KR101790654B1 - 잣박 추출물과 이를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
잣박 추출물과 이를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 잣박 추출물과 이를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 잣박 추출물을 포함하는 간암 예방 또는 치료용 조성물, 약학적 조성물, 식품 조성물, 건강기능식품 및 잣박 분획물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 잣박 추출물은 세포독성을 갖지 않으면서, 여러 암세포주 중에서 특허 간암 세포주에 대한 생장억제효과가 뛰어나므로 간암의 예방 또는 치료에 효과적이다.
Description
본 발명은 잣박 추출물과 이를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 잣박 추출물을 포함하는 간암 예방 또는 치료용 조성물, 약학적 조성물, 식품 조성물, 건강기능식품 및 잣박 분획물의 제조 방법에 관한 것이다.
통계청이 발표한 ‘2012년 사망 및 사망원인 통계자료’에 따르면 우리나라의 사망률 순위는 암, 심장질환, 뇌혈관 질환 등으로 나타났다 (National Statical Office, 2012). 그 중에서 제일 높은 사망순위인 암은 현재 전 세계적으로 가장 높은 사망률 1위의 질병이며, 의학의 발전 및 여러 가지 노력에도 불구하고 사망률이 개선되지 않아 그 중요성이 부각되고 있다. 특히 국가암정보센터에서 2012년에 밝힌 바에 따르면 우리나라 남성의 간암 발생률은 위암, 대장암, 폐암에 이어 4위를 차지했으며, 이는 일본 및 미국보다 높은 순위이다 (국가별 간암 발생률: 일본; 5위, 미국; 9위, 국가암정보센터). 암 치료에 가장 많이 쓰이는 방법은 외과적 수술, 방사선요법, 화학요법이 있는데, 이 치료방법은 암세포를 표적으로 삼지만 우리 몸의 정상세포들까지 손상을 입힐 수도 있다. 2007년 FDA에 허가를 받아 간암치료에 쓰이고 있는 넥사바 (Nexavar)는 현재 알려진 간암에 대한 약물 중에서 가장 뛰어난 치료효과를 갖고 있지만, 넥사바 치료를 받은 환자 66%는 무기력증을 겪었으며 그 외에도 설사, 탈모, 손발 수포 등의 다양한 부작용을 나타내어 새로운 간암 치료제에 대한 요구가 늘고 있는 추세다 (Brunocilla et al., 2013). 넥사바 외에도 현재 사용되고 있는 항암약물의 독성 및 부작용이 문제점으로 대두되고 있어, 천연물에서 항암제를 찾고자 하는 노력이 증가하고 있다 (Bae et al. 2004; Bae et al, 2004; Alekseyenko et al, 2007).
한편, 다당류는 식품류에서 점증제, 안정제, 겔화제, 지방대체제 등의 식품첨가물로서 광범위하게 사용되고 있으며 식품 외 제지, 광업, 섬유, 미용 등의 산업에도 이용되는 활용도가 높은 생물소재다. 또한 다당류는 인체 내에서 에너지 제공, 구조적지지, 신호전달, 세포간암 상호작용, 면역반응, 혈액응고 등 광범위한 역할을 하는 중요 생체 거대 분자로서 (Naveen Chandra et al.,2011), 최근에는 천연물에서 추출한 다당류의 항염증, 항바이러스, 항암활성과 같은 다양한 생리활성에 대해 보고되고 있다 (Ali et al. 2009; Wijesekara et al. 2011; Yu et al. 2009). 특히 버섯, 효모, 인삼, 해조류, 미생물 등 다양한 천연물에서 추출한 다당류의 항암활성에 대한 연구가 무수히 진행 되었으며, 그동안 연구되지 않은 새로운 천연물에서 추출한 다당류의 항암활성에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다 (Aizhen et al., 2012). 예를 들어, 숙주의 저하된 면역기능을 상당수준 높임으로써 항암활성을 보이는 버섯류 자실체에서 분리된 다당류는 제품화되어 항암 및 면역보조제의 조성물로서 시판 중이며 (Chang, 2010) 해조류인 톳 유래의 수용성 다당류는 리파아제의 활성을 저해함으로써 항비만 효과를 기대할 수 있다는 보고 (Beak et al, 2013)도 있었다. 특히, 항암활성이 뛰어난 식물성 다당류는 세포독성으로 인해 부작용 빈도가 높은 항암제를 대체하여 약제 혹은 그 조성물로서 주목받고 있다.
잣나무 (Pinus koraiensis)는 동아시아권인 한반도를 비롯한 중국 북동부, 일본 등에 분포하는 구과식물목 소나무과인 한대성 고산식물로 낙엽송 (Larix leptolepis)과 리기다소나무 (Pinus rigida) 다음으로 2010년도 기준, 한반도 전체 산림 면적 중 3.4 %를 차지하는 주요 경제 수종 중 하나이다. 그 목재는 현재 건축재, 가구재, 포장재, 합판, 펄프, 목탄 등에 주로 이용되고 있으며 그 종자 생산 또한 우수하여 잣나무는 높은 경제적 가치를 지닌 수목으로 분류된다 (Lee et al., 2013; 국립산림과학원, 2013). 잣나무의 종자인 잣 (Korean pine nut)은 대한민국의 주요 소비 견과류 중 하나로서 주 생산지인 가평의 지역특산물로 알려져 있다. 잣은 그 특유의 맛과 향을 가지고 있어 생식으로 섭취할 뿐만 아니라 기름, 죽, 국수, 칼국수, 두부, 월병, 막걸리, 묵, 냉면, 소시지 등의 음식 첨가물 또는 재료로 이용되기도 한다.
잣은 약 지질 64.2%, 단백질 18.6%, 수분 5.5%, 당질 4.3%, 회분 1.5%로 구성되어 있으며 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 비타민B1, 비타민E와 같은 다양한 미네랄과 각종 아미노산을 함유하고 있는 고칼로리 견과류이다 (Park et al, 2005). 또는 일반적으로 소비되는 호두 (43.5%), 아몬드 (43.2%), 땅콩 (49.7%) 등과 같은 다른 견과류와 비교하여 보았을 때 월등히 높은 지질함유량으로 가장 높은 에너지를 가진 고열량 식품이다 (Chung et al, 2013). 특히, 잣의 구성성분 중 절반 이상을 차지하는 지질은 약 80%가 불포화지방산인 리놀레인산 (linoleic acid) 48.6%, 올레인산 (oleic acid) 22.8%, 아라키돈산 (arachidonic acid) 14.4%로 이루어져 있다.
최근 잣의 성분을 이용한 연구들이 보고되고 있는데 대표적으로 잣의 지질성분이 지질대사를 조절하여 IL-1β를 크게 증가시키면서 체중증가를 억제한다고 보고되었으며 (Park et al, 2013), 역시 잣의 지질성분이 AMPK (AMP-activated protein kinase)와 산화적 대사와 관련된 단백질의 발현증가로 골격근의 지질축적을 억제하고 갈색지방조직을 감소시켜 비만과 그와 관련된 대사질환을 개선시킬 수 있다는 연구가 보고되었다 (Le et al, 2012). 또는 고온의 이산화탄소압으로 추출된 잣기름의 항산화활성 (Chen et al, 2010), CCK (cholecystokinin)의 증가에 따른 식욕감소 (hughes et al, 2008), 간암의 지질축적 저해 (Ferramosca et al, 2008) 등이 잣기름의 생리활성으로 연구, 보고되었다.
잣이나 잣기름이 가지고 있는 다양한 작용 및 기능에도 불구하고, 압착과정 후 남은 찌꺼기 (박, 粕)는 영양 성분 및 유용 생리활성에 대한 어떠한 보고가 없어 대부분 폐기처리 되고 있다. 현재 국내 잣 박 (잣기름 채유 후 걸러진 박)에 대한 연구는 잣 박을 도포한 김의 식품 개발 연구가 보고된 바가 있으나 잣 박에 대한 성분 및 유용한 생리활성에 대한 보고나 연구가 진행된 바가 없다 (대한민국 등록 특허 제 10-0679676 호).
