KR100793081B1 - 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 꼬시래기(Gracilaria verucosa) 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물은 염증 전구 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 형성 억제 및 iNOS 및 NO의 발현을 억제하는 효과를 나타내어 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
꼬시래기 추출물, 화합물, 염증성 질환, 치료용 조성물

Description

꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물{A composition comprising the compound isolated from the extract of Gracilaria verucosa for preventing and treating inflammatory disease}
도 1은 꼬시래기로부터 메탄올 조추출물, 극성용매 가용 추출물 및 비극성용매 가용 추출물을 분리 하는 과정을 나타낸 도이며,
도 2는 꼬시래기 추출물로부터 화합물 1 내지 14 을 분리하는 과정을 나타낸 도이고,
도 3은 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물 1 내지 14 의 RAW264.7 세포에서의 세포독성을 평가한 도이며,
도 4는 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물 1 내지 14 가 NO 생성 억제 정도를 나타낸 도이고,
도 5는 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물 1 내지 14 가 염증 전구 사이토카인(TNF-α) mRNA 발현에 미치는 영향을 나타내는 도이며,
도 6은 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물 1 내지 14 가 염증 전구 사이토카인(IL-6) mRNA 발현에 미치는 영향을 나타내는 도이고,
도 7은 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물 1 내지 14 가 염증 전구 사이토카인(IL-1β) mRNA 발현에 미치는 영향을 나타내는 도이며,
도 8은 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물 1 내지 14 가 염증 전구 물질인 iNOS mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
본 발명은 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.
염증반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전이며, 일단 자극이 가해지면 국소적으로 프로스타글란딘(prostaglandins), 하이드록시에이코사테트라에노익에시드(hydroxyeicosatetraenoic acid ; 이하 HETE), 류코트리엔(leukotriene)과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증을 유발한다. 그러나 지속적인 염증반응은 도리어 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 일으킨다(Willoughby, D. A., Ann. Rheum. Dis ., 34 (6), p471, 1975).
내독소로 잘 알려진 지질다당류(lipopolysaccaride: 이하 LPS)는 그람-음성균의 세포외막에 존재하며, 대식세포(macrophage) 또는 단핵세포(monocyte)에서 TNF-α (tumor necrosis factor ? alpha), IL-6(interleukin-6), IL-1β(interleukin-1β)와 같은 전구염증성사이토카인 (pro-inflammatory cytokine)을 증가시키는 것으로 알려져 있다 (Lee, E. S. et al., Biol . Pharm . Bull., 27(5), p617, 2004). 또한 이러한 염증매개 물질의 형성은 포스포리파아제 A2(phospholipase A2)의 활성으로 인해 아라키돈산(arachidonic acid)이 프로스타글란딘으로 바뀌는 과정 및 NO (nitric oxide) 형성 과정으로 이어지게 된다 (Funk, C. D. et al., FASEB J., 5, p2304, 2001).
TNF-α와 같은 다 기능성 사이토카인(cytokine)은 정상조직에서 발현될 뿐만 아니라 병변 과정에서 그 발현 정도가 증가되며, 특히, 암촉진 과정에서 일어나는 피부염증에 중요한 역할을 한다. TNF-α가 인간의 염증성 피부질환과 관련이 있음은 이미 많이 보고되어 왔으며 (Groves, R. W. et al., Br. J. Dematol., 32, p345, 1995), 여러 염증질환과 알러지 현상에 TNF- α에 대한 항체를 처리하였을 때 증상이 완화되었다 (Wakefield, P. E. et al., J. Am. Acad . Dermatol ., 24, p675, 1991). TNF-α는 호중성 백혈구를 활성화 시켜 과산화수소 생성를 증가시킴으로 내인성 암촉진제로서의 기능도 하고 있다.
체내 염증과정에서는 과량의 NO가 NOS (NO synthase)에 의해 형성된다. 일반적인 NO의 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만 (Weis, Z. A., Biochem J., 316, p209, 1996), 염증상태에서 iNOS (inducible NO synthase)에 의해 생성된 NO는 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다 (Mu, M. M., J. Endotoxin Res. 7, p431, 2001).
아스피린이 개발된 이래로 오랫동안 비스테로이드성 항염증 약물 (nonsteroidal anti- inflammatory drug : NSAID)의 사용은 통증의 완화를 초래해 왔으며, 비마약성 진통제의 대부분 역시 항염증 효과를 가지므로 급성 및 만성 염증 질환의 치료에 적절히 사용되어 왔다 (Jung, J. H. et al., Yakhak Hoeji, 48(6), p317, 2004). 그러나 이 약의 장기 사용은 위궤양, 출혈, 천공과 같은 심각한 부작용을 초래하여 새롭거나 개선된 치료제 개발은 필수적이고 시급한 실정이다. 이러한 부작용을 극복하는 문제와 관련지어 천연물에서 그 활성 성분을 찾으려는 연구들이 활발히 진행되고 있다.
