KR20110035127A - 곰피와 감태 추출물 유래의 플로로탄닌을 유효성분으로 하는 염증억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 곰피와 감태 추출물 유래의 플로로탄닌을 유효성분으로 함유하는 염증억제용 조성물에 관한 것으로, 특히 에탄올 또는 메탄올 추출물 중 헥산과 에틸아세테이트 획분과 에틸아세테이트 획분에서 분리된 phlorofucofuroeckol A (플로로푸코푸로에콜 에이)는 염증매개인자인 iNOS와 COX-2 발현억제와 이 효소에 의해 생성되는 NO와 PGE₂의 생성억제에 효능이 있으므로 염증과 관련된 질병을 예방 및 치료하는데 뛰어난 효과가 있다.

곰피와 감태 추출물, 플로로탄닌, 항염증 효과, iNOS, COX-2, PGE2

Description

곰피와 감태 추출물 유래의 플로로탄닌을 유효성분으로 하는 염증억제용 조성물{Anti-inflammatory composition containing phlorotannins from ecklonia stolonifera and ecklonia cava extract as a effective component}

본 발명은 곰피와 감태 추출물로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 항염증 활성을 지닌 조성물에 관한 것이다.

염증반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전이며, 일단 자극이 가해지면 국소적으로 histamine, serotonine, bradykinin, prostaglandins, hydroxyeicosatetraenoic acid (HETE), leukotriene과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증을 유발한다 (Willoughby, D.A. Ann. Rhem . Dis, 34, p471-478, 1975).

대식세포는 NO, cytokine 등에 의해 염증에 반응하고, 또한 염증, 면역반응 모두에서 중요한 조절세포로 작용하는데, 이렇게 작용하기 위해서는 반드시 활성화 과정을 거쳐야 한다. 그람 음성균의 세포벽 구성성분 중의 하나이며 내독소로 잘 알려진 LPS (lipopolysaccharide)는 대식세포의 활성화에 관여하는 가장 잘 알려진 외부인자이다. 특히 RAW 264.7 세포와 같은 대식세포나 단핵세포에서 TNF-α (tumor necrosis factor-alpha), IL-6 (interleukin-6), IL-1β (interleukin-1 beta)와 같은 전구염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokine)을 증가시키는 것으로 알려져 있다 (Lee, E. S. et al., Biol . Pharm . Bull . 27, p617-620, 2004).

LPS가 대식세포를 자극하게 되면 iNOS (inducible nitric oxide synthase)라는 효소에 의해 L-arginine이 L-citrulline으로 변하는 과정에서 L-arginine의 nitric oxide (NO)가 떨어져 나감으로써 대식세포에 NO가 생성된다. 포유동물에서 NO는 세 가지 종류의 NO 합성효소 (NOS, nitric oxide synthase), 즉 nNOS (neuronal NOS), eNOS (endothelial NOS), iNOS (inducible NOS)에 의해 합성된다. 이 세 가지 종류의 NOS 중 특히 iNOS에 의해 생성된 NO는 병리적인 혈관확장, 세포독성, 조직 손상 등과 같은 생체에 유해한 작용을 나타낸다.

염증인자인 프로스타글란딘 E2 (PGE₂)는 세포막의 구성성분인 인지질이 LPS에 의해 자극을 받아 포스포리파제 A2 (phospholipase A2)라는 효소에 의해 유리된 아라키돈산이 COX (cyclooxygenae)라고 불리우는 효소의 촉매작용을 받아 형성되어 염증반응을 유도하게 된다. COX는 COX-1과 COX-2로 분류되는데, COX-1은 체내에서 혈소판의 형성, 위벽보호, 신장기능의 유지 등 정상적이 생체기능에 작용하며 (Seibert, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91, p12013-12017, 2004) COX-2는 염증매개물질인 PGE₂를 합성한다. PGE₂는 염증반응, 면역반응, 그리고 angiogenesis를 촉진하는 등 암 발생에도 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다 (Kim, J. Y. et al., FEBS letters., 569, p321-326, 2004).

선택성 COX-2 억제제 (selective COX-2 inhibitors)를 포함하는 모든 비스테로이드성 항 염증제 (non-steroidal antiinflammatory drugs, NSAIDs)는 항염증, 해열 및 진통 효과를 나타낸다. 하지만 이러한 약들의 장기간 복용은 심각한 부작용을 초래한다. 예를 들어, 위장관계의 소화성 궤양출혈로 인한 이차적 빈혈 초래, 혈소판 기능 억제, 분만 유도 억제, 신장에 대한 부작용, 간장 손상, 과민 방응 등이 있다. 이러한 약물의 부작용을 극복하기 위하여 보다 개선된 치료제의 개발은 필수적이고 시급한 실정이다. 이것과 관련지어 천연물에서 그 항염증 활성 성분을 찾으려는 연구들이 활발히 진행되고 있다.

