KR20220116695A - 아로니아 추출물을 포함하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아로니아 추출물을 포함하는 근육 질환에 대한 예방, 개선 또는 치료 목적의 조성물로서, 상기 조성물은 근원 세포의 분화 촉진 및 근원 세포에서의 미토콘드리아 활성 증진을 통하여 근력을 강화시키고, 다양한 근육 질환에 대한 치료 효과를 가진다.

Description

아로니아 추출물을 포함하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for prevention or treatment of muscle diseases containing aronia extract}

본 발명은 아로니아 추출물을 포함하는 근육 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.

근육은 에너지 대사, 운동 능력 등 신체 기능의 중요한 부분을 차지하며, 노화에 의한 근감소증, 영양 불균형 또는 운동량 부족에 의한 근위축증, 기타 암과 같은 다른 질환, 노화 등 다양한 요인에 의해 손상되거나 약화될 수 있다.

노화과정에서 발생되는 점진적인 골격근의 손실을 노화성 근감소증(sarcopenia)이라 하며, 다양한 원인에 의해 발병된다. 특히, 노화성 근감소증은 노화과정에서 근섬유의 수와 크기의 감소 그리고 근육 재생 능력 감소에 기인하여 근육량(skeletal muscle mass)의 감소와 근섬유의 종류가 변화하기도 한다. 노화에 따라 타입 1 근섬유 및 타입 2 근섬유가 비슷한 비율로 감소하는데 반해, 근감소증 환자에서 타입 1 근섬유 두께가 더욱 눈에 띄게 감소한다. 이러한 근감소증은 근육량의 감소 뿐만 아니라, 근력 저하와 근 기능 장애를 유발한다고 보고되고 있다(Roubenoff R., Can. J. Appl. Physiol. 26, 78-89, 2001).

또한, 근위축증(Muscular atrophy)은 영양 결핍이나 장기간 근육을 사용하지 않은 경우에 유발되는데 정상적인 단백질의 합성과 분해의 균형이 붕괴되어 근육 내 단백질이 분해됨으로써 발병한다.

이러한 근육 질환을 근본적으로 치료하기 위한 다양한 치료 방법이 개발 중이며, 줄기세포치료법, 근육 분화 촉진 등 이에 포함된다. 또한, 이러한 치료법 이외에 보다 접근이 용이하며 부작용이 없는 천연 물질을 이용하여 증상을 개선하거나, 치료할 수 있는 치료 물질에 대한 연구도 함께 진행되고 있는 실정이다.

아로니아(Aronia melanocarpa)는 장미목 장미과의 아로니아속에 속하는 식물로, 당류와 플라보노이드, 비타민, 베타 카로틴, 아연 등을 포함하고 있으며, 안토시아닌 및 카테킨 등의 폴리페놀 함량이 풍부하여 강력한 항산화 효과를 가지는 것으로 알려져 있다. 안토시아닌 등의 폴리페놀 성분은 혈액순환에 도움을 주고, 체내 활성산소 제거, 알코올 분해 촉진 등의 효능을 가지며, 이와 같은 효능에 따라 식용 또는 약용으로 널리 사용되고 있다. 아로니아는 '킹스 베리'라고도 불리며, 이의 열매는 특히 '초크베리(chokeberry)'라고 부르기도 한다. 한국특허 제 10-2015-0007922호에서는 아로니아를 이용한 노화방지용 조성물, 한국특허 제 10-2015-0099491호는 아로니아 추출물을 포함하는 항비만 조성물 등을 기재하고 있으나, 아로니아 추출물이 근육 세포 분화 또는 근력 향상에 직접적으로 도움을 준다는 내용은 아직까지 공지된 바 없다.

