KR101449575B1 - 테뉴폴리사이드 ａ를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 테뉴폴리사이드 A(tenuifoliside A)를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 테뉴폴리사이드 A는 대식세포에서 마이토겐 활성 단백질 키나아제(MAPKs) 중 p-JNK 경로 억제를 통한 염증 반응 억제 효과가 우수하여, 염증성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

테뉴폴리사이드 Ａ를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising tenuifoliside A for preventing or treating inflammatory diseases}

본 발명은 테뉴폴리사이드 A(tenuifoliside A)를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

최근 경제성장의 발전과 더불어 평균수명의 연장과 함께 고령자 인구의 비율도 날로 증가하고 있는 추세이다. 또한 풍요로운 식생활은 수산물이나 야채 등과 같은 식품 소재를 주로 이용하던 전형적인 우리나라 식문화를 변화시켜 암, 당뇨병, 고혈압, 비만 및 혈관성 질환 등의 생활습관 병이 차지하는 비율이 매년 증가하고 있다. 이와 더불어, 면역 조절 이상으로 인하여 유발된 염증이 지속됨으로써 발생되는 염증성 질환의 발병률 또한 최근 10년 사이에 서양에서 뿐만 아니라 한국에서도 급증하고 있는 실정이다. 이에 따라 근래에 이르러 건강과 장수에 대한 관심이 증가되고, 건강기능성 소재나 제품에 대한 소비자들의 수요가 많아지고 있다. 이는 건강기능성 식의약품 시장의 규모 확대 등으로 이어지고 있어 천연자원으로부터 새로운 기능성 소재를 발굴하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 중 염증으로 인해 생길 수 있는 질병을 파악하고, 이를 예방하거나 치료하는데 목적을 둔 항염증효능 소재 발굴 연구도 중요한 부분을 차지하고 있다.

염증반응은 생체 혹은 조직에 기질적 변화를 가져오는 화학적 물질, 세균 감염 및 물리적 작용에 의해 발생된 손상 부위를 재생하려는 복구기전이다. 유해한 자극, 감염 및 외상 등에 의해 염증이 발현되면 국소적으로 염증성 성분과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 염증을 유발하는데, 이와 같은 염증반응이 지속되면 오히려 점막손상을 촉진함에 따라 발적, 발열, 종창, 동통, 기능장애 등으로 인한 류마티스 관절염, 동맥경화증, 위염, 천식 등의 염증성질환을 유발할 수 있다.

이러한 염증반응은 사이토카인(cytokines), 프로스타글란딘E2(prostagrandins E2, PGE2), 유리라디칼(free radicals) 등 다양한 매개물질이 관여하고 있다. 특히, 대식세포에서는 사이토카인, 종양괴사인자-a(tumor necrosis factor-α, TNF-α), 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 같은 자극에 의해 염증반응의 전사인자인 NF-κB(nclear factor-κB)를 활성화시키며, 그 결과 유도성 산화질소(inducible nitiric oxide synthase, iNOS), 사이클로옥시제나아제-2(cyclooxygenase-2, COX-2)를 발현시켜 과량의 산화질소(NO)와 프로스타글라란딘 E2를 생성하여 염증을 일으키게 된다.