전술한 바와 같이 잣이 가지고 있는 약리적, 식품학적 기능 및 효과에도 불구하고 잣기름은 식용으로 애용되는 데에 비해, 약리적 효과가 기대되는 잣 박에 대한 연구는 국내외로 매우 미미하였다.
이에 본 발명자들은 산업적으로 가치가 없던 잣 박을 특정한 방법으로 이용함으로서 간암 예방 또는 치료용 조성물을 발명하여, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 잣박 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 잣박 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 간암 예방 또는 치료에 효과적인 잣박 분획물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 잣박 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 잣박 추출물이 0.01 내지 50 μg/ml 농도로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 잣박 추출물은 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 트리클로로아세트산, 디에틸에테르, 물 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출된 것 일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 잣박 추출물은 잣박 조추출물을 분획하여 얻은 잣박 분획물일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 잣박 추출물은 우론산(uronic acid), 갈락투론산(galacturonic acid). 글루쿠론산(glucuronic acid), 아라비노오스(arabinose), 글루코오스(glucose), 자일로오스(xylose), 갈락토오스(galactose) 및 람노오스(rhamnose)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 잣 박에 유기용매를 첨가하여 기름을 제거하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 기름이 제거된 잣박을 열수 추출하는 단계; (c) 상기 (b)단계에서 얻어진 잣박 열수 추출물로부터 단백질을 제거하는 단계; (d) 상기 (c)단계에서 얻어진 추출물에 알코올 용매를 처리한 후, 증류수에서 투석하여 잣박 조추출물(PNE)을 수득하는 단계; 및 (e) 상기 (d)단계에서 수득된 잣박 조추출물(PNE)을 정제하여 잣박 분획물(PNE-P1)을 수득하는 단계를 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 잣박 분획물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 잣박 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 잣박 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
따라서 본 발명은 잣박 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 잣박 추출물은 세포독성을 갖지 않으면서, 여러 암세포주 중에서 특허 간암 세포주에 대한 생장억제효과가 뛰어나므로 간암의 예방 또는 치료에 효과적이다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따라 잣 박으로부터 열수추출 후 에탄올 침전법을 통한 조추출물(PNE)의 추출 과정을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 2는 잣 박으로부터 얻어진 조추출물 (PNE)을 DEAE-셀룰로오스 칼럼을 통해 잣박 분획물(PNE-P1)을 정제한 모식도(A)와 페놀-황산법으로 당을 검출한 그래프(B)이다.
도 3은 HPAEC-PAD법(High Performance Anion Exchange Chromatography-Pulsed Amperometric Detection법)을 이용하여 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 중성당의 정성 및 정량 분석한 결과이며, 구체적으로 A는 표준당 분석 결과, B는 PNE의 중성당 측정 결과, C는 PNE-P1의 중성당 측정 결과 그래프이다. Peak 1은 람노오스(rhamnose), peak 2는 아라비노오스(arabinose), peak 3는 갈락토오스(galactose), peak 4는 글루코오스(glucose), peak 5는 자일로오스(xylose)를 나타낸다.
도 4는 HPAEC-PAD법을 이용한 HPLC의 우론산 정성 및 정량 분석 그래프로 A는 표준 우론산 측정 결과 그래프이고 B는 PNE-P1의 우론산 분석 그래프이다. Peak 1은 갈락투론산(galacturonic acid), peak 2는 글루쿠론산(glucuronic acid)을 나타낸다.
도 5는 HPLC를 이용한 PNE와 PNE-P1의 분자량 측정 결과 그래프이다.
도 6은 대식세포에 대한 PNE-P1의 세포독성 여부를 MTT 분석법으로 측정한 결과 그래프이다.
도 7은 PNE-P1을 농도별로 처리한 대식세포의 질소산화물 생성량 변화의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 PNE-P1을 농도별로 처리한 대식세포의 iNOS의 발현량을 PCR로 측정한 결과를 나타낸 그림(A)과 그래프(B)이다.
도 9는 PNE-P1을 농도별로 처리한 대식세포의 사이토카인 생성량을 측정한 결과이다. A는 TNF-α의 생성량 변화를 나타내는 그래프이고, B는 IL-6의 생성량 변화를 나타내는 그래프이다.
도 10은 PNE-P1을 농도별로 처리한 대식세포의 케모카인 생성량을 측정한 결과이다. A는 MIP-1α의 생성량 변화를 나타낸 그래프이고, B는 RANTES의 생성량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 11은 PNE-P1이 다양한 종류의 암세포[인간 대장암 세포(HCT 116), 마우스 피부암 세포 (B16F10). 인간 전립선암 세포 (PC-3), 인간 간암 세포 (HepG 2)] 및 일반 세포 [원숭이 신장표피 세포 (Vero)]에 대한 세포 증식 억제 효과여부를 확인한 그래프이다.
도 12는 PNE 및 PNE-P1에 대하여 인간 간암 세포 증식 억제 효과를 비교한 그래프이다.
도 13은 PNE 및 PNE-P1에 대하여 인간 간암 세포 모양 변화 (세포모양 축소) 유도 효과를 비교한 세포의 현미경 사진이다.
도 14는 PNE-P1에 의한 간암 세포 내 카스파제(caspase) 단백질 및 PARP 단백질 활성화 변화를 측정한 데이터이다.
도 15는 PNE-P1에 의한 간암 세포 내 미토콘드리아 막전위 붕괴를 측정한 그래프이다.
도 16은 PNE-P1에 의한 간암 세포 내 Bax 단백질의 발현량 변화를 측정한 데이터이다.
도 2는 잣 박으로부터 얻어진 조추출물 (PNE)을 DEAE-셀룰로오스 칼럼을 통해 잣박 분획물(PNE-P1)을 정제한 모식도(A)와 페놀-황산법으로 당을 검출한 그래프(B)이다.
도 3은 HPAEC-PAD법(High Performance Anion Exchange Chromatography-Pulsed Amperometric Detection법)을 이용하여 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 중성당의 정성 및 정량 분석한 결과이며, 구체적으로 A는 표준당 분석 결과, B는 PNE의 중성당 측정 결과, C는 PNE-P1의 중성당 측정 결과 그래프이다. Peak 1은 람노오스(rhamnose), peak 2는 아라비노오스(arabinose), peak 3는 갈락토오스(galactose), peak 4는 글루코오스(glucose), peak 5는 자일로오스(xylose)를 나타낸다.
도 4는 HPAEC-PAD법을 이용한 HPLC의 우론산 정성 및 정량 분석 그래프로 A는 표준 우론산 측정 결과 그래프이고 B는 PNE-P1의 우론산 분석 그래프이다. Peak 1은 갈락투론산(galacturonic acid), peak 2는 글루쿠론산(glucuronic acid)을 나타낸다.
도 5는 HPLC를 이용한 PNE와 PNE-P1의 분자량 측정 결과 그래프이다.
도 6은 대식세포에 대한 PNE-P1의 세포독성 여부를 MTT 분석법으로 측정한 결과 그래프이다.
도 7은 PNE-P1을 농도별로 처리한 대식세포의 질소산화물 생성량 변화의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 PNE-P1을 농도별로 처리한 대식세포의 iNOS의 발현량을 PCR로 측정한 결과를 나타낸 그림(A)과 그래프(B)이다.
도 9는 PNE-P1을 농도별로 처리한 대식세포의 사이토카인 생성량을 측정한 결과이다. A는 TNF-α의 생성량 변화를 나타내는 그래프이고, B는 IL-6의 생성량 변화를 나타내는 그래프이다.
