JP6082488B1 - カルボキシル基により酸性になったｐａｋ１遮断剤のエステル体の調製および癌やその他のｐａｋ１依存性疾患治療への応用 - Google Patents
カルボキシル基により酸性になったｐａｋ１遮断剤のエステル体の調製および癌やその他のｐａｋ１依存性疾患治療への応用 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】ＤＮＡ毒や微小管毒を主体とするいわゆる化学療法剤（ケモ）や放射線療法に耐性の癌など一連のＰＡＫ１依存性疾患の治療に有益な細胞透過性が高くかつ水溶性の（腸管吸収が良い）一連の新たなＰＡＫ１遮断エステル体やその用途を提供する。【解決手段】式（１）で表される１，２，３−トリアゾール環を有する化合物、或いはこの化合物の薬学的に許容される塩及びこれらを含有する医薬、ＰＡＫ１遮断剤、ＰＡＫ１依存性疾患の治療剤、化学療法又は放射線治療による癌細胞の耐性軽減剤、癌細胞の増殖・転移予防剤、ＰＡＫ１依存性疾患の薬物療法による耐性軽減剤、化粧料。（Ｒ１はカルボキシル基により酸性になったＰＡＫ１遮断剤由来の脱カルボキシル体；Ｒ２は芳香族環誘導体）【選択図】なし
Description
本発明は、カルボキシル基により酸性になったＰＡＫ１遮断剤のエステル体の調製および癌やその他のＰＡＫ１依存性疾患治療への応用に関する。
（外科手術に加えて）従来のいわゆる化学（ＤＮＡ毒や微小管毒）療法および放射線療法が今日まで、「癌」治療法の主流をなしてきたが、これらの療法には、残念ながら、不可避な一連の副作用が伴う。例えば、免疫機能の低下、脱毛、食欲の低下、生殖不能などが必ず伴う。その主要原因は、これらの薬剤や放射線が、癌細胞を含む増殖の早い細胞を標的としているため、正常な細胞でも比較的増殖の早い、骨髄などの造血細胞、頭髪細胞、腸管細胞、生殖細胞などがその犠牲（巻添え）になるからである。もう一つの障壁は、（遺伝子の変異に伴い）癌細胞が治療期間中に薬剤耐性をしばしば獲得することである。例えば、（ＤＮＡを標的とする）抗癌剤「シスプラチン」や（微小管を標的とする）抗癌剤「タキソール」などに対する耐性が、ＮＳＣ肺癌や乳癌などの治療の失敗の主因に挙げられている。
その解決策として、２１世紀初頭に登場したのが、癌のいわゆる「分子標的療法」である。厳密には、「シグナル伝達（遮断）療法」と呼ぶべきであろう（非特許文献１）。この療法は（従来の標的であったＤＮＡや微小管などの「非特異的な」分子の代わりに）癌の増殖には必須であるが、正常細胞の増殖には必ずしも必須でない（発癌性の）「シグナル伝達蛋白」を特異的に標的に絞る療法である。その先駆けを果たしたのが、「グリーベック」と呼ばれる特定の発癌性チロシンキナーゼ「ＡＢＬ」を標的にした阻害剤である。この薬剤により、ＣＭＬやＧＩＳＴなどの稀少癌の治療が可能になった。しかしながら、この薬剤が有効な癌は、ヒトに発生する癌のわずかの０.１％にも達しない。更に、この薬剤に耐性のＣＭＬやＧＩＳＴの患者がやがて続出した。
そこで、更に研究が進められた結果、最近、ＰＡＫ１ (RAC/CDC42-activated kinase 1) と呼ばれるセリン／スレオニンを燐酸化する蛋白キナーゼが、発癌性を持つばかりではなく、老化現象にも深く関与するいわゆる「悪玉酵素」であり、癌や認知症などを含む一連の難病の原因になっていることが判明した（非特許文献１、２）。しかも、ＰＡＫ１は正常な細胞の増殖には必須ではないばかりか、薬剤耐性の主因がＰＡＫ１の異常な活性化であることも明らかになった（非特許文献１、２）。少なくとも大部分の固形腫瘍の増殖および転移がＰＡＫ１依存性である。こうして、「ＰＡＫ１遮断剤による様々な難病の療法」という極めて魅力的な（市場価値の高い）アプローチが登場してきた。
ＰＡＫ１の主な基質蛋白として、発癌性／老化促進キナーゼであるＲＡＦやＬＩＭ キナーゼ、発癌性の転写蛋白「ベータカテニン」や長寿転写蛋白「ＦＯＸＯ」などが知られている。ＲＡＦ、ＬＩＭ キナーゼ、ベータカテニンなどはＰＡＫ１によって活性化されるのに対して、ＦＯＸＯはＰＡＫ１によって抑制される。
さて、従来のＰＡＫ１遮断剤の開発は、ＰＡＫ１を直接かつ選択的に阻害する物質 (ＰＡＫ１特異阻害剤) を試験管内でスクリーニングする方法が主流であった。しかしながら、この方法では、ＰＡＫ１だけを選択的に阻害する物質を見つけることは、殆んど不可能に近いことが次第に判明した。その理由は、ＰＡＫファミリーに属する６種類の蛋白キナーゼ（ＰＡＫ１〜ＰＡＫ６) の中、グループ１に属する３種のキナーゼ（ＰＡＫ１〜ＰＡＫ３) の「ＡＴＰ結合ポケット」の立体構造が互いに極めて近似しているため、ＰＡＫ１のみを選択的に阻害することは至難の術である。しかも、試験管内でスクリーニングにかかった阻害剤の大部分は、水に不溶で、しかも細胞透過性が極めて低いため、臨床には応用しにくい。
そこで、我々は逆に、ＰＡＫ１のみを細胞内で選択的に活性化するシグナル伝達経路を同定し、その経路（ＰＡＫ１の上流）の一つを特異的に遮断する（細胞透過性が高い）薬剤を、「細胞培養系」でスクリーニングする先見的なアプローチを過去十数年とってきた。細胞内でのＰＡＫ１の活性化には、いくつかの因子が関与している。先ず、発癌性のＧ蛋白（ＧＴＰ依存性のシグナル蛋白）であるＲＡＣやＣＤＣ４２が必須である。その他、少なくとも３種類のチロシン＝キナーゼ（ＥＴＫ、ＦＹＮ、ＪＡＫ２）およびカゼイン＝キナーゼの一種（ＣＫ２）も必須である。更に、ＰＩＸやＮＣＫなどのいわゆるアダプター蛋白も必須である（非特許文献１、２）。
言い換えれば、もし、これらＰＡＫ１の上流にあるシグナル蛋白の一つか２つが「ＰＡＫ１遮断剤」と総称される化合物によって、直接阻害されると、ＰＡＫ１の発癌作用が完全に阻止されることになる。例えば、化合物「ＡＧ８７９／ＧＬ−２００３」はＥＴＫを直接阻害する一方、化合物「ＰＰ１」はＦＹＮを直接阻害する（非特許文献１〜３）。さて、ＥＴＫとＦＹＮは独立に、然も相補的にＰＡＫ１を活性化する（非特許文献１〜３）。従って、これら２種類の遮断剤を併用すると、細胞内でのＰＡＫ１の活性化が完全に抑制される結果、（マウスに移植された）スイゾウ癌などを含む大部分のヒト由来の固形癌／腫瘍の増殖が殆んど完全にストップする（非特許文献３）。しかも、何らの副作用も示さない。しかしながら、「ＰＰ１」は水に不溶性なので、臨床には使用できないため、我々は一連の水溶性誘導体（例えば、「ＰＰ１２」）を目下開発しつつあるが、これまで開発されたいくつかの「ＰＡＫ１遮断剤」で、癌一般の治療へ使用がＦＤＡによって許可されたものはまだ一例もない（非特許文献２）。
丸田 浩 (2001).「癌との闘い: "シグナル" 療法と "遺伝子" 療法」(共立出版)