대식세포는 선천면역뿐만 아니라 획득면역 등 다양한 숙주반응에 대하여 항상성 유지에 관여하며, 염증 반응 시에는 산화질소 및 다양한 사이토카인을 생산하여 감염 초기에 생체방어에 중요한 역할을 하는 세포이다. RAW 264.7과 같은 대식세포 또는 단핵구는 그람 음성균의 세포외막에 존재하는 내독소인 리포폴리사카라이드의 자극에 의해 종양괴사인자-α, IL-1β 및 인터루킨-6(IL-6)과 같은 염증매개성 사이토카인들의 분비를 촉진한다. 이러한 염증 매개 물질들의 형성은 아라키돈산(arachidonic acid)이 사이클로옥시제나아제(COX)의 작용을 거쳐 류코트리엔(leukotriene), 트롬복산(thromboxane), 프로스타글란딘(prostaglandin) 등으로 바뀌는 과정 및 산화질소(NO)의 대량 생성에 관여함으로써 염증매개에 큰 역할을 하며, 숙주에 치명적 결과를 초래한다고 알려져 있다. COX는 세포막의 인지질로부터 아라키돈산이 유리된 후 프로스타글란딘으로의 변화를 촉진시키는 효소로서 사이클로옥시제나아제-1, 사이클로옥시제나아제-2의 이형(isoform)이 존재한다. 사이클로옥시제나아제-1은 대부분의 조직에서 발현되어 인체의 항상성 유지에 관하여하는 반면 사이클로옥시제나아제-2는 성장인자(growth factors), 사이토카인 및 리포폴리사카라이드 등의 다양한 자극에 의해서 대식세포(macrophage)나 단핵구(monocyte) 등의 세포에서만 다량 발현되며, 이로 인해 발생된 프로스타글란딘은 종양의 세포사멸을 억제하고 혈관생성을 유도하여 종양생성에 기여한다. 산화질소(NO)는 세포 내에서 L-아르기닌(L-arginine)을 기질로 하여 산화질소 신타아제(nitric oxide synthase, NOS)에 의해 L-시트룰린(L-citruline)과 함께 생성되는 신경계, 면역계, 심장혈관계에서 주요 전달 물질로 신경독성 및 신경 보호성의 기능을 동시에 나타내고, 쇼크 및 여러 가지 신경 퇴행성 질병의 발생에도 관여하는 것으로 보고되고 있다. NOS는 세포의 종류에 따라 신경성 NOS(nNOS, NOS1), 유도성 NOS(iNOS, NOS2), 내피성 NOS(eNOS, NOS)로 분류되며(Tsao et al., 2002), 이중 유도성 iNOS는 세포내 칼슘 농도와 외부에서 주입된 칼모둘린(calmodulin)의 자극과는 무관하게 활성화된 세포에서만 활성을 보이며 다양한 세포에서 유도된다. 또한, 활성화된 핵전사인자(Nuclear transcription factor-kappa B, NF-κB)는 TNF-α, IL-1β, IL-6, iNOS 및 COX-2 등의 여러 염증 매개 물질의 전사를 촉진하는 전사인자로서 이들의 유전자 발현에 크게 영향을 미친다.

뿐만아니라, 헴 옥시게나제-1은 헴(heme)을 분해하는 효소로 담록소(biliverdin), 일산화탄소(carbon monoxide) 및 철(iron)을 생성한다. 이와 같은 헴 옥시게나아제-1에 의한 헴의 분해는 다양한 약리 작용을 한다. 그 중 헴의 철 및 담록소로의 분해는 세포 보호 작용과 항산화 작용을 통하여 DNA의 산화적 손상을 예방한다. 따라서 발암의 개시를 막고, 산화적 혹은 염증 유발성의 세포나 조직 손상과 연관된 암의 촉진과정을 억제하며 보호하는 역할을 한다. 따라서 헴 옥시게나제-1의 유도는 화학적암 예방 연구에 중요한 부분을 차지하게 된다. 또한 헴의 일산화탄소로의 분해는 염증 반응에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 최근 연구에서 류마티스 관절염의 조직에서 헴 옥시게나아제-1의 발현이 현저하게 증가되어 나타났으며, 이는 퇴행성 관절염의 조직과 비교해 보았을 때도 유의성 있게 증가하여 염증성 관절염에 헴 옥시게나아제-1의 역할이 중요함을 밝혀내었다(Jang, S. J. et al. The effects of heme oxygenase-1 on collagen induced arthritis model. The Korean J. Anat. 39,393-399 (2006)).

한편, 테뉴폴리사이드 A는 원지(Polygala tenuifolia Willd., 원지과 Polygalaceae)로부터 분리한 식물성 폴리페놀 화합물로서, 페닐프로파노이드 성분으로 구성되어 있다. 원지(Polygala tenuifolia)는 원지과 (Polygalaceae)에 속하며 중국동북, 화북, 산서, 협서, 내몽고 등에 자생하는 다년 생 초본으로 목심 부위를 제거하고 건조한 뿌리를 사용하며 우리나라에는 북부, 중부지방에 분포한다. 예로부터 거담, 강장, 진정제로 널리 사용되어왔고, 건망증, 신경쇠약, 불안, 심계항진, 불면증, 정신혼란 또는 치매 예방과 치료제로 사용되어 왔으며, 이는 국내특허출원 제10-2002-0046250호에 공지된 바 있다.

