処置後、これらの血清試料を採取し、インスリン、ＡＬＴ及びクレアチニンアッセイに供した。
血清インスリン、ＡＬＴ及びクレアチニンアッセイ
インスリン、ＡＬＴ及びクレアチニンの血清中レベルを、それぞれ、Ｔｈｅｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＩｎｓｕｌｉｎ Ｍｏｕｓｅ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＥＭＩＮＳ）、ＳｉｇｍａのＡＬＴ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙキット（カタログ番号ＭＡＫ０５２）、及びＡｂｃａｍのＣｒｅａｔｉｎｉｎｅ Ａｓｓａｙキット（カタログ番号Ａｂ６５３４０）を使用して、製造元のプロトコールに従って測定した。
インスリン、ＡＬＴ及びクレアチニンの血清中レベルを、それぞれ、Ｔｈｅｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＩｎｓｕｌｉｎ Ｍｏｕｓｅ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＥＭＩＮＳ）、ＳｉｇｍａのＡＬＴ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙキット（カタログ番号ＭＡＫ０５２）、及びＡｂｃａｍのＣｒｅａｔｉｎｉｎｅ Ａｓｓａｙキット（カタログ番号Ａｂ６５３４０）を使用して、製造元のプロトコールに従って測定した。
統計解析
適用可能な場合、スチューデントｔ検定を使用して、生理食塩水処置群と化合物処置群との差異の統計的有意性を判定し、０．０５未満のＰ値を有意とみなした。データは、図中に示すマウスの数の平均値±ＳＥＭとして提示する。
適用可能な場合、スチューデントｔ検定を使用して、生理食塩水処置群と化合物処置群との差異の統計的有意性を判定し、０．０５未満のＰ値を有意とみなした。データは、図中に示すマウスの数の平均値±ＳＥＭとして提示する。
結果及び考察
図２４Ａに示すように、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスは、インスリンレベルが約２５８６μＩＵ／ｍｌ（非糖尿病の野生型マウスよりも約１００倍高い）の高インスリン血症を示した。しかしながら、化合物＃４３処置により、そのレベルは非糖尿病の野生型マウスよりも依然として高いものの、血清インスリンレベルが劇的に減少（約８０％の減少）した（図２４Ａ）。これらの結果は、化合物＃４３が糖尿病患者の高インスリン血症を治療する可能性を有していることを示唆している。
図２４Ａに示すように、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスは、インスリンレベルが約２５８６μＩＵ／ｍｌ（非糖尿病の野生型マウスよりも約１００倍高い）の高インスリン血症を示した。しかしながら、化合物＃４３処置により、そのレベルは非糖尿病の野生型マウスよりも依然として高いものの、血清インスリンレベルが劇的に減少（約８０％の減少）した（図２４Ａ）。これらの結果は、化合物＃４３が糖尿病患者の高インスリン血症を治療する可能性を有していることを示唆している。
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）試験は、一般的には肝臓損傷を検出するために使用される。図２４Ｂに示すように、生理食塩水で処置したＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血清ＡＬＴレベルは、非糖尿病マウスよりも有意に高かった。しかしながら、化合物＃４３処置により、血清ＡＬＴレベルが有意に低下した。これらの結果は、化合物＃４３の慢性処置（５２日間毎日処置）が、肝臓毒性を示さず；むしろ、肝臓損傷に対する保護効果を有していたことを示唆している。
血中クレアチニン試験は、腎機能を評価するために広く使用されており、クレアチニンレベルの上昇は、腎機能障害または腎疾患を意味する。図２４Ｃに示すように、化合物＃４３処置後、Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスの血清クレアチニンレベルに有意な変化はなかった。これらの結果は、化合物＃４３の慢性処置（５２日間毎日処置）が腎機能に毒性効果を及ぼす可能性が低いことを示唆している。
総合すると、上記の結果は、糖尿病の被験体の高インスリン血症に対する化合物＃４３の潜在的な使用を示唆している。さらに、上記の結果は、化合物＃４３が肝臓及び腎臓の機能にほとんどまたはまったく毒性効果を及ぼさないことも示唆している。むしろ、化合物＃４３は肝臓の損傷に対する保護効果を示し得る。
結論（作用機序；図２５）