도 10은 PNE-P1을 농도별로 처리한 대식세포의 케모카인 생성량을 측정한 결과이다. A는 MIP-1α의 생성량 변화를 나타낸 그래프이고, B는 RANTES의 생성량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 11은 PNE-P1이 다양한 종류의 암세포[인간 대장암 세포(HCT 116), 마우스 피부암 세포 (B16F10). 인간 전립선암 세포 (PC-3), 인간 간암 세포 (HepG 2)] 및 일반 세포 [원숭이 신장표피 세포 (Vero)]에 대한 세포 증식 억제 효과여부를 확인한 그래프이다.
도 12는 PNE 및 PNE-P1에 대하여 인간 간암 세포 증식 억제 효과를 비교한 그래프이다.
도 13은 PNE 및 PNE-P1에 대하여 인간 간암 세포 모양 변화 (세포모양 축소) 유도 효과를 비교한 세포의 현미경 사진이다.
도 14는 PNE-P1에 의한 간암 세포 내 카스파제(caspase) 단백질 및 PARP 단백질 활성화 변화를 측정한 데이터이다.
도 15는 PNE-P1에 의한 간암 세포 내 미토콘드리아 막전위 붕괴를 측정한 그래프이다.
도 16은 PNE-P1에 의한 간암 세포 내 Bax 단백질의 발현량 변화를 측정한 데이터이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 잣이 가지고 있는 약리적, 식품학적 기능 및 효과에도 불구하고 잣기름은 식용으로 애용되는 데에 비해, 잣 박은 땔감용 또는 멀칭용으로만 사용될 뿐 약리적, 식품학적 기능 및 효과에 대한 연구는 국내외로 매우 미미하였다.
이에, 본 출원인은 산업적으로 가치가 없던 잣 박을 특정한 방법으로 이용함으로서 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 발명하였다. 본 발명의 잣박 추출물은 세포에 대한 세포독성을 갖지 않으면서, 인간 간암 세포 (HepG 2)에서 미토콘드리아의 막 전위 상실을 유도하여 간암세포의 생장을 억제하므로 간암의 예방 또는 치료효과가 뛰어나다.
본 발명은 잣박 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 ‘잣’은 잣나무 (Pinus koraiensis)로부터 수득되는 열매이며, 잣나무는 동아시아권인 한반도를 비롯한 중국 북동부, 일본 등에 분포하는 구과식물목 소나무과인 한대성 고산식물이다. 본 발명의 ‘잣 박’은 ‘잣 껍질’을 의미한다. 본 발명에서 ‘잣 박’은 잣 알갱이로부터 잣기름을 짜고 남은 찌꺼기 즉, 탈지 잣박을 의미한다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 잣박 추출물이 0.01 내지 50 μg/ml 농도로 포함되는 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 10 내지 50 μg/ml 농도의 잣박 추출물에서 낮은 세포독성을 확인하였다(도 6 참조). 또한, 간암 억제 효과에 있어서, 농도 의존적으로 효과가 상승됨을 확인하였다(도 12 내지 16).
본 발명의 일실시예에 따르면, PNE-P1을 각각 1, 10, 30, 50 μg/ml의 농도로 처리 한 다양한 암세포주 중에서 인간 간암 세포(HepG 2)에서만 특이적으로 세포 생존율이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였으며, 50 μg/ml에서 약 77%의 세포성장 억제 효과를 보였고, 정상세포 (원숭이 신장표피 세포)에서는 어떠한 세포생존율 감소효과를 보이지 않았다(도 11 참조).
또한, 본 발명의 일실시예에 따르면, PNE-P1을 각각 1, 10, 30, 50 μg/ml의 농도로 처리 한 간암세포주의 생존율이 PNE를 각각의 농도로 처리한 간암세포주와 비교하여 훨씬 월등하게 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였으며, 50 μg/ml에서 PNE-P1은 약 77%의 세포성장 억제 효과를 보였다(도 12 참조).
또한, 본 발명의 일실시예에 따르면, PNE (20 및 50 μg/ml)를 처리한 군은 대조군에 비하여 뚜렷한 세포모양의 변화를 관찰 할 수 없었지만 PNE-P1 (50 μg/ml)을 처리한 군은 대조군에 비하여 확연한 세포모양의 변화를 관찰할 수 있었다. 따라서 PNE-P1이 세포를 축소시킴으로서 세포사멸을 유도하는 것을 확인하였다(도 14 참조).
또한, 본 발명의 일실시예에 따르면, PARP[Poly (ADP-ribose) polymerase]의 발현양이 PNE-P1의 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인 하였다(도 15).
또한, 본 발명의 일실시예에 따르면, PNE-P1을 1, 10, 30, 50 μg/ml 처리하였을 때 미토콘드리아 막전위가 각각 3%, 10%, 14%, 18% 감소한 것을 확인 할 수 있다(도 15 참조). 이는 PNE-P1에 의해 간암 세포의 미토콘드리아 막전위가 붕괴됨을 시사한다.
또한, 본 발명의 일실시예에 따르면, PNE-P1을 이용하여 Bax 발현 양을 조사해 보았을 때 세포에 처리한 PNE-P1의 농도가 증가할수록 발현양이 현저하게 증가하였다. 따라서 PNE-P1에 의한 암세포 내 미토콘드리아 막전위 붕괴는 Bax 단백질이 활성화됨에 따라 유도됨을 확인하였다(도 16 참조).
보다 바람직하게 본 발명의 바람직한 농도 범위는 0.01 내지 50 μg/ml 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 내지 40 μg/ml일 수 있다. 만약 잣박 추출물의 0.01 μg/ml보다 적게 포함되어 있다면, 효과적인 간암 억제 효과가 나타나기 어려우며, 50 μg/ml보다 많게 포함되어 있으면, 세포 독성이 나타날 수 있다.
본 발명의 상기 잣박 추출물은 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 트리클로로아세트산, 디에틸에테르, 물 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출된 것 일 수 있다. 바람직하게는 헥산, 물, 트리클로로아세트산, 디에틸에스터 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매일 수 있다.
추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다.
가장 바람직하게 상기 잣박 추출물은 실시예1에 기재된 바와 같이, 헥산으로 유분을 제거하고, 열수 추출한 후, 트리클로로아세트산으로 단백질을 제거한 다음, 디에틸에테르로 트리클로로아세트산을 제거하고, 80 내지 100 % 알코올을 첨가하여 반응시킨 후 에탄올을 제거한 조추출물일 수 있다.
본 발명의 잣박 추출물은 잣박 조추출물을 분획하여 얻은 잣박 분획물일 수 있다. 상기 잣박 추출물은 실시예 1-1에 기재된 바와 같이, 제조된 조추출물을 크로마토그래피를 이용하여 정제 및 분획한 후, 투석하여 얻어진 잣박 분획물일 수 있다.
본 발명의 잣박 추출물은 우론산(uronic acid), 갈락투론산(galacturonic acid). 글루쿠론산(glucuronic acid), 아라비노오스(arabinose), 글루코오스(glucose), 자일로오스(xylose), 갈락토오스(galactose) 및 람노오스(rhamnose)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 중성당 분석 결과, 잣박 조추출물 (PNE) 10 μg 당 아라비노오스, 글루코오스, 자일로오스, 갈락토오스, 람노오스가 각각 5490.90, 5773.93, 4225.09, 1344.84, 580.91 pmole이 존재하며 주된 당 성분은 아라비노오스, 글루코오스, 자일로오스인 것을 확인하였다. 또한, 정제된 분획물(PNE-P1)은 10 μg 당 아라비노오스, 글루코오스, 자일로오스, 갈락토오스, 람노오스가 각각 6676.25, 5443.22, 2984.78, 1668.58, 756.83 pmole로 존재하며 주된 당 성분은 아라비노오스와 자일로오스인 것으로 확인되었다(도 3 참조).