또한, 식물성 폴리페놀 화합물은 염증성 질환의 치료 및 예방에 우수한 효과가 있음은 공지되어 있으며, 이에 대한 연구가 활발히 이루어져 있다. 또한, 식물 유래 프로파노이드 성분의 항염증 및 항산화 효과에 대해 공지된 바 있으며, 원지 및 버섯 추출물의 항염증 효과에 대한 것도 다수 논문 및 학술지에 공지되어 있다. 그러나, 원지로부터 분리된 페닐프로파노이드 성분인 테뉴폴리사이드 A의 항염증 및 항산화 효과에 대한 보고는 전혀 없으며, 이에 대한 연구도 전무한 상태이다. 따라서, 테뉴폴리사이드 A를 이용한 효과적인 염증성 질환의 치료제의 필요성이 요구되는 실정이다.

이에 본 발명자들은 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 원지로부터 분리한 테뉴폴리사이드 A가 대식세포에서 헴 옥시제나아제-1(HO-1) 효소의 발현을 통한 우수한 염증 반응 억제 효과를 나타내는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 테뉴폴리사이드 A를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 테뉴폴리사이드 A를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은테뉴폴리사이드 A를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 테뉴폴리사이드 A를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 테뉴폴리사이드 A는 대식세포에서 마이토겐 활성 단백질 키나아제(MAPKs) 중 p-JNK 경로 억제를 통한 염증 반응 억제 효과가 우수하여, 염증성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 원지로부터 테뉴폴리사이드 A의 분리 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 원지로부터 분리한 테뉴폴리사이드 A의 순도 확인을 위한 HPLC 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 테뉴폴리사이드 A의 구조를 확인하기 위한 ¹H-NMR(A) 및 ¹³C-NMR(B) 스펙트럼의 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 테뉴폴리사이드 A의 대식세포에 대한 세포독성을 확인하기 위한 세포생존율을 나타낸 도이다.
도 5는 테뉴폴리사이드 A의 염증 유발에 대한 iNOS mRNA 발현(A) 및 COX-2 mRNA 발현(B)억제 효과를 RT-PCR 분석 결과로 나타낸 도이다.
도 6은 테뉴폴리사이드 A의 염증 유발에 대한 iNOS 단백질 발현(A) 및 COX-2 단백질 발현(B)억제 효과를 웨스턴블롯 분석 결과로 나타낸 도이다.
도 7은 테뉴폴리사이드 A의 염증 유발에 대한 NO 생성(A), PGE₂ 생성(B), 염증 매개성 사이토카인 TNF-α(C) 및 IL-1β(D)의 생성 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 8은 테뉴폴리사이드 A의 염증 유발에 대한 IκBα 분해 및 IκBα 인산화 억제(A), NFκB-p65 핵 내 전사 억제(B) 및 NFκB-p65 결합능 억제(C) 효과를 나타낸 도이다.
도 9는 테뉴폴리사이드 A의 염증 유발에 대한 마이토겐 활성 단백질 키나아제(MAPKs)활성 억제 효과를 나타낸 도이다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 테뉴폴리사이드 A를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

상기 조성물은 약학적 조성물 또는 개선용 식품 조성물을 포함한다.

[화학식 1]

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 테뉴폴리사이드 A는 시판되는 시약을 사용하거나 유기 합성적인 방법으로 합성하여 사용할 수 있으며, 생약재로부터 분리하여 사용할 수 있다. 본 발명에서는 하기와 같은 방법으로 분리하여 사용하였다.

