KR101039145B1 - 부들 추출물을 포함하는 순환기 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

부들 추출물을 포함하는 순환기 질환의 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 부들(Typha angustata) 화분의 유기용매 추출물 및 이로부터 분리한 나린게닌 화합물에 관한 것으로 이들은 혈관 평활근 세포의 증식을 억제하여 순환기 계통 질환의 예방 및 치료에 널리 이용될 수 있다.

Description

부들 추출물을 포함하는 순환기 질환의 예방 및 치료용 조성물 {A Composition containing extract of Typha angustata for preventing and treating circulatory diseases}
본 발명은 순환기 질환의 예방 및 치료에 유용한 부들 화분 추출물 및 이로부터 분리·정제한 화합물에 관한 것이다.
보다 자세하게는, 본 발명은 부들 화분 추출물 및 이로부터 분리·정제한 화합물을 유효 성분으로 하며 혈관 평활근 세포의 증식 억제 효과가 있는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 이는 동맥경화증을 포함한 순환기 계통 질환의 예방 및 치료에 널리 이용될 수 있다.
부들(Typha angustata)은 부들과의 다년초 외떡잎식물로서, 연못이나 하천, 강, 늪지 등에서 볼 수 있는데, 근경이 가로로 뻗고 굵으며, 줄기는 원주형으로 곧게 서고, 잎은 선형으로서 좁고 길며 녹색이다. 부들 화분(꽃가루)은 수촉 혹은 포황(蒲黃)이라 하며 맛이 달고 독성이 없어 한방에서 지혈제, 자궁출혈, 토혈, 출혈성하리, 탈항, 소염성 이뇨약, 치질, 대하증, 월경불순, 방광염 등의 약재로 사용하여 왔다. 부들 화분에는 리신(lysine)을 포함한 유리아미노산의 함량이 높고 미량원소, 비타민이 다량 함유되어 있으며 아밀라아제(amylase), 인버타아제(invertase) 등과 같은 여러 종류의 효소 활성이 높다고 알려져 있으며, 부들의 싹(蒲黃苗)인 향포(香蒲)는 입 안이 헤어지면서(爛) 냄새나는 것을 치료하고 이를 든든하게 하며 눈과 귀를 밝게 한다고 알려져 있다.
일반적으로 화분은 단단한 세포막을 가지고 있어 생물학적 분해 작용이 안정하여 수명이 길어 수 백 년이 지나더라도 화분으로서 생명을 보유하고 있는 것도 있으나, 직접 섭취할 시에는 인체 내에서 흡수율이 떨어져 유효성분이 제대로 이용되지 못하는 편이다. 이러한 이유로, 각종 영양성분이 풍부한 화분을 약재나 건강기능성 식품으로 유효하게 이용하기 위한 연구가 필요하게 되었다.
순환기 질환은 주로 혈관 평활근 세포의 증식으로 유발된다고 한다. 구체적으로 혈관 내피세포의 상해에 의하여 내피세포의 투과성이 항진되면 상해 부위에서 혈소판 응집이 일어나고, 응집한 혈소판에서는 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF)가 방출되며 이 PDGF에 의하여 혈관 평활근 세포의 증식이 촉진되며, 이는 동맥경화를 비롯한 다양한 순환기 질환의 주요한 원인이 된다. 또한 혈액 중에 존재하는 단구 유래의 마크로파지는 내피세포의 상해 부위로부터 침입하여 대량의 지방을 탐식하고 포마세포가 됨으로 지방의 축적을 유발시켜 역시 동맥경화를 비롯한 다양한 순환기 질환을 유도하게 된다. 상기 순환기 질환에는 동맥경화증 이외에도 고혈압, 협심증, 심근경색, 뇌경색, 심부전 및 경혈관 동맥 성형술 후 발생하는 합병증을 포함한 질환 등이 있다.
본 발명자들은 순환기 질환에 유용한 새로운 물질을 천연물로부터 분리하기 위하여 계속 연구한 결과, 부들 화분 추출물 및 이로부터 분리·정제한 화합물이 혈관 평활근 세포의 증식을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
한국등록특허 제913370호에 부들 화분 추출물을 함유하는 항혈전 조성물에 관한 기술이 공지되어 있으나 상기 부들 화분 추출물은 물 추출물이며 평활근 세포 증식의 억제 또는 순환기 질환의 예방 및 치료용 조성물이 아니기에 본 발명과는 그 구성과 효과가 다른 특허이다.