우론산 분석 결과, PNE 10 μg 당 갈락투론산과 글루쿠론산이 각각 2436.82, 34.04 pmole로 존재하며 갈락투론산이 주된 우론산임을 확인하였으며 PNE-P1 10 μg 당 갈락투론산과 글루쿠론산이 각각 3351.24, 54.62 pmole로 존재하며 역시 주된 우론산은 갈락투론산인 것을 확인하였다(도 4 참조).
따라서, 본원 발명의 잣박 조추출물은 10 μg 중량대비 4490 내지 6490 pmole의 아라비노오스, 4773 내지 6773 pmole의 글루코오스, 3225 내지 5225 pmole의 자일로오스, 344 내지 2344 pmole의 갈락토오스, 0.001 내지 1580 pmole의 람노오스, 1436 내지 3436 pmole의 갈락투론산, 및 0.001 내지 500 pmole의 글루쿠론산을 포함할 수 있다. 또한, 본원 발명의 잣박 분획물은 10 μg 중량대비 5676 내지 7676 pmole의 아라비노오스, 4443 내지 6443 pmole의 글루코오스, 1984 내지 3984 pmole의 자일로오스, 668 내지 2668 pmole의 갈락토오스, 0.001 내지 1756 pmole의 람노오스, 2351 내지 4351 pmole의 갈락투론산, 및 0.001 내지 500pmole의 글루쿠론산을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 잣 박에 유기용매를 첨가하여 기름을 제거하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 기름이 제거된 잣박을 열수 추출하는 단계; (c) 상기 (b)단계에서 얻어진 잣박 열수 추출물로부터 단백질을 제거하는 단계; (d) 상기 (c)단계에서 얻어진 추출물에 알코올 용매를 처리한 후, 증류수에서 투석하여 잣박 조추출물(PNE)을 수득하는 단계; 및 (e) 상기 (d)단계에서 수득된 잣박 조추출물(PNE)을 정제하여 잣박 분획물(PNE-P1)을 수득하는 단계를 포함하는 간암 예방 또는 치료용 잣박 분획물의 제조 방법을 제공한다.
상기 (a)단계의 유기용매는 바람직하게는 기름 성분을 제거할 수 있는 용매라면 제한하지 않으나, 바람직하게는 헥산일 수 있다.
상기 열수 추출하는 (b)단계는 100 ℃의 온도에서 2 내지 5 시간동안 교반하며 추출되는 것일 수 있다. 만약 2시간보다 적은 시간동안 추출한다면, 간암 억제 효과를 나타내는 유효성분이 충분히 추출되지 않을 수 있으며, 5 시간보다 긴 시간동안 추출한다하면, 유효성분의 변성이나 손실을 초래할 수 있다.
상기 (c) 단계는 단백질을 제거할 수 있는 용매라면 사용에 제한하지 않으며, 본 발명의 일실시예에 방법으로, 증류수에 여과액을 녹인 후, 10% 트리클로로아세트산과 상온에서 24시간동안 반응시키는 것일 수 있다.
상기 (d)단계에 처리하는 알코올은 1 내지 4 탄소수를 갖는 알코올로, 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 에탄올 또는 메탄올일 수 있으며, 가장 바람직하게는 90 내지 100 %의 에탄올일 수 있다. 상기 (d)단계의 알코올 처리는 4 ℃에서 12 시간 내지 36 시간동안 반응시키는 것일 수 있다.
상기 (e)단계의 정제는 통상에 알려진 정제 방법으로 정제될 수 있으며, 바람직하게는 크로마토그래피를 통해 정제될 수 있다. 보다 바람직하게는 음이온 교환 칼럼크로마토그래피를 사용할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분(잣박 추출물) 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 잣박 추출물은 조성물에 0.01 μg/ml 내지 50 μg/ml의 농도로 포함될 수 있으며, 또한 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 99 중량%로 포함될 수 있다.
본 발명은 잣박 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
식품 조성물은 유효성분인 잣박 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명은 잣박 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품은 간암의 예방 또는 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 잣박 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 잣박 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 잣박 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 잣박 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 잣박 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
잣 박 유래 조추출물의 추출 및 정제
(1) 잣 박 유래 조추출물의 추출
경기도 가평 원산지의 탈지 잣 (Pinus koraiensis)박 100 g에 남은 기름을 제거하기 위해 10배 용량의 헥산 (Hexane)을 첨가하여 균질기로 3분 동안 교반한 후 여과지 (Whatman #4)로 여액과 고형물을 분리하였다. 이 과정을 3번 반복한 후 고형물을 건조하여 40배 용량의 증류수에 충분히 녹인 뒤 100 ℃에서 3시간 동안 교반하면서 열수추출을 하였다. 여과지를 통해 여액을 회수한 후 건조하여 단백질을 제거하기 위해 0.5%의 농도로 증류수에 충분히 녹인 뒤 같은 용량의 10% 트리클로로아세트산 (TCA; Trichloroacetic acid)과 상온에서 24시간 동안 반응시켰다. 침전된 단백질을 제거하기 위해 반응물을 원심분리 (10,000 rpm, 30분)하여 상층액을 모두 회수하고 같은 용량의 디에틸에테르와 교반한 후 층 분리함으로서 pH를 중성으로 맞춤과 동시에 TCA를 제거하였다. 이에 3배 용량의 95% 에탄올을 첨가하여 4 ℃에서 24시간 동안 반응시킨 후 원심분리 (10,000 rpm, 30분)하여 침전물을 회수하였다. 감압농축기를 이용하여 침전물에 남아있는 에탄올을 모두 제거한 뒤 증류수에서 3일 동안 투석 (MWCO 1,000)하고 동결건조 하여 고분자 다당류를 얻었다. 잣 박 유래 조추출물 (PNE)는 약 1.4 g이 얻어졌으며 약 1.4%의 수율을 보였다(도 1 참조).
(2) 잣 박 유래 조추출물의 정제
실시예 1에 따른 잣 박 조추출물에서 다당류를 정제하기 위해 음이온 교환 칼럼크로마토그래피 (Anion exchange column chromatography)를 사용하였다. 10 mg의 잣 박 조추출물을 1 ml의 증류수에 충분히 녹인 뒤 DEAE-cellulose (3×22 cm)에 주입하고 증류수를 충분히 흘려주어 칼럼에 결합되지 않은 불순물을 모두 제거하고 난 뒤, NaCl (0~1 M)의 농도구배를 주어 칼럼에 결합된 다당류를 용출시켰다. 각각의 용출된 분획에서 페놀-황산법을 이용하여 당을 검출하였으며 당이 검출된 분획을 모아 증류수에서 3일 동안 투석 (MWCO 1,000)하고 동결건조 하였다. 잣 박 분획물(PNE-P1)은 약 6.2 mg이 얻어졌으며 약 0.8%의 수율을 보였다 (도 2 참조).
잣 박 유래 조추출물 (PNE)과 잣박 분획물(PNE-P1)의 화학적 조성 분석
PNE와 PNE-P1의 총 당 분석은 글루코오스를 표준물질로 하여 phenol-sulfuric acid 방법을 통해 490 nm에서 측정하였고, 우론산 분석은 글루쿠론산을 표준물질로 하여 카르바졸 분석법(carbazole assay)을 이용하여 550 nm에서 측정하였다. 단백질 분석은 소혈청 알부민을 표준물질로 하여 bradford assay를 통해 595 nm에서 확인하였다.