먼저, 건조된 원지 뿌리를 원지 뿌리 총 중량에 대하여 5 내지 15배 부피, 바람직하게는 5배 내지 7배 부피의 용매를 가하여, 1 내지 5시간 동안 환류추출하여 원지 뿌리 조추출물을 수득한다. 상기 추출용매는 이에 제한되지 않으나, 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합용매로부터 선택된 1종 이상의 용매를 이용할 수 있으며, 본 발명에서는 물이 바람직하다. 상기 원지 뿌리 조추출물에 증류수를 가하고, 부탄올로 용액-용액 분배법(partition)을 이용하여, 원지뿌리 부탄올 분획물을 수득한다. 얻어진 원지뿌리 부탄올 분획물을 다시 증류수에 녹인 다음, 에틸아세테이트로 용액-용액 분배법(partition)을 이용하여, 에틸아세테이트 분획물을 수득한다. 80% 메탄올 용매를 사용한 세파덱스(Sephadex LH-20 C.C.) 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 3개 분획을 수득한다(Fr1~Fr3). 그 중 1번째 분획(Fr1)을 80% 메탄올 용매를 사용한 세파덱스(Sephadex LH-20 C.C.) 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 3개 분획을 수득한다(Fr1-1~Fr1-3). 그 중 2번째 분획(Fr1-2)을 클로로포름 : 메탄올 : 물 = 13 : 7: 0.3 내지 8:2:0.2 를 혼합용매로 하는 실리카겔 (Silicagel C.C.) 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 활성 화합물인 테뉴폴리사이드 A를 수득한다.

본 발명의 테뉴폴리사이드 A는 대식세포에서 마이토겐 활성 단백질 키나아제(MAPKs) 중 p-JNK 경로 억제를 통한 염증 반응 억제 효과가 우수하여, 염증성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

상기 염증성 질환은 퇴행성 신경관절염, 류마티스성 관절염, 물리적 손상으로 인한 신경관절염, 염증성 창자염, 강직 척추염, 건선, 죽상동맥경화증, 동맥경화, 천식, 급성 통증, 만성 통증, 신경병적 통증, 수술 후 통증, 편두퉁 및 관절통과 같은 통증, 신경손상, 과민성 장증후군, 내독소에 의한 쇼크, 염증성 장 질환, 다발성 경화증 및 염증성 요통으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 테뉴폴리사이드 A와 함께 염증성 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 또한, 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 1mg/kg 내지 1000 mg/kg의 양으로 투여할 수 있다. 상기 조성물의 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명에서, 건강기능식품이란 질병의 예방 및 개선, 생체방어, 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해하여야 한다.

본 발명의 테뉴폴리사이드 A는 염증성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 테뉴폴리사이드 A를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 테뉴폴리사이드 A를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 테뉴폴리사이드 A는 원료에 대하여 15중량 % 이하, 바람직하게는 10 중량 % 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예, 실험예 및 제조예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 원지 뿌리로부터 테뉴폴리사이드 A의 분리

1-1. 테뉴폴리사이드 A의 분리

건조된 원지 뿌리(5 ㎏)를 물(10L)로 3시간 동안 환류추출 하여 원지 뿌리 조수추출물 980 g을 얻었다. 원지 뿌리 조수추출물을 증류수(2L)에 녹인 후, 부탄올로 용액-용액 분배법(partition)을 이용하여, 원지 뿌리 부탄올 분획물 128.5 g을 얻었다. 얻어진 원지 뿌리 부탄올 분획물을 다시 증류수에 녹인 다음, 에틸아세테이트로 용액-용액 분배법(partition)을 이용하여, 에틸아세테이트 분획물 13.5 g을 얻었다. 80% 메탄올 용매를 사용한 세파덱스(Sephadex LH-20 C.C.) 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 3개 분획을 획득하였다(Fr1~Fr3). 그 중 1번째 분획(Fr1) 8.47 g을 80% 메탄올 용매를 사용한 세파덱스(Sephadex LH-20 C.C.) 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 3개 분획을 획득하였다(Fr1-1~Fr1-3). 그 중 2번째 분획(Fr1-2) 2.3 g을 클로로포름 : 메탄올 : 물 = 13 : 7: 0.3 내지 8:2:0.2 를 혼합용매로 하는 실리카겔 (Silicagel C.C.) 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 테뉴폴리사이드A 1.06 g을 얻었다.

본 발명의 원지 뿌리로부터 테뉴폴리사이드A 의 분리 과정을 도 1에 나타내었다.

1-2. 테뉴폴리사이드 A의 구조 동정

상기 실시예 1-1에서 수득한 테뉴폴리사이드 A의 구조 동정을 위해서, ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR을 이용하여 구조 동정을 하였다. 테뉴폴리사이드 A의 구조를 확인하는 방법으로는 Ikeya의 문헌을 참고하였다(Ikeya Y et al., Chemical & Pharmaceutical Bulletin 39, pp.2600-2605, 1991).