꼬시래기 (Gracilaria verrucosa papenfuss)는 홍색 해조류의 일종으로 돌가사리목 꼬시래기과에 속하며 한국, 일본, 사할린섬, 타이완 등의 조간대의 돌과 조개껍데기 등에 붙어 자란다. 특히 강물이 바다로 흘러드는 얕은 바닷가의 자갈이나 말뚝 등에서 번식하며, 우뭇가사리류와 더불어 전 세계적으로 한천의 주요 원료로서 널리 이용되고 있다. 이러한 중요성 때문에 꼬시래기에 관한 연구는 분류, 생태, 생활사는 물론 한천의 수율, 품질 및 물리화학적 특성 등 다양한 분야에 걸쳐서 수행되어져 왔으나 (Kim, Y. S. et al., J. Kor . Fish. Soc . 36(5), p474, 2003), 성분 및 생리활성에 대한 연구는 미흡한 실정이다.
이에 본 발명자들은 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물이 염증 전구 사이토카인 생성과 iNOS 및 NO의 발현을 억제함을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 꼬시래기 (Gracilaria verrucosa papenfuss) 추출물로부터 분리된 하기 구조식 (1) 내지 (6)의 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
화합물 1 : C 20 H 32 O 4
15-히드록시-9-옥소-프로스타-5,13-디에노인산 ((5Z,13E)-(15S)-15-Hydroxy-9-oxoprosta-5,13-dienoic acid (11-deoxyprostaglandin E2))
Figure 112006084560171-pat00001
(1)
화합물 2 : C 21 H 34 O 4
메틸-15-히드록시-9-옥소-프로스타-5,13-디에노에이트 (Methyl-(5Z,13E)-(15S)-15-hydroxy-9-oxoprosta-5,13-dienoate)
Figure 112006084560171-pat00002
(2)
화합물 3 : C 20 H 34 O 4
15-히드록시-9-옥소-프로스타-13-에노인산( (E)-(15S)-15-Hydroxy-9-oxoprost-13-enoic acid (11-deoxyprostaglandin E1))
Figure 112006084560171-pat00003
(3)
화합물 4 : C 20 H 32 O 4
9,15-디옥소-프로스타-5-에노인산 ((Z)-9,15-Dioxoprost-5-enoic acid)
Figure 112006084560171-pat00004
(4)
화합물 5 : C 19 H 39 NO 3
2-포름아미도-1,3-디히드록시-옥타데칸 ((2R,3S)-2-Formamido-1,3-dihydroxyoctadecane)
Figure 112006084560171-pat00005
(5)
화합물 6 : C 16 H 28 O 3
11-옥소-헥사데카-9-에노인산 ((E)-11-Oxohexadec-9-enoic acid)
Figure 112006084560171-pat00006
(6)
상기 구조식 (1) 내지 (6)으로 표시되는 본 발명의 화합물들은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.
염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올 (예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산 (maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산 (citric acid), 젖산 (lactic acid), 글리콜산 (glycollic acid), 글루콘산 (gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산 (glutaric acid), 글루쿠론산 (glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화 물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
상기 구조식 (1) 내지 (6)의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 구조식 (1) 및 (6)의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트 (메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트 (토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.
또한 본 발명의 상기 구조식 (1) 내지 (6)의 신규 화합물 또는 하기 구조식 (7) 내지 (14)로 표기되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
화합물 7 : C 16 H 30 O 3
10-옥소-헥사데카노인산 (10-Oxo-hexadecanoic acid (Hexadecanoic acid))
Figure 112006084560171-pat00007
(7)
화합물 8 : C 16 H 30 O 3
9-히드록시-헥사데카-8-에노인산 ((E)-(S)-9-Hydroxyhexadec-8-enoic acid)
Figure 112006084560171-pat00008
(8)
화합물 9 : C 18 H 32 O 3
10-옥소-옥타데카-8-에노인산 ((E)-10-Oxooctadec-8-enoic acid)
Figure 112006084560171-pat00009
(9)
화합물 10 : C 18 H 32 O 3
11-옥소-옥타데카-9-에노인산 ((E)-11-Oxooctadec-9-enoic acid)
Figure 112006084560171-pat00010
(10)
화합물 11 : C 18 H 34 O 3
10-히드록시-옥타데카-8-에노인산((E)-(R)-10-Hydroxyoctadec-8-enoic acid)
Figure 112006084560171-pat00011
(11)
화합물 12 : C 18 H 34 O 3
10-옥소-옥타데카노인산 (10-Oxooctadecanoic acid)
Figure 112006084560171-pat00012
(12)
화합물 13 : C 18 H 34 O 3
11-옥소-옥타데카노인산 (11-Oxooctadecanoic acid)
Figure 112006084560171-pat00013
(13)
화합물 14 : C 18 H 34 O 3
12-옥소-옥타데카노인산 (12-Oxooctadecanoic acid)
Figure 112006084560171-pat00014
(14)
본원에서 정의되는 추출물은 물, 에탄올, 메탄올과 같은 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 등의 극성용매 및 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 메틸렌클로라이드 등의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매로부터 가용한 추출물을 포함한다.