本開示における実験結果を、実線の赤い矢印で示し、一方、予想される結果（公開された文献に基づく）を破線の矢印で示す。化合物＃４３は、インスリンを模倣するが迂回して、細胞膜の内表面上でインスリン受容体βサブユニットのチロシンリン酸化を迅速に誘導することができるため、インスリンが細胞表面でインスリン受容体αに結合して活性化する必要性はなくなる。これにより、肝臓と骨格筋の両方でＰＩ３Ｋ／ＰＤＫ１／ＡＫＴシグナル伝達カスケードが活性化される。言い換えると、インスリンまたは活性な細胞表面インスリン受容体を存在させる必要なく、正常なインスリンシグナル伝達を回復させることができる。肝細胞では、ＡＫＴの活性化によりＦＯＸＯ１のリン酸化のロバストな増加が生じ、ＦＯＸＯ１の直接標的遺伝子Ｇ６ＰＣの発現が有意に低下し；これは、糖尿病の被験体の肝細胞におけるグルコース産生の阻害につながる。さらに、ＦＯＸＯ１間接標的遺伝子ＧＬＵＴ４の発現、及び細胞質小胞から細胞膜へのＧＬＵＴ４移行の重要な因子であるＡＫＴ標的基質ＡＳ１６０（ＴＢＣ１Ｄ４）のリン酸化は、化合物＃４３処置後の肝細胞において増強され、その結果、肝細胞膜のＧＬＵＴ４輸送タンパク質が増加し、血流からのグルコース取り込みが向上する。これらはすべて、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病の被験体の耐糖能の向上を示す。骨格筋細胞では、化合物＃４３は、インスリンを模倣するが迂回して、ＩＮＳＲβ／ＰＤＫ１／ＡＫＴシグナル伝達を活性化し、ＡＳ１６０（ＴＢＣ１Ｄ４）のリン酸化をもたらすことができる。ここでも、これによって、細胞質小胞から細胞膜へのＧＬＵＴ４移行が増強され、骨格筋細胞へのグルコース取り込みが促進され、最終的に、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病の被験体の両方で血糖値の有意な低下と耐糖能の劇的な向上がもたらされる。示すように、化合物＃４３は、肝細胞におけるＧ６ＰＣ発現の阻害によりインスリン作用を増強することができる。Ｇ６ＰＣ発現によって駆動されるプロセスである肝臓による制御不能のグルコース産生は、２型糖尿病の重要な特徴であり、重要な問題でもある。糖尿病の肝臓におけるグルコース産生の抑制は、最も広く使用されている抗糖尿病薬のクラスであるビグアナイド、例えばメトホルミンの重要な作用機序である。化合物＃４３は、このプロセスを遮断する能力を有しているため、２型糖尿病の治療において潜在的に非常に価値が高い。さらに、化合物＃４３は、インスリン抵抗性糖尿病マウスの骨格筋のインスリン受容体機能を回復させ、インスリン作用を増強して、培養骨格筋細胞のグルコース取り込みを刺激することができる。総合すると、これらの結果は、ヒトのＩ型及びＩＩ型糖尿病に対する化合物＃４３の使用に関する大きな可能性を示している。
本開示における実験結果を、実線の赤い矢印で示し、一方、予想される結果（公開された文献に基づく）を破線の矢印で示す。化合物＃４３は、インスリンを模倣するが迂回して、細胞膜の内表面上でインスリン受容体βサブユニットのチロシンリン酸化を迅速に誘導することができるため、インスリンが細胞表面でインスリン受容体αに結合して活性化する必要性はなくなる。これにより、肝臓と骨格筋の両方でＰＩ３Ｋ／ＰＤＫ１／ＡＫＴシグナル伝達カスケードが活性化される。言い換えると、インスリンまたは活性な細胞表面インスリン受容体を存在させる必要なく、正常なインスリンシグナル伝達を回復させることができる。肝細胞では、ＡＫＴの活性化によりＦＯＸＯ１のリン酸化のロバストな増加が生じ、ＦＯＸＯ１の直接標的遺伝子Ｇ６ＰＣの発現が有意に低下し；これは、糖尿病の被験体の肝細胞におけるグルコース産生の阻害につながる。さらに、ＦＯＸＯ１間接標的遺伝子ＧＬＵＴ４の発現、及び細胞質小胞から細胞膜へのＧＬＵＴ４移行の重要な因子であるＡＫＴ標的基質ＡＳ１６０（ＴＢＣ１Ｄ４）のリン酸化は、化合物＃４３処置後の肝細胞において増強され、その結果、肝細胞膜のＧＬＵＴ４輸送タンパク質が増加し、血流からのグルコース取り込みが向上する。これらはすべて、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病の被験体の耐糖能の向上を示す。骨格筋細胞では、化合物＃４３は、インスリンを模倣するが迂回して、ＩＮＳＲβ／ＰＤＫ１／ＡＫＴシグナル伝達を活性化し、ＡＳ１６０（ＴＢＣ１Ｄ４）のリン酸化をもたらすことができる。ここでも、これによって、細胞質小胞から細胞膜へのＧＬＵＴ４移行が増強され、骨格筋細胞へのグルコース取り込みが促進され、最終的に、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病の被験体の両方で血糖値の有意な低下と耐糖能の劇的な向上がもたらされる。示すように、化合物＃４３は、肝細胞におけるＧ６ＰＣ発現の阻害によりインスリン作用を増強することができる。Ｇ６ＰＣ発現によって駆動されるプロセスである肝臓による制御不能のグルコース産生は、２型糖尿病の重要な特徴であり、重要な問題でもある。糖尿病の肝臓におけるグルコース産生の抑制は、最も広く使用されている抗糖尿病薬のクラスであるビグアナイド、例えばメトホルミンの重要な作用機序である。化合物＃４３は、このプロセスを遮断する能力を有しているため、２型糖尿病の治療において潜在的に非常に価値が高い。さらに、化合物＃４３は、インスリン抵抗性糖尿病マウスの骨格筋のインスリン受容体機能を回復させ、インスリン作用を増強して、培養骨格筋細胞のグルコース取り込みを刺激することができる。総合すると、これらの結果は、ヒトのＩ型及びＩＩ型糖尿病に対する化合物＃４３の使用に関する大きな可能性を示している。