화학적 조성 분석 결과 하기 표 1과 같이, PNE의 총 당 함량은 약 31.11%, 우론산 함량은 25.65 %이며 단백질은 검출되지 않았다. PNE-P1의 총 당 함량은 약 45.80%, 우론산 함량은 32.53%이며 단백질은 검출되지 않았다.
| 시료 | 중성당(mg) | 우론산(mg) | 단백질(mg) |
| 잣박 조추출물(PNE) 1g | 31.11 ± 0.45 | 25.65 ± 0.01 | 불검출 |
| 잣박 분획물(PEN-P1) 1g | 45.80 ± 0.60 | 32.53 ±0.01 | 불검출 |
잣 박 유래 조추출물 (PNE)과 정제된 분획물 (PNE-P1)의 중성당 정성 및 정량 분석
PNE와 PNE-P1의 중성당 정성 및 정량 분석을 하기 위해 1% 용액으로 증류수에 녹인 후, 최종농도가 2 M이 되도록 트리플루오로아세트산 (TFA; trifluoroacetic acid)을 가하여 100℃에서 4시간 동안 반응하여 산 가수분해를 하고 Speed Vac.을 이용하여 시료를 건조시켰다. 건조된 시료를 100 μl의 증류수에 녹여 Bio-LC (LC 20 Chromatography Enclosure, Dionex, Co., USA)를 이용하여 HPAEC-PAD법으로 중성당을 확인하였다. 표준 중성당으로는 sigma (USA)사로부터 구입한 푸코오스(fucose), 람노오스(rhamnose), 아라비노오스(arabinose), 갈락토오스(galactose), 글루코오스(glucose), 만노오스(mannose), 자일로오스(xylose)를 사용하였다. 칼럼은 CarboPac PA1 (4×250 mm, Dionex, Thermo Scientific, USA)을 사용하였고 분석조건은 0.7 ml/min의 속도로 증류수와 200 mM의 NaOH로 농도구배를 가하면서 용출시켰다. 정성분석은 각 피크의 retention time (min) 값을 비교하였고, 정량은 Chromeleon software (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 피크 면적을 비교 분석하였다.
중성당 분석 결과, 조추출물 (PNE) 10 μg 당 아라비노오스, 글루코오스, 자일로오스, 갈락토오스, 람노오스가 각각 5490.90, 5773.93, 4225.09, 1344.84, 580.91 pmole이 존재하며 주된 당 성분은 아라비노오스, 글루코오스, 자일로오스인 것을 확인하였다. 정제된 분획물(PNE-P1)은 10 μg 당 아라비노오스, 글루코오스, 자일로오스, 갈락토오스, 람노오스가 각각 6676.25, 5443.22, 2984.78, 1668.58, 756.83 pmole로 존재하며 주된 당 성분은 아라비노오스와 자일로오스인 것으로 확인되었다(도 3 참조).
잣 박 유래 조추출물 (PNE)과 정제된 분획물 (PNE-P1)의 우론산 정성 및 정량 분석
PNE와 PNE-P1의 우론산 정성 및 정량 분석을 하기 위해 1% 용액으로 증류수에 녹인 후, 최종농도가 2 M이 되도록 트리플루오로아세트산 (TFA; trifluoroacetic acid)을 가하여 100℃에서 4시간 동안 반응하여 산 가수분해를 하고 Speed Vac.을 이용하여 시료를 건조시켰다. 건조된 시료를 100 μl의 증류수에 녹여 HPAEC-PAD법으로 우론산을 확인하였다. 표준 우론산으로는 sigma (USA)사로부터 구입한 갈락투론산과 글루쿠론산을 사용하였다. 칼럼은 CarboPac PA1 (4×250 mm, Dionex, Thermo Scientific, USA)을 사용하였고 분석조건은 0.5 ml/min의 속도로 600mM sodium acetate (in 100 mM NaOH)와 100 mM의 NaOH로 농도구배를 가하면서 용출시켰다. 정성분석은 각 피크의 retention time (min) 값을 비교하였고, 정량은 Chromeleon software (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 피크 면적을 비교 분석하였다.
우론산 분석 결과, PNE 10 μg 당 갈락투론산과 글루쿠론산이 각각 2436.82, 34.04 pmole로 존재하며 갈락투론산이 주된 우론산임을 확인하였으며 PNE-P1 10 μg 당 갈락투론산과 글루쿠론산이 각각 3351.24, 54.62 pmole로 존재하며 역시 주된 우론산은 갈락투론산인 것을 확인하였다(도 4 참조).
잣 박 유래 조추출물 (PNE)과 정제된 분획물(PNE-P1)의 분자량 측정
분말 형태의 PNE 및 PNE-P1의 분자량 측정은 HPLC를 이용하여 측정하였다. 분자량의 측정을 위해 사용한 HPLC는 미국 워터스사 (Waters Alliance HPLC 2695)의 제품을 사용하였다. 칼럼은 SB-showdex 804 HQ 칼럼을 사용하였으며, 이동상으로는 3차 증류수를 사용하였다. 분석 시 이동상의 속도는 0.7 ml/min 이었고, 표준물질로는 pullulan과 blue dextran (P-112 kDa, P-200 kDa, P-366 kDa, P-805 kDa, B-2000 kDa)을 사용하였다. PNE의 분자량은 PNE-1, PNE-2 순으로 1394, 705 kDa 이며, PNE-P1의 분자량은 PNE-P1-1, PNE-P1-2, PNE-P1-3 순으로 1274, 640, 307 kDa인 것으로 확인되었다(도 5 참조).
잣 박 유래 정제 분획물(PNE-P1)의 면역증강 효과
(1) PNE-P1 자극에 따른 대식세포의 세포 생존율 (cell viability) 측정
마우스 유래의 대식세포 (Raw 264.7)에서 PNE-P1의 세포독성 능력을 평가하기 위해 MTT (methylthiazolyldiphenyl tetrazolium bromide) assay를 하였다. 10% 소태아혈청 (FBS; fetal bovine serum, Gibco, USA)과 1% Penicillin-Streptomycin (10,000 Units /μg Penicillin, 10,000 μg/μl Streptomycin, Hyclone, USA)이 포함된 DMEM배양액 (Welgene, Korea)으로 세포를 배양하여 96웰 플레이트에 1×104 cells/ml의 밀도로 36℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 배양하고 나서 PNE-P1을 각 농도별 (PNE-P1 10, 25, 50, 100, 200 μg/ml)로 처리하고 다시 위와 같은 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 배양액을 모두 제거하고 인산완충식염수 (PBS; phosphate buffer saline, Hyclone, USA)에 MTT시약 (3-[4,5-dimethyl-thiazol]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, Roch, Germany)을 0.5% 농도로 용해시켜 배양액과 1:5로 섞은 다음 각 웰에 120 μl씩 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. MTT용액을 모두 제거한 후 세포가 형성한 자색 비수용성 포마잔을 디메틸설폭사이드 (DMSO; dimethyl sulfoxide, Daejung, Korea) 200 μl를 첨가하여 녹여내고 microplate reader (Molecular devices, UK)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
MTT 분석법으로 세포 생존율을 측정한 결과, PNE-P1의 농도가 증가할수록 세포 생존율이 증가하다가 감소하는 양상을 보였으며 대조군과 비교하여 보았을 때 유의적인 차이를 보이지 않아 PNE-P1의 세포에 대한 독성은 미미하거나 오히려 낮은 농도에서는 세포의 생장을 촉진시키는 것으로 확인되었다(도 6 참조).