또한 상기 염증성 질환은 염증, 위염, 대장염, 관절염, 신장염, 간염, 동맥경화, 암 또는 퇴행성 질환을 포함한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 꼬시래기 조추출물을 수득하는 방법을 설명하면, 우선 꼬시래기를 채집하여 음건한 다음 마쇄기로 갈아 미세분말화한 후, 꼬시래기 시료 중량의 약 10 내지 30배, 바람직하게는 약 15 내지 25배에 달하는 부피의 물 및 메탄올, 에탄올, 부탄올 등과 같은 C1 내지 C4의 저급알콜 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 메탄올로 실온에서 약 1일 내지 5주간, 바람직하게는 1 내지 3주 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여, 진공여과에 의해 상층액을 회수한 다음, 상기의 과정을 2 내지 5회, 바람직하게는 3회 반복 수행하여 상층액을 모으고 감압농축하여 본 발명의 꼬시래기 조추출물 수득할 수 있다.
상기에서 수득한 조추출물을 물과 메틸렌클로라이드 용매에 부유하고용매분획, 감압 농축하여 본 발명의 꼬시래기 물 및 메틸렌클로라이드 가용 분획물을 수득하였고, 상기 메틸렌클로라이드 가용 분획물로부터 다시 수성의 메탄올(aqueous MeOH)과 헥산(n-hexane) 가용 분획물을 수득할 수 있다.
상기에서 수득한 메탄올 가용성 분획물을 용출용매로 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 20개의 분획으로 분리한 후, 하부분획을 순차적으로 MPLC 및 HPLC 방법으로 정제하여 본 발명의 화합물 1 내지 14 를 수득할 수 있다.
본 발명은 상기의 제법으로 얻어진 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 꼬시래기는 오랫동안 식용되거나 생약으로 사용되어 오던 약재로서 본 발명의 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.
상기와 같은 방법으로 얻어진 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물은 염증 전구 사이토킨인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 생성과 iNOS 및 NO의 발현을 억제하므로서, 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량 %로 포함한다.
본 발명의 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상 기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위을 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사 에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 꼬시래기 추출물로부터 분리된 구조식 (1) 내지 (14)로 표기되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.
또한, 염증성 질환의 예방 및 개선 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량 %로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 화합물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 화합물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 꼬시래기 추출물의 제조
1-1. 꼬시래기 조추출물의 제조
제주도 북제주군에서 꼬시래기를 채집하여 음건한 다음 마쇄기로 갈아 미세 분말화 한 후, 미세 분말 시료 50 g에 메탄올 1 ℓ를 가하여 상온에서 24시간 추출한 다음, 진공 여과하여 상층액을 회수하였다. 이 과정을 3회 반복하여 상층액을 모은 후, 감압 농축하여 꼬시래기 메탄올 가용 조추출물 15 g을 수득하였다(도 1 참조).
1-2. 꼬시래기 가용 추출물의 제조
상기 실시예 1-1에서 얻은 꼬시래기 메탄올 가용 조추출물 15 g을 물 1ℓ에 현탁시킨 후에, 메틸렌클로라이드로 용매 분획하였다. 먼저 물 1ℓ에 현탁시킨 꼬시래기 메탄올 가용 추출물에 메틸렌클로라이드 1ℓ을 첨가하여 용해한 다음, 이를 분획여두에서 메틸렌클로라이드층에 용해되는 성분만 분리해서 진공 건조하였다. 이 과정을 3회 반복 수행하여 메틸렌클로라이드 가용 분획물을 수득하였다(7.5 g). 남은 수층을 감압 농축하여 수층 가용 분획물을 수득하였다(8.0 g). 상기에서 얻은 메틸렌클로라이드 가용 분획물에 메탄올과 헥산을 9:1의 비율로 정확하게는 90% 메탄올/헥산 용매로 분획하여 메탄올 가용 분획물(3.8 g)과 헥산 가용 분획물(3.6 g)을 수득하였다 (도 1 참조).