이에 본 발명자들은 다양한 천연 물질로부터 근육 질환을 개선할 수 있는 효과를 가지는 물질에 대한 연구를 진행하던 중, 아로니아 추출물이 근육 질환에 대한 효과를 가질 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명자들은 아로니아 추출물이 근육세포 분화를 촉진하고, 근육의 미토콘드리아 활성을 증진시키는 등 에너지 대사를 향상시켜 근력을 강화하고 특히 근위축증과 같은 근육 질환에 치료 효과가 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 아로니아 추출물을 포함하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 아로니아 추출물을 포함하는 근육 질환의 예방 또는 개선용 건강기능 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아로니아 추출물을 포함하는 근력 강화용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아로니아 추출물을 포함하는 운동수행능력 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아로니아 추출물을 포함하는 사료 첨가용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아로니아 추출물을 포함하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 아로니아 추출물을 포함하는 근육 질환의 예방 또는 개선용 건강기능 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 아로니아 추출물을 포함하는 근력 강화용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아로니아 추출물을 포함하는 운동수행능력 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 아로니아 추출물을 포함하는 사료 첨가용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 양태로서, 본 발명은 아로니아 추출물을 포함하는 조성물로서, 상기 아로니아는 아로니아 속에 속하는 식물로서, 그 하위 종의 종류에 제한되는 것은 아니며, 붉은 아로니아(A. arbutifolia (L.) Pers.), 검은 아로니아(A. melanocarpa (Michx.) Elliott) 또는 자주 아로니아(A. prunifolia (Marshall) Rehder)를 포함할 수 있으나, 보다 바람직하게는 검은 아로니아(A. melanocarpa, 블랙 초크베리)의 추출물일 수 있다. 또한 상기 아로니아 추출물은 열매, 잎, 줄기 등 아로니아 식물 전체 포함할 수 있으나, 보다 바람직하게는 아로니아 열매 추출물일 수 있다.

또한 상기 아로니아 추출물은 그 용매 또는 추출 방법에 제한되는 것은 아니며, 아로니아로부터 활성 성분이 추출될 수 있도록 물, 유기 용매 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 용매로 하여 추출된 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

상기 추출 용매는 아로니아 중량의 1~20배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 5~15배 첨가하는 것이다. 추출 온도는 4 내지 50

인 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 추출 시간은 1 내지 60시간인 것이 바람직하며, 10 내지 48 시간 동안 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 제한되지 않는다.

추출 방법은 감압 고온 추출, 열탕 추출, 환류 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 상온 추출, 초음파 추출 또는 증기 추출로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 추출 방법으로 추출된 것일 수 있다.

본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 아로니아 추출물은 노화, 근 기능 저하, 근육 소모, 근육 퇴화 또는 근육 손상으로 인해 유발되는 근육 질환의 예방 또는 치료 효과를 가진다. 상기 “근육 질환”은 근육이 노화 혹은 질병에 의해 손상되거나 손실되어 근력이 약화된 상태에 있는 것을 의미하며, 이는 유전적 소인, 고혈압, 내당능장애, 당뇨, 비만, 이상지질혈증, 아테롬성경화증 또는 심혈관질환 등의 연령과 관련된 질환; 암, 자가면역질환, 감염성 질환, AIDS, 만성 염증성 질환, 관절염, 영양 실조, 신장 질환, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐기종, 구루병, 만성 하부 척추통증, 말초 신경 손상, 중추 신경 손상 및 화학적 손상과 같은 질환 등의 만성 질환; 골절, 외상 등과 같은 원인 혹은 장기간의 침상 요양에 의한 운동 손실; 노화 등 다양한 원인에 의해 기인할 수 있다.

이에 제한되는 것은 아니나, 상기 근육 질환은 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 (cachexia) 및 노인성 근육감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 근육 질환일 수 있으며, 특히 본 발명의 상기 근육 질환은 노화, 근 기능 저하, 근육 소모, 근육 퇴화 또는 근육 손상으로 인하여 유발되는 것일 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명에서 상기 근육 질환은 근위축증(muscular atrophy), 노화로 인한 근감소증(sarcopenia), 근이영양증(근육 퇴행 위축, muscular dystrophy), 악액질 (cachexia) 및 심위축증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 근육 질환일 수 있다.