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多くのＰＡＫ１遮断剤、特に天然のＰＡＫ１遮断剤の中に、カルボン酸を有する酸性の化合物が多数ある。これらの酸は水には比較的溶けやすいが、（酸同志の反発により）酸性の細胞膜（燐脂質）を通過しにくいので、試験管内では、標的であるＰＡＫ１自身、あるいはその上流にあるシグナル伝達蛋白に対する親和性はたとえ強くとも、体内（あるいは細胞内）では薬理（ＰＡＫ１遮断）作用が弱いという欠点がある。これらの酸性の薬剤を臨床に応用するためには、その欠点を補うために、水溶性（腸管吸収の良さ）をそのまま保ったまま、その酸性度を飛躍的に弱めるという「トリック」が必要である。
本発明者らは、このようなトリックを見出すことを本発明の課題とした。
本発明者らは上記課題の解決策として、バリー=シャープレス教授(２００１年のノーベル受賞者）が世に広く普及した「クリックケミストリー（Click Chemistry）」と呼ばれる化学反応を応用することにたどり着いた。
そして、本発明者らは、カルボン酸を有するいくつかのＰＡＫ１遮断剤（プロポリスの抗癌成分あるいは鎮痛剤など）のカルボン酸基はＰＡＫ１遮断作用には不要であることを発見し、これをクリックケミストリーにより、カルボン酸を有するいくつかのＰＡＫ１遮断剤（プロポリスの抗癌成分あるいは鎮痛剤など）から、細胞透過性の極めて高い一連の１,２,３−トリアゾール環を有するエステルが得られることを見出した。
そして、これにより得られるエステルは、細胞透過性および（細胞内の）ＰＡＫ１遮断作用が飛躍的（１００〜５００倍）に増し、しかも（経口投与に適した）水溶性の薬剤となることを見出した。
すなわち、本発明は、一般式（１）
（ただし、式（１）中、Ｒ１はカルボキシル基により酸性になったＰＡＫ１遮断剤由来の脱カルボキシル体を示し、Ｒ２は芳香族環誘導体を示す。）で表される化合物、あるいはこの化合物の薬学的に許容される塩である。
また、本発明は、上記化合物、あるいはこの化合物の薬学的に許容される塩を含有することを特徴とする医薬、ＰＡＫ１遮断剤、ＰＡＫ１依存性疾患の治療剤、化学療法または放射線治療による癌細胞の耐性軽減剤、癌細胞の増殖・転移予防剤、ＰＡＫ１依存性疾患の薬物療法による耐性軽減剤、化粧料である。
更に、本発明は、以下の工程（ａ）および（ｂ）
（ａ）カルボキシル基により酸性になったＰＡＫ１遮断剤と、アルコールとを反応させる工程
（ｂ）上記（ａ）で得られた反応物と、水溶性の１,２,３−トリアゾール誘導体とを反応させる工程を含むことを特徴とする上記化合物、あるいはこの化合物の薬学的に許容される塩の製造方法である。
（ａ）カルボキシル基により酸性になったＰＡＫ１遮断剤と、アルコールとを反応させる工程
（ｂ）上記（ａ）で得られた反応物と、水溶性の１,２,３−トリアゾール誘導体とを反応させる工程を含むことを特徴とする上記化合物、あるいはこの化合物の薬学的に許容される塩の製造方法である。
「クリックケミストリー」自体は２００１年頃に、バリー＝シャープレス教授（ノーベル受賞者）により、銅触媒を利用した効率良いカップリング反応として、初めて紹介された。問題は、何と何をカップリングさせると飛躍的な効果をもたらすかである。最高に近いパートナーの選択が、本発明（特許）の主な「目玉賞品」である。更に、動物実験を除いては、ＰＡＫ１遮断剤を、癌やその他一連の「ＰＡＫ１依存性疾患」の治療に（臨床的に）広く応用した前例は皆無に等しい。従って、本発明は、臨床に応用しうる（副作用のない）新しい治療法を提供するという意味でも、極めてユニークである。
また、本発明は数種のカルボキシル基により酸性になったＰＡＫ１遮断剤、例えば、化学的全合成が容易なＡＲＣ（artepillin C）、コーヒー酸（caffeic acid）、ケトロラック（Ketorolac）、カプトプリル（(2S)-1-[(2S)-2-methyl-3-sulfanylpropanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid）、ＭＦＦ（Mimosine-Phe-Phe）、クロセチンモノエステル、ＣＸ−４９４５（5-(3-Chloroanilino)benzo[c][2,6]naphthyridine-8-carboxylic acid：Silmitasertib）、ＣＤＤＯ（ＴＰ１５１）（2-cyano-3,12-dioxooleana-l,9(ll)-dien-28-oic acid）等を原料とする１,２,３−トリアゾール環を有する水溶性かつ細胞透過性の極めて高いエステルである。具体的には、原料のＰＡＫ１遮断剤の癌細胞の増殖に対するＩＣ５０は１〜１００μＭであるが、簡単な（収率の高い）トリアゾール環カップリング反応によって、その細胞透過性が（原料化合物や標的細胞の種類によって）１００〜１０００倍に飛躍した。
更に、本発明者らの研究によれば、ＰＡＫ１は老化現象にも深く関与しており、ＰＡＫ１遺伝子を欠如した健康なセンチュウは野生株にくらべて５０％以上長生きする（非特許文献２）。その上、ＰＡＫ１はメラニン色素の合成や脱毛現象にも必須である（非特許文献４、５）。従って、これら細胞透過性の高いアゾエステル化合物は（医薬品ばかりではなく）美白作用や育毛作用を持つ化粧品にも使用しうる。
また更に、本発明では、「クリックケミストリー」と呼ばれる銅触媒を使用した収率の高いカップリング反応を利用して、わずか２ステップで、水溶性の１,２,３−メチレン−トリアゾール環を有するアルコールによるエステル化ができる。
本発明の化合物は、下記一般式（１）で示されるものである。
上記式（１）中、Ｒ１はカルボキシル基により酸性になったＰＡＫ１遮断剤由来の脱カルボキシル体を示す。酸性のＰＡＫ１遮断剤は、特に限定されないが、例えば、アルテピリンＣ、コーヒー酸、（Ｒ）−ケトロラック、カプトプリル、クロセチンモノエステル、ＣＤＤＯ（ＴＰ１５１）、ＣＸ−４９４５、ＭＦＦ、ロズマリン酸、ニコチン酸等が挙げられる。これらの酸性のＰＡＫ１遮断剤の中でも（Ｒ）−ケトロラックが最も好ましい。
また、上記式（１）中、Ｒ２は芳香族環誘導体を示し、好ましくはｏ−フェノール、ｏ−メトキシベンゼン、ｏ−アニリン、ｏ−アルギニンフェニルエステル、ｏ−アミノヘキシルベンゼン等の化合物の脱水素体を示す。これらの芳香族環誘導体の中でもｏ−メトキシベンゼンの脱水素体が最も好ましい。
更に、上記式（１）の化合物の薬学的に許容される塩とは、例えば、塩酸塩等である。
上記式（１）の化合物、あるいはこの化合物の薬学的に許容される塩は、例えば、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含むことにより製造することができる。
（ａ）カルボキシル基により酸性になったＰＡＫ１遮断剤と、アルコールとを反応させる工程
（ｂ）上記（ａ）で得られた反応物と、水溶性の１,２,３−トリアゾール誘導体とを反応させる工程
（ａ）カルボキシル基により酸性になったＰＡＫ１遮断剤と、アルコールとを反応させる工程
（ｂ）上記（ａ）で得られた反応物と、水溶性の１,２,３−トリアゾール誘導体とを反応させる工程
上記工程（ａ）に用いられるカルボキシル基により酸性になったＰＡＫ１遮断剤は、特に限定されないが、例えば、アルテピリンＣ、コーヒー酸、（Ｒ）−ケトロラック、カプトプリル、クロセチンモノエステル、ＣＤＤＯ（ＴＰ１５１）、ＣＸ−４９４５、ＭＦＦ、ロズマリン酸、ニコチン酸等が挙げられる。