実施例１０：無細胞系における化合物＃４３によるインスリン受容体タンパク質の直接活性化
材料及び方法
化合物
化合物＃４３及びその硫黄類似体化合物＃６８を、Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｉｎｃの化学実験室で合成した。試験したこれらの化合物の純度は、ＨＰＬＣによる測定で≧９９％であることが確認された。
材料及び方法
化合物
化合物＃４３及びその硫黄類似体化合物＃６８を、Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｉｎｃの化学実験室で合成した。試験したこれらの化合物の純度は、ＨＰＬＣによる測定で≧９９％であることが確認された。
インスリン受容体（Ｉｎｓｒ）のｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化、及び活性化Ｉｎｓｒ（Ｉｎｓｒβサブユニットの１１４６、１１５０、及び１１５１のリン酸化チロシン残基によって示される）のウエスタンブロット分析による検出
Ｉｎｓｒのｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化を、以下の修正を加えたＳｉｇｍａのプロトコールに従って実施した。簡潔に述べると、０．８μｌのネイティブＩＮＳＲストック溶液の原液を含有する１０μｌのネイティブインスリン受容体溶液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ９２６６；５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含有する酵素希釈緩衝液で希釈）を、インスリン（Ｓｉｇｍａ）、ＤＭＳＯ（化合物＃４３溶媒）、化合物＃４３または化合物＃６８（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６及び１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミンで希釈）を含有する同体積の溶液の存在下で氷上、３０分間インキュベートした。次いで、０．２ｍＭ ＡＴＰ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び４ｍＭ ＭｎＣｌ２を含有する２０μｌの２×キナーゼ緩衝液を上記の反応液に加え、混合し、氷上で４５分間インキュベートした。
Ｉｎｓｒのｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化を、以下の修正を加えたＳｉｇｍａのプロトコールに従って実施した。簡潔に述べると、０．８μｌのネイティブＩＮＳＲストック溶液の原液を含有する１０μｌのネイティブインスリン受容体溶液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ９２６６；５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含有する酵素希釈緩衝液で希釈）を、インスリン（Ｓｉｇｍａ）、ＤＭＳＯ（化合物＃４３溶媒）、化合物＃４３または化合物＃６８（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６及び１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミンで希釈）を含有する同体積の溶液の存在下で氷上、３０分間インキュベートした。次いで、０．２ｍＭ ＡＴＰ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び４ｍＭ ＭｎＣｌ２を含有する２０μｌの２×キナーゼ緩衝液を上記の反応液に加え、混合し、氷上で４５分間インキュベートした。
５マイクロリットルの上記反応物を、直ちに、Ｉｎｓｒβタンパク質（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｉｎｃ．）の１１４６、１１５０及び１１５１のリン酸化チロシン残基に対する特異的抗体を使用したウエスタンブロット分析に供した。ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して、タンパク質バンド濃度を測定した。