상기 실시예 1-1에서 수득한 테뉴폴리사이드 A는 HPLC 순도 평가를 통해, 순도가 96.6± 1.2 %임을 확인하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 또한, ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트럼의 결과는 하기와 같으며, 도 3에 나타내었다.

¹H-NMR (CD₃OD,　500MHz) δ: 5.41 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-3), 4.29 (1H, t, J = 7.8 Hz, H-4), 3.94 (1H, m, H-5), 5.42 (1H, d, J = 3.7 Hz, H-1′), 4.16 (1H, m, H-5′), 4.34 (1H, dd, J = 11.9, 5.0 Hz, H-6′ a), 4.57 (1H, dd, J = 11.9, 1.8 Hz, H-6′b), 6.87 (2H, s, H-2″, 6″), 7.64 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-7″), 6.47 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-8″), 3.78 (6H, s, 3″, 5″-OCH₃), 3.70 (3H, s, 4″-OCH₃), 7.83 (2H, d, J = 8.7 Hz, H-2″′, 6″′), 6.74 (2H, d, J = 8.7 Hz, H-3″′, 5″′).

¹³C-NMR (CD₃OD, 125MHz) δ: 64.2 (C-1), 103.5 (C-2), 78.3 (C-3), 72.7 (C-4), 82.8 (C-5), 62.0 (C-6), 91.8 (C-1′), 71.8 (C-2′), 73.5 (C-3′), 70.3 (C-4′), 71.2 (C-5′), 63.8 (C-6′), 130.1 (C-1″), 105.5 (C-2″), 153.4 (C-3″), 140.0 (C-4″), 153.4 (C-5″), 105.5 (C-6″), 145.9 (C-7″), 116.4 (C-8″), 166.4 (C-9″), 55.4 (3″,5″-OCH₃), 59.8 (4″-OCH₃), 120.7 (C-1″′), 131.6 (C-2″′), 114.8 (C-3″′), 162.2 (C-4″′), 114.8 (C-5″′), 131.6 (C-6″′), 166.8 (C-7″′).

실험예 1. 세포배양 및 세포독성 측정

상기 실시예 1에서 수득한 테뉴폴리사이드 A의 세포주에 대한 세포 독성 측정을 위해서, 세포 생존율을 측정하였다.

1-1. 세포배양

마우스의 복강에서 분리한 일차 대식세포를 얻기 위해서, C57BL/6 마우스의 복강에 티오글라이콜레이트(Thioglycolate,TG) 3ml를 주입하고 4일 동안 사육하였다. 마우스의 복강에 주사기로 배지(RPMI 1640 + antibiotics + 10% FBS)를 주입한 후, 1분 정도 복강을 마사지한 후에 다시 배지를 채취하였다. 채취한 배지를 원심분리 하여 상층액을 버리고, 여기에 다시 배지를 5㎖ 정도 넣었다. 이중 10㎕를 채취하여 세포 수를 측정하고 96 웰에 1x10⁶ cell/mL 을 플레이팅하고, 37℃, 5% CO₂, 95% 습도로 조정된 배양기(incubator)에서 2-3시간 정도 배양한 후에 상층부에 부유하는 세포는 버리고 배지를 갈아 주었다. 새로운 배지를 넣어준 후, 배양기에 12시간 정도 안정화 시킨 후 시약을 처리하고 실험을 수행하였다.

1-2. 세포독성 측정

테뉴폴리사이드 A의 세포 독성을 측정하기 위해서, 세포생존율 실험을 수행하였다.

마우스의 복강에서 분리한 일차 대식세포(2×10⁵ cells/well)를 10% 열-불활성화시킨(heat-inactivated) FBS, 페니실린 G(100 IU/ml)(Gibco, 15240062)와 스트렙토마이신(100 μg/ml)(Gibco, 15240062)을 함유한 DMEM 배지에 분주하고 5% CO₂ 배양기(Sanyo, MCO175), 37℃ 내에서 48시간 배양한 다음, 테뉴폴리사이드 A를 10, 20, 40, 80, 160 μM의 농도 별로 처리하여 48시간 동안 5 % CO₂ 배양기 내에서 배양하였으며, 세포생존율은 MTT 법을 활용하여 측정하였다. 또한, 모든 실험치는 대조군에 대한 세포 생존율을 평균치로 표시하였으며, 각각 3회 반복 실험치를 이용하여 계산하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 마우스의 복강에서 분리한 일차 대식세포 10, 20, 30, 40, 50μM의 테뉴폴리사이드 A을 48시간 처리하여 세포생존율을 측정한 결과, 50 μM 농도의 테뉴폴리사이드 A을 처리 하였을 때 세포독성이 나타나, 최고 농도를 40 μM로 실험을 진행하였다. 테뉴폴리사이드 A를 40 μM 농도 이하로 처리 하였을 때는 테뉴폴리사이드 A 농도와 상관없이 세포 생존율은 높게 유지됨을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 테뉴폴리사이드 A에 의한 iNOS 및 COX-2의 mRNA 및 단백질 발현에 미치는 영향

