KR101222779B1

KR101222779B1 - 식용피 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR101222779B1
Application number: KR1020100073324A
Authority: KR
Inventors: 김영호; 오인택; 이제원; 박동화; 전도연; 서명철; 이재생; 강종래; 남민희
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2010-07-29
Filing date: 2010-07-29
Publication date: 2013-01-15
Also published as: KR20120011498A

Abstract

본 발명은 식용피 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 식용피 추출물의 탄수화물 소화효소인 α-아밀라아제 및 α-글루코시다제에 대한 탁월한 저해활성을 확인함으로써 당뇨병의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품의 제공으로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

식용피 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학조성물 {A composition comprising the extract of Barnyardgrass as an active ingredient for preventing and treating inflammatory disease}

본 발명은 식용피 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품에 관한 것이다.

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당뇨병은 혈중 포도당 수준이 높은 것으로 특징지어지는 대사질환이다. 전 세계적으로 당뇨병은 1억 8천만 명의 사람들이 앓고 있으며, 2030년에는 두 배 이상으로 환자수가 증가할 것으로 예측되고 있다. 최근에는 당뇨병 환자수가 빠른 속도로 증가하고 있을 뿐만 아니라 그 발병 연령이 점차 낮아지고 있는 추세이다. 당뇨병은 2가지로 분류되고 있는데, 제 1형 당뇨병은 췌장에서 인슐린의 생성과 분비를 담당하는 β세포가 자가면역질환에 의하여 손상을 입어 인슐린이 분비되지 않는 것이 그 원인이다. 따라서 혈중 포도당이 세포내로 흡수가 일어나지 않아 당뇨병으로 연결된다 (Brands et al., 2008). 반면에, 전체 당뇨병의 약 90%를 차지하고 있는 제 2형 당뇨병은 췌장의 β세포에 의해 인슐린의 분비는 정상적으로 일어나지만, 인슐린의 활성 또는 간이나 근육세포에 대한 인슐린의 작용력이 떨어져서 혈당 강하작용이 제대로 일어나지 못하기 때문에 발생하는 질환이다. 제 1형 당뇨병을 인슐린 의존성 당뇨병, 제 2형 당뇨병을 인슐린 비의존성 당뇨병이라고 한다 (Moller, 2001; Vidal-Puig et al., 2001).

현재 임상에서 당뇨병의 치료제로는 설포닐우레아 (sulfonylurea)계통, 비구아니드 (biguanide)계통, 치아졸리딘다이온 (thiazolidinedione)계통, 그리고 α-아밀라아제 (amylase) 저해제 및 α-글루코시다제(glucosidase) 저해제 계통의 약제들이 사용되고 있다. 그 작용기전으로서, 설포닐우레아 (Sulfonylurea) 계통의 약제는 췌장의 β세포의 수용체와 결합하여 세포내에 Ca² ⁺를 증가시키고 그 결과 사이토스켈레톤 (cytoskeleton)에 영향을 미쳐 세포 밖으로의 인슐린 과립의 유출을 자극하여 인슐린 분비를 증가시킨다 (UKPDS group, 1998; Fineman et al., 2003). 비구아니드(Biguanide)계통의 약제는 간에서의 포도당신생 (gluconeogenesis)을 감소시키고 근육세포에서의 AMP 키나아제(kinase) (AMPK) 활성을 증대시켜 글루코오스(glucose)의 소비를 촉진하는 역할을 한다 (Large et al., 1999; Cryer et al., 2005; Musi et al., 2002). 치아졸리딘다이온(Thiazolidinedione)계통의 약제는 인슐린 표적세포의 핵내에 존재하는 전사인자인 PPAR-γ와 결합하여 인슐린에 반응하는 여러 종류의 단백질 합성을 촉진시켜 인슐린의 작용을 증진시키는 작용을 한다 (Brunmair et al., 2001; Moller, 2001). 이를 통해 제2형 당뇨병의 주된 원인인 인슐린 저항성을 개선해 준다. 또한, α-아밀라아제 (amylase) 저해제 및 α-글루코시다제 (glucosidase) 저해제 계통의 약제는 탄수화물이 소화효소에 의해 단당류로 가수분해되는 것을 억제하는 작용을 하므로 식후 혈당 상승을 완만하게 한다 (Chen et al., 2006; Moller, 2001). 대부분 당뇨병 치료과정에 있어서는 이러한 약제들을 두 가지 이상 동시에 조합하여 사용하여, 그 결과 약제 서로간의 상승효과에 의해 혈당이 효과적으로 저하되도록 한다 (Tosi et al., 2003).