실시예 2. 꼬시래기 추출물로부터 화합물의 분리
상기 실시예 1-2에서 수득한 메탄올 가용 분획물(3.8 g)을 역상 플래시 컬럼 크로마토그래피(step gradient reversed-phase flash column chromatography)(YMC Gel ODS-A, 60 A, 220 mesh)로 50-100% MeOH/H2O 용매 시스템(solvent system)을 사용하여 20개의 분획을 얻었다. 그 중 분획물 5 (136 mg)를 역상크로마토그래피(reversed- phase HPLC)(C18-5E Shodex packed) 에서 60% 아세토니트릴(acetonitrile; MeCN)을 이동상으로 사용하여, 본 발명의 신규 화합물 1 ((5Z,13E)-(15S)-15-Hydroxy-9-oxoprosta-5,13-dienoic acid)(1.5 mg), 신규 화합물 3 ((E)-(15S)-15-Hydroxy-9-oxoprost-13-enoic acid)(0.4 mg) 및 신규 화합물 4 ((Z)-9,15-Dioxoprost-5-enoic acid)(5 mg)를 분리하여 수득하였으며, 분획물 7 (74 mg) 을 역상크로마토그래피(C18-5E Shodex packed) 에서 81% 메탄올을 이동상으로 하여, 본 발명의 신규 화합물 2 (Methyl-(5Z,13E)-(15S)-15-hydroxy-9-oxoprosta-5,13-dienoate)(0.8 mg), 신규 화합물 6 ((E)-11-Oxohexadec-9-enoic acid)(0.4 mg), 화합물 7 (10-Oxo-hexadecanoic acid)(0.4 mg) 및 화합물 8 ((E)-(S)-9-Hydroxyhexadec-8-enoic acid)(3 mg)을 분리하여 수득하였고, 본 발명의 신규 화합물 5 ((2R,3S)-2-Formamido-1,3-dihydroxyoctadecane)(1.2 mg)는 분획물 11 (125 mg)을 역상크로마토그래피 (YMC ODS-H80)에서 88% 아세토니트릴을 이동상으로 분리하여 수득하였다. 또한, 분획물 9 (238 mg)를 역상크로마토그래피(C18-5E Shodex packed)에서 81% 메탄올을 이동상으로 하여, 본 발명의 화합물 9 ((E)-10-Oxooctadec-8-enoic acid)(1.3 mg), 화합물 10 ((E)-11-Oxooctadec-9-enoic acid)(1.2 mg), 화합물 11 ((E)-(R)-10-Hydroxyoctadec-8-enoic acid)(4 mg), 화합물 12 (10-Oxo-octadecanoic acid)(0.6 mg), 화합물 13 (11-Oxo-octadecanoic acid)(1.1 mg) 및 화합물 14 (12-Oxo-octadecanoic acid)(1.2 mg)를 분리하여 수득하였다(도 2 참조).
상기 화합물들의 구조는 핵자기 공명(nuclear magnetic resonance) 스펙트럼과 고해상 질량분석 데이터에 의하여 결정되었고, 핵자기 공명 스펙트럼에서 1H-NMR 시그날과 13C-NMR 시그날에 대한 위치지정(assignment)은 COSY, TOCSY 등의 다차원 핵자기 공명 실험을 통하여 이루어졌다.
화합물 1 : 15-히드록시-9-옥소-프로스타-5,13- 디에노인산
분자식 : C20H32O4
분자량 : 359.2198
색 : 무색 유지상
[α]24D ?33.0° (c 0.09, MeOH)
1H and 13C NMR 데이터 : 표 1, 2 참조
MS(FAB) m/z 359.2187 [M + Na]+
화합물 2 : 메틸 -15-히드록시-9-옥소-프로스타-5,13- 디에노에이트
분자식 : C21H34O4
분자량 : 373.2355
색 : 무색 유지상
[α]25D ?35.0° (c 0.05, MeOH)
1H and 13C NMR 데이터 : 표 1, 2 참조
MS(FAB) m/z 373.2347 [M + Na]+
화합물 3 : 15-히드록시-9-옥소-프로스타-13- 에노인산
분자식 : C20H34O4
분자량 : 361.2356
색 : 무색 유지상
[α]27D ?23.0° (c 0.04, MeOH)
1H and 데이터 : 표 1 참조
MS(FAB) m/z 361.2358 [M + Na]+
화합물 4 : 9,15- 디옥소 -프로스타-5- 에노인산
분자식 : C20H32O4
분자량 : 359.2198
색 : 무색 유지상
[α]24D ?53.0° (c 0.1, MeOH)
1H and 13C NMR 데이터 : 표 1, 2 참조
MS(FAB) m/z 359.2183 [M + Na]+
화합물 5 : 2- 포름아미도 -1,3-디히드록시- 옥타데칸
분자식 : C19H39NO3
분자량 : 359.2198
색 : 백색 무정형 고체상
[α]27 D ?2.7° (c 0.1, MeOH)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) : 0.90 (3H, t, J = 6.4 Hz, H-18), 1.29 (26H, m, H-5 - H-17), 1.54( 2H, H-4), 3.62 (1H, m, H-3), 3.70 (2H, d, J = 5.2 Hz, H-1), 3.90 (1H, q, J = 6.4 Hz, H-2), 8.11 (1H, s, CHO)
13C NMR (100 MHz, CD3OD) : 14.4, 23.7, 26.8, 30.5, 30.8, 33.1, 34.8, 55.6, 62.0, 72.2, 163.8
MS(FAB) m/z 352.2834 [M + Na]+
화합물 6 : 11-옥소- 헥사데카 -9- 에노인산
분자식 : C16H28O3
분자량 : 291.1936
색 : 무색 유지상
[α]24D ?53.0° (c 0.1, MeOH)
1H NMR (500 MHz, CD3OD) : 0.94 (3H, t, J = 7.0 Hz, H-16), 1.31-1.36 (10H, m), 1.51 (2H, quint, J = 7.0 Hz, H-7), 1.60 (4H, m, H-3 and H-13), 2.26 (4H, m, H-2 and H-8), 2.60 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-12), 6.13 (1H, dt, J = 14.0, 1.5 Hz, H-10), 6.94 (1H, dt, J = 14.0, 7.0 Hz, H-9)
MS(FAB) m/z 291.1943 [M + Na]+
CID of m/z (rel int) 313 [M ? H + 2Na]+ (100) m/z 283 (5), 269 (29), 173 (52), 159 (31), 145 (12), 131 (7), 117 (33), 104 (33), 90 (29).