곰피 (Ecklonia stolonifera OKAMURA)와 감태 (Ecklonia cava)는 다년생 갈조류로서 수심 2~10 m에 서식하고 있으며, 한국과 일본 등지에 분포하고 있다. 오래전부터 다시마, 미역 등과 함께 식용으로 이용되어져 왔다. 곰피의 생리활성으로는 항산화 활성 (Lee, J. H. et al., Arch . Pharm . Res. 19, p223-227, 1996), 항돌연변이 활성 (Lee J. H. et al., J. Food Sci . Nutr. 1, p64-68, 1996; Lee, J. H. et al., Nat . Prod . Sci . 4, p105-114, 1998; Han E. S. et al., Environ . Mutagen. Carcinogen. 20, p104-111, 2000), 섭식 저해 효과 (Taniguchi K. et al., Nippon Suisan Gakkaishi, 57, p2065-2071, 1991) 및 티로시나제 저해 활성이 보고되어 있다 (Park D. C. et al., J. Fish. Sci. Tech. 3, p195-199, 2000).

하지만 곰피와 감태에서 분리된 유기용매 분획과 특히 항산화활성이 높은 에틸아세테이트 분획으로부터 분리된 화합물의 항염증에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 따라서, 본 발명자들은 곰피와 감태로부터 분리한 신규한 화합물이 염증 인자들의 발현을 억제함을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 곰피와 감태 유래의 신규한 화합물을 분리, 정제하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 곰피와 감태에서 분리된 유기용매 분획과 특히 항산화활성이 높은 에틸아세테이트 분획으로부터 분리된 화합물의 항염증 효과를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 곰피와 감태로부터 분리한 상기 화합물이 염증 인자들의 발현을 억제를 확인하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 항염증 활성을 지닌 신규한 화합물을 제공하기 위하여 곰피와 감태 조추출물을 제조하고, 이로부터 n-헥산가용추출물과 에틸아세테이트 가용추출물을 얻어, 에틸아세테이트 가용추출물로부터 신규한 플로로푸코푸로에콜 에이를 분리 정제한 후, 그의 항염증 효과를 검증하므로써 달성하였다.

곰피 (Ecklonia stolonifera OKAMURA)로부터 분리된 플로로푸코푸로에콜 A는 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도된 NO와 ROS 생성을 저해할 뿐만 아니라, iNOS와 COX-2 단백질의 발현 저해를 유가시키므로써 NO와 PGE₂의 생성 저해 효과가 있으므로 염증 질환의 예방 및 치료용 약학조성물로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

본 발명은 곰피 (Ecklonia stolonifera OKAMURA)와 감태 추출물로부터 분획된 n-헥산 가용성분과 에틸아세테이트 가용성분 및 에틸아세테이트 가용성분으로부터 분리된 하기 구조의 신규 화합물 또는 이의 약학조성물을 제공한다.

Phlorofucofuroeckol A : C₃₀H₁₈O₁₄ (MW=602).

상기 곰피와 감태 추출물은 조추출물 또는 비극성용매 가용 추출물로써, 조추출물은 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올과 같은 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 에탄올에 가용한 추출물을 포함하며, 비극성용매 가용추출물은 n-헥산, 디클로로메탄, 클로로포름 또는 에틸 아세테이트로부터 선택된 비극성용매로, 바람직하게는 n-헥산 또는 에틸아세테이트로 추출한 것을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 곰피와 감태 조추출물 및 비극성용매 가용추출물로부터 분리되는 플로로탄닌류의 화합물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 곰피와 감태 조추출물은 곰피와 감태를 음지에서 자연건조 후 마쇄하여 분말화한 후, 곰피와 감태 건조 중량의 약 3 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올과 같은 저급 알코올 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 메탄올로 20 내지 100℃, 바람직하게는 20 내지 70℃의 추출 온도에서 약 0.5 시간 내지 2일, 바람직하게는 1시간 내지 1일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법으로 1회 내지 5회, 바람직하게는 3회 연속 추출하여 수득한 후, 감압여과하고 여액을 진공회전농축기로 20 내지 100℃, 바람직하게는 40 내지 70℃에서 감압농축하여 물, 저급알코올 또는 이들의 혼합용매에 가용한 곰피와 감태 조추출물을 수득할 수 있다.