본 발명의 목적은 부들 화분의 유기용매 추출물 및 이로부터 분리·정제한 화합물을 유효 성분으로 하는 순환기 질환의 예방 및 치료에 유용한 약학적 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명에 따른 추출물 및 화합물은 부들(Typha angustata) 화분으로부터 물, 유기용매(에탄올, 에탄올 수용액, 메탄올, 메탄올 수용액, 에틸아세테이트, 에테르, 아세톤, 클로로포름 등)에 의한 추출, 바람직하게는 에탄올, 에탄올수용액, 메탄올, 메탄올 수용액에 의한 추출, 에탄올 헥산과 물의 분배, 디아이온 HP-20 레진과 같은 흡착수지 사용방법, 칼럼 크로마토그래피에 의한 방법 등 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합하여 용이하게 얻을 수가 있다. 또한 추출단계에서 발생되는 조추출물은 필요에 따라서 상법에 따라서 더욱 정제할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 크로마토그래피에는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 칼럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 부들 화분 유기용매 추출물로부터 분리되며 하기 화학식 1의 구조를 갖는다.
[화학식 1]
Figure 112010057938311-pat00001
상기 화학식 1로 표시되는 본 발명의 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염으로 제조될 수 있다.
염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰 량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
본 발명의 부들 화분 유래의 추출물 및 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF)로 유도한 혈관평활근 세포 성장의 억제 효과가 확인되어, 순환기 질환의 예방 및 치료에 효과적이며 안정도가 높아 식품, 의약품의 첨가제로 이용할 수 있다. 상기 부들 화분의 추출물 및 이로부터 분리된 화합물은 치료용 약제 및 식품으로 이용되기 위해서는 약제학적 및 식품학적 분야에서 공지의 방법에 의하여 제조될 수 있다.
따라서 본 발명은 부들 화분 유래의 유기용매(바람직하게는 알코올 용매) 추출물 및 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 순환기 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 부들 화분의 추출물 및 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 활성성분의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 추출물 및 화합물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 추출물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명은 상기 부들 화분의 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 순환계 질환을 위한 건강기능 식품을 제공한다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.
본 발명은 부들 추출물 및 이로부터 분리·정제된 화합물에 관한 것으로, 혈관 평활근 세포의 증식 억제 효과가 뛰어나 동맥경화증, 고혈압, 협심증, 심근경색, 뇌경색, 심부전 및 경혈관 동맥 성형술 후 발생하는 합병증을 포함한 순환기 계통의 질환 등을 예방 및 치료할 수 있으며, 상기 질병들을 개선할 수 있는 다양한 건강식품에도 유용하게 응용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 부들화분의 추출물이 혈관 평활근 세포의 증식을 억제하는 것을 WST-1 어세이로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 화합물1이 혈관 평활근 세포의 증식을 억제하는 것을 WST-1 어세이로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 화합물1이 혈관 평활근 세포의 증식을 억제하는 것을 세포 수 측정으로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 화합물1이 디기토닌과 비교하여 세포독성이 없음을 WST-1 어세이로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1 : 부들 화분 추출물의 제조 및 혈관 평활근 세포의 증식 억제 활성이 있는 화합물의 분리·정제>
부들(Typha angustata) 화분 1.5㎏을 60℃에서 15ℓ 메탄올로 세 번 추출하고 상기 메탄올 추출물을 감압 농축하여 부들 추출물(80.7g)을 제조하였다. 이 후 상기 부들 추출물(80.7g)을 물 1ℓ로 현탁한 후 n-헥산 1ℓ, 에틸아세테이트 1ℓ로 순차적으로 용매 분획 및 감압 농축하여 n-헥산 분획물 20.0g, 에틸 아세테이트 분획물 30.5g을 얻었다.
이 후, 에틸아세테이트 분획물(30.5g)을 클로로포름:메탄올 [50:1 → 1:5, v/v, 5.0ℓ]의 용매 구배 조건으로 실리카겔 칼럼(Φ 100 × L 400 ㎜) 크로마토그래피를 실시하여 4개의 분획물을 얻었다(TA1~TA4).