また、工程（ａ）に用いられるアルコールも特に限定されないが、例えば、プロパルギルアルコール等が挙げられる。
この工程（ａ）において、カルボキシル基により酸性になったＰＡＫ１遮断剤と、アルコールとの反応は特に限定されず、例えば、酸性のＰＡＫ１遮断剤と、アルコールとを適量で混合し、ＥＤＣ、ＤＭＡＰ等の溶媒の存在下、室温程度で反応させればよい。この反応により、酸性のＰＡＫ１遮断剤のカルボキシル基をエステル化した化合物が得られる。反応後は、公知の精製方法で精製を行ってもよい。
上記工程（ｂ）に用いられる水溶性の１,２,３−トリアゾール誘導体は、特に限定されないが、例えば、２−アジドアニソール等が挙げられる。
上記（ａ）で得られた反応物（カルボキシル基により酸性になったＰＡＫ１遮断剤のカルボキシル基をエステル化したもの）と、水溶性の１,２,３−トリアゾール誘導体とを適量で混合し、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム等の還元剤と、硫酸銅無水物等の銅触媒の存在下、室温程度で反応させればよい。この反応により、工程（ａ）で得られた化合物のエステル部分が１,２,３−トリアゾール誘導体となったエステルが得られる（式（１）の化合物）。反応後は、公知の精製方法で精製を行ってもよい。
また、上記で得られた式（１）の化合物は、公知の方法により、例えば、塩酸塩等の薬学的に許容される塩とすることができる。
上記で製造される式（１）の化合物、あるいはこの化合物の薬学的に許容される塩は、ＮＭＲ等の公知の測定方法により、容易にその生成を確認することができる。
上記した本発明の式（１）の化合物およびこの化合物の薬学的に許容される塩は、原料となるＰＡＫ１遮断剤と同様の用途に用いることができる。具体的には、ＰＡＫ１遮断剤、ＰＡＫ１依存性疾患の治療剤、化学療法または放射線治療による癌細胞の耐性軽減剤、癌細胞の増殖・転移予防剤、ＰＡＫ１依存性疾患の薬物療法による耐性軽減剤等に用いることができる。なお、式（１）の化合物およびこの化合物の薬学的に許容される塩は癌細胞の増殖を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）が２５〜２５０ｎＭと極めて低いため、癌等の腫瘍と関連する疾患の治療に用いることが好ましい。
上記ＰＡＫ１依存性疾患としては、例えば、固形腫瘍、認知症、パーキンソン氏病、癲癇、炎症、感染症、糖尿病（２型）、高血圧、肥満症、鬱病、統合失調症、自閉症、頭痛、骨粗しょう症、過度の色素沈着、脱毛症等が挙げられる。
上記固形腫瘍としては、例えば、膵臓癌、大腸癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮癌、悪性脳腫瘍、良性脳腫瘍、多発性骨髄腫等が挙げられる。
上記の各種治療剤等には、更に「相乗効果」を狙って、他の既に市販（あるいは開発途上）のＰＡＫ１遮断剤（例えば、ＣＴＣＬ治療薬「ＦＫ２２８」、ＭＳ治療薬「ＦＴＹ７２０」、認知症薬「Ｅ２０２０」、胃潰瘍薬「セルベックス」、プロポリス「Ｂｉｏ ３０」、ＦＹＮ阻害剤「ＰＰ１２」など）を適量添加してもよい。
上記治療剤等の剤形は、特に限定されないが、例えば、錠剤、カプセル、粉薬等の経口投与用の剤形や、軟膏、クリーム等の皮膚投与用の剤形等が挙げられる。経口投与用の剤形の場合、本発明の式（１）の化合物、あるいはこの化合物の薬学的に許容される塩を、例えば、１日分として、１〜１０ｍｇ含有させればよい。また、皮膚投与用の剤形の場合、本発明の式（１）の化合物、あるいはこの化合物の薬学的に許容される塩を、例えば、１日分として、０.１〜１ｍｇ／ｍｌで含有させればよい。特に、局所の炎症や痛みを抑えたり、ＮＦ１患者の皮膚に多発する良性腫瘍（いわゆる「ブク」）の増殖を抑えたりする目的の場合には、皮膚投与用の剤形が好ましい。
また、上記治療剤等は、臨床用ばかりではなく、犬や猫などのペット、あるいは馬や牛などの家畜の治療にも用いることができる。
更に、本発明の式（１）の化合物およびこの化合物の薬学的に許容される塩は、化粧料等にも用いることができる。具体的な化粧料の用途としては、特に限定されないが、例えば、美白用、育毛促進用等である。
化粧料の剤形は、特に限定されないが、例えば、クリーム、ローション、化粧水等の外用の剤形が挙げられる。これらの剤形の場合、本発明の式（１）の化合物、あるいはこの化合物の薬学的に許容される塩を、例えば、０.１〜１ｍｇ／ｍｌで含有させればよい。
以下、本発明を製造例および実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれら製造例および実施例に何ら限定されるものではない。
［製造例１］
アルテピリンＣ（ARC）の1,2,3-methylene-Triazolylエステル（AzoARCあるいはPRC-15A）の調製：
＜ステップａ＞
化合物１（アルテピリンＣ １６１ｍｇ（５３６μｍｏｌ））のプロパルギルアルコール（６ｍｌ）溶液に０℃でＥＤＣ（１００μｌ（５６７μｍｏｌ））とＤＭＡＰ（１７ｍｇ（１３９μｍｏｌ））を加えた。室温で反応液をＴＬＣで追跡しながら約１日かけて原料が消えるまで撹拌した。撹拌を止め、反応液を減圧留去し、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）して化合物２（１００ｍｇ（２９５μｍｏｌ））を収率５５％、淡黄色固体の状態で得た。
アルテピリンＣ（ARC）の1,2,3-methylene-Triazolylエステル（AzoARCあるいはPRC-15A）の調製：
＜ステップａ＞
化合物１（アルテピリンＣ １６１ｍｇ（５３６μｍｏｌ））のプロパルギルアルコール（６ｍｌ）溶液に０℃でＥＤＣ（１００μｌ（５６７μｍｏｌ））とＤＭＡＰ（１７ｍｇ（１３９μｍｏｌ））を加えた。室温で反応液をＴＬＣで追跡しながら約１日かけて原料が消えるまで撹拌した。撹拌を止め、反応液を減圧留去し、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）して化合物２（１００ｍｇ（２９５μｍｏｌ））を収率５５％、淡黄色固体の状態で得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.66 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 7.17 (s, 2H), 6.29 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 5.30 (t, J = 7.30 Hz, 2H), 4.79 (d, J = 2.27 Hz, 2H), 3.33 (d, J = 7.14 Hz, 4H), 2.49 (t, J = 2.44 Hz, 1H), 1.77 (d, J = 8.76 Hz, 12H).