화합물 7 : 10-옥소- 헥사데카노인산
분자식 : C16H30O3
색 : 무색 유지상
1H NMR 데이터, 표 3 참조
negative-ion MS(FAB) m/z 269 [M - H]-
positive-ion MS(FAB) m/z 293 [M + Na]+, 315 [M ? H + 2Na]+
CID of m/z (rel int) 315 [M ? H + 2Na]+ (100) m/z 299 (9), 285 (14), 271 (23), 257 (75), 187 (77), 173 (30), 159 (34), 145 (18), 131 (14), 117 (61), 104 (69), 90 (69).
화합물 8 : 9-히드록시- 헥사데카 -8- 에노인산
분자식 : C16H30O3
색 : 무색 유지상
[α]24D +2.8° (c0.04, MeOH)
1H NMR 데이터, 표 3 참조
negative-ion MS(FAB) m/z 269 [M - H]-
positive-ion MS(FAB) m/z 293 [M + Na]+, 315 [M ? H + 2Na]+
CID of m/z (rel int) 315 [M ? H + 2Na]+ (100) m/z 271 (12), 257 (10), 243 (14), 229 (20), 159 (24), 145 (12), 131 (10), 117 (78), 104 (90), 90 (71).
화합물 9 : 10-옥소- 옥타데카 -8- 에노인산
분자식 : C18H32O3
색 : 무색 유지상
1H NMR 데이터, 표 3 참조
MS(FAB) m/z 319 [M + Na]+, 341 [M ? H + 2Na]+
CID of m/z (rel int) 341 [M ? H + 2Na]+ (100) m/z 297 (14), 283 (17), 269 (14), 255 (86), 159 (57), 145 (19), 131 (12), 117 (88), 104 (89), 90 (81).
화합물 10 : 11-옥소- 옥타데카 -9- 에노인산
분자식 : C18H32O3
색 : 무색 유지상
1H NMR 데이터, 표 3 참조
MS(FAB) m/z 319 [M + Na]+, 341 [M ? H + 2Na]+
CID of m/z (rel int) 341 [M ? H + 2Na]+ (100) m/z 297 (15), 283 (20), 269 (78), 173 (53), 159 (19), 145 (20), 131 (15), 117 (75), 104 (90),90 (58).
화합물 11 : 10-히드록시- 옥타데카 -8- 에노인산
분자식 : C18H34O3
색 : 무색 유지상
[α]24D -3.8° (c 0.07, MeOH)
1H NMR 데이터, 표 4 참조
negative-ion MS(FAB) m/z 297 [M - H]-
positive-ion MS(FAB) m/z 321 [M + Na]+, 343 [M ? H + 2Na]+
CID of m/z (rel int) 343 [M ? H + 2Na]+ (100) m/z 299 (14), 271 (18), 257 (11), 243 (18), 229 (32), 159 (26), 145 (19), 131 (18), 117 (86), 104 (93), 90 (68).
화합물 12 : 10-옥소- 옥타데카노인산
분자식 : C18H34O3
색 : 무색 유지상
1H NMR 데이터, 표 4 참조
negative-ion MS(FAB) m/z 297 [M - H]-
positive-ion MS(FAB) m/z 321 [M + Na]+, 343 [M ? H + 2Na]+
CID of m/z (rel int) 343 [M ? H + 2Na]+ (100) m/z 327 (13), 313 (19), 299 (22), 285 (13), 271 (25), 257 (66), 187 (66), 173 (25), 159 (31), 145 (19), 131 (16), 117 (66), 104 (66), 90 (78).
화합물 13 : 11-옥소- 옥타데카노인산
분자식 : C18H34O3
색 : 무색 유지상
1H NMR 데이터, 표 4 참조
negative-ion MS(FAB) m/z 297 [M - H]-
positive-ion MS(FAB) m/z 321 [M + Na]+, 343 [M ? H + 2Na]+
CID of m/z (rel int) 343 [M ? H + 2Na]+ (100) m/z 313 (14), 299 (14), 285 (36), 271 (71), 201 (75), 187 (25), 173 (32), 159 (29), 145 (21), 131 (14), 117 (71), 104 (89), 90 (64).