統計解析
該当する場合、スチューデントｔ検定を使用して、処置群間の差異の統計的有意性を判定し、０．０５未満のＰ値を有意とみなした。
該当する場合、スチューデントｔ検定を使用して、処置群間の差異の統計的有意性を判定し、０．０５未満のＰ値を有意とみなした。
結果：
１．ラット肝臓組織から精製した天然のインスリン受容体タンパク質は、化合物＃４３とインスリンによってｉｎ ｖｉｔｒｏ無細胞系で活性化された
培養肝細胞及び分化骨格筋細胞、ならびにＴ２Ｄ糖尿病マウスにおける研究により、化合物＃４３がｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方でインスリン受容体を活性化することができることが明らかになった。化合物＃４３がＩｎｓｒの活性化に直接影響を及ぼすかどうかを調べるため、ネイティブインスリン受容体タンパク質（ラット肝組織から精製）のｉｎ ｖｉｔｒｏ無細胞リン酸化アッセイを実施した。チロシン残基１１４６、１１５０及び１１５１においてリン酸化Ｉｎｓｒβに対する特異的抗体を使用して、活性化Ｉｎｓｒを検出した。予想通り、インスリン処置はこの無細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ系においてＹ１１４６／１１５０／１１５１においてＩｎｓｒβのリン酸化を誘導することができた（図２６）。重要なことに、化合物＃４３は、１．９及び３．８μＭの用量で、Ｙ１１４６／１１５０／１１５１においてＩｎｓｒβのリン酸化を有意に増強することができ、リン酸化レベルの上昇は０．５μＭインスリンと直接比較可能であった（図２６）。これらの結果は、化合物＃４３がインスリンを忠実に模倣してインスリン受容体を直接活性化することができることを裏付けるものであり、化合物＃４３がＩ型糖尿病を含む糖尿病に対してインスリンを置き換えるものとなる可能性を有するというさらなる分子的エビデンスを提供している。
１．ラット肝臓組織から精製した天然のインスリン受容体タンパク質は、化合物＃４３とインスリンによってｉｎ ｖｉｔｒｏ無細胞系で活性化された
培養肝細胞及び分化骨格筋細胞、ならびにＴ２Ｄ糖尿病マウスにおける研究により、化合物＃４３がｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方でインスリン受容体を活性化することができることが明らかになった。化合物＃４３がＩｎｓｒの活性化に直接影響を及ぼすかどうかを調べるため、ネイティブインスリン受容体タンパク質（ラット肝組織から精製）のｉｎ ｖｉｔｒｏ無細胞リン酸化アッセイを実施した。チロシン残基１１４６、１１５０及び１１５１においてリン酸化Ｉｎｓｒβに対する特異的抗体を使用して、活性化Ｉｎｓｒを検出した。予想通り、インスリン処置はこの無細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ系においてＹ１１４６／１１５０／１１５１においてＩｎｓｒβのリン酸化を誘導することができた（図２６）。重要なことに、化合物＃４３は、１．９及び３．８μＭの用量で、Ｙ１１４６／１１５０／１１５１においてＩｎｓｒβのリン酸化を有意に増強することができ、リン酸化レベルの上昇は０．５μＭインスリンと直接比較可能であった（図２６）。これらの結果は、化合物＃４３がインスリンを忠実に模倣してインスリン受容体を直接活性化することができることを裏付けるものであり、化合物＃４３がＩ型糖尿病を含む糖尿病に対してインスリンを置き換えるものとなる可能性を有するというさらなる分子的エビデンスを提供している。
２．化合物＃４３の硫黄類似体である化合物＃６８は、無細胞系でのＩｎｓｒの活性化において化合物＃４３よりもはるかに効果が低い
培養肝細胞及び２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスでの研究により、化合物＃４３の硫黄類似体である化合物＃６８は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのグルコース産生の阻害（図１）及びＴ２Ｄマウスにおける高血糖症の減弱（図４）において化合物＃４３よりも効果が低いことが示された。無細胞系でのＩｎｓｒの活性化において化合物＃４３と化合物＃６８の間に示差的な効果があるかどうかを調べるために、同量のネイティブインスリン受容体タンパク質を同じモル濃度（３．８μＭ）の化合物＃４３または化合物＃６８の存在下でインキュベートし、ｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化アッセイに供した。図２７に示すように、試験した用量で化合物＃６８ではなく化合物＃４３がＩｎｓｒを活性化することができた。これらの研究は、Ｉｎｓｒの活性化において化合物＃６８が試験した用量で化合物＃４３よりも効果が低いことを示唆しており、これは肝臓グルコース産生の阻害（図１）及びＴ２Ｄマウスにおける高血糖症（図４）に対する化合物＃６８の低い効力の説明となり得る。