＜ステップｂ＞
化合物２（５２ｍｇ（１５４μｍｏｌ））のｔ−ＢｕＯＨ：水（２：１）の混合溶液４ｍｌに対して、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム（６ｍｇ（３０.３μｍｏｌ））と硫酸銅無水物（４ｍｇ（２５.１μｍｏｌ））を室温で加えた。この反応液に０.５Ｍの２−アジドアニソール（３１０μｌ（１５５μｍｏｌ））を加え、４２℃で超音波を照射しながら原料が消えるまで７時間撹拌した。これを酢酸エチル２０ｍｌで３回抽出し、抽出液を水、飽和食塩水で順次洗浄し芒硝で脱水後にエバポレーターで減圧留去して残渣を得た。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）して化合物３（５２ｍｇ（１０７μｍｏｌ））を収率６９％、淡黄色固体の状態で得た。
化合物２（５２ｍｇ（１５４μｍｏｌ））のｔ−ＢｕＯＨ：水（２：１）の混合溶液４ｍｌに対して、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム（６ｍｇ（３０.３μｍｏｌ））と硫酸銅無水物（４ｍｇ（２５.１μｍｏｌ））を室温で加えた。この反応液に０.５Ｍの２−アジドアニソール（３１０μｌ（１５５μｍｏｌ））を加え、４２℃で超音波を照射しながら原料が消えるまで７時間撹拌した。これを酢酸エチル２０ｍｌで３回抽出し、抽出液を水、飽和食塩水で順次洗浄し芒硝で脱水後にエバポレーターで減圧留去して残渣を得た。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）して化合物３（５２ｍｇ（１０７μｍｏｌ））を収率６９％、淡黄色固体の状態で得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.20 (s, 1H), 7.77 (d, J = 7.79 Hz, 1H), 7.63 ( d, J = 16.1, 1H), 7.42 (t, J = 7.78Hz, 1H), 7.15 (s, 2H), 7.12-7.07 (m, 2H), 6.30 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 5.42 (s, 2H), 5.28 (t, J = 6.49 Hz, 2H), 3.89(s, 3H), 3.32 (d, J = 7.27 Hz, 4H), 1.76 (d, J = 7.27, 12H). HRMS calcd for C29H34N3O4 (M+H)+ m/z 488.2549, found m/z 488.2586.
上記反応式は以下で示される。
［製造例２］
コーヒー酸（CA）の1,2,3-methylene-Triazolylエステル（AzoCAあるいはPRC-15C）の調製：
＜ステップｃ＞
化合物４（コーヒー酸 ３８２ｍｇ（２.１２ｍｍｏｌ））のＤＭＦ（３ｍｌ）溶液に対して、０℃でＥＤＣ塩酸塩（４２３ｍｇ（２.２１ｍｍｏｌ））とＤＭＡＰ（７２ｍｇ（５８９μｍｏｌ））を加えた。この反応液にプロパルギルアルコール（４００μｌ（６.８７ｍｍｏｌ））を滴下し、室温で１７時間撹拌した。０.５Ｍの塩酸２０ｍｌでクエンチした後、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（１：１）の混合溶媒で抽出を行い、抽出液を水、飽和食塩水で順次洗浄し芒硝で脱水後にエバポレーターで減圧留去して残渣を得た。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）して化合物５（１４３ｍｇ（６５５μｍｏｌ））を収率３１％、乳白色固体の状態で得た。
コーヒー酸（CA）の1,2,3-methylene-Triazolylエステル（AzoCAあるいはPRC-15C）の調製：
＜ステップｃ＞
化合物４（コーヒー酸 ３８２ｍｇ（２.１２ｍｍｏｌ））のＤＭＦ（３ｍｌ）溶液に対して、０℃でＥＤＣ塩酸塩（４２３ｍｇ（２.２１ｍｍｏｌ））とＤＭＡＰ（７２ｍｇ（５８９μｍｏｌ））を加えた。この反応液にプロパルギルアルコール（４００μｌ（６.８７ｍｍｏｌ））を滴下し、室温で１７時間撹拌した。０.５Ｍの塩酸２０ｍｌでクエンチした後、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（１：１）の混合溶媒で抽出を行い、抽出液を水、飽和食塩水で順次洗浄し芒硝で脱水後にエバポレーターで減圧留去して残渣を得た。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）して化合物５（１４３ｍｇ（６５５μｍｏｌ））を収率３１％、乳白色固体の状態で得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.62 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 2.08 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 8.00 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 8.30 Hz, 1H), 6.27 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 4.80 (d, J = 2.60 Hz, 2H), 2.50 (t, J = 2.60 Hz, 1H).
＜ステップｄ＞
化合物５（１３０ｍｇ（５９５μｍｏｌ））のＴＨＦ：水（１：１）の混合溶液４ｍｌに対して、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム（６１ｍｇ（３０８μｍｏｌ））と硫酸銅無水物（１７ｍｇ（１０７μｍｏｌ））を室温で加えた．この反応液に０.５Ｍの２−アジドアニソール（１.２０ｍｌ（６００μｍｏｌ））を加え、原料が消えるまで５時間撹拌した。これを酢酸エチル２０ｍｌで３回抽出し、抽出液を水、飽和食塩水で順次洗浄し芒硝で脱水後にエバポレーターで減圧留去して、化合物６（１８５ｍｇ（５０４μｍｏｌ））を収率８５％、乳白色固体の状態で得た。
化合物５（１３０ｍｇ（５９５μｍｏｌ））のＴＨＦ：水（１：１）の混合溶液４ｍｌに対して、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム（６１ｍｇ（３０８μｍｏｌ））と硫酸銅無水物（１７ｍｇ（１０７μｍｏｌ））を室温で加えた．この反応液に０.５Ｍの２−アジドアニソール（１.２０ｍｌ（６００μｍｏｌ））を加え、原料が消えるまで５時間撹拌した。これを酢酸エチル２０ｍｌで３回抽出し、抽出液を水、飽和食塩水で順次洗浄し芒硝で脱水後にエバポレーターで減圧留去して、化合物６（１８５ｍｇ（５０４μｍｏｌ））を収率８５％、乳白色固体の状態で得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ = 8.37 (s, 1H), 7.64 (d, J = 8.04 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.50 (t, J = 7.92 Hz, 1H), 7.23 (d, J = 8.30 Hz, 1H), 7.12 (t, J = 7.79 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 2.08 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 8.04 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 8.30 Hz, 1H), 6.28 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 5.35 (s, 2H), 3.89 (s, 3H). HRMS calcd for C19H18N3O5 (M+H)+ m/z 368.1246, found m/z 368.1250.
上記反応式は以下で示される。
［製造例３］
ケトロラックの1,2,3-methylene-Triazolyl エステル（AzoKetoあるいはPRC-15 K）の調製：
＜ステップｅ＞
化合物７（（Ｒ,Ｓ）−ケトロラック（ラセミ体：５０／５０）、２０２ｍｇ（７９４μｍｏｌ））のＤＭＦ（３ｍｌ）溶液に対して、０℃でＥＤＣ塩酸塩（１５６ｍｇ（８１３μｍｏｌ））とＤＭＡＰ（６０ｍｇ（４９１μｍｏｌ））を加えた。この反応液にプロパルギルアルコール（２００μｌ（３.４３ｍｍｏｌ））を滴下し、室温で５時間撹拌した。０.５Ｍの塩酸２０ｍｌでクエンチした後、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（１：１）の混合溶媒で抽出を行い、抽出液を水、飽和食塩水で順次洗浄し芒硝で脱水後にエバポレーターで減圧留去して残渣を得た。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）して化合物８（１４７ｍｇ（５０１μｍｏｌ））を収率６３％、淡黄色オイル状で得た。
ケトロラックの1,2,3-methylene-Triazolyl エステル（AzoKetoあるいはPRC-15 K）の調製：
＜ステップｅ＞
化合物７（（Ｒ,Ｓ）−ケトロラック（ラセミ体：５０／５０）、２０２ｍｇ（７９４μｍｏｌ））のＤＭＦ（３ｍｌ）溶液に対して、０℃でＥＤＣ塩酸塩（１５６ｍｇ（８１３μｍｏｌ））とＤＭＡＰ（６０ｍｇ（４９１μｍｏｌ））を加えた。この反応液にプロパルギルアルコール（２００μｌ（３.４３ｍｍｏｌ））を滴下し、室温で５時間撹拌した。０.５Ｍの塩酸２０ｍｌでクエンチした後、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（１：１）の混合溶媒で抽出を行い、抽出液を水、飽和食塩水で順次洗浄し芒硝で脱水後にエバポレーターで減圧留去して残渣を得た。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）して化合物８（１４７ｍｇ（５０１μｍｏｌ））を収率６３％、淡黄色オイル状で得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.81 (d, J = 7.79 Hz, 2H), 7.52 (d, J = 7.26 Hz, 1H), 7.44 (d, J = 7.26 Hz, 2H), 6.81 (d, J = 3.63 Hz, 1H), 6.13 (d, J = 4.67 Hz, 1H), 4.76 (d, J = 2.60 Hz, 2H), 4.61-4.55 (m, 1H), 4.48-4.41 (m, 1H), 4.14-4.09 (q, 1H), 2.99-2.90 (m, 1H), 2.86-2.77 (m, 1H) 2.50 (t, J = 2.20 Hz, 1H).