상기 곰피와 감태 조추출물은 물에 현탁한 후, n-헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, n-부탄올 순으로 용매를 이용하여 추출하여 본 발명의 곰피와 감태 비극성용매 가용 추출물, 바람직하게는 n-헥산 또는 에틸아세테이트 가용성 분획물을 수득할 수 있고, 더욱 구체적으로는 곰피와 감태 조추출물 즉, 곰피와 감태 에탄올추출물에 n-헥산:물:에탄올을 일정 비율, 바람직하게는 10:9:1로 혼합하여 n-헥산 가용성 분획물 및 물가용성 분획물을 수득할 수 있고, 다시 상기 물가용성 분획물을 디클로로메탄으로 추출하여 물가용성 분획물 및 디클로로메탄 가용성 분획물을 수득할 수 있으며, 이 물가용성 분획물에 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세테이트 가용성 분획물 및 물가용성 분획물을 수득할 수 있고, 마지막으로 상기 물가용성 분획물을 부탄올로 추출하여 부탄올가용성 분획물과 물가용성 분획물을 수득할 수 있다.

상기 비극성 용매 가용성 분획물에 대하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (SiO₂ column chromatography)를 수행할 수 있으며, 에틸아세테이트:메탄올의 혼합용매, 바람직하게는 에틸아세테이트:메탄올의 50:1의 혼합용매로 시간당 일정용량, 바람직하게는 시간당 1000 mL의 속도로 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 F1부터 F20까지 20개의 분획물을 수득할 수 있다.

상기 F1 분획물은 다시 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 헥산:에틸아세테이트 1:1의 혼합용매로 분리한 후, 칼럼 크로마토그래피에서 농도기울기 용출로 20％ ∼100％ 메탄올 용액을 사용하여 분리하고, 세파덱스로 정제하여 화합물들을 분리 및 동정할 수 있다.

본 발명은 곰피와 감태 조추출물 및 비극성용매 가용추출물로부터 분리되는 플로로탄닌류의 화합물을 분리, 정제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 방법으로 수득된 플로로탄닌류의 화합물을 함유하는 항염증 활성을 갖는 약학조성물을 제공한다.

상기에서 수득된 곰피와 감태 추출물 또는 그로부터 분리된 플로로탄닌류 화합물의 염증반응에 대한 항염증 약학조성물로써의 효능을 조사하기 위하여, 염증과 관련된 실험에 사용하는 세포주 중에서 염증반응에 있어 아주 특이적인 결과를 보여주는 세포인 RAW 264.7 세포를 사용하여 LPS로 유발된 염증반응에 대한 효과를 측정해 본 결과, 본 발명에 따른 곰피 추출물 또는 그로부터 분리된 플로로탄닌류의 화합물이 RAW 264.7 세포에 대한 항염증효과가 효과적으로 나타남을 확인하였다.

본 발명의 곰피와 감태 추출물 또는 그로부터 분리된 플로로탄닌류 화합물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 곰피와 감태 추출물 또는 그로부터 분리된 플로로탄닌류의 화합물을 함유하는, 항염증에 대한 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.5 % ∼ 50 % 중량으로 포함한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화합물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈. 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고 무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로즈 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물 또는 화합 물은 1일 0.01 내지 250 mg/kg으로, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 화합물의 투여량은 투여 경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 곰피와 감태 조추출물의 제조

본 발명에 사용한 곰피는 부산시 기장군 대변연안 앞바다에서, 감태는 부산시 기장군 일광면 문동리 앞바다에서 채집하여 사용하였다. 곰피와 감태는 음지에서 자연건조 후 마쇄하여 얻은 분말 3 kg을 에탄올 10 L를 넣고 70℃에서 일정시간 간격 (12h, 6h, 3h)으로 3회 반복하여 환류냉각추출한 후 여지(와트만사, 미국)로 감압여과한 다음, 여과 추출물은 진공회전농축기로 40℃에서 에탄올을 제거한 후 추출된 잔사로서 곰피와 감태 조추출물 500 ∼ 800g을 수득하였으며, 이 중 1 g을 취하여 항염증 활성검색을 위한 시료로 사용하였다.

실시예 2: 곰피와 감태 헥산 가용 추출물의 제조

상기 실시예 1에서 얻은 곰피와 감태 조추출물 700 g에 헥산:메탄올:물 =10:9:1 의 혼합용매 4 L를 가하여 혼합한 후 3∼4차례 분획하여 수가용성 분획물 2 L 및 헥산 가용성 분획물 2 L를 얻은 후 헥산 가용성 분획물을 건조하여 헥산 가용 추출물 27.93 g을 수득하여 시료로 사용하였으며, 이 중 1 g을 취하여 염증반응에 대한 활성검색을 위한 시료로 사용하였다.