테뉴폴리사이드 A에 의한 항염증 효과를 확인하기 위해서, 마우스의 복강에서 분리한 일차 대식세포에서의 염증 매개인자인 iNOS 및 COX-2의 mRNA와 단백질 발현을 관찰하였다.

2-1. RT-PCR

테뉴폴리사이드 A의 함량 및 처리시간에 따른 iNOS 및 COX-2 mRNA 발현 촉진 효과를 확인하기 위하여, RT-PCR을 수행하였다.

60 mm 디쉬에 3 X 10⁶cells/ml농도로 생쥐의 복강에서 분리한 일차 대식세포 12시간 배양한 후, 라티폴린을 농도 별로 처리 후 리포폴리사카라이드(LPS)를 1μg/ml 처리하고, 24시간 배양하여 염증반응을 유발시켰다. 상기 배양 후, RIPA(89900, Thermo) 완충액을 첨가하고, 4℃ 및 14,000X g의 조건에서 25분 동안 원심분리하여, 상등액을 분리하였다. 분리한 상등액을 QIAAmp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 시료로부터 RNA를 수득하였다. RT-PCR은 Agpath id one step step RT-PCR(Ambion)을 사용하여 하기 표1의 프라이머로 반응을 수행하였다. RT-PCR 수행시 반응 온도 및 시간은 역전사 42℃ 10분, 95℃ 10분으로 RT 반응을 실시하였고, PCR 반응은 95℃에서 15초, 60℃에서 60초를 45회 반복 실시하여, 아가로오스 젤로 전기영동하여 EtBr(Ethidium Bromide)염색 후 반응결과를 확인하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

유전자	프라이머(염기서열)
iNOS	F: 5’-AGC CCA ACA ATA CAA ATG ACC CTA-3’
	R: 5’-TTC CTG TTG TTT CTA TTT CCT TTGT-3’
cox-2	F: 5’-CAC TCA GTT TGT TGA GTC ATTC-3’
	R: 5’-GAT TAG TAC TGT AGG GTT AAT G-3

도 5에 나타난 바와 같이, 라티폴린의 농도가 증가함에 따라 염증 매개 인자로 알려진 iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현이 현저하게 억제됨을 확인하였다.

2-2. 웨스턴블롯

테뉴폴리사이드 A의 함량 및 처리시간에 따른 iNOS 및 COX-2 단백질 발현 촉진 효과를 확인하기 위하여, 웨스턴 블럿을 수행하였다.

60 mm 디쉬에 3 X 10⁶cells/ml 농도로 생쥐의 복강에서 분리한 일차 대식세포 12시간 배양한 후, 테뉴폴리사이드 A를 농도별로 처리 후, 리포폴리사카라이드(LPS)를 1μg/ml 처리하고, 24시간 배양 염증반응을 유발 시켰다. 상기 배양 후, RIPA(89900, Thermo) 완충액을 첨가하고, 4℃ 및 14,000X g의 조건에서 25분 동안 원심분리하여, 상등액을 분리하였다. 상기 분리된 상등액에서 단백질 정량은 BSA 단백질 실험 키트(Pierce Biotechnology)를 이용하여 수행하였다.