본 발명에서 상기 근육 질환에 대한 예방, 치료 또는 개선 효과는 근원세포 분화 촉진에 의한 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 아로니아 추출물이 근원세포의 분화를 촉진함을 확인하였다. 상기 "근원세포 분화" 란, 단핵인 근원세포(myoblast)가 융합을 통해 다핵의 근관(myotube)를 형성하는 과정을 의미하며, 근관을 형성하는 분화단계의 세포는 Pax7-, MyoD+, MyoG 등의 마커를 이용하여 구분할 수 있다. 상기 근관을 형성하는 분화 초기단계의 세포는 마이오신 D(MyoD)와 같은 근원성 전사인자(myogenic transcription factor)의 발현이 증가하며, 중기에는 마이오신 G(MyoG) 가 증가한다. 분화가 거의 끝나는 후기에는 마이오신 중쇄(MHC, Myosin Heavy Chain)의 발현이 증가한다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 아로니아 추출물을 근원세포(C2C12)에 처리한 경우, MHC 및 Myogenin의 발현이 증가되었음을 확인하였으며, 근육 분화 신호전달에 관여하는 Akt 인산화의 형태가 농도의존적으로 증가된 것을 확인하였다.

또한 본 발명에서 상기 근육 질환에 대한 예방, 치료 또는 개선 효과는 근육의 미토콘드리아 활성 증진을 통한 것일 수 있다. 근육 내 미토콘드리아 활성을 통하여 근육의 성장과 근 지구력을 향상시킬 수 있으며, 이를 통해 근력을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 아로니아 추출물을 마우스 뒷다리 근육에 투여할 경우, 산화성 근육 타입으로 전환을 촉진하며, 이는 미토콘드리아의 활성이 증진되는 것임을 실험적으로 확인하였다(도 3).

SDH(Succinic acid dehydrogenase)는 미토콘드리아 내막에 위치한 효소 complexⅡ에 포함된 것으로, 크렙스 회로 및 전자 전달계에서 숙신산에서 푸마르산으로의 산화에 관여하는 효소이다. NADH-TR(NADH-tetrazolium reductase)은 미토콘드리아에서 탈수소효소 활성을 분석할 수 있다. NADH는 세포 호흡 중 미토콘드리아 전자전달계의 complexⅠ에서 coenzyme Q로 전자를 전달하는 것으로, 이때 사용되는 NBT(Nitro blue tetrazolium)은 전자 전달을 방해해서 포마잔(formazan)을 형성하도록 한다. 따라서 상기 SDH 및 NADH-TR 염색을 통해 미토콘드리아 활성 여부를 관찰할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서 전경골(TA) 근육의 SDH 및 NADH-TR의 활성을 면역염색으로 관찰한 결과, 아로니아 추출물 투여군에서 활성이 증진되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 근육 내 미토콘드리아 활성을 증진시키기 때문에 결과적으로 근육에서의 에너지 수지를 개선하는 효과를 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 아로니아 추출물은 근력 향상 효과를 가진다. 아로니아 추출물의 미토콘드리아 활성 증진은, 근육 성장 및 근 지구력을 향상시키는 효과를 가지며, 아울러 근육량의 증가, 근력 향상, 근육 회복력 강화, 근육 피로 감소 등 근육 기능을 개선할 수 있는 효과를 가질 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 확인한 바, 아로니아 추출물을 투여한 마우스에서 근섬유 사이즈가 증가된 것을 확인하였으며, 실질적으로 근력이 향상되는 효과가 있음을 Grip strength를 측정함으로써 확인하였다.

본 발명의 아로니아 추출물은 또한, 운동 수행능력을 향상시킬 수 있다. "운동 수행능력"이라 함은, 근력을 이용하여 운동을 수행하는 능력을 말하며, 이 때 근력은 근육의 양, 근 지구력, 산화성 근육량의 증가, 근육 회복력 및 근육 내 에너지 수지의 개선에 의해 향상될 수 있으며, 또한 근육 내 피로물질 감소 등에 의해서도 증진될 수 있다. 본 발명의 아로니아 추출물은 상기 나열된 다양한 근육에 대한 효과를 통하여, 근육을 통한 운동수행 능력을 증진시키는 효과를 가진다.

본 발명의 상기 조성물은 의약품, 건강기능식품, 기능성 식품, 동물용 사료, 세포 배양액 조성물 등 다양한 용도로 활용될 수 있으며, 근원 세포의 분화 촉진, 근육 내 미토콘드리아의 활성을 증진 및 근육량 증가를 통해, 근육 질환에 대한 예방, 개선 또는 치료 효과를 가진다.