실시예 3: 곰피와 감태 디클로로메탄 가용 추출물의 제조

상기 실시예 2에서 얻은 수가용성 분획물 2 L에 디클로로메탄 2 L를 가하여 혼합한 후 3∼4차례 분획하여 수가용성 분획물 2 L 및 디클로로메탄 가용성 분획물 2 L를 얻은 후 이 디클로로메탄 가용성 분획물을 건조하여 디클로로메탄 가용 추출물 25.58 g을 수득하여 시료로 사용하였으며, 이 중 2 g을 취하여 염증반응에 대한 활성검색을 위한 시료로 사용하였다.

실시예 4: 곰피와 감태 에틸아세테이트 가용 추출물의 제조

상기 실시예 3에서 얻은 수가용성 분획물 2 L에 에틸아세테이트 2 L를 가하여 혼합한 후 3∼4차례 분획하여 수가용성 분획물 2 L 및 에틸아세테이트 가용성 분획물 2 L를 얻은 후 이 에틸아세테이트 가용성 분획물을 건조하여 에틸아세테이트 가용 추출물 24.99 g을 수득하여 시료로 사용하였으며, 이 중 2 g을 취하여 염증반응에 대한 활성검색을 위한 시료로 사용하였다.

실시예 5: 곰피와 감태 부탄올 가용 추출물의 제조

상기 실시예 4에서 얻은 수가용성 분획물 2 L에 부탄올 2 L를 가하여 혼합한 후 3∼4차례 분획하여 수가용성 분획물 2 L 및 부탄올 가용성 분획물 2 L를 얻은 후 이 부탄올 가용성 분획물을 건조하여 수가용 추출물 및 부탄올 가용 추출물 99.59 g을 수득하여 시료로 사용하였으며, 이 중 2 g을 취하여 염증반응에 대한 활성검색을 위한 시료로 사용하였다.

실시예 6: 플로로탄닌류 화합물의 분리

상기 실시예 4의 곰피와 감태 에틸 아세테이트 가용 추출물 24.99 g을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하였다. 이때 전개용매로서 에틸아세테이트:메탄올의 50:1의 혼합용매를 사용하였고, 고정상으로는 카이셀 겔 60 (Kiesel gel 60, 230-400 메쉬)을 사용하여 시간당 1000 mL씩 분획을 수행하여 10개의 하부분획물로 나눈 후, 각각의 분획물의 활성을 측정하여 그 중 가장 활성이 뛰어난 F1 분획물을 용매로는 헥산:에틸아세테이트=1:1의 혼합용매를 사용하였고, 고정상으로는 키에셀 겔 (Kiesel gel 60, 230-400 메쉬)을 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행한 다음, RP-18 CC를 고정상으로 리크로프렙 (Lichroprep, Merck사, Germany)을 사용하고, 용매로는 20 %∼100 % 메탄올 용액을 사용하여 농도 기울기 용출로 분리한 다음, 세파덱스 LH-20 (st. Louis, MO, 시그마 사)로 정제하여 하기 기재한 바와 같은 플로로탄닌류의 화합물을 분리하였다. 화합물을 핵자기공명 (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) 기기 및 질량분석기 (Mass Spectrometer, MS) 등과 같은 각종 분석기기로 분석한 결과는 하기와 같다.

화합물 : 플로로푸코푸로엑콜 에이 (phlorofucofuroeckol A)

물질의 성상 : 무정형 분말

물질의 분자식 : C₃₀H₁₈O₁₄

양성 FAB-MS m/z: 602 [M]⁺

¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD)δ: 6.63 (1H,s,H-7), 6.40 (1H,s,H-11), 6.26 (1H,s,H-2), 5.97 (2H,d,J=2.1Hz,H-2″, 6″), 5.94 (1H, t, J=1.9Hz,H-4´), 5.92 (1H, t, J=2.0Hz,H-4″), 5.88 (2H, d, J=2.1Hz,H-2´, 6´).

¹³C-NMR (100MHz,CD₃OD)δ: 162.7(C-1″), 162.6 (C-1´), 161.0 (C-3´, 5 ´), 161.0 (C-3″, 5″), 154.0 (C-7a), 152.5 (C-10), 152.0 (C-8a), 149.1 (C-3), 149.0 (C-12), 146.7 (C-6), 144.7 (C-1), 139.2 (C-4a), 136.2 (C-12c), 128.9 (C-5a), 125.9 (C-13a), 125.6 (C-4), 123.2 (C-9), 106.2 (C-12a), 106.1 (C-12b), 100.8 (C-11), 100.2 (C-2), 98.6 (C-4´), 98.5 (C-4″), 97.0 (C-7), 96.2 (C-2″, 6″), 96.2 (C-2´, 6´).