이 분획물들 중 TA1 분획물(2.5g)을 클로로포름:메탄올 [20:1, v/v, 2.0ℓ]의 용매구배 조건으로 실리카겔 칼럼(Φ 20 × L 700 ㎜) 크로마토그래피를 실시하여 화합물1(10.0mg)을 얻었다.
< 실시예 2 : 부들 화분 유래 화합물의 물리 화학적 특성 및 화학구조 분석>
상기 실시예 1에서 부들 화분의 메탄올 추출물로부터 분리·정제된 화합물의 구조를 분석하였다. 화합물의 화학적 구조는 ESI 질량분석기(Electrospray Ionization mass spectrometer)를 사용하여 얻은 분자량 및 핵자기 공명 분석의 1H 및 13C-NMR 분석 결과를 토대로 화합물의 구조를 분석하였다.
그 결과, 구조 결정된 화합물은 상기 화학식1에서 보여준 구조를 가졌으며, 분리된 화합물의 화학적 특성 및 1H, 13C-NMR 결과값을 정리하여 하기에 표시하였다.
화합물1 ((2 S )- Naringenin : (2 S )- 나린게닌 ) : Yellowish powder ; mp. 150-151℃ ; ESI-MS : m/z 273 [M + H]+ ; 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ : 5.40 (dd, J = 2.5, 12.5 Hz, H-2), 2.65 (dd, J = 2.5, 16.0 Hz, Ha-3), 3.25 (dd, J = 12.5, 16.0 Hz, Hb-3), 5.87 (s, H-6, H-8), 7.31 (d, J = 8.0 Hz, H-2′, H-6′), and 6.79 (d, J = 8.0 Hz, H-3′, H-5′) ; 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ : 78.4 (C-2), 41.9 (C-3), 196.4 (C-4), 163.5 (C-5), 95.8 (C-6), 166.6 (C-7), 94.8 (C-8), 162.9 (C-9), 101.7 (C-10), 129.8 (C-1′), 128.3 (C-2′, 6′), 115.1 (C-3′, 5′), and 157.7 (C-4′).
< 실시예 3 : 부들 화분 유래의 추출물 및 화합물의 혈관 평활근 세포의 증식 억제 효과>
3-1. 부들 화분 추출물의 혈관 평활근 세포 증식 억제 활성 확인
실시예 1의 부들 화분 메탄올 추출물, n-헥산 분획물, 에틸 아세테이트 분획물의 혈관 평활근 세포 증식 억제 활성을 확인하기 위해 Roche에서 제조된 키트를 이용하여 WST-1 어세이를 하였다. 이를 위해 렛드 혈관 평활근 세포를 96웰 플레이트(96well-plate)의 각각의 웰(well)에 4×104개/㎖의 농도로 분주하여 10%의 소태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 세포 배양 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 이 후 세포 배양 플레이트의 70% 이상 세포가 증식되면 배지를 소태아혈청이 포함되지 않고 실시예 1의 부들 화분 메탄올 추출물, n-헥산 분획물, 에틸 아세테이트 분획물이 각각 100, 50, 10㎍/㎖의 농도로 포함된 DMEM 배지로 교체하여 24시간 동안 반응시켰다. 이 후 25ng/㎖ PDGF-BB를 넣고 다시 22시간 추가로 반응시키다가 WST-1 반응액을 각 웰에 넣어주고 이 후 37℃에서 2시간 동안 추가로 반응시켰다. 이에 대한 대조군은 PDGF-BB와 부들 화분의 메탄올 추출물 또는 n-헥산 분획물, 에틸 아세테이트 분획물을 처리하지 않았다. 이 후 OD값(Optical Density)을 ELISA 분석기로 450㎚에서 확인하였고 결과값은 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 대로, PDGF-BB의 처리로 세포의 증식이 현저하게 활성화되어 있던 혈관 평활근 세포가 본 발명의 부들화분의 메탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물 및 화합물1이 다량 포함된 TA1 분획에서 대조군에 비해 유의성 있게 세포 증식이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
* PDGF-BB : 인체 혈소판 유래 성장인자(PDGF, Human Platelet-Derived Growth Factor)의 한 형태임.
3-2. 화합물1의 혈관 평활근 세포 증식 억제 활성 확인 - I
본 발명의 화합물1의 혈관 평활근 세포의 증식 억제 활성을 확인하기 위해 WST-1(CCK-8) 어세이 키트를 이용하였다.