화합물 14 : 12-옥소- 옥타데카노인산
분자식 : C18H34O3
색 : 무색 유지상
1H NMR 데이터, 표 4 참조
MS(FAB) m/z 321 [M + Na]+, 343 [M ? H + 2Na]+
CID of m/z (rel int) 343 [M ? H + 2Na]+ (100) m/z 299 (16), 285 (42), 215 (42), 201(29), 187 (24), 173 (21), 159 (26), 145 (21), 131 (13), 117 (63), 104 (63), 90 (55).
Figure 112006084560171-pat00015
Figure 112006084560171-pat00016
Figure 112006084560171-pat00017
Figure 112006084560171-pat00018
참고예 1. 시약 및 세포 배양
LPS (Lipopolysaccharide; E. coli serotype 0111:B4)는 시그마사(St. Louis. MO. USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 쥐과의 대식세포 세포주 (Murine macrophage cell line)인 RAW264.7 세포는 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank; KCLB)으로부터 분양 받아 100 단위/㎖ 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin)과 10 % 소 태아 혈청 (fetal bovine serum; FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO2 항온기에서 배양하였으며, 계대 배양은 3일에 한 번씩 시행하였다.
실험예 1. 시험관내 ( In vitro )에서 세포독성 ( cytotoxicity ) 평가
LDH는 모든 세포의 세포질 안에 존재하는 효소로서 피루브산(pyruvic acid)와 락트산(lactic acid)간의 가역적 전환에 관여하여 촉매작용을 하며, LDH를 내포한 조직이 파괴될 때 혈액 중으로 흘러나와 혈중 LDH가 상승한다. 따라서 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험하였다(Tomoki, S. et al., J. Biol. Chem ., 277(4), p2437, 2002).
상기 참고예 1의 RAW264.7 세포를 상기 실시예 2에서 수득한 화합물과 LPS 최종농도(1 ㎍/㎖)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여, 24시간 배양 한 후, 배양 배지를 얻어 3,000 rpm에서 5분 원심분리 하였다. LDH 활성을 비방사성 세포독성 분석 키트(Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit) (promega, USA)를 이용하여 측정했으며, 96 웰플레이트에 원심분리하여 얻은 배양 배지 50 ㎕와 재조합된 기질혼합물(reconstituted substrate mix; containing nitro blue tetrazolium, diaphorase and NAD)을 50 ㎕를 넣고, 실온에서 30분 반응시킨 후, 50 ㎕의 정지용액(stop solution)을 넣어 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군(LDH control, 1:5000)의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.
상기 실험 결과, 꼬시래기 추출물에서 분리된 화합물을 처리한 결과, 대조군 흡광도와 비교하여 30 % 이하로 독성을 나타내지는 않았다 (도 3 참조)
실험예 2. 산화질소(Nitric oxide) 형성에 미치는 영향
최근 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 산화질소(NO) 생성에 대한 효과를 알아보기 위해 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다(Mu, M. M. et al., J. Endotoxin Res., 7, p431, 2001).
먼저, 상기 참고예 1의 RAW264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5 × 105 세포/㎖로 조절한 후, 24 웰 플레이트에 접종하고, 상기 실시예 2에서 수득한 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물과 LPS(1 ㎍/㎖)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 그리즈(Griess) 시약(Sigma, St. Louis. MO. USA)을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 ㎕와 그리즈 시약 [1 % (w/v) 술파닐아미드(sulfanilamide), 0.1 % (w/v) 나피레틸렌디아민(naphylethylenediamine) in 2.5 % (v/v) 인산(phosphoric acid)] 100 ㎕를 혼합하여 96 웰 플레이트에서 10분 동안 반응시킨 후, ELISA 리더(reader)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준농도 곡선은 아질산 나트륨(sodium nitrite; NaNO2)을 연속희석(serial dilution)하여 얻었다(1-100 μM).
상기 실험 결과, 실시예 2에서 수득한 화합물을 처리한 결과, LPS 무처리군 5.2 μM과 비슷한 생성농도로 생성량이 감소됨을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
실험예 3. 시험관내 ( In vitro )에서 염증 전구 사이토카인 ( TNF -α 및 IL-6) 생성 및 정량
꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물은 염증 전구 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 생성에 어느 정도 영향을 주는지를 조사하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다(Yi, A. K. et al., Int Immunol., 13(11), p1391, 2001).
먼저, 상기 참고예 1의 RAW264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 7 × 105 세포/㎖로 조절한 후, 24 웰플레이트에 접종하고, 5 % CO2 항온기에서 18시간 전 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 10배 농도(1 ㎎/㎖)로 조제된 상기 실시예 2에서 수득한 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물 50 ㎕과 450 ㎕의 LPS 최종농도(1 ㎍/㎖)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 상기 배양과 동일 조건에서 배양하였다. TNF-α는 6시간 후, IL-6는 24시간 후, 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 분)하여 얻어진 상층액의 TNF-α 및 IL-6 함량을 측정하였다.