＜ステップｆ＞
化合物８（１９０ｍｇ（６４８μｍｏｌ））のＴＨＦ：水（１：１）の混合溶液４ｍｌに対して、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム（６５ｍｇ（３２８μｍｏｌ））と硫酸銅無水物（２１ｍｇ（１３１μｍｏｌ））を室温で加えた。この反応液に０.５Ｍの２−アジドアニソール（１.２０ｍｌ（６００μｍｏｌ））を加え、原料が消えるまで５時間撹拌した。これを酢酸エチル２０ｍｌで３回抽出し、抽出液を水、飽和食塩水で順次洗浄し硫酸マグネシウムで脱水後にエバポレーターで減圧留去して、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）して化合物９（１９１ｍｇ（４３２μｍｏｌ））を収率８５％、うすい褐色のオイル状で得た。
化合物８（１９０ｍｇ（６４８μｍｏｌ））のＴＨＦ：水（１：１）の混合溶液４ｍｌに対して、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム（６５ｍｇ（３２８μｍｏｌ））と硫酸銅無水物（２１ｍｇ（１３１μｍｏｌ））を室温で加えた。この反応液に０.５Ｍの２−アジドアニソール（１.２０ｍｌ（６００μｍｏｌ））を加え、原料が消えるまで５時間撹拌した。これを酢酸エチル２０ｍｌで３回抽出し、抽出液を水、飽和食塩水で順次洗浄し硫酸マグネシウムで脱水後にエバポレーターで減圧留去して、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）して化合物９（１９１ｍｇ（４３２μｍｏｌ））を収率８５％、うすい褐色のオイル状で得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.15 (s, 1H), 7.80-7.76 (m, 3H), 7.51 (t, J = 7.42 Hz, 1H), 7.45-7.40 (m, 3H), 7.12-7.06 (m, 2H), 6.78 (d, J = 3.60 Hz, 1H), 6.07 (d, J = 4.11 Hz, 1H), 5.40 (s, 2H), 4.60-4.53 (m, 1H), 4.46-4.40 (m, 1H), 4.14-4.08 (m, 1H), 3.87 (s, 3H), 2.98-2.09 (m, 1H), 2.85-2.75 (m, 1H). HRMS calcd for C25H23N4O4 (M+H)+ m/z 443.1719, found m/z 443.1737.
上記反応式は以下で示される。
（特記）ＦＤＡによって販売許可されている抗炎症剤／鎮痛剤７（ｋｅｔｏｒｏｌａｃ、商標「トラドール」）は光学異性体（Ｒ体とＳ体のラセミ混合物）である。そのうち、Ｒ体のみがＲＡＣ−ＰＡＫ１経路を直接阻害し、Ｓ体のみがＣＯＸ−２を直接阻害する（非特許文献６）。しかし、幸いにも、Ｓ体はＲ体のＰＡＫ１遮断作用を邪魔しない。市販のトラドールは、Ｒ体とＳ体の１：１混合物でヒト由来肺癌細胞の増殖を５０％抑える濃度（ＩＣ５０）＝１３μＭ（表１を参照）。当然の成り行きとして、化合物８も化合物９も１：１ラセミ混合物になる。化合物９のＩＣ５０＝２４ｎＭ（抗癌作用は原料である化合物７の５００倍以上）。従って、化合物９は、血管脳関門を通過しうる化合物中で史上最強のＰＡＫ１遮断剤である。その上、ＰＡＫ１が（癌の増殖やメラニン合成にも必須である）ＣＯＸ−２遺伝子の発現に必須であることがわかっている。従って、化合物９は発癌性のＲＡＣ−ＰＡＫ１−ＣＯＸ−２シグナル経路を２種類の独立した経路を介して遮断することになる。言い換えれば、（「一石二鳥」のラセミ体である）化合物９の薬理作用が（遺伝子変異による）薬剤耐性によって、邪魔されるという可能性は殆んどない。
［製造例４］
CDDO(TP151)（オレアノール酸の2-cyano誘導体）の1,2,3-Triazolyl エステルの調製：
上記製造例において、最初のステップ（ａ、ｃおよびｅ）で、原料（CDDO(TP151)）をプロパルギルアルコールで処理し、次に生成物であるプロパギルエステルを２−アジドアニソールと無水硫酸銅（II）で処理し（ｂ、ｄおよびｆ）、CDDO(TP151)のトリアゾリルエステルを得る。
CDDO(TP151)（オレアノール酸の2-cyano誘導体）の1,2,3-Triazolyl エステルの調製：
上記製造例において、最初のステップ（ａ、ｃおよびｅ）で、原料（CDDO(TP151)）をプロパルギルアルコールで処理し、次に生成物であるプロパギルエステルを２−アジドアニソールと無水硫酸銅（II）で処理し（ｂ、ｄおよびｆ）、CDDO(TP151)のトリアゾリルエステルを得る。
［製造例５］
Mimosine-Phe-Pheの1,2,3-Triazolylエステル（AzoMFFあるいはPRC-15M）の調製：
上記製造例において、最初のステップ（ａ、ｃおよびｅ）で、原料（Mimosine-Phe-Phe）をプロパルギルアルコールで処理し、次に生成物であるプロパギルエステルを２−アジドアニソールと無水硫酸銅（II）で処理し（ｂ、ｄおよびｆ）、Mimosine-Phe-Pheのトリアゾリルエステルを得る。
Mimosine-Phe-Pheの1,2,3-Triazolylエステル（AzoMFFあるいはPRC-15M）の調製：
上記製造例において、最初のステップ（ａ、ｃおよびｅ）で、原料（Mimosine-Phe-Phe）をプロパルギルアルコールで処理し、次に生成物であるプロパギルエステルを２−アジドアニソールと無水硫酸銅（II）で処理し（ｂ、ｄおよびｆ）、Mimosine-Phe-Pheのトリアゾリルエステルを得る。
［製造例６］
Crocetin monoesterの1,2,3-Triazolylエステル（AzoCroあるいはPRC-15R） の調製：
上記製造例において、最初のステップ（ａ、ｃおよびｅ）で、原料（Crocetin monoester）をプロパルギルアルコールで処理し、次に生成物であるプロパギルエステルを２−アジドアニソールと無水硫酸銅（II）で処理し（ｂ、ｄおよびｆ）、Crocetin monoesterのトリアゾリルエステルを得る。
Crocetin monoesterの1,2,3-Triazolylエステル（AzoCroあるいはPRC-15R） の調製：
上記製造例において、最初のステップ（ａ、ｃおよびｅ）で、原料（Crocetin monoester）をプロパルギルアルコールで処理し、次に生成物であるプロパギルエステルを２−アジドアニソールと無水硫酸銅（II）で処理し（ｂ、ｄおよびｆ）、Crocetin monoesterのトリアゾリルエステルを得る。
［製造例７］
CX-4945の1,2,3-Triazolyl エステル（AzoCXあるいはPRC-15X）の調製：
上記製造例において、最初のステップ（ａ、ｃおよびｅ）で、原料（CX-4945）をプロパルギルアルコールで処理し、次に生成物であるプロパギルエステルを２−アジドアニソールと無水硫酸銅（II）で処理し（ｂ、ｄおよびｆ）、CX-4945のトリアゾリルエステルを得る。
CX-4945の1,2,3-Triazolyl エステル（AzoCXあるいはPRC-15X）の調製：
上記製造例において、最初のステップ（ａ、ｃおよびｅ）で、原料（CX-4945）をプロパルギルアルコールで処理し、次に生成物であるプロパギルエステルを２−アジドアニソールと無水硫酸銅（II）で処理し（ｂ、ｄおよびｆ）、CX-4945のトリアゾリルエステルを得る。
［製造例８］
カプトプリルの1,2,3-Triazolyl エステル（AzoCapあるいはPRC-15CP）の調製：