또한 상기 조성물 내 포함되는 아로니아 추출물의 농도는 0.001 내지 10%(mg/mL)일 수 있고, 바람직하게는 0.05 내지 5%(mg/mL)일 수 있고, 가장 바람직하게는 0.1 내지 1%(mg/mL)일 수 있으나, 특별히 농도에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 아로니아 추출물의 농도 의존적으로 효과가 우수한 것을 확인하였다.

본 명세서에서 용어 "예방"은 본 발명에 따른 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 근육 질환을 억제시키거나 발병을 지연시킬 수 있는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 용어 "치료"는 본 발명에 따른 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 제형화에 필요한 담체 혹은 부형제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 유효 성분에 추가로 포함될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 포함된다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

예를 들어, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 적어도 면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구 투여(정맥주사, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)될 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도 및 약물 형태, 투여 경로 및 시간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절한 형태로 선택될 수 있다.

본 발명의 상기 약학적 조성물은, 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 양으로, 질병을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 그 기준은 환자의 질환, 중증도, 약물 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 병용되는 성분 및 기타 사항에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물은, 개별 치료제 혹은 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용을 최소화할 수 있는 수준으로 투여량을 결정할 수 있고, 이는 당업자에 의해 용이한 수준으로 결정될 수 있다. 구체적으로 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 연령, 체중, 중증도, 성별 등에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 체중 1kg 당 0.001 내지 150 mg, 보다 바람직하게는 0.01 내지 100mg의 양을 매일 또는 격일, 1일 1 내지 3회 투여할 수 있다. 다만, 이는 예시적인 것으로, 상기 투여량은 필요에 달리 설정할 수 있다.

또한 본 발명의 상기 조성물은 식품 또는 건강기능식품일 수 있으며, 특히 상기 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 상기 식품 또는 건강기능식품은, 근육 질환의 예방 및 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등 약학적 투여 형태 또는 티백, 침출자, 음료, 캔디, 젤리, 껌 등의 건강 기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.

본 발명의 상기 식품 또는 건강기능식품 조성물은, 식품 첨가물로 사용될 수 있으며, 단독으로 혹은 다른 성분과 조합하여 제품화될 수 있다. 또한, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제 및 증진제, 펙트산 및 이의 염, 알긴산 및 이의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함될 수 있다. 상기 성분은 단독 혹은 조합하여 사용될 수 있으며, 적절한 함량으로 조합되어 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시 양태로서, 본 발명은 아로니아 추출물을 포함하는 근력 강화용 조성물에 대한 것이다.

상기 "근력 강화"란, 신체 수행의 강화, 최대 지구력의 강화, 근육량의 증가, 근육 회복의 강화, 근육피로의 감소, 에너지 수지의 개선 또는 이들의 조합 효과를 말한다. 상기 조성물은 근원세포를 근육 세포로 분화시키는 능력을 통하여 근육량을 증가시켜 전체 근육량을 증가시킬 수 있으며, 최대 지구력이 강화되고, 이에 따라 신체 수행이 강화되고 근육 피로도 감소할 수 있다. 또한, 근육 세포가 빠르게 대체될 수 있기 때문에 근육의 손상을 빠르게 치유할 수 있다. 또한, 본 발명의 근력강화용 조성물은 식품조성물 또는 식품첨가제 형태로 제조될 수 있으며, 특히 건강식품 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 상기 식품조성물은 상기 설명한 바와 같다. 따라서, 본 발명의 근력 강화용 조성물은 노화에 의한 근육 감소 뿐만 아니라 일반인의 근육 생성, 근력 강화에 대한 보조제 등의 형태로 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 실시 양태로서, 본 발명은 아로니아 추출물을 포함하는 사료 또는 사료 첨가용 조성물에 대한 것이다.