培養肝細胞及び２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスでの研究により、化合物＃４３の硫黄類似体である化合物＃６８は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのグルコース産生の阻害（図１）及びＴ２Ｄマウスにおける高血糖症の減弱（図４）において化合物＃４３よりも効果が低いことが示された。無細胞系でのＩｎｓｒの活性化において化合物＃４３と化合物＃６８の間に示差的な効果があるかどうかを調べるために、同量のネイティブインスリン受容体タンパク質を同じモル濃度（３．８μＭ）の化合物＃４３または化合物＃６８の存在下でインキュベートし、ｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化アッセイに供した。図２７に示すように、試験した用量で化合物＃６８ではなく化合物＃４３がＩｎｓｒを活性化することができた。これらの研究は、Ｉｎｓｒの活性化において化合物＃６８が試験した用量で化合物＃４３よりも効果が低いことを示唆しており、これは肝臓グルコース産生の阻害（図１）及びＴ２Ｄマウスにおける高血糖症（図４）に対する化合物＃６８の低い効力の説明となり得る。
実施例１１：化合物＃４３の急性処置後のストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）マウスの血糖値の低下
材料及び方法
化合物
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）はＳｉｇｍａから購入した。化合物＃４３は、Ａｌｌｔｅｃｈ，ＩｎｃのＣｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで合成した。化合物＃４３の純度は、ＨＰＬＣによる測定で≧９９％であることが確認された。
材料及び方法
化合物
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）はＳｉｇｍａから購入した。化合物＃４３は、Ａｌｌｔｅｃｈ，ＩｎｃのＣｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで合成した。化合物＃４３の純度は、ＨＰＬＣによる測定で≧９９％であることが確認された。
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）マウスモデル及びこれらのＴ１Ｄマウスの血糖値に対する化合物＃４３の効果
５週齢のＣ５７／ＢＬ６雄マウスに、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ、５５ｍｇ／ｋｇマウス体重）を５日間、毎日腹腔内注射し、その後、回復のためにさらに１４日間飼育室に収容した。これらのマウスの血糖値を、グルコメーターを使用して測定した。血糖値が５００ｍｇ／ｄＬを上回る動物を、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）とみなした。５００～５５０ｍｇ／ｄＬの非絶食時血糖値を有するこれらのＴ１Ｄマウスを一晩絶食させ、５．４ｍｇ／ｋｇ体重の化合物＃４３または２％ＤＭＳＯを含有する生理食塩水（化合物＃４３ストック溶媒）を腹腔内注射した。注射後１、２及び３時間において、グルコメーターを使用してこれらのマウスの血糖値を測定した。
５週齢のＣ５７／ＢＬ６雄マウスに、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ、５５ｍｇ／ｋｇマウス体重）を５日間、毎日腹腔内注射し、その後、回復のためにさらに１４日間飼育室に収容した。これらのマウスの血糖値を、グルコメーターを使用して測定した。血糖値が５００ｍｇ／ｄＬを上回る動物を、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）とみなした。５００～５５０ｍｇ／ｄＬの非絶食時血糖値を有するこれらのＴ１Ｄマウスを一晩絶食させ、５．４ｍｇ／ｋｇ体重の化合物＃４３または２％ＤＭＳＯを含有する生理食塩水（化合物＃４３ストック溶媒）を腹腔内注射した。注射後１、２及び３時間において、グルコメーターを使用してこれらのマウスの血糖値を測定した。
統計解析
スチューデントｔ検定を使用して、各時点での対照（ＤＭＳＯ）と化合物＃４３群との差異の統計的有意性を判定した。０．０５未満のＰ値は、これら２つの群間の統計的に有意な差を示す。
スチューデントｔ検定を使用して、各時点での対照（ＤＭＳＯ）と化合物＃４３群との差異の統計的有意性を判定した。０．０５未満のＰ値は、これら２つの群間の統計的に有意な差を示す。