실험예 1: n- Hexane 추출물의 항염증 활성

상기 실시예 2에서 얻은 곰피와 감태의 헥산 가용 추출물로 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS (1 μg/mL)을 처리하여 항염증 활성을 확인하였다.

MTT assay

RAW 264.7 세포 (5×10⁴ cells/well)를 DMEM 배지에 시험 약물을 처리하여 24시간 배양하였다. 96 well plate에 배지 95 μL와 MTS 용액 5 μL를 넣고 3 시간 정도 반응시킨 후 microplate reader를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정치는 3회 반복 실험의 평균값으로 하여, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타나듯이, RAW 264.7 세포에 대한 곰피와 감태의 n-Hexane 추출물의 세포 독성은 400 μg/mL의 농도까지 나타나지 않았다.

Nitric oxide 측정

RAW 264.7 세포 (7×10⁴ cells/well)를 DMEM 배지를 이용하여 96 well plate 에 접종하고, 시험물질과 LPS (1 μg/mL)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양을 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO₂ ^-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 μL와 Griess시약 [1% sulfanilamide, 0.1% naphtylethylenediamine in 5 % phosphoric acid] 100 μL를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준농도 곡선은 sodium nitrite (NaNO₂)를 serial dilution(연속 희석)하여 얻었고, 그 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에서 볼 수 있듯이, 곰피와 감태의 헥산 추출물은 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 효과적으로 NO의 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인할 수 있었다.

염증성 사이토카인 측정 ( ELISA )

세포배양액 내의 IL-1β, TNF-α 농도 측정은 BD Biosciences (San Jose, USA)사의 ELISA kit를 사용하였다. 세포에 0, 100, 200 μg/mL의 곰피와 감태의 헥산 추출물과 1 μg/mL의 LPS를 함께 처리하였다. 24시간 후 세포 배양액을 원심분리하여 상층액에서 IL-1β, TNF-α을 측정하였다. Microplate reader를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였고 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이 n-헥산 가용성 추출물에 의하여 염증성 사이토카인의 일종인 IL-1β와 TNF-α의 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 알 수 있었다.

Immunoblot

염증과 관련된 단백질들의 발현에 곰피의 헥산 추출물이 어떠한 효과가 있는지 관찰하기 위하여 immunoblot을 실시하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에서 확인할 수 있듯이, 곰피의 헥산추출물은 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 iNOS의 발현 억제로 인하여 NO의 생성을 억제하여 염증반응을 저해함을 알 수 있었다. 그리고 분자생물학적인 기전을 확인하기 위하여 염증에 관련된 단백질들을 Western blot으로 분석한 결과 iNOS의 발현에 영향을 주는 주요 전사인자인 NF-κB의 핵으로의 이동을 분석하였다. 그 결과 LPS 처리에 의하여 p-ERK의 인산화로 인하여 IκB-α의 세포질에서의 분해가 확인되었으며 이러한 결과로 인하여 NF-κB의 핵으로의 이동이 확연하게 나타났다. 그러나 n-헥산 가용성 추출물에 의하여 p-ERK의 인산화가 억제되었으며, 그로인해 IκB-α의 분해가 억제됨으로써 NF-κB의 핵으로의 이동을 감소시켜 iNOS의 발현을 억제하는 것으로 나타났다.

실험예 2: 플로로푸코푸로에콜 A의 세포 독성

RAW 264.7 세포 (5×10⁴ cells/well)를 DMEM 배지에 플로로푸코푸로에콜 A를 처리하여 24시간 배양하였다. 96 well plate에 배지 95 μL와 MTS 용액 5 μL를 넣 고 3 시간 정도 반응시킨 후 microplate reader를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정치는 3회 반복 실험의 평균값으로 하여, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난바와 같이, LPS 처리에 의해 나타나는 약간의 세포 독성이 플로로푸코푸로에콜 A를 함께 처리함으로써 플로로푸코푸로에콜 A에 의해 상쇄된다는 것을 알 수 있었고, PFF-A 20 μM에서도 독성이 나타나지 않았다.