(2) 질소산화물 (Nitrite)의 생산량 측정
PNE-P1의 질소산화물 생산량은 Griess assay에 따라 측정하였다. Raw 264.7 세포를 6-웰 플레이트에 1.25×105 cells/ml의 밀도로 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 배양하고 나서 PNE-P1을 (10, 25, 50, 100, 200 μg/ml) 처리하고 다시 위와 같은 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 그 후에, 각 농도별 배양액과 Griess 시약 (1% sulfanilamide in 5% H3PO4과 0.1% N-(1-Naphthyl)ethylene diamine dihydrochloride)을 1:1로 혼합하여 microplate reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
질소산화물 생산량 측정 결과, 대식세포에 PNE-P1을 처리하였을 때 질소산화물이 농도 의존적으로 생성되며 최고농도인 200 μg/ml에서 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 질소산화물이 약 14.5배 증가하였다. 따라서, PNE-P1이 대식세포에서 NO분비를 자극시켜 종양세포괴사, 바이러스 사멸 등의 면역작용을 유도한다는 것을 확인하였다(도 7 참조).
(3) 유도성 일산화질소 생산효소 (iNOS; inducible nitric oxide synthase)발현도 조사
PNE-P1의 iNOS 발현유도 정도는 RT-PCR (reverse transcriptation polymerase chain reaction)을 통해 확인하였다. Raw 264.7 세포를 6-well plate에 1.25×105 cells/ml의 밀도로 36℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 배양하고 나서 PNE-P1을 (10, 25, 50, 100, 200 μg/ml) 처리하고 다시 위와 같은 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 배양액을 모두 제거한 다음 각 웰을 인산완충식염수로 세척하고 트리졸 (Invitrogen, USA)을 1 ml씩 가하여 실온에서 30분간 세포를 용해시키고 나서 클로로포름 (Sigma, USA)을 200 μl씩 첨가하여 강하게 교반시킨 후 원심분리 (13,000 rpm, 15분)하였다. RNA가 포함되어 있는 상층액을 회수하여 총 RNA 추출 키트 (Intron Biotechnology, Korea)를 사용하여 RNA를 추출하였다. RNA 1 μg을 high capacity cDNA reverse transcription Kit (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하고 maxime PCR premix kit (Intron Biotechnology, Korea)에 cDNA 1 μl와 정방향 프라이머 (10 pmol/L, 5'-CTGCAGCACTTGGATCAGGAACCTG-3' : 서열번호 1), 역방향 프라이머 (10 pmol/L, 5'-GGGAGTAGCCTGGAACCTGA-3' : 서열번호 2)를 잘 혼합하여 PCR (denaturation 94℃, 30초; annealing 55℃, 30초; extention 72℃, 40초; 30 싸이클)을 하였다. PCR 산물을 전기영동을 통해 에티디움브로마이드 (EtBr; ethidium bromide, Sigma, USA)를 포함한 2% 아가로즈 겔 내에서 분자량에 따라 전개시키고 image station 4000MM (Kodak, USA)으로 밴드를 확인하였다. 발현강도는 imageJ (NIH, USA)프로그램을 통해 비교하였다.
PNE-P1 처리에 따른 대식세포의 iNOS 발현량 측정 결과, 농도에 따라 iNOS의 발현량이 증가하였으며 200 μg/ml에서 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때 약 2.3배 증가하였다. 이로서 PNE-P1이 대식세포의 iNOS 발현량을 증가시켜 NO생성을 유도하고 면역증강의 효과가 있음을 확인하였다(도 8 참조).
(4) 사이토카인의 생성량 측정
PNE-P1의 자극에 따른 대식세포의 사이토카인 생성량을 측정하였다. 사이토카인은 세포가 분비하는 모든 물질을 일컫는 말로 특히 선천성 면역, 항원 제시, 골수세포의 분화, 세포 모집 및 활성화, 세포부착분자 발현을 포함하는 면역 및 염증 반응에서 중요한 역할을 한다.
Raw 264.7 세포를 12-웰 플레이트에 6×104 cells/ml의 밀도로 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 배양하고 나서 PNE-P1을 (0.1, 1, 5, 10, 25, 50, 100 μg/ml) 처리하고 다시 위와 같은 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 그 후에, 각 농도별 배양액을 회수하고 ELISA kit (mouse TNF alpha platinum ELISA, Affymetrix, USA; mouse IL-6 duoset ELISA, R&D Systems, USA)를 사용하여 사이토카인 생성량을 조사하였다.
PNE-P1을 농도별로 처리하였을 때 농도 의존적으로 사이토카인 생성량이 크게 증가하였고 100 μg/ml에서 TNF-α와 IL-6양이 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 각각 약 14.6배, 84.1배 증가하였다. 특히, IL-6는 대표적인 면역반응 자극 물질로 사용되는 다당류인 LPS (lipopolysaccharide)를 대조구로 0.1μg/ml 처리했을 때 보다 PNE-P1 처리에서 더 많이 생산되는 것으로 보아 PNE-P1이 IL-6를 통해 림프구들의 분화와 활성을 유도하여 적응면역반응을 촉진하는 것으로 확인되었다(도 9 참조).
(5) 케모카인의 생성량 측정
PNE-P1의 자극에 따른 대식세포의 케모카인 생성량을 측정하였다. 케모카인은 호중구, 단핵구, 림프구, 호산구, 섬유아세포, 케라틴세포에서 주화성 (chemotaxis; 특정 화학물질에 반응하여 이동방향에 영향을 끼치는 성질)을 유도하는 작은 화학분자이다. 전염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokine)의 자극에 의해 분비된 케모카인은 림프구 (lymphocyte), 호중구 (neutrophil) 및 단핵구 (monocyte)를 감염부위로 유도하고 면역반응을 개시하여 염증을 치료하도록 한다.
Raw 264.7 세포를 12-웰 플레이트에 6×104 cells/ml의 밀도로 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 배양하고 나서 PNE-P1을 (0.1, 1, 5, 10, 25, 50, 100 μg/ml) 처리하고 다시 위와 같은 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 그 후에, 각 농도별 배양액을 회수하고 ELISA kit (murine RANTES ELISA kit, Peprotech, USA; murine MIP-1α ELISA kit, Peprotech, USA)를 사용하여 케모카인 생성량을 조사하였다.
PNE-P1을 농도별로 처리하였을 때 농도 의존적으로 케모카인 생성량이 기하급수적으로 증가하였고 100 μg/ml에서 RANTES와 MIP-1α양이 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 각각 약 25배, 26배 증가하였다. PNE-P1 처리가 LPS 대조구보다 케모카인의 생성량이 월등히 높았으며 이에 따른 뛰어난 면역세포 모집을 유도하였다.
잣 박 유래 정제된 분획물(PNE-P1)의 암세포 생장 억제 효과
(1) 세포 종류에 따른 잣박 분획물(PNE-P1)의 암세포 생장 억제 효과 측정
PNE-P1의 암세포 성장 억제 효과는 MTT assay에 따라 시험하였다. 인간 대장암 세포 (HCT 116), 마우스 피부암 세포 (B16F10). 인간 전립선암 세포 (PC-3), 인간 간암 세포 (HepG 2), 원숭이 신장표피 세포 (Vero)를 1×105 cells/ml의 밀도로 96-웰 플레이트에 24시간 동안 37℃, 5% CO2조건으로 배양하였다. PNE-P1을 각각 1, 10, 30, 50 μg/ml의 농도로 세포에 처리하였다. 72시간, 37℃, 5% CO2조건으로 배양한 후, 5 mg/ml 농도의 MTT 시약을 20 μl씩 첨가하여 4시간 동안 반응시켰다. 반응 후 200 μl의 디메틸설폭사이드를 첨가하여 형성된 포마잔을 모두 녹인 뒤 microplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
PNE-P1을 각각 1, 10, 30, 50 μg/ml의 농도로 처리 한 다양한 세포군 중에서 특이적으로 인간 간암 세포 (HepG 2)의 세포 생존율이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였으며, 50 μg/ml에서 약 77%의 세포성장 억제 효과를 보였고, 정상세포 (원숭이 신장표피 세포)에서는 어떠한 세포생존율 감소효과를 보이지 않았다(도 11 참조).