結果
Ｔ１Ｄマウスの高血糖症に対する化合物＃４３の潜在能力を調べるために、５００～５５０ｍｇ／ｄＬの血糖値を有するＳＴＺ誘発Ｔ１Ｄマウスを一晩絶食させ、ＤＭＳＯまたは化合物＃４３（５．４ｍｇ／ｋｇ体重）を含有する生理食塩水を、１、２及び３時間、腹腔内注射し、血糖値の測定に供した。図２８に示すように、３時間の期間中、対照マウス（ＤＭＳＯ含有生理食塩水を注射した）の血糖値に明白な変化はなかった。しかしながら、化合物＃４３で１時間処置した後、これらのＴ１Ｄマウスでは血糖値の低下傾向が観察された（図２８）。さらに重要なことに、２時間及び３時間の化合物＃４３処置後のいずれにおいても、これらのＴ１Ｄマウスで血糖値の有意な低下が観察された（図２８）。総合すると、これらの結果は、化合物＃４３がＴ１Ｄマウスの高血糖症を軽減することを裏付けるものである。
Ｔ１Ｄマウスの高血糖症に対する化合物＃４３の潜在能力を調べるために、５００～５５０ｍｇ／ｄＬの血糖値を有するＳＴＺ誘発Ｔ１Ｄマウスを一晩絶食させ、ＤＭＳＯまたは化合物＃４３（５．４ｍｇ／ｋｇ体重）を含有する生理食塩水を、１、２及び３時間、腹腔内注射し、血糖値の測定に供した。図２８に示すように、３時間の期間中、対照マウス（ＤＭＳＯ含有生理食塩水を注射した）の血糖値に明白な変化はなかった。しかしながら、化合物＃４３で１時間処置した後、これらのＴ１Ｄマウスでは血糖値の低下傾向が観察された（図２８）。さらに重要なことに、２時間及び３時間の化合物＃４３処置後のいずれにおいても、これらのＴ１Ｄマウスで血糖値の有意な低下が観察された（図２８）。総合すると、これらの結果は、化合物＃４３がＴ１Ｄマウスの高血糖症を軽減することを裏付けるものである。
実施例においていくつかの実施形態を示しているが、本開示の他の実施形態を提供するためにそれらを変更し得ることは明らかである。したがって、本発明の範囲は、単に例示として示す特定の実施形態によってではなく、添付の特許請求の範囲によって定義されることが理解されるであろう。
Claims (34)
- 式（２）に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩：
式中、Ｒ８が、Ｈであり；
Ｘが、Ｈであり；
各Ｒ５’が、独立して、Ｈまたはハロゲンであり；ならびに
各Ｒが、独立して、Ｃ１－６アルキルであり、そのそれぞれが、独立して、場合によりハロゲンで１～３回置換されていてもよい。 - 前記化合物が、式（２’）：
の化合物である、請求項１に記載の化合物（式中、Ｒ ８ 、Ｘ、及びＲは、請求項１の定義と同じである。）。 - 式中、各Ｒが、独立して非置換Ｃ１－６アルキルである、請求項１または２に記載の化合物。
- 式中、各Ｒが、独立してＣ１－３アルキルであり、その各々が、独立して、場合により、ハロゲンにより１～３回置換されていてもよい、請求項１または２に記載の化合物。
- 式中、各Ｒが、独立して非置換Ｃ１－３アルキルである、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。
- 式中、各Ｒが、独立して、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３である、請求項５に記載の化合物。
- 前記化合物が、式（３）：
の化合物であり、
式中、Ｒ８が、Ｈであり；
Ｘが、Ｈであり；及び
各Ｒ’が、独立して、Ｈまたはハロゲンである、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。 - 前記化合物が、式（３’）：
の化合物である、請求項７に記載の化合物（式中、Ｒ ８ 、Ｘ、及びＲ’は、請求項７の定義と同じである。）。 - 式中、各Ｃ（Ｒ’）３が、独立して、ＣＦ３、ＣＨＦ２、もしくはＣＨ２Ｆ、またはＣＨ３である、請求項７または８に記載の化合物。
- 式中、各Ｃ（Ｒ’）３がＣＨ３である、請求項９に記載の化合物。
- 前記化合物が、以下の式で表される化合物である、請求項１～６のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩：
- 前記化合物が、以下の式で表される化合物である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩：
- 請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、医薬組成物。
- 前記組成物が、式（２）の単一の化合物、またはその薬学的に許容される塩のみを含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
- 治療有効量の、請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、インスリン抵抗性障害の治療のための医薬組成物であって、