상기 상등액을 7.5% SDS-폴리아크릴아마이드겔(polyacrylamide gel)을 이용하여 2시간 동안 전기영동한 후, 니트로셀룰로오스 막(Nitrocellulose membrane, NC membrane)을 이용하여 상기 폴리아크릴아마이드겔로부터 전사하였다. 상기 전사된 니트로셀룰로오스 막을 5% 탈지유가 포함된 신선한 차단 완충액(blocking buffer, 0.1% Tween 20 in Tris-buffered saline)에서 1시간 동안 반응을 정지시켰다. 상기 반응 정지 후, 상기 막을 PBST(PBS, 0.1% Tween 20)로 10분에 1회씩 3회 세척한 후에, iNOS(SC-650, Santacruz biotechnology, USA), COX-2(SC-1745, Santacruz biotechnology, USA)의 항체(Ab)를 1:1000으로 희석하여 넣고 1시간 동안 반응을 수행하였다. 반응 후, 상기 PBST로 10분에 1회씩 3회 세척하고, 2차 항체(Anti-rabbit IgG, SC-2004, Santacruz biotechnology, USA)를 1:1000으로 희석하여 넣고 1시간 동안 반응을 수행하였다. 반응 후, PBST로 10분에 1회씩 3회 세척한 다음, ECL(Amersham Pharmacia Biotech)용액을 1:1로 잘 섞어서 니트로셀룰로오스 막 위에 부어 발광시키고, 암실에서 X선 필름에 감광한 후 현상하였다. 동일한 방법으로 액틴(Actin)에 대한 항체(SC-1616, Santacruz biotechnology, USA)를 이용하여 Actin의 함량을 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 테뉴폴리사이드 A의 농도가 증가함에 따라 염증 매개 인자로 알려진 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현이 현저하게 억제됨을 확인하였다.

실험예 3. 테뉴폴리사이드 A에 의한 NO 및 PGE2와 염증매개성 사이토카인의 생성에 미치는 영향

테뉴폴리사이드 A가 마우스의 복강에서 분리한 일차 대식세포에서 염증 매개 물질인 NO 및 PGE₂ 생성과 염증매개성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-1β의 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해서, 웨스턴블롯을 수행하여 정량분석 하였다.

마우스의 복강에서 분리한 일차 대식세포에 테뉴폴리사이드 A를 5, 10, 20, 40 μM로 전처리하여 3시간 동안 배양한 후, LPS로 염증반응을 유발하여 18시간 동안 5% CO₂ 배양기 내에서 배양하였다. 배양된 세포의 상층액을 수집하여 실험예 2-2에서와 동일한 방법으로 웨스턴블롯을 수행하였으며, 그 결과를 정량분석하였다. 테뉴폴리사이드 A에 의한 염증 유발 인자인 NO 및 PGE₂ 생성에 미치는 영향을 도 7A 및 도 7B에 나타내었고, 염증매개성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-1β의 생성에 미치는 영향을 도 7C 및 도 7D에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 마우스의 복강에서 분리한 일차 대식세포에 LPS를 처리 하였을 때 증가하던 NO, PGE₂, TNF-α 및 IL-1β의 생성이 테뉴폴리사이드 A를 5, 10, 20, 40 μM의 농도로 처리 하였을 때, 농도 의존적으로 NO, PGE₂, TNF-α 및 IL-1β의 생성이 억제 되는 효과가 있음을 확인하였다.

따라서, 테뉴폴리사이드 A는 염증 유발 인자인 iNOS와 iNOS 로부터 매개된 NO 및 COX-2 뿐만아니라, COX-2 로부터 매개된 PGE₂의 생성을 저해하였고, 염증매개성 사이토카인인 TNF-α및 IL-1β를 유의적으로 감소시킴으로써, 대식 세포에서 유발된 염증 반응의 억제 효과가 우수함을 확인하였다.

실험예 4. 테뉴폴리사이드 A에 의한 전사 인자 활성에 미치는 영향

테뉴폴리사이드 A가 전사 인자 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해서, 마우스의 복강에서 분리한 일차 대식세포에서 IκBα 분해, IκBα 인산화, NFκB-p65 핵내 전사 및 NFκB-p65 결합능 억제 효과를 측정하였다. 상기 실험예 2-2에서와 동일한 방법으로 웨스턴블롯을 수행하였다.