본 발명에서, '사료'란, 동물의 생명을 유지하는데 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 의미한다. 상기 사료는 가축 등의 동물이 필요로 하는 에너지, 단백질, 지질, 비타민, 광물질 등의 영양소를 포함하며, 곡물류, 근과류, 식품가공부산물류, 조류, 섬유질류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류 등의 식물성 사료 또는 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질 등의 동물성 사료가 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, '사료 첨가제'란, 동물의 생산성 향상이나 건강을 증진시키기 위해 사료에 첨가되는 물질을 의미하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 성장 촉진, 질병 예방 등을 위한 아미노산제, 비타민제, 효소제, 향미제, 규산염제, 완충제, 추출제, 올리고당 등이 더욱 포함될 수 있다.

상기 본 발명의 사료 또는 사료 첨가제에 포함되는 아로니아 추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 0.001 내지 10%(w/w)일 수 있고, 바람직하게는 0.05 내지 5%(w/w)일 수 있고, 가장 바람직하게는 0.1 내지 1%(w/w)일 수 있다.

본 발명은 아로니아 추출물을 포함하는 근육 질환에 대한 예방, 개선 또는 치료 목적의 조성물로서, 상기 조성물은 근육 세포의 분화 촉진 및 근육 세포에서의 미토콘드리아 활성 증진을 통하여 근력을 강화시키고, 근육량을 증가시키는 효과를 가지며, 이에 따라 다양한 근육 질환에 대한 치료 효과를 가지므로, 이에 대한 약학적 또는 건강기능식품 조성물로 사용될 수 있다.

도 1은 아로니아 추출물(AMC#9003)의 농도에 따른 근원세포(C2C12)에서의 분화 정도를 보여주는 것으로, AMC#9003을 농도별로 처리한 C2C12 세포의 분화 3일차 면역 염색 이미지로써 AMC#9003 농도 의존적으로 다핵구조의 myotube 형성이 증가된 것을 확인할 수 있다.
도 2는 농도별 아로니아 추출물(AMC#9003)이 처리된 C2C12 세포 분화 3일차에서 MHC⁺ myotube의 비율(*p<0.05)을 나타낸 것이다.
도 3은 C2C12 세포에서 아로니아 추출물(AMC#9003)이 처리되었을 때 MHC와 Myogenin의 발현에 대한 면역 블롯 분석 결과이다.
도 4는 C2C12 세포에 아로니아 추출물(AMC#9003)을 처리한 후, 근육 분화 신호전달에 관여하는 Akt 인산화 형태에 대한 결과를 확인한 것이다.
도 5는 근원 세포에서 아로니아 추출물(AMC#9003)의 농도별 미토콘드리아 활성 증진 효과에 대한 것으로, 도 5A는 마우스 뒷다리 근육(hindlimb muscle), 도 5B는 gastrocnemius (GA), soleus (SOL), tibialis anterior (TA), extensor digitorum longus (EDL)과 quadriceps (QU) 근육을 각각 관찰한 결과로서, 아로니아 추출물 투여군의 경우 대조군에 비해 진한 붉은색을 띄므로, 미토콘드리아 활성이 증진된 것을 알 수 있다.
도 6은 마우스 TA(전경골) 근육의 SDH과 NADH-TR을 각각 염색하여 확인한 이미지이며, 도 6B는 이를 정량화한 결과로서, AMC#9003 투여한 군에서 대조군 대비 SDH과 NADH-TR 활성이 증가된 것을 확인하였다.
도 7은 아로니아 추출물(AMC#9003)을 투여한 마우스의 근섬유 크기(myofiber size)를 측정하기 위하여 MHC 면역 염색을 수행하고, 이를 영상화하여 면적(myofiber area)을 분석한 결과이다.
도 8은 아로니아 추출물(AMC#9003)을 투여한 마우스의 근력(Grip strength)을 측정하여 대조군과 비교한 결과이다.
도 9는 덱사메타손(DEX)에 의해 근 위축이 유발된 C2C12세포에 아로니아 추출물(AMC#9003) 처리 시, 근 위축이 회복되는 것을 면역 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 10은 덱사메타손에 의한 근 위축이 유발된 C2C12세포에 아로니아 추출물(AMC#9003) 처리 시, 근 위축 회복 효과를 면역 블로팅으로 확인한 결과이다.
도 11은 덱사메타손에 의한 근 위축이 유발된 C2C12세포에 아로니아 추출물(AMC#9003) 처리 시 골격근-특이적인 ubiquitin ligases로 알려진 근위축 매개체, 즉 Atrogin-1/MAFbx 및 MuRF1의 mRNA 수준의 발현을 qRT-PCR로 측정한 결과이다.
도 12는 아로니아 추출물(AMC#9003)의 growth medium(GM, 성장배지)에서 C2C12 근원세포에 대한 MTT 어세이 결과이며, AMC#9003의 농도 의존적으로 C2C12 근원세포의cell viability가 증가하는 경향을 확인한 것이다.