前記インスリン抵抗性障害が、糖尿病、肥満、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性症候群、シンドロームＸ、インスリン抵抗性、血圧上昇、高血圧、高血中コレステロール、脂質異常症、高脂血症、脂質異常症、脳卒中、冠動脈疾患または心筋梗塞を含む動脈硬化性疾患、高血糖症、耐糖能障害、インスリン放出遅延、冠動脈心疾患を含む糖尿病合併症、狭心症、うっ血性心不全、脳卒中、認知症の認知機能、網膜症、神経障害、腎症、糸球体腎炎、糸球体硬化症、ネフローゼ症候群、高血圧性腎硬化症、いくつかの種類のがん（例えば、子宮内膜、乳房、前立腺、及び結腸）、高インスリン血症及び／もしくは高プロインスリン血症、妊娠関連疾患又は女性の生殖機能の低下（例えば、月経不順、不妊、排卵不順、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ））、脂肪異栄養症、コレステロール関連障害、例えば、胆石、胆嚢炎及び胆石症、痛風、閉塞性睡眠時無呼吸、呼吸器系の問題、骨関節炎、骨粗鬆症、またはＩＩ型糖尿病関連血管障害である、医薬組成物。 - 治療有効量の請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、糖尿病の治療のための医薬組成物。
- 前記糖尿病が、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病である、請求項１６に記載の医薬組成物。
- 治療有効量の請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、変性疾患の治療のための医薬組成物であって、
前記変性疾患が、心血管疾患、心不全、アルツハイマー病、パーキンソン病、及び筋肉減少症からなる群から選択される、医薬組成物。 - 請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、グルコース産生を阻害するための医薬組成物。
- 請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、血清ＨｂＡ１ｃレベルの低下のための医薬組成物。
- 請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、耐糖能の増加のための医薬組成物。
- 請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、Ｇ６ｐｃ発現の阻害のための医薬組成物。
- 請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、肝臓及び／または骨格筋における、Ｐｄｋ１、Ａｋｔ、ＡＳ１６０、及びＦｏｘｏ１のリン酸化の増強のための医薬組成物。
- 請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、Ｇｌｕｔ４発現の増加のための医薬組成物。
- 請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、インスリン抵抗性状態の被験体におけるインスリンシグナル伝達の活性化及び／または回復のための医薬組成物。
- 前記被験体が、有意なレベルの循環インスリンを特徴とする、請求項２５に記載の医薬組成物。
- 前記インスリン抵抗性状態が、前記被験体における正確または適切なリン酸化インスリン受容体の減少を特徴とする、請求項２５に記載の医薬組成物。
- 前記被験体が、糖尿病、及び／または糖尿病関連疾患、障害、または病態を有する、請求項２５に記載の医薬組成物。
- 請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、被験体における細胞へのグルコース取り込みの増強のための医薬組成物。
- 前記細胞が、骨格筋細胞及び肝細胞である、請求項２９に記載の医薬組成物。
- 請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、グルコース取り込みのための、細胞質小胞から細胞膜へのグルコース輸送体タンパク質（ＧＬＵＴ）の移行の増強のための医薬組成物。
- 前記治療有効量の投与を達成するレジメンに従って、前記化合物を含み及び／または送達する組成物である、請求項１５～３１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記組成物が、活性医薬成分及び１つ以上の担体または賦形剤を含む医薬組成物であり、前記活性医薬成分が、請求項１に記載の式（２）の化合物を含むか、またはそれからなる、請求項３２に記載の医薬組成物。
- 前記活性医薬成分が、前記化合物からなる、請求項３３に記載の医薬組成物。
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