上記製造例において、最初のステップ（ａ、ｃおよびｅ）で、原料（カプトプリル）をプロパルギルアルコールで処理し、次に生成物であるプロパギルエステルを２−アジドアニソールと無水硫酸銅（II）で処理し（ｂ、ｄおよびｆ）、カプトプリルのトリアゾリルエステルを得る。
カプトプリルの1,2,3-Triazolyl エステル（AzoCapあるいはPRC-15CP）の調製：
上記製造例において、最初のステップ（ａ、ｃおよびｅ）で、原料（カプトプリル）をプロパルギルアルコールで処理し、次に生成物であるプロパギルエステルを２−アジドアニソールと無水硫酸銅（II）で処理し（ｂ、ｄおよびｆ）、カプトプリルのトリアゾリルエステルを得る。
［実施例１］
薬理／生理作用測定：
＜抗癌作用の測定＞
Ａ．細胞株：ヒト由来のＮＳＣ（Non-Small Cell）肺癌 細胞（Ａ５４９株）、Ｋ−ＲＡＳ遺伝子に発癌性の変異を有し、その増殖や転移にＰＡＫ１及びＣＯＸ−２を必須とする。
Ｂ．継代培養 （あるいは前培養）： ９６ｗｅｌｌプレート上で行う。
Ｃ．細胞培養液：１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を含むＤ−ＭＥＭ
Ｄ．阻害剤（検体）のストック液：通常、ＤＭＳＯ溶液を使用する。細胞培養中の検体の最終ＤＭＳＯ濃度は、細胞増殖に影響を与えないよう１％あるいはそれ以下に調整する。
薬理／生理作用測定：
＜抗癌作用の測定＞
Ａ．細胞株：ヒト由来のＮＳＣ（Non-Small Cell）肺癌 細胞（Ａ５４９株）、Ｋ−ＲＡＳ遺伝子に発癌性の変異を有し、その増殖や転移にＰＡＫ１及びＣＯＸ−２を必須とする。
Ｂ．継代培養 （あるいは前培養）： ９６ｗｅｌｌプレート上で行う。
Ｃ．細胞培養液：１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を含むＤ−ＭＥＭ
Ｄ．阻害剤（検体）のストック液：通常、ＤＭＳＯ溶液を使用する。細胞培養中の検体の最終ＤＭＳＯ濃度は、細胞増殖に影響を与えないよう１％あるいはそれ以下に調整する。
（トリパンブルー染色による細胞の生存率および増殖の測定（非特許文献４））
Ａ．検体の抗癌作用（厳密には、癌細胞の生存率や増殖を阻害する効果）を測定するために、一般に広く使用されているＭＴＴ法は、トリアゾール環を含む化合物の抗癌作用を正確に測定するには不向きである。その主な理由は、検体であるトリアゾール環誘導体が（トリアゾール環誘導体である）ＭＴＴ試薬と同様、細胞内でミトコンドリアの還元酵素により、紫色の色素を形成するため、ＭＴＴ法による色素測定を著しく妨害するからである。従って、ＭＴＴ法の代わりに、より古典的な「トリパンブルー染色」法を使用して、染色されない（生きた）細胞の数を直接、ヘモサイトメーターで測定しなければならない。この染色法では死んだ細胞のみが染色される。
Ｂ．具体的には、Ａ５４９細胞（２ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を上記の培地で２４時間前培養したのち、細胞を適当な濃度の検体を含む培地で、更に７２〜９６時間培養する。次に細胞を「アクターゼ」と呼ばれるプロテアーゼでプレートから引き剥し、トリパンブルーで染色し、染色されない細胞の数を顕微鏡下、ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ上で数える。
Ａ．検体の抗癌作用（厳密には、癌細胞の生存率や増殖を阻害する効果）を測定するために、一般に広く使用されているＭＴＴ法は、トリアゾール環を含む化合物の抗癌作用を正確に測定するには不向きである。その主な理由は、検体であるトリアゾール環誘導体が（トリアゾール環誘導体である）ＭＴＴ試薬と同様、細胞内でミトコンドリアの還元酵素により、紫色の色素を形成するため、ＭＴＴ法による色素測定を著しく妨害するからである。従って、ＭＴＴ法の代わりに、より古典的な「トリパンブルー染色」法を使用して、染色されない（生きた）細胞の数を直接、ヘモサイトメーターで測定しなければならない。この染色法では死んだ細胞のみが染色される。
Ｂ．具体的には、Ａ５４９細胞（２ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を上記の培地で２４時間前培養したのち、細胞を適当な濃度の検体を含む培地で、更に７２〜９６時間培養する。次に細胞を「アクターゼ」と呼ばれるプロテアーゼでプレートから引き剥し、トリパンブルーで染色し、染色されない細胞の数を顕微鏡下、ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ上で数える。
＜美白作用の測定＞
Ａ．細胞株：マウス由来のメラノーマ（Ｂ１６Ｆ１０）
Ｂ．細胞培養液：１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）および１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１０，０００ Ｕ／ｍＬ ａｎｄ １００μｇ／ｍＬ）を含むＤ−ＭＥＭ
Ｃ．継代培養 （あるいは前培養）： ９６ｗｅｌｌプレート上で行う。
Ｄ．細胞培養液：１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を含むＤ−ＭＥＭ
Ｅ．阻害剤（検体）のストック液：通常、ＤＭＳＯ溶液を使用する。細胞培養中の検体の最終ＤＭＳＯ濃度は、細胞増殖に影響を与えないよう１％あるいはそれ以下に調整する。
Ｆ．細胞の生存率および増殖の測定：トリパンブルー染色による（非特許文献４）。
Ａ．細胞株：マウス由来のメラノーマ（Ｂ１６Ｆ１０）
Ｂ．細胞培養液：１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）および１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１０，０００ Ｕ／ｍＬ ａｎｄ １００μｇ／ｍＬ）を含むＤ−ＭＥＭ
Ｃ．継代培養 （あるいは前培養）： ９６ｗｅｌｌプレート上で行う。
Ｄ．細胞培養液：１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を含むＤ−ＭＥＭ
Ｅ．阻害剤（検体）のストック液：通常、ＤＭＳＯ溶液を使用する。細胞培養中の検体の最終ＤＭＳＯ濃度は、細胞増殖に影響を与えないよう１％あるいはそれ以下に調整する。
Ｆ．細胞の生存率および増殖の測定：トリパンブルー染色による（非特許文献４）。
（メラニン含量の測定（非特許文献４））
Ｂ１６Ｆ１０細胞（５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を上記の培地で２４時間前培養したのち、メラニン合成刺激ホルモンα−ＭＳＨ（１００ｎＭ）と（適当に希釈した）検体を含む培地で、更に４８−７２時間培養する。次に、培地を除き、細胞を１Ｎ ＮａＯＨ（１００μｌ）で溶かし、９０℃で一時間加熱した後、メラニン含量をフォトメーター（波長４０５ｎｍの吸収）で、測定する。
Ｂ１６Ｆ１０細胞（５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を上記の培地で２４時間前培養したのち、メラニン合成刺激ホルモンα−ＭＳＨ（１００ｎＭ）と（適当に希釈した）検体を含む培地で、更に４８−７２時間培養する。次に、培地を除き、細胞を１Ｎ ＮａＯＨ（１００μｌ）で溶かし、９０℃で一時間加熱した後、メラニン含量をフォトメーター（波長４０５ｎｍの吸収）で、測定する。
（チロシナーゼ活性の測定（非特許文献４））