마우스의 복강에서 분리한 일차 대식세포에 테뉴폴리사이드 A를 5, 10, 20, 40 μM로 전처리하여 12시간 동안 배양한 후, LPS로 염증 반응을 유발시켜 1시간 동안 5% CO₂ 배양기 내에서 배양하였다. 배양 후, 세포질에서의 전사인자 활성을 IκBα(SC-371, Santacruz biotechnology, USA)분해 및 IκBα 인산화(p-IκBα, SC-8404, Santacruz biotechnology, USA) 억제를 통해 확인하였고, 핵 내에서의 전사인자 활성을 NFκB-p65(SC-8008, Santacruz biotechnology, USA) 핵 내 전사 및 NFκB-p65 결합능 억제 효과를 통해 확인하였다. 세포질 내에서의 결과를 도 7(A)에 나타내었고, 핵 내에서의 전사 결과를 도 7(B) 및 도 7(C)에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 마우스의 복강에서 분리한 일차 대식세포에 LPS를 처리 하였을 때 증가하던 IκBα분해, IκBα인산화, NFκB-p65 핵내 전사 및 NFκB-p65 결합능이 테뉴폴리사이드 A를 5, 10, 20, 40 μM의 농도로 처리 하였을 때, 농도 의존적으로 활성이 감소됨을 확인하였다. 이는 NFκB의 전사를 막는 기능을 가진 IκB-α의 인산화를 억제함으로써, 전사 인자인 p65의 핵내 전사를 억제시켜 나타난 결과이다.

실험예 5. 테뉴폴리사이드 A에 의한 마이토겐 활성 단백질 키나아제의 발현에 미치는 영향

테뉴폴리사이드 A가 마우스의 복강에서 분리한 일차 대식세포에서 염증반응에 의한 마이토겐 활성 단백질 키나아제(MAPKs, mitogen activated protein kinase)에 미치는 영향을 확인하기 위해서, p-ERK, p-JNK 및 p-38 발현 억제 경로를 상기 실험예 2-2에서와 동일한 방법으로 웨스턴블롯을 수행하여 관찰하였다.

마우스의 복강에서 분리한 일차 대식세포에 테뉴폴리사이드 A를 5, 10, 20, 40 μM로 전처리하여 12시간 동안 배양한 후, LPS로 염증 반응을 유발시켜 1시간 동안 5% CO₂ 배양기 내에서 배양하였다. 배양 후, 세포에서의 p-ERK, p-JNK 및 p-38 발현을 통해 확인하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 테뉴폴리사이드 A를 농도별 처리 하였을 때, LPS에 의해 p-ERK, p-JNK, p-38 발현이 증가하였다. 그러나 테뉴폴리사이드 A를 농도별로 처리하였을 때 p-JNK의 발현이 점점 감소하였으며, p-ERK, p-38 발현은 변화가 없었다. 이는 테뉴폴리사이드 A의 염증 억제 관련 경로는 미토겐 활성 단백질 키나아제(MAPKs)의 종류인 p-ERK, p-JNK, p-38 경로 가운데 p-JNK 경로를 억제함으로써 나타난다는 것을 확인하였다.

Claims (5)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 테뉴폴리사이드 A(tenuifoliside A)를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 신경관절염, 류마티스성 관절염, 물리적 손상으로 인한 신경관절염, 염증성 창자염, 강직 척추염, 건선, 죽상동맥경화증, 동맥경화, 천식, 급성 통증, 만성 통증, 신경병적 통증, 수술 후 통증, 편두통, 관절통, 신경손상, 과민성 장증후군, 내독소에 의한 쇼크, 염증성 장 질환, 다발성 경화증 및 염증성 요통으로 이루어진 군으로부터 선택된 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   [화학식 1]
   

   
2. 제 1항에 있어서, 상기 테뉴폴리사이드 A는 원지 뿌리로부터 분리된 것임을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 테뉴폴리사이드 A는 마이토겐 활성 단백질 키나아제(MAPKs) 중 p-JNK 경로를 통해 염증 반응을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 삭제
5. 하기 화학식 1로 표시되는 테뉴폴리사이드 A(tenuifoliside A)를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 신경관절염, 류마티스성 관절염, 물리적 손상으로 인한 신경관절염, 염증성 창자염, 강직 척추염, 건선, 죽상동맥경화증, 동맥경화, 천식, 급성 통증, 만성 통증, 신경병적 통증, 수술 후 통증, 편두통, 관절통, 신경손상, 과민성 장증후군, 내독소에 의한 쇼크, 염증성 장 질환, 다발성 경화증 및 염증성 요통으로 이루어진 군으로부터 선택된 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   

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