(2) 인간 간암 세포에 대한 잣 박 조추출물 (PNE) 및 정제된 분획물(PNE-P1)의 암세포 생장 억제 효과 측정
PNE-P1의 간암 세포 성장 억제 효과를 조추출물과 비교하기 위해 PNE 및 PNE-P1의 간암 세포 생장 억제 효과를 MTT assay에 따라 시험하였다. 인간 간암 세포 (HepG 2)를 1×105 cells/ml의 밀도로 96-웰 플레이트에 24시간 동안 37℃, 5% CO2조건으로 배양하였다. PNE 및 PNE-P1을 각각 1, 10, 30, 50 μg/ml의 농도로 세포에 처리하였다. 72시간, 37℃, 5% CO2조건으로 배양한 후, 5 mg/ml 농도의 MTT(3-[4,5-dimethyl-thiazol]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) 시약을 20 μl씩 첨가하여 4시간 동안 반응시켰다. 반응 후 200 μl의 디메틸설폭사이드를 첨가하여 형성된 포마잔을 모두 녹인 뒤 microplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 PNE-P1을 각각 1, 10, 30, 50 μg/ml의 농도로 처리 한 세포군의 생존율이 PNE를 각각의 농도로 처리한 세포군에 대조하여 훨씬 월등하게 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였으며, 50 μg/ml에서 PNE-P1은 약 77%의 세포성장 억제 효과를 보였고 PNE는 어떠한 세포생장 억제 효과를 보이지 않았다(도 12 참조).
(3) PNE 및 PNE-P1에 의한 간암 세포 모양 변화 측정
PNE-P1의 간암 세포 성장 억제 효과를 PNE와 비교하기 위해 PNE 및 PNE-P1의 간암 세포 생장 억제 효과를 세포 모양 변화를 관찰함으로써 측정하였다.
세포가 죽는 과정은 크게 두 가지 방법 즉, 세포사멸 (apoptosis)와 세포괴사 (necrosis)로 나뉠 수 있다. 그중 세포사멸 (apoptosis, programmed cell death)은 비정상 세포, 손상된 세포 및 노화된 세포가 스스로 자살해 사멸함으로써 전체적인 신체건강을 유지하게 해주는 중요한 메카니즘이다. 특히 암세포의 특징 중 한가지로 세포사멸 반응이 억제되어있는데, 특이적으로 암세포에만 세포사멸을 유도함으로써 암을 치료하고자 하는 노력이 늘고 있는 추세이다. 세포사멸의 과정은 세포가 축소되면서 시작되는데 이후 인접하는 세포사이에 틈새가 생기고 세포사멸 특이적 단백질이 활성화 되며 유전물질인 DNA가 규칙적으로 절단되면서 진행된다. 따라서 PNE-P1이 세포사멸 (apoptosis) 과정을 통해 암세포의 생장을 저해하는지 확인하기 위하여 PNE 및 PNE-P1을 처리한 세포모양을 위상차현미경을 이용하여 관찰하였다.
PNE 및 PNE-P1이 세포 모양 변화에 미치는 영향을 조사하기 위하여 HepG 2 세포를 6-웰 세포 배양 플레이트에 24시간 동안 배양 한 뒤 농도별로 제조한 PNE 및 PNE-P1 (0, 20, 50 μg/ml)을 처리하고 48시간 동안 더 배양하였다.
그 결과 PNE (20 및 50 μg/ml)를 처리한 군은 대조군에 비하여 뚜렷한 세포모양의 변화를 관찰 할 수 없었지만 PNE-P1 (50 μg/ml)을 처리한 군은 대조군에 비하여 확연한 세포모양의 변화를 관찰할 수 있었다. 따라서 PNE-P1이 PNE와 다르게 세포를 축소시킴으로서 세포사멸을 유도하는 것을 확인하였다(도 14 참조).
잣 박 유래 정제된 분획물(PNE-P1)의 간암 세포 사멸 기전 조사
PNE-P1의 간암 세포 사멸 기전을 조사하기 위해 인간 간암 세포에 대해 카스파제 (cysteinyl-aspartate-specific protease) 및 PARP[Poly (ADP-ribose) polymerase] 신호 전달에 의한 세포 사멸 기전을 웨스턴 블롯 방법으로 조사하였다.
인간 간암 세포 (HepG 2)를 6-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하고 다당류를 1, 10, 30, 50 μg/ml의 농도로 세포에 처리 후, 48시간 동안 배양하였다. 48시간 배양 후 PBS로 세척하고 1,400 rpm에서 5분 동안 원심분리 하여 세포를 획득하였다. 침전된 세포에 50 μl의 용해 버퍼(lysis buffer)를 첨가한 후, 30분 동안 얼음 상에서 반응시키고, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 하여 단백질을 획득하였다. Bradford 분석법을 이용하여 단백질을 정량 후 loading dye를 넣고 95oC에서 5분 동안 변성 시킨 뒤에 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 겔을 이용하여 전기영동 하였다. 전기영동 후 nitrocellulose 막에 옮긴 후, 1차 항-cleaved caspase 9 항체, 항-cleaved caspase 3 항체, 항-cleaved PARP 항체, 항-베타 액틴 항체 (1:500-1000)를 5% 탈지분유 (skim milk)에 각각의 비율로 희석하여 nitrocellulose막에 넣고 4oC에서 24시간 반응시켰다. TBST (TBS, 0.1% Tween 20)로 10분마다 3번 세척하고 HRP (horseradish peroxidase)-conjugated 2차 항체를 5% 탈지분유에 1:2000으로 희석한 후 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 위와 같은 방법으로 TBST를 이용하여 3차례 세척한 후 ECL (Enchanced Chemiluminescence) 기질 용액을 막에 1분 동안 반응시킨 후에 X-ray 필름에 현상하였다.
세포사멸 (apoptosis)의 핵심 단백질인 카스파제는 단백질이 잘림으로서 세포 모양 변화, DNA 조각 및 PARP 활성화를 유도하는 것으로 알려져 있다. PNE-P1을 이용하여 cleaved caspase 9 및 3의 발현 양을 조사해 보았을 때 세포에 처리한 PNE-P1의 농도가 증가할수록 발현양이 증가하였다. 세포사멸 (apoptosis)의 특징적인 지표 이면서 핵 효소 (nuclear enzyme)인 PARP[Poly (ADP-ribose) polymerase]가 세포에 처리한 PNE-P1의 농도가 증가할수록 발현양이 증가하는 것을 확인 하였다. (도 15)
잣 박 유래 정제된 분획물(PNE-P1)에 의한 간암 세포 내 미토콘드리아 기능장애 조사
미토콘드리아의 기능장애는 미토콘드리아 막의 전위차가 상실함으로서 발생하는데 이는 사이토크롬 C를 세포질로 방출하여 Apaf1, 카스파제9 과 아팝토좀 (apoptosome)을 형성하여 세포사멸 (apoptosis)를 유발하는 것으로 알려져 있다.
(1) PNE-P1에 의한 암세포 내 미토콘드리아 막전위 변화 측정
PNE-P1에 의하여 간암 세포 (HepG 2)의 미토콘드리아 막전위가 상실하였는지를 측정하기 위하여 JC-1 (5,5',6,6'-tetrachloroc-1,1',3,3'tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide) 미토콘드리아 막 전위 측정 키트를 이용하였다. 인간 간암 세포를 1×105 cells/ml의 밀도로 96-웰 플레이트에 24시간 동안 37℃, 5% CO2조건으로 배양하였다. 배양 후 PNE-P1을 1, 10, 30, 50 μg/ml의 농도로 세포에 처리 후 48시간 배양하였다. 배양 후 JC-1을 100 μl씩 각 웰에 처리한 다음 30분 동안 37℃에서 배양한 뒤에 형광광도계를 이용하여 빨강 형광은 excitation 550 nm, emission 600 nm에서 형광광도를 측정하였고 초록 형광은 형광 excitation 485 nm, emission 535 nm에서 형광광도를 측정하였다. 빨강 형광은 살아있는 모든 세포에서 측정되고, 초록 형광은 세포사멸 (apoptosis)로 죽은 세포에서 측정된다.