TNF-α 및 그 외의 사이토카인 정량은 쥐과의 ELISA(murine enzyme-linked immnunosorbent assay) 킷트(kit) (R&D system, Inc, USA)를 이용하여 정량하였으며, 표준(standard) 에 대한 표준곡선의 r2 값은 0.99 이상이었다.
상기 실험 결과, 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물을 처리한 결과, TNF-α 및 IL-6의 생성을 LPS 처리군에 비하여 강하게 억제함을 알 수 있었다(표 5 참조).
Figure 112006084560171-pat00019
실험예 4. mRNA 발현에 미치는 영향
상기 실험의 염증 전구 사이토카인과 산화질소의 생성억제가 mRNA 발현을 억제한 결과인지를 알아보기 위하여 LPS와 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물을 함께 처리하여 LPS에 의한 염증성 전구인자들의 mRNA 발현에 대한 억제 효과를 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같은 실험을 하였다(Mu, M. M. et al., J. Endotoxin Res., 7, p431, 2001).
5-1. RNA 분리
먼저, 상기 참고예 1의 RAW264.7 세포를 18 시간 전 배양하고, 10배 농도로 조제된 상기 실시예 2에서 수득한 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물과 LPS (최종농도 1 ㎍/㎖)를 동시 처리하여 시간별로 배양 한 후, 총 RNA 추출은 TRI-시약(reagent)(MRC)을 이용하여 분리하였다. 세포에 TRI-시약을 500 ㎕ 첨가하여 균질화한 후, 클로로포름을 첨가하여 원심분리시킨 다음, 상층액에 동량의 이소프로판올을 첨가하여 원심 분리시켜 RNA를 침전시키고 75 %의 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 에탄올로 세척한 후, 건조시켜 DEPC 처리된 증류수에 녹인 다음, 260 nm에서 흡광도를 측정하여 RNA를 정량하였고, A260/A280 nm의 비율이 1.7~1.9 범위 내의 값을 갖는 RNA를 수득하였다. 모든 실험은 리보뉴클레아제-제거(RNase-free)한 조건 하에서 이루어졌다.
5-2. cDNA 합성
상기 실험예 5-1에서 수득한 1 ㎍의 총 RNA를 올리고(oligo)(dT)18 프라이머(primer), dNTP(0.5 μM), 1 단위(unit) 리보뉴클레아제 저해제(RNase inhibitor) 및 M-MuLV 역전사 효소(reverse transcriptase)(2 U)(Promega, USA)로 70 ℃ 5 분, 25 ℃ 5 분, 37 ℃ 60 분 및 75 ℃에서 15 분 가열(heating) 시킨 후, 반응을 중지시켜 cDNA를 합성하였다.
5-3. PCR (Polymerase Chain Reaction)
상기 실험예 5-2에서 합성된 cDNA로부터 TNF-α, IL-6, IL-1β, iNOS, COX-2 및 β-액틴(Actin)을 증폭시키기 위하여, 2 ㎕ cDNA, 4 μM의 5′와 3′프라이머, 10x 완충용액(10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1 % Triton X-100), 250 μM dNTP, 25 mM 염화마그네슘(MgCl2), 1 단위 태그 폴리머라아제(Taq polymerase)(Promega, USA)를 섞고 증류수(distilled water)로 전체를 25 ㎕로 맞춘 다음, 유전자 증폭기(Thermal Cycler, Perkin-Elmer, USA)를 이용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 조건은 94 ℃/45초, 55~60 ℃/45초, 72 ℃/60초, 30회이며, PCR에 의하여 생성된 산물은 1.2 % 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동을 실시하고, 불화 에티디움(ethidium bromide)으로 염색하여 특정 밴드를 확인하였다 (표 6 참조).
유전자 프라이머 서열(Primer sequences) 단편 사이즈(bp)
TNF-α F 5'-TTGACCTCAGCGCTGAGTTG-3' 364
R 5'-CCTGTAGCCCACGTCGTAGC-3'
IL-1β F 5'-CAGGATGAGGACATGAGCACC-3' 447
R 5'-CTCTGCAGACTCAAACTCCAC-3'
IL-6 F 5'-GTACTCCAGAAGACCAGAGG-3' 308
R 5'-TGCTGGTGACAACCACGGCC-3'
iNOS F 5`-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3` 496
R 5`-GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTGG-3`
β-액틴 F 5'-GTGGGCCGCCCTAGGCACCAG-3' 603
R 5'-GGAGGAAGAGGATGCGGCAGT-3'
상기 실험 결과, 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물을 처리시, TNF-α, IL-6 및 IL-1β 생성에 높은 억제 효과를 보였다. 또한, 베타-액틴을 같이 나타내줌으로써 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물 자체가 세포에 영향을 주어 감소하는 것이 아님을 보여주었다 (도 5, 도 6 및 도 7 참조).