이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. 아로니아 추출물의 제조

아로니아(Aronia melanocarpa. (Michx.) Elliott)는 2017년 7월 해솔푸드에서 구입하였고 성균관대 김기현 교수가 식물 재료를 확인하고, 바우처 표본 (No. AR2017)이 수원 성균관대학교 약학대학 식물 표본실에 기탁되어 있다.

반건조 아로니아 (0.5kg)을 세단하여 70% 에탄올(2L)을 이용하여 48시간 동안 실온에서 추출하였다. 해당 추출물을 여과하고 60℃에서 회전증발 농축기를 이용하여 농축하여 추출물 (22g)을 생산하였다.

실시예 2. 세포 분리 및 배양

C2Cl2는 C3H종의 생 마우스에서 얻은 근원 세포주로서, 근세포 분화 연구에 널리 사용되고 있다. 상기 C2C12세포는 일반적인 세포 배양용 배지와 분화용 배지에서 각각 배양하였다. 정상적인 세포 배양용 배지(GM, growth media)로는 15 % 어린 소혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 DMEM을 사용하였으며, 분화용 배지(DM, differentiation media)로는 2 % 말 혈청이 포함된 DMEM을 사용하였다.

실험예 1. 근원세포 분화 촉진 효과 확인

실시예 2의 C2Cl2 세포주를 세포 배양용 배지에 분주하여 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양한 후, 분화 배지에 아로니아 추출물을 각각 0(DMSO), 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.8 및 1.0 νg/mL의 농도로 각각 처리하고 상기 배지는 격일로 교체하면서 3일 동안 분화를 유도하였다.

분화 후, 세포들을 현미경으로 확인하였으며, 세포들을 파쇄하여 분화 마커인 Myogenin 및 MHC(myosin heavy chain) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 1 에서 보듯이, 아로니아 추출물(AMC#9003)을 농도별로 처리한 C2C12 세포의 경우 분화 3일차 면역 염색 이미지로써 AMC#9003 농도 의존적으로 다핵구조의 근관(myotube) 형성이 증가되어 있는 것을 알 수 있다. 도 2는 분화 3일차에 MHC+ 근관 형성 비율을 표시한 것으로, 대조군에 비하여 아로니아 추출물을 처리한 경우 MHC+ 근관 형성이 증가된 것을 확인하였다.

또한 도 3에서 보듯이, 아로니아 추출물(AMC#9003)을 농도별로 처리한 C2C12 세포는 MHC, Myogenin의 발현이 대조군에 비하여 증가되어 있는 것을 확인하였다. 상기와 같은 결과로부터, 아로니아 추출물은 근원세포의 분화를 촉진한다는 것을 확인하였다.

아로니아 추출물의 근원세포 분화 촉진 효과는 근육분화 신호전달에 관여하는 Akt 인산화에 의한 것임을 확인하기 위하여, 근원세포(C2C12)에 아로니아 추출물(AMC#9003)을 처리하고, 1시간, 2시간 및 6시간 경과 후 Akt 인산화를 관찰하였다. 그 결과, 도 4에서 보듯이, Akt 인산화 형태가 아로니아 추출물의 처리에 의해 증가된 것을 확인하였다.