실험예 3: 플로로푸코푸로에콜 A의 항산화활성 (세포 내 ROS 측정)

RAW 264.7 세포에 플로로탄닌의 활성산소 생성 억제효과를 알아보기 위하여 DCFH-DA를 이용하여 활성산소 양을 측정하였다. 플로로푸코푸로에콜 A와 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리하여 2시간 배양한 후 20 μM의 DCFH-DA를 처리하여 30분 동안 배양하였다. 그 후 배양액을 걷어 spectrofluorometry를 사용하여 여기 파장은 485 nm, 방사 파장은 523 nm에서 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6은 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에 플로로푸코푸로에콜 A의 ROS의 생성 영향을 보여주고 있다. LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에 20 uM의 플로로푸코푸로에콜 A를 처리하였을 때 ROS 생성이 감소하였다. 따라서 RAW 264.7 세포에서 플로로푸코푸로에콜 A는 세포의 ROS 생성 저해를 위한 중요한 항산화 화합물로 기대된다.

실험예 4: NO 와 PGE ₂ 에 대한 플로로푸코푸로에콜 A의 영향

RAW 264.7 세포 (7×10⁴ cells/well)를 DMEM 배지를 이용하여 96 well plate에 접종하고, 플로로푸코푸로에콜 A와 LPS (1 μg/mL)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양을 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO₂ ^-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100μL와 Griess 시약 (1% sulfanilamide, 0.1% naphtyl-ethylenediamine in 5% phosphoric acid) 100 μL를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. PGE₂ 생성량 또한 ELISA kit를 사용하여 측정하였다. 그 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다.

NO는 산화질소 합성효소 (NOS)에 의해 L-arginine으로부터 합성된다. 병리적인 조건 하에서 NO의 상당한 증가는 염증성 과정을 자극하고 다른 염증 매개체와 함께 상승효과를 나타내는 iNOS에 의해 합성된다. 또한, iNOS는 염증성 사이토카인과 박테리아성 endotoxin에 노출되었을 때 강하게 자극된다. 화합물들은 iNOS에 의한 NO 생성을 감소시킬 수 있고 항염증제로써 매력이 있을 수도 있다. 이런 이유로 iNOS 활성에 대한 폴리페놀의 효과는 항염증제로 개발하기 위해서 집중적으로 연구되고 있다. 도 7은 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 NO 생성에 대한 플로로푸코푸로에콜 A의 효과를 보여준다. 아질산염으로 측정된 NO 생성은 RAW 264.7 세포에서 LPS를 처리하지 않은 대조군의 NO 생성량은 4.2±1.1 μM인 것에 비해, 1 μg/mL의 LPS를 처리하였을 때, NO 생성량은 25.1±1.9 μM 이상으로 증가하였다. 플로로푸 코푸로에콜 A는 LPS로 유도된 NO 생성량을 농도 의존적으로 감소시켰다. 따라서 플로로푸코푸로에콜 A는 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 iNOS 단백질 발현의 억제효과 또는 iNOS에 대한 저해 효과를 가지고 있다는 것을 알 수 있다.

COX는 아라키돈산을 PGE₂로 변환시키고 프로스타글란딘의 생합성을 조절하는 효소로서 중요한 역할을 가지고 있다. COX는 COX-1과 COX-2의 두 가지 형태로 존재하는데, COX-1은 위 및 신장기능의 유지, 혈소판의 형성에 필요한 프로스타글란딘의 합성 등 정상적인 생체기능에 작용하며, COX-2는 동물이나 인간의 염증반응 부위에서 발현된다. LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에 PGE₂의 생성에 대한 플로로푸코푸로에콜 A의 효과가 도 8에 제시되어 있다. 플로로푸코푸로에콜 A는 효과적으로 PGE₂의 생성을 억제하였다.

실험예 5: iNOS 와 COX -2의 단백질 발현에 대한 플로로푸코푸로에콜 A의 효과

LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 iNOS와 COX-2의 단백질 발현에 대한 플로로푸코푸로에콜 A의 효과를 웨스턴 블롯을 통하여 관찰하였다. 도 9에서는 RAW 264.7 세포에서 iNOS와 COX-2의 단백질 발현에 대한 플로로푸코푸로에콜 A의 효과를 나타낸 것이다.

1 μg/mL의 LPS를 세포에 처리하면 대조군에 비해서 iNOS와 COX-2의 단백질 발현이 크게 증가한다. 하지만 플로로푸코푸로에콜 A를 10, 20 μM를 처리하였을 때는 iNOS와 COX-2의 단백질 발현이 억제되며 그 결과 플로로푸코푸로에콜 A는 iNOS와 COX-2의 단백질 발현을 농도 의존적으로 감소시킨다는 것을 알 수 있다.