Ｂ１６Ｆ１０細胞（２ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を上記の培地で２４時間前培養したのち、メラニン合成刺激ホルモンα−ＭＳＨ（１００ｎＭ）と（適当に希釈した）検体を含む培地で、更に７２時間培養する。細胞を冷たい燐酸緩衝液で洗浄したのち、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（５００μｌ／ｗｅｌｌ）を含む燐酸緩衝液（ｐＨ６.８）で溶解する。次にプレートを−８０℃で３０分間冷凍した後、解凍した細胞溶液に（チロシナーゼの基質である）１％ Ｌ−ＤＯＰＡ（１００μｌ）を加え、３７℃で２時間反応させたのち、フォトメーターで４９０ｎｍの吸収を測定して、チロシナーゼ活性を算出する。
Ｂ１６Ｆ１０細胞（２ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を上記の培地で２４時間前培養したのち、メラニン合成刺激ホルモンα−ＭＳＨ（１００ｎＭ）と（適当に希釈した）検体を含む培地で、更に７２時間培養する。細胞を冷たい燐酸緩衝液で洗浄したのち、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（５００μｌ／ｗｅｌｌ）を含む燐酸緩衝液（ｐＨ６.８）で溶解する。次にプレートを−８０℃で３０分間冷凍した後、解凍した細胞溶液に（チロシナーゼの基質である）１％ Ｌ−ＤＯＰＡ（１００μｌ）を加え、３７℃で２時間反応させたのち、フォトメーターで４９０ｎｍの吸収を測定して、チロシナーゼ活性を算出する。
＜育毛促進作用の測定（非特許文献５）＞
Ａ．細胞株：ヒト毛乳頭細胞（HFDPCs）
Ｂ．継代培養 （あるいは前培養）： ９６ｗｅｌｌプレート上で行う。
Ｃ．継代培養液：１％ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ（ＦＳＣ）、１％ＢＰＥ、０.５％ Ｃｙｐ、０.５％ＩＴＴを含むｐａｐｉｌｌａ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ （ＰＣＧＭ）。
Ａ．細胞株：ヒト毛乳頭細胞（HFDPCs）
Ｂ．継代培養 （あるいは前培養）： ９６ｗｅｌｌプレート上で行う。
Ｃ．継代培養液：１％ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ（ＦＳＣ）、１％ＢＰＥ、０.５％ Ｃｙｐ、０.５％ＩＴＴを含むｐａｐｉｌｌａ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ （ＰＣＧＭ）。
（トリパンブルー染色による細胞の生存率および増殖の測定（非特許文献４、５））
ＨＦＤＰＣｓ（１ｘ１０４ｃｅｌｌ／ｍＬ）を、１０％ＦＢＳ含むＤ−ＭＥＭで懸濁後、その２００μｌ（２,０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）をコラーゲンでコーチングした９６ｗｅｌｌプレート上に移し、３７℃で、７２時間培養する。次に、培地を除き、適当な濃度に希釈した検体を含むＤＭＥＭ（２００μｌ）で、細胞を更に９６時間培養する。次に細胞を「アクターゼ」と呼ばれるプロテアーゼでプレートから引き剥し、トリパンブルーで染色し、染色されない細胞の数を顕微鏡下、ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ上で数える。
ＨＦＤＰＣｓ（１ｘ１０４ｃｅｌｌ／ｍＬ）を、１０％ＦＢＳ含むＤ−ＭＥＭで懸濁後、その２００μｌ（２,０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）をコラーゲンでコーチングした９６ｗｅｌｌプレート上に移し、３７℃で、７２時間培養する。次に、培地を除き、適当な濃度に希釈した検体を含むＤＭＥＭ（２００μｌ）で、細胞を更に９６時間培養する。次に細胞を「アクターゼ」と呼ばれるプロテアーゼでプレートから引き剥し、トリパンブルーで染色し、染色されない細胞の数を顕微鏡下、ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ上で数える。
＜（細胞培養系）ＰＡＫ１遮断作用の測定（非特許文献４）＞
Ａ．細胞株：ヒト由来のＮＳＣ（Non-Small Cell）肺癌細胞（Ａ５４９株）
Ｂ．継代培養 （あるいは前培養）：９６ｗｅｌｌプレート上で行う。
Ｃ．細胞培養液：１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を含むＤ−ＭＥＭ
Ｄ．阻害剤 (検体) のストック液：通常、ＤＭＳＯ溶液を使用する。細胞培養中の検体の最終ＤＭＳＯ濃度は、細胞増殖に影響を与えないよう１％あるいはそれ以下に調整する。
Ａ．細胞株：ヒト由来のＮＳＣ（Non-Small Cell）肺癌細胞（Ａ５４９株）
Ｂ．継代培養 （あるいは前培養）：９６ｗｅｌｌプレート上で行う。
Ｃ．細胞培養液：１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を含むＤ−ＭＥＭ
Ｄ．阻害剤 (検体) のストック液：通常、ＤＭＳＯ溶液を使用する。細胞培養中の検体の最終ＤＭＳＯ濃度は、細胞増殖に影響を与えないよう１％あるいはそれ以下に調整する。
（”Ｍａｃａｒｏｎｉ−Ｗｅｓｔｅｒｎ”（ＩＰ）ＡＴＰ−Ｇｌｏキナーゼ活性の測定（非特許文献４））
最近はキナーゼ活性を、自己燐酸化されたキナーゼに対する抗体を使用して、免疫沈降ブロット（ウエスタン）で測定することが流行しているが、（厳密に言えば）ＰＡＫ１の場合は、この方法を使っても、細胞内のキナーゼ活性を正確に測定できないし、全く信頼性がない。その理由は、細胞内で、ＰＡＫ１を活性化する経路が幾多もあり、必ずしも自己燐酸化を経由するわけではないからである。そこで、癌細胞（Ａ５４９株）内のＰＡＫ１キナーゼ活性は、最近我々が開発した“Ｍａｃａｒｏｎｉ−Ｗｅｓｔｅｒｎ”（ＩＰ）ＡＴＰ−Ｇｌｏキナーゼ活性測定法と呼ばれる方法によって、定量される（非特許文献４）。概略すれば、肺癌細胞（２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を６−ｗｅｌｌプレート上で２４時間前培養した後、（適当な濃度に希釈した）検体を含む培養液で、更に２４時間処理する。次に細胞を破壊するために、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、１５０ｍＭ食塩および１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含む緩衝液で処理する。ＰＡＫ１を免液沈降（ＩＰ）するために、細胞上清をａｎｔｉ−ＰＡＫ１ ＩｇＧ（１：５０希釈）およびｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−ａｇａｒｏｓｅビーズと共に１〜２時間、氷室でロータリーミキサー（日進理化：東京都杉並区）を使用して間断なく撹拌する。遠心器で沈殿させたＩＰ（ＰＡＫ１）をＡＴＰ−Ｇｌｏキナーゼ活性測定法ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＴＰおよびＭＢＰ（ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）と共に３７℃で１時間反応させた後、残ったＡＴＰレベルを定量するために、ＡＴＰ−依存性のＬｕｃｉｆｅｒｉｎ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ反応で発生する蛍光を測定する（非特許文献４）。懸濁液を遠心後、上清を９６−ｗｅｌｌプレート上に移し、ＭＴＰ−８８０Ｌａｂ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（コロナ電気：茨城県ひたちなか市）にて蛍光を測定する。