이를 위해 렛드 혈관 평활근 세포(Rat aortic smooth muscle cells, 렛드에서 직접 추출함)를 96웰 플레이트(96well-plate)의 각각의 웰(well)에 4×104개/㎖의 농도로 분주하여 10%의 소태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 세포 배양 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 이 후, 상기 세포에 부들 화분 유래의 화합물1을 0~50μM의 농도로 소태아혈청이 포함되지 않는 DMEM 배지에서 24시간 동안 반응시켰다. 이 후, 25ng/㎖ PDGF-BB를 넣고 다시 24시간 추가로 반응시키다가 WST-1 반응액을 각 웰에 넣어주고 이 후 37℃에서 2시간 동안 추가로 반응시켰다. 이에 대한 대조군은 PDGF-BB와 화합물1을 처리하지 않았다. 이 후 OD값(Optical Density)을 ELISA 분석기로 450㎚에서 확인하였고 결과값은 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 대로, PDGF-BB의 처리로 세포의 증식이 현저하게 활성화되어 있던 혈관 평활근 세포가 본 발명의 화합물1의 처리로 인해 대조군(PDGF-BB 및 화합물1의 무처리군)과 유사하게 세포 증식이 억제되었음을 확인할 수 있었다.
3-3. 화합물1의 혈관 평활근 세포 증식 억제 활성 확인 - II
화합물1의 평활근 세포 증식 억제 활성을 직접 세포 수 측정으로 확인하기 위해 12웰 플레이트에 렛드 혈관 평활근 세포를 각 웰에 4×104개/㎖의 농도로 분주하여 10%의 소태아혈청이 포함된 DMEM 세포 배양 배지로 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이 후 세포 배양 플레이트의 70% 이상 세포가 증식되면 배지를 소태아혈청이 포함되지 않고 0~50μM의 화합물1이 포함된 DMEM 배지로 교체하여 24시간 동안 반응시켰다. 이 후 25ng/㎖ PDGF-BB를 넣고 다시 24시간 추가로 반응시켰다. 이에 대한 대조군은 PDGF-BB와 화합물1을 처리하지 않았다. 이 후 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)를 처리하여 세포를 모은 후 헤모싸이토미터(hemocytometer)를 이용하여 세포 수를 확인하였고 이를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 대로, 세포 수 역시 WST-1 어세이의 결과와 비슷한 유형으로 PDGF-BB의 처리로 세포 수 증가가 현저하게 활성화되어 있던 혈관 평활근 세포가 본 발명의 화합물1의 처리로 인해 대조군과 유사하게 세포 수 증가가 억제되었음을 확인할 수 있었다.
3-4. 화합물1의 세포 독성 확인
본 발명의 화합물1의 혈관 평활근 세포의 증식 억제가 세포 독성으로 인한 세포 사멸 결과가 아니라는 것을 확인하기 위해 WST-1 어세이 키트를 이용하여 세포 독성을 확인하였다. 96웰 플레이트에 렛드 혈관 평활근 세포를 각 웰에 4×104개/㎖의 농도로 분주하여 10%의 소태아혈청이 포함된 DMEM 세포 배양 배지로 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이 후 세포 배양 플레이트의 70% 이상 세포가 자라면 배지를 소태아혈청이 포함되지 않는 DMEM 배지로 교체한 후 50μM의 화합물1 또는 50㎍/㎖의 디기토닌(digitonin)을 넣고 0~48시간 동안 시간별로 반응시켰다. 이에 대한 대조군은 화합물1이나 디기토닌을 처리하지 않았다. 이 후, WST-1 반응액을 각 웰에 넣어주고 이 후 37℃에서 2시간 동안 추가로 반응시켰으며 OD값(Optical Density)을 ELISA 분석기로 450㎚에서 확인하였고 결과값은 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 대로, 50% 이상의 세포가 사멸하여 세포 독성이 있는 디기토닌과 달리 본 발명의 화합물1은 특별한 세포 독성 결과를 나타내지 않았으며, 이로 인해 본 발명의 화합물1의 평활근 세포의 증식 억제 결과는 세포 사멸 등의 부작용으로 인한 억제 효과가 아님을 확인할 수 있었다.
* 디기토닌 : 디기탈리스(Digitalis purpurea)로부터 얻은 백색 분말 형태의 사포닌으로 유리 콜레스테롤을 침전시키는 역할을 함.