실험예 6: 세포내 항염증 신호전달 관련 인자 분석

일반적으로 LPS로 유도된 대식세포에는 iNOS, COX-2와 같은 염증 관련 단백질들이 활성화된다. 염증상태에서 활성화된 iNOS에 의해 생성된 NO는 병리적인 혈관확장, 세포독성, 조직손상 등과 같은 생체에 유해한 작용을 나타낸다. COX-2에 의한 프로스타글란딘의 합성은 염증반응을 매개하는 것으로 여겨진다. RAW 264.7에 LPS를 처리하여 생성되는 NO와 PGE₂에 대한 플로로푸코푸로에콜 A의 효과를 살펴본 결과 강한 억제 효과를 보였다(도 7 및 도 8). 여기에서는, 염증 관련 인자인 iNOS와 COX-2의 단백질과 mRNA 발현을 immunoblot과 RT-PCR을 통해 분석하였다. 그 결과 단백질 수준은 물론 mRNA 발현 수준에서도 플로로푸코푸로에콜 A가 LPS 단독 처리군에 비해 강한 억제효과를 나타내었다(도 10).

전사인자인 NF-κB는 일반적인 상태에서는 inhibitory κB-alpha (IκB-α)와 함께 결합하여 세포질에 존재한다. 하지만 LPS와 같은 외부자극에 의해 자극을 받으면 IκB-α가 분해되어 유리형의 NF-κB는 핵으로 이동하여 cytokine, cytokine receptor, cell adhesion molecule, growth factor 등의 발현에 관여하는 유전자의 promoter나 enhancer의 κB site에 결합함으로써 전사를 유도한다. LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 플로로푸코푸로에콜 A에 의한 NF-κB의 translocation을 immunoblot으로 관찰하였다. 실험결과, LPS에 의해 핵으로 이동한 NF-κB가 플 로로푸코푸로에콜 A를 처리함으로써 핵으로의 이동이 억제된다는 것을 알 수 있었다(도 11).

NF-κB는 면역체계에서 중요한 역할을 하며 cytokine, major histocompatibility complex gene의 발현에 중요한 역할을 한다. 염증 유도 효소인 iNOS와 COX-2의 발현 또한 NF-κB의 활성화에 의해 조절된다는 보고가 많이 있다. NF-κB와 더불어 또다른 전사인자인 AP-1은 TPA response element (TRE)라는 DNA 부분에 붙어서 종양촉진 및 신경계 손상 등에 관련된 단백질의 발현을 촉진시킨다. LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 플로로푸코푸로에콜 A에 의한 NF-κB와 AP-1 전사 인자의 활성 저해 효과를 luciferase assay로 확인하였다. 그 결과 플로로푸코푸로에콜 A 20 μM을 처리하였을 때 LPS로 유도된 AP-1의 전사 인자 활성은 약한 억제 효과를 보였고 NF-κB 전사 인자 활성은 강한 억제 효과를 보였다(도 12).

다양한 외부자극에 의한 NF-κB와 AP-1 전사인자들의 활성화를 통해 iNOS나 COX-2의 발현을 유도하는 과정을 조절하는 분자신호 전달기전은 주요 MAPK superfamily에 속하는 세 가지 효소들로 extracellular-regulated protein kinase (ERK), c-Jun NH2-protein kinase (JNK)/stress-activated pretein kinase (SAPK), serine/threonine protein kinase인 p38 MAPK들을 들 수 있다. 이러한 세포내 단백질의 인산화에 관한 플로로푸코푸로에콜 A의 효과를 알아보기 위하여 immunoblot으로 관찰한 결과, LPS에 의해 유도된 ERK-1/2 과 JNK-1/2의 인산화는 약한 저해 효과를 보였지만 PI3K의 downstream effector인 Akt와 p38 MAPK의 인산화는 강력한 저해를 보였다. 따라서 LPS에 의해 유도된 대식세포에서 플로로푸코푸로에콜 A는 다양한 세포내 신호 단백질 경로를 차단함으로써 염증 반응을 저해한다고 볼 수 있다(도 13).

하기에 상기 약학조성물의 제제 예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 하는데 불과하므로 통상적인 범위의 수치변경, 부제의 변경은 본 발명의 권리범위를 침해하는 것이다.

제제예 1: 주사제제의 제조

실시예 6의 플로로푸코푸로엑콜 에이 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2976 mg

Na2HPO4, 12H2O 24 mg

상기의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 mL) 상기의 성분 함량으로 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.