실험예 2. 미토콘드리아 활성 촉진 확인

2-1. 마우스 뒷다리 근육 조직의 미토콘드리아 활성 촉진 효과

마우스의 근육 내 미토콘드리아 활성을 평가하기 위하여, AMC#9003을 8개월 수컷 마우스에 12 mg/kg의 농도로 8주 동안 투여한 군에서 미토콘드리아 활성 항진 효과를 확인하였다. 이는 마우스의 산화성 근육(oxidative muscle, slow twitch fiber) 타입 전화를 촉진하는지 여부를 통하여 확인할 수 있으며, 뒷다리 근육(hindlimb muscle)인 gastrocnemius (GA), soleus (SOL), tibialis anterior (TA), extensor digitorum longus (EDL)및 quadriceps (QU)에서 변화를 육안으로 관찰하고, 이를 분석 및 정량화 하였다.

그 결과, 도 5에서 보듯이, 대조군에 비하여 아로니아 추출물을 주입한 마우스 뒷다리 근육은 전체적으로 진한 붉은색을 띄는 것을 관찰할 수 있었다(도 5A). 또한 상기 5종류의 뒷다리 근육 모두에서 아로니아 추출물을 투여한 경우 대조군 대비 진한 붉은 색상을 띄는 것을 확인하였다(도 5B).

2-2. SDH 및 NADH-TR 염색법

상기 아로니아 추출물의 근육 내 미토콘드리아 활성 촉진 여부를 확인하기 위하여 마우스의 뒷다리 근육(hindlimb muscle) 조직을 OCT (Sakura Tissue Tek)에 매립하고 염색을 위해 7μm 두께로 분할하였다. NADH 탈수소효소 활성을 분석하기 위해 3.5mM 인산염 완충액 (pH 7.4)에서 0.9mM NADH 및 1.5mM 니트로 블루테트라졸륨(Sigma)으로 30 분 동안 샘플을 배양하였다. 숙신산 탈수소효소 (SDH) 활성을 분석하기 위해 K-EGTA (Sigma)를 포함하는 114 mM 인산화 버퍼에서 50μM 숙신산나트륨 및 0.3mM 니트로블루 테트라졸륨(Sigma)으로 샘플을 1 시간 동안 배양하였다.

그 결과, 도 6에서 보듯이, 아로니아 추출물을 처리한 군에서, 대조군 대비 SDH 및 NADH-TR 활성이 증가되어 있는 것을 면역 염색을 통해 관찰하였으며, 그 결과를 정량화한 결과, 도 6B와 같이 아로니아 추출물 처리군의 활성이 증가된 것을 확인하였다.

실험예 3. 근섬유 크기 증가 확인

실험동물은 생후 8개월령의 C57BL/6 수컷 마우스를 이용하였다. 아로니아 추출물(AMC#9003)을 8개월 수컷 마우스에 12 mg/kg의 농도로 8주 동안 투여하고, 전경골 근육(TA muscle)에서 근섬유 크기를 측정하였다. 전경골 근육(TA muscle) 섹션에 MHC 면역 염색을 수행하고 Nikon ECLIPSE TE-2000U를 이용하여 섹션의 영상을 획득하였으며, ImageJ software를 활용하여 근섬유 면적을 분석하였다.

그 결과 도 7에서 보듯이, 아로니아 추출물을 처리한 군에서 근섬유 면적이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 이는 아로니아 추출물이 근육의 크기를 증가시키며, 이로 인하여 근육량의 증가를 유도할 수 있다는 것을 의미한다.

실험예 4. 아로니아 추출물의 근력 강화 효과 확인

실험동물은 생후 8개월령의 C57BL/6 수컷 마우스를 이용하였다. 아로니아 추출물(AMC#9003)을 8개월 수컷 마우스에 12 mg/kg의 농도로 8주 동안 투여하고 운동 능력의 변화를 Grip strength를 통해 관찰하였다.

그 결과, 도 8에서 보듯이, 비 투여군인 대조군에 비하여 아로니아 추출물 투여군에서 근력이 보다 향상되어 있음을 확인하였다.

실험예 5. 아로니아 추출물의 근 위축증 치료 효과 확인

아로니아 추출물이 DEX(dexamethasone)-유발 근육 위축으로부터 근육을 회복 또는 보호할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, C2C12 근원세포를 이용한 실험을 수행하였다.

C2C12 근원세포를 DM(분화 배지)에서 2일 동안 분화시킨 다음, 100μM DEX를 4시간 동안 전처리 하고 vehicle로 DMSO와 함께 아로니아 추출물을 농도별(0, 0.1, 1, 10 μg/mL)로 처리하고 24시간 동안 DM에서 추가 배양하였다.