따라서 빨강 형광과 초록형광의 비율로서 미토콘드리아의 막 전위 붕괴정도를 확인 할 수 있는데 도 16에서 보는 바와 같이 대조군에 비해 PNE-P1을 1, 10, 30, 50 μg/ml 처리하였을 때 미토콘드리아 막전위가 각각 3%, 10%, 14%, 18% 감소한 것을 확인 할 수 있다(도 15 참조). 이는 PNE-P1에 의해 간암 세포의 미토콘드리아 막전위가 붕괴됨을 시사한다.
(2) PNE-P1에 의한 간암 세포 내 Bax 단백질 발현량 변화 측정
세포사멸과정에서 중요한 역할을 하는 Bax 단백질은 미토콘드리아의 기능장애를 유발한다. Bax 단백질은 세포질에 존재하다가 DNA 손상 등 스트레스가 전해지면 미토콘드리아의 외막으로 이동하여 투과도를 유발해 막전위를 상실케 한다. 따라서 PNE-P1에 의한 간암 세포 (HepG 2)의 미토콘드리아 막전위 상실이 Bax 단백질에 의해 유도되었는지 확인하기 위하여 Bax 단백질의 발현량 변화를 웨스턴 블롯 방법으로 조사하였다.
인간 간암 세포 (HepG 2)를 6-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하고 PNE-P1을 1, 10, 30, 50 μg/ml의 농도로 세포에 처리 후, 48시간 동안 배양하였다. 48시간 배양 후 PBS로 세척하고 1,400 rpm에서 5분 동안 원심분리 하여 세포를 획득하였다. 침전된 세포에 50 μl의 용해 버퍼 (lysis buffer)를 첨 후, 30분 동안 얼음 상에서 반응시키고, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 하여 단백질을 획득하였다. Bradford 분석법을 이용하여 단백질을 정량 후 loading dye를 넣고 95℃에서 5분 동안 변성 시킨 뒤에 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 겔을 이용하여 전기영동 하였다. 전기영동 후 니트로셀룰로오스 막에 전달한 후, 1차 항-Bax 항체, 항-베타 튜불린 항체 (1:500-1000)를 5% 탈지분유 (skim milk)에 각각의 비율로 희석하여 nitrocellulose막에 넣고 4℃에서 24시간 반응시켰다. TBST (TBS, 0.1% Tween 20)로 10분마다 3번 세척하고 HRP (horseradish peroxidase)-conjugated 2차 항체를 5% 탈지분유에 1:2000으로 희석한 후 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 위와 같은 방법으로 TBST를 이용하여 3차례 세척한 후 ECL (Enchanced Chemiluminescence) 기질 용액을 막에 1분 동안 반응시킨 후에 X-ray 필름에 현상하였다.
PNE-P1을 이용하여 Bax 발현 양을 조사해 보았을 때 세포에 처리한 PNE-P1의 농도가 증가할수록 발현양이 현저하게 증가하였다. 따라서 PNE-P1에 의한 암세포 내 미토콘드리아 막전위 붕괴는 Bax 단백질이 활성화됨에 따라 유도됨을 확인하였다(도 16 참조).
종합하여 잣 박으로부터 열수추출 후 에탄올 침전으로 분리, 정제되어 얻어진 PNE-P1은 주된 당 성분이 아라비노오스와 자일로오스이고 갈락투론산을 포함하는 다당류이며 대식세포에 대한 세포독성이 낮으면서 iNOS 발현량을 증가시켜 NO 생성을 유도하는 동시에 사이토카인과 케모카인의 생성량도 대량 증가시킴으로써 면역증강 활성을 갖는다. 또한, 상기 다당류는 인간 간암 세포 (HepG 2)에서 미토콘드리아의 막 전위 상실을 유도하면서 카스파제 9, 카스파제 3, PARP의 활성화 및 Bax의 발현을 촉진하여 세포사멸을 일으키는 간암에 대한 항암활성을 지닌 천연생리활성물질인 것으로 확인되었다.
본 발명은 산업적 이용 가능성이 낮아 땔감으로만 사용하던 잣박의 간암의 예방 및 치료 효과를 확인하여, 잣박 추출물을 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 잣박 추출물은 세포에 대한 세포독성을 갖지 않으면서, 간암 세포주의 생장 억제 효과가 뛰어나 산업상 이용 가능성이 높다.
Claims (11)
- 잣박 조추출물을 음이온 교환 칼럼크로마토그래피로 용출시킨 잣박 분획물을 유효성분으로 포함하고,
상기 잣박 분획물은 갈락투론산(galacturonic acid), 글루쿠론산(galacturonic acid)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 우론산(uronic acid) 및 아라비노오스(arabinose), 글루코오스(glucose), 자일로오스(xylose), 갈락토오스(galactose) 및 람노오스(rhamnose)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 중성당을 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 상기 잣박 분획물이 0.01 내지 50 μg/ml 농도로 포함됨을 특징으로 하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 잣박 조추출물은 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 트리클로로아세트산, 디에틸에테르, 물 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출된 것을 특징으로 하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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- 제1항에 있어서, 상기 잣박 분획물은 일산화질소(NO)의 생성 증가 효과; 유도성 일산화질소 생산효소(iNOS, inducible nitric oxide synthase) 발현 증가 효과; 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 유전자 발현 증대 효과; 및 케모카인 RANTES(regulated on activation, normal T cell expressed and secreted) 및 MIP-1α(macrophage inflammatory protein 1-α)의 생성 증가 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- (a) 잣 박에 유기용매를 첨가하여 기름을 제거하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 기름이 제거된 잣박을 열수 추출하는 단계;
(c) 상기 (b)단계에서 얻어진 잣박 열수 추출물로부터 단백질을 제거하는 단계;
(d) 상기 (c)단계에서 얻어진 추출물에 알코올 용매를 처리한 후, 증류수에서 투석하여 잣박 조추출물을 수득하는 단계; 및
(e) 상기 (d)단계에서 수득된 잣박 조추출물을 음이온 교환 칼럼크로마토그래피로 용출시켜 잣박 분획물을 수득하는 단계를 포함하고,
상기 잣박 분획물은 갈락투론산(galacturonic acid), 글루쿠론산(galacturonic acid)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 우론산(uronic acid) 및 아라비노오스(arabinose), 글루코오스(glucose), 자일로오스(xylose), 갈락토오스(galactose) 및 람노오스(rhamnose)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 중성당을 포함하는 간암의 예방 및 치료용 잣박 분획물의 제조 방법.
- 잣박 조추출물을 음이온 교환 칼럼크로마토그래피로 용출시킨 잣박 분획물은 갈락투론산(galacturonic acid), 글루쿠론산(galacturonic acid)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 우론산(uronic acid) 및 아라비노오스(arabinose), 글루코오스(glucose), 자일로오스(xylose), 갈락토오스(galactose) 및 람노오스(rhamnose)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 중성당을 포함하는 간암의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 잣박 조추출물을 음이온 교환 칼럼크로마토그래피로 용출시킨 잣박 분획물을 유효성분으로 포함하고,
상기 잣박 분획물은 갈락투론산(galacturonic acid), 글루쿠론산(galacturonic acid)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 우론산(uronic acid) 및 아라비노오스(arabinose), 글루코오스(glucose), 자일로오스(xylose), 갈락토오스(galactose) 및 람노오스(rhamnose)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 중성당을 포함하는 간암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 제10항에 있어서, 상기 식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 간암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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