제제예 2: 정제의 제조

실시예 6의 플로로푸코푸로엑콜 에이 150 mg

유당 75 mg

전분 75 mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제제예 3: 캡슐제의 제조

실시예 6의 플로로푸코푸로엑콜 에이 100 mg

유당 50 mg

전분 50 mg

탈크 2 mg

테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 4: 액제의 제조

실시예 6의 플로로푸코푸로엑콜 에이 1000 mg

설탕 20 g

이성화당 15 g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 100 mL로 맞추었다.

상기의 성분을 통상의 액제의 제조방법에 따라서 혼합하고 레몬향을 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100 mL의 갈색병에 충전하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 5: 건강 음료의 제조

실시예 6의 플로로푸코푸로엑콜 에이 100 mg

비타민 C 15.5 g

비타민 E 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.25 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3 g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강 음료 조성물 제조에 사용한 다. 상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

본 발명은 곰피와 감태 유래의 플로로탄닌 화합물을 추출하며 이를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 염증억제용 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 이를 유효성분으로 하는 항염증용 식품조성물 또는 약제학적 조성물을 제공하는 효과가 있으므로 식품 및 의약품 산업상 매우 유용한 방법인 것이다.

도 1은 본 발명 곰피와 감태의 헥산 가용 추출물로 대식세포인 RAW 264.7 에 LPS (1 μg/mL)를 처리하여 항염증 활성을 확인한 그림이다.

도 2는 곰피와 감태의 헥산 가용 추출물로 대식세포인 RAW 264.7 에 LPS (1 μg/mL)를 처리하여 NO의 생성을 확인한 그림이다.

도 3은 곰피와 감태의 헥산 가용성 추출물에 의하여 염증성 IL-1β와 TNF-α의 생성 여부를 확인하여 450 nm에서 흡광도를 측정한 그림이다.

도 4는 염증반응과 관련된 단백질들의 발현에 본 발명 곰피의 헥산 가용성 추출물이 미치는 효과를 관찰하기 위한 immunoblot을 실시한 결과이다.

도 5는 본 발명 플로로푸코푸로에콜 A의 세포특성을 확인한 실험결과를 보인 그림이다.

도 6은 본 발명 플로로푸코푸로에콜 A와 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리하여 RAW 264.7 세포에 활성산소(ROS) 생성억제 효과를 확인한 결과를 보인 그림이다.

도 7과 도 8은 본 발명 플로로푸코푸로에콜 A가 각 NO와 PGE₂의 생성에 미치는 효과를 보인 그림이다.

도 9는 RAW 264.7 세포에서 iNOS와 COX-2의 단백질 발현에 대한 본 발명 플로로푸코푸로에콜 A의 효과를 실험한 western blot 결과를 나타낸 사진도이다.

도 10은 본 발명 플로로푸코푸로에콜 A의 염증관련인자 iNOS와 COX-2 단백질과 mRNA 발현을 immunoblot과 RT-PCR을 통하여 분석한 결과를 보인 사진도이다.

도 11은 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 본 발명 플로로푸코푸로에콜 A에 의한 NF-κB의 translocation을 immunoblot으로 관찰한 실험결과를 보인 사진도이다.

도 12는 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 본 발명 플로로푸코푸로에콜 A에 의한 NF-κB와 AP-1 전사 인자의 활성저해 효과를 luciferase assay로 확인한 그림이다.

도 13은 LPS에 의해 유도된 RAW 264.7 세포에서 본 발명 플로로푸코푸로에콜 A에 의한 인산화 효과를 확인하기 위한 immunoblot 실시 결과를 보인 그림이다.

Claims (6)

1. 곰피와 감태의 추출물 유래의 염증억제용 조성물.
2. 제1항에 있어서,

   상기 조성물은 곰피와 감태의 물, 저급알코올 또는 이들의 혼합용매, 비극성용매 중 어느 하나로 추출한 헥산 추출물 유래의 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   곰피와 감태의 조추출물 또는 비극성용매 가용성추출물로 분리 정제된 플로로탄닌류를 유효성분으로 함유하는 염증억제용 약학적 또는 기능성 식품 조성물.
4. 곰피와 감태의 조추출물 또는 비극성용매 가용성 플로로탄닌류를 0.1∼100㎎/㎏을 1일 1회 이상 투여할 수 있는 것이 특징인 염증억제용 약학적 또는 기능성 식품 조성물.
5. 제4항 기재에 있어서,

   곰피와 감태의 에틸아세테이트 분획으로부터 분리된 플로로푸코푸로엑콜 에이 화합물을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
6. 제4항에 있어서,

   곰피와 감태의 에틸아세테이트 분획으로부터 분리된 플로로푸코푸로엑콜 에이 화합물을 유효성분으로 하는 항염증 건강기능성 식품 조성물.

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