그 결과, DEX-처리한 C2C12 근관세포는 대조군 대비 근관세포의 직경이 얇아졌으며, 근관세포 중간중간 잘라지는 것을 확인하였다. 그러나, 아로니아 추출물 처리 시, 농도 의존적으로 DEX에 의해 얇아진 근관세포의 직경이 대조군 (DMSO 처리군)과 동등하게 회복/개선되었음을 확인하였다(도 9).

또한, MHC에 대한 면역 블롯팅 결과, DEX에 의해 감소된 MHC의 발현이 아로니아 추출물을 처리하였을 때, 농도 의존적으로 증가된 것을 알 수 있다 (도 10).

또한, 골격근-특이적인 ubiquitin ligases로 알려진 근위축 매개체, 즉 Atrogin-1/MAFbx 및 MuRF1의 mRNA 수준의 발현을 qRT-PCR로 측정하였다. 그 결과, DEX에 의해 증가된 MuRF1과 Atrogin-1의 mRNA 발현이 아로니아 추출물 처리에 따라 농도의존적으로 감소됨을 확인하였다 (도 11).

즉, 상기 결과로부터 아로니아 추출물이 골격근 특이적인 ubiquitin ligases인 MuRF1과 Atrogin-1의 발현을 억제하고 DEX에 의한 근관세포 직경의 회복과 MHC 발현 그리고 근관세포의 fusion을 상향조절하여 근위축을 예방 또는 개선할 수 있는 효능이 있음을 규명하였다.

특히, 골격근 특이적인 ubiquitin ligase의 저해 및 근관세포의 직경과 MHC 발현의 증가/회복은 Akt signaling에 의한 것으로 유추할 수 있다.

실험예 6. 아로니아 추출물의 세포 독성 평가

MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 어세이는 미토콘드리아의 숙신산 탈수소효소에 의해 MTT로부터 포마잔(formazan)형성이 촉매되는 환원 반응이다. MTT assay는 미토콘드리아 대사에 의존하므로 살아있는 세포 비율을 분석하여, 세포 독성이 있는지 여부를 확인할 수 있다.

C2C12 세포 (1.0 Х 10⁴ cells)에 AMC#9003을 농도별로 24시간동안 처리하고, 5 mg/mL의 MTT를 처리한 후 흡광도를 측정하였다. 결과값을 비교하기 위하여, DMSO 처리군의 생존을 1로 하였을 때 상대적 값으로 세포 생존 비율을 처리 농도별로 표현하였다.

그 결과, 도 12에서 보듯이, 아로니아 추출물(AMC#9003) 처리 시, 대조군과 비교하여 세포 생존률이 감소되지 않으며, 농도 의존적으로 C2C12 근원세포의cell viability가 증가하는 경향을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명에서 사용되는 아로니아 추출물은 상기 농도 범위에서 세포 독성을 가지지 않는 것임을 알 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

1. 아로니아 추출물을 포함하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 아로니아 추출물은 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 추출 용매로 추출된 것인, 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 근육 질환은 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질 (cachexia), 심위축증 및 근육감소증(sarcopenia)을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인, 약학적 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 근육 질환은 노화, 근 기능 저하, 근육 소모, 근육 퇴화 또는 근육 손상으로 인하여 유발되는 것임을 특징으로 하는 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 아로니아 추출물은 근육 내 미토콘드리아 활성을 촉진하는 것임을 특징으로 하는 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 아로니아 추출물은 근원 세포의 분화를 촉진하는 것임을 특징으로 하는 조성물.
7. 아로니아 추출물을 포함하는 근육 질환의 예방 또는 개선용 건강기능 식품 조성물.
8. 아로니아 추출물을 포함하는 근력 강화용 조성물.
9. 아로니아 추출물을 포함하는 운동 수행능력 향상용 조성물.
10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 식품, 기능성 식품, 건강기능 식품, 의약품, 동물용 사료 또는 사료 첨가제 중 하나 이상 선택되는 것인, 조성물.
11. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 근육 내 미토콘드리아 활성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 조성물.

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