最近はキナーゼ活性を、自己燐酸化されたキナーゼに対する抗体を使用して、免疫沈降ブロット（ウエスタン）で測定することが流行しているが、（厳密に言えば）ＰＡＫ１の場合は、この方法を使っても、細胞内のキナーゼ活性を正確に測定できないし、全く信頼性がない。その理由は、細胞内で、ＰＡＫ１を活性化する経路が幾多もあり、必ずしも自己燐酸化を経由するわけではないからである。そこで、癌細胞（Ａ５４９株）内のＰＡＫ１キナーゼ活性は、最近我々が開発した“Ｍａｃａｒｏｎｉ−Ｗｅｓｔｅｒｎ”（ＩＰ）ＡＴＰ−Ｇｌｏキナーゼ活性測定法と呼ばれる方法によって、定量される（非特許文献４）。概略すれば、肺癌細胞（２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を６−ｗｅｌｌプレート上で２４時間前培養した後、（適当な濃度に希釈した）検体を含む培養液で、更に２４時間処理する。次に細胞を破壊するために、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、１５０ｍＭ食塩および１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含む緩衝液で処理する。ＰＡＫ１を免液沈降（ＩＰ）するために、細胞上清をａｎｔｉ−ＰＡＫ１ ＩｇＧ（１：５０希釈）およびｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−ａｇａｒｏｓｅビーズと共に１〜２時間、氷室でロータリーミキサー（日進理化：東京都杉並区）を使用して間断なく撹拌する。遠心器で沈殿させたＩＰ（ＰＡＫ１）をＡＴＰ−Ｇｌｏキナーゼ活性測定法ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＴＰおよびＭＢＰ（ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）と共に３７℃で１時間反応させた後、残ったＡＴＰレベルを定量するために、ＡＴＰ−依存性のＬｕｃｉｆｅｒｉｎ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ反応で発生する蛍光を測定する（非特許文献４）。懸濁液を遠心後、上清を９６−ｗｅｌｌプレート上に移し、ＭＴＰ−８８０Ｌａｂ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（コロナ電気：茨城県ひたちなか市）にて蛍光を測定する。
＜結果＞
（１）製造例１で調製したアルテピリンＣ（ARC）の1,2,3-methylene-Triazolylエステル
抗癌作用（ＩＣ５０）＝２５０ｎＭ（１００倍ほど強化、詳しくは、表１を参照）。
抗メラニン合成作用（ＩＣ５０）＝２５０ｎＭ
育毛促進作用（ＥＤ）＝２０ｎＭ（ＡＲＣの活性を１０００倍強化）
濃度１μＭでＰＡＫ１活性を４５％抑制
（１）製造例１で調製したアルテピリンＣ（ARC）の1,2,3-methylene-Triazolylエステル
抗癌作用（ＩＣ５０）＝２５０ｎＭ（１００倍ほど強化、詳しくは、表１を参照）。
抗メラニン合成作用（ＩＣ５０）＝２５０ｎＭ
育毛促進作用（ＥＤ）＝２０ｎＭ（ＡＲＣの活性を１０００倍強化）
濃度１μＭでＰＡＫ１活性を４５％抑制
（２）製造例２で調製したコーヒー酸（CA）の1,2,3-methylene-Triazolylエステル
抗癌作用（ＩＣ５０）＝２２５ｎＭ（４００倍以上強化、詳しくは、表１を参照）。
抗メラニン合成作用（ＩＣ５０）＝２２５ｎＭ
濃度１μＭでＰＡＫ１活性を３５％抑制
抗癌作用（ＩＣ５０）＝２２５ｎＭ（４００倍以上強化、詳しくは、表１を参照）。
抗メラニン合成作用（ＩＣ５０）＝２２５ｎＭ
濃度１μＭでＰＡＫ１活性を３５％抑制
（３）製造例３で調製したケトロラックの1,2,3-methylene-Triazolyl エステル
抗癌作用（ＩＣ５０）＝２４ｎＭ（５００倍以上強化、詳しくは、表１を参照）。
抗メラニン合成作用（ＩＣ５０）＝２４ｎＭ
濃度７０ｎＭでＰＡＫ１活性を５０％抑制
抗癌作用（ＩＣ５０）＝２４ｎＭ（５００倍以上強化、詳しくは、表１を参照）。
抗メラニン合成作用（ＩＣ５０）＝２４ｎＭ
濃度７０ｎＭでＰＡＫ１活性を５０％抑制
以上の通り、カルボキシル基により酸性になったＰＡＫ１遮断剤をTriazolyl エステル化することにより、細胞透過性が飛躍的に強化されることが示された。
本発明は、ＰＡＫ１が関連する疾患の治療剤に用いることができる。
以 上
以 上
Claims (12)
- 一般式（１）
- 請求項１記載の化合物、あるいはこの化合物の薬学的に許容される塩を含有することを特徴とする医薬。
- 請求項１記載の化合物、あるいはこの化合物の薬学的に許容される塩を含有することを特徴とするＰＡＫ１遮断剤。
- 請求項１記載の化合物、あるいはこの化合物の薬学的に許容される塩を含有することを特徴とするＰＡＫ１依存性疾患の治療剤。
- ＰＡＫ１依存性疾患が、固形腫瘍、認知症、パーキンソン氏病、癲癇、炎症、感染症、糖尿病（２型）、高血圧、肥満症、鬱病、統合失調症、自閉症、頭痛、骨粗しょう症、過度の色素沈着および脱毛症から選ばれるものである請求項４記載のＰＡＫ１依存性疾患の治療剤。
- 固形腫瘍が、膵臓癌、大腸癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮癌、悪性脳腫瘍、良性脳腫瘍および多発性骨髄腫から選ばれるものである請求項５記載のＰＡＫ１依存性疾患の治療剤。
- 請求項１記載の化合物、あるいはこの化合物の薬学的に許容される塩を含有することを特徴とする化学療法または放射線治療による癌細胞の耐性軽減剤。
- 請求項１記載の化合物、あるいはこの化合物の薬学的に許容される塩を含有することを特徴とする癌細胞の増殖・転移予防剤。
- 請求項１記載の化合物、あるいはこの化合物の薬学的に許容される塩を含有することを特徴とするＰＡＫ１依存性疾患の薬物療法による耐性軽減剤。
- 請求項１記載の化合物、あるいはこの化合物の薬学的に許容される塩を含有することを特徴とする化粧料。
- 美白用である請求項１０記載の化粧料。
- 育毛用である請求項１０記載の化粧料。
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| JPN6016043678; ＸＩＡ Ｃ． ｅｔ ａｌ．: Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｖｏｌ．１８, 2008, ｐ．６５５３-７ * |
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| JPN6016043685; ＨＩＲＯＫＡＷＡ Ｙ． ｅｔ ａｌ．: Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｖｏｌ．２４５, 2007, ｐ．２４２-５１ * |
| JPN6016043687; ＬＯＮＥ Ａ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．: ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．７, 2016, ｐ．８２-９ * |
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