또한, 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물의 mRNA 발현(expession) 저해정도를 Raw264.7세포에 LPS(1 ㎍/㎖)를 사용하여 iNOS 및 COX-2의 생성을 유도한 후, RT-PCR을 통하여 알아보았다.
상기 실험 결과, LPS에 의해 iNOS 및 COX-2는 현저히 증가하였으며, 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물은 mRNA 발현을 강하게 억제하였다 (도 8 참조).
본 발명의 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
실시예 2의 화합물 1 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
실시예 2의 화합물 2 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
실시예 2의 화합물 3 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
실시예 2의 화합물 4 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
실시예 2의 화합물 5 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강 음료의 제조
실시예 2의 화합물 6 100 ㎎
비타민 C 15 g
비타민 E(분말) 100 g
젖산철 19.75 g
산화아연 3.5 g
니코틴산아미드 3.5 g
비타민 A 0.2 g
비타민 B1 0.25 g
비타민 B2 0.3 g
물 정량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다. 상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물은 염증 전구 사이토킨인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 형성 억제 및 iNOS, COX-2 및 NO의 발현억제를 나타내므로, 꼬시래기 추출물로부터 분리된 화합물을 함유하는 염증질환의 예방 및 치료용 약학조성물로 이용될 수 있다.

Claims (11)

  1. 꼬시래기 (Gracilaria verrucosa papenfuss) 추출물로부터 분리된 하기 구조식 (1)로 표기되는 신규화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    Figure 112006084560171-pat00020
    (1)
  2. 꼬시래기 (Gracilaria verrucosa papenfuss) 추출물로부터 분리된 하기 구조식 (2)로 표기되는 신규화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    Figure 112006084560171-pat00021
    (2)
  3. 꼬시래기 (Gracilaria verrucosa papenfuss) 추출물로부터 분리된 하기 구조 식 (3)으로 표기되는 신규화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    Figure 112006084560171-pat00022
    (3)
  4. 꼬시래기 (Gracilaria verrucosa papenfuss) 추출물로부터 분리된 하기 구조식 (4)로 표기되는 신규화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    Figure 112006084560171-pat00023
    (4)
  5. 꼬시래기 (Gracilaria verrucosa papenfuss) 추출물로부터 분리된 하기 구조식 (5)로 표기되는 신규화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    Figure 112006084560171-pat00024
    (5)
  6. 꼬시래기 (Gracilaria verrucosa papenfuss) 추출물로부터 분리된 하기 구조식 (6)으로 표기되는 신규화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    Figure 112006084560171-pat00025
    (6)
  7. 꼬시래기 추출물로부터 분리된 신규 15-히드록시-9-옥소-프로스타-5,13-디에노인산 , 신규 메틸-15-히드록시-9-옥소-프로스타-5,13-디에노에이트, 신규 15-히드록시-9-옥소-프로스타-13-에노인산, 신규 9,15-디옥소-프로스타-5-에노인산 , 신규 2-포름아미도-1,3-디히드록시-옥타데칸, 신규 11-옥소-헥사데카-9-에노인산, 10-옥소-헥사데카노인산, 9-히드록시-헥사데카-8-에노인산, 10-옥소-옥타데카-8-에노인산 , 11-옥소-옥타데카-9-에노인산, 10-히드록시-옥타데카-8-에노인산, 10-옥소-옥타데카노인산, 11-옥소-옥타데카노인산 또는 12-옥소-옥타데카노인산으로부터 선택된 화합물 및 그 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 추출물은 메탄올, 메틸렌클로라이드, 헥산 또는 이들의 혼합용매 가용 추출물인 약학조성물.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증, 위염, 대장염, 관절염, 신장염 또는 간염인 약학 조성물.
  10. 꼬시래기 추출물로부터 분리된 신규 15-히드록시-9-옥소-프로스타-5,13-디에노인산 , 신규 메틸-15-히드록시-9-옥소-프로스타-5,13-디에노에이트, 신규 15-히드록시-9-옥소-프로스타-13-에노인산, 신규 9,15-디옥소-프로스타-5-에노인산 , 신규 2-포름아미도-1,3-디히드록시-옥타데칸, 신규 11-옥소-헥사데카-9-에노인산, 10-옥소-헥사데카노인산, 9-히드록시-헥사데카-8-에노인산, 10-옥소-옥타데카-8-에노인산 , 11-옥소-옥타데카-9-에노인산, 10-히드록시-옥타데카-8-에노인산, 10-옥소-옥타데카노인산, 11-옥소-옥타데카노인산 또는 12-옥소-옥타데카노인산으로부터 선택된 화합물 및 그 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능 식품.
  11. 제 10항에 있어서, 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제인 건강기능식품.
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