< 실시예 4 : 독성실험>
4-1. 급성독성
부들 화분의 메탄올 추출물 및 화합물1이 포함된 에틸 아세테이트 분획물을 단기간에 과량을 섭취하였을 시 급성적(24시간 이내)으로 동물 체내에 미치는 독성을 조사하고, 치사율을 결정하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 일반적인 마우스인 ICR 마우스 계통 20 마리를 대조군은 10마리, 실험군은 10마리씩 배정하였다. 대조군에는 용매만을 투여하고, 실험군은 부들 화분의 메탄올 추출물 및 화합물1이 포함된 에틸 아세테이트 분획물을 각각 4.0g/㎏(일반적인 동물실험에서 사용되는 양의 100배 정도)의 농도로 경구 투여하였다. 투여 24시간 후에 각각의 치사율을 조사한 결과, 대조군과 4.0g/㎏ 농도의 부들 화분의 메탄올 추출물 및 화합물1이 포함된 에틸 아세테이트 분획물을 투여한 실험군에서 모두 생존하였다.
4-2. 실험군 및 대조군의 장기 및 조직 독성실험
장기 독성 실험은 C57BL/6J 생쥐를 대상으로 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 부들 화분의 메탄올 추출물 및 화합물1이 포함된 에틸 아세테이트 분획물을 투여한 실험군과 용매만을 투여한 대조군의 동물들로부터 8주 후 혈액을 채취하여 GPT(glutamate-pyruvate transferase) 및 BUN(Blood Urea Nitrogen)의 혈액 내 농도를 Select E(Vital Scientific NV, Netherlands) 기기를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 간독성과 관계있는 것으로 알려진 GPT와 신장독성과 관계있는 것으로 알려진 BUN의 경우, 대조군과 비교하여 실험군은 별다른 차이를 보이지 않았다. 또한, 각 동물로부터 간과 신장을 정취하여 통상적인 조직절편 제작과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였으며 특이한 이상이 관찰되지 않았다.
< 사용예 1 : 약학적 제제예 >
1-1. 정제의 제조
본 발명의 화합물1 20g을 락토오스 17.6g, 감자전분 18g 및 콜로이드성 규산 3.2g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 16g, 활석 5g 및 스테아린산 마그네슘 0.5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
1-2. 주사액제의 제조
본 발명의 화합물1 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 120℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.
< 사용예 2 : 식품 제조예 >
2-1. 조리용 양념의 제조
본 발명 실시예 1의 메탄올 추출물을 전체 중량의 0.2~10 중량%로 하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.
2-2. 밀가루 식품의 제조
본 발명 실시예 1의 메탄올 추출물을 전체 중량의 0.1~5.0 중량%로 하여 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
2-3. 스프 및 육즙( gravies )의 제조
본 발명 실시예 1의 메탄올 추출물을 전체 중량의 0.1~1.0 중량%로 하여 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.
2-4. 유제품( dairy products )의 제조
본 발명 실시예 1의 메탄올 추출물을 전체 중량의 0.1~1.0 중량%로 하여 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
< 사용예 3 : 음료 제조예 >
3-1. 야채쥬스 제조
본 발명 실시예 1의 메탄올 추출물 1g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.
3-2. 과일쥬스 제조
본 발명 실시예 1의 메탄올 추출물 1g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

Claims (4)

  1. 부들(Typha angustata) 화분의 알코올 추출물로서 하기 화학식 1의 (2S)-나린게닌이 유효성분으로 함유되며 평활근 세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 고혈압, 협심증, 심근경색, 뇌경색 및 심부전으로 이루어진 군에서 선택되는 순환기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112011030433313-pat00002
  2. 하기 화학식 1의 (2S)-나린게닌을 유효성분으로 포함 하며 평활근 세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 고혈압, 협심증, 심근경색, 뇌경색 및 심부전으로 이루어진 군에서 선택되는 순환기 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112011030433313-pat00007
  3. 삭제
  4. 부들(Typha angustata) 화분의 알코올 추출물로서 하 기 화학식 1의 (2S)-나린게닌이 유효성분으로 함유되고 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함 하며 평활근 세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 고혈압, 협심증, 심근경색, 뇌경색 및 심부전으로 이루어진 군에서 선택되는 순환기 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
    [화학식 1]
    Figure 112011030433313-pat00008
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