한편, α-아밀라아제 (amylase) 저해제 및 α-글루코시다제(glucosidase) 저해제와 같은 탄수화물 소화 억제제는 식후 체내 혈당의 급격한 상승을 완화시키므로 당뇨병 환자의 치료에 유용한 약제로 알려져 있다. 현재 당뇨병 치료를 위해 상용되는 탄수화물 소화 억제제로는 아카보스(acarbose) (도 1A 참조)와 보글리보스 (voglibose) (도 1B 참조)가 알려져 있다. 아카보스 (acarbose)는 슈도테트라사카라이드 (pseudotetrasaccharide)의 일종으로 올리고사카라이드 (oligosaccharide)와 유사한 구조를 지니고 있어서 탄수화물 분해효소인 α-아밀라아제 (amylase), 글루코아밀라아제(glucoamylase), 인베르타아제(invertase), 덱스트라나아제 (dextranase), α-글루코시다제 (glucosidase), 말타아제 (maltase)의 기질에 대한 효소작용을 경쟁적으로 저해하며, 각 효소들과의 친화력은 왼쪽의 α-아밀라아제 (amylase)의 경우가 가장 강하며 오른쪽 α-글루코시다제 (glucosidase), 말타아제 (maltase)의 경우는 가장 약하다. 또한, 아카보스 (acarbose)는 인베르타아제(invertase)에 대한 친화력이 수크로오스 (sucrose)에 비해 10⁴~10⁵배 정도 강하지만, 아이소말타아제 (isomaltase) 및 β-글루코시다제 (glucosidase)와는 친화력이 매우 낮거나 없어서 아이소말타아제 (isomaltase)와 β-글루코시다제 (glucosidase)에 대한 저해효과는 크지 않다 (Laube, 2002). 한편, 보글리보스 (voglibose)는 발리올아민 (valiolamine) 유도체의 일종으로 모노사카라이드 (monosaccharide)와 유사한 구조이며 α-글루코시다제(glucosidase)는 효과적으로 저해하지만 α-아밀라아제 (amylase)는 저해하지 못한다 (Chen et al., 2006).

식후 혈당의 갑작스런 증가를 완화하기 위해 α-아밀라아제(amylase) 저해제 및 α-글루코시다제 (glucosidase) 저해제를 복용하면 그 영향으로 탄수화물의 소화 및 흡수가 원활하지 못하므로 소화되지 못한 탄수화물을 이용하는 장내 세균의 수가 증가한다. 또한 소화되지 못한 탄수화물과 당류는 결장의 세균 유래 효소에 의해 분해된 뒤 대사되어 아세틱엑시드(acetic acid), 뷰티릭엑시드 (butyric acid), 락틱엑시드 (lactic acid)와 같은 유기산 생성에 관여하게 된다. 생성된 유기산들은 장내의 pH를 저하시키며 삼투압을 증가시켜 설사와 복통을 유발할 수 있으며, 또 다른 대사부산물인 이산화탄소, 메탄 등의 기체는 복부 팽만감 등의 부작용을 일으킬 수 있다 (Jeong et al., 2002).

식용피 (Echinochloa crusgalli)는 일년생 초본과 작물로 잎은 편평하고 선형이며 길이 30~50 cm, 폭 1~2 cm 이고 털은 없으며 가장자리는 깔깔하다. 엽초는 밑부분의 것은 홍자색이 돌고 껄끄럽거나 털이 없고 엽설은 없다. 높이 80~100 cm, 지름 2~5 mm 정도이고 총생하며 밑부분에서 가지가 갈라진다. 꽃은 7-8월에 피며 원추화서는 성글게 배열되고 자주빛을 띠며 길이 10~25 cm 이고 화서축은 굵고 기부에 가시 같은 털이 있다. 첫째 포영은 길이 1-1.5 mm 이며 5맥이 있고 맥줄에 가시털이 있다. 둘째 포영은 소수와 길이가 비슷하며 5맥이있고 끝은 점점 뾰족한 까락으로 끝난다. 호영은 막질이며 7맥이 있고 끝에 길이 2~4cm의 까락이 있거나 없다. 내영은 길이 3-3.5 mm로서 예두이다. 영과는 타원형으로서 길이 3 mm 정도이다 (들뫼곳간 웹도감 http://plant.ecolib.kr).

우리나라는 현재 논농사 위주의 농업형태를 취하고 있으므로 전통 잡곡류의 재배 및 수확은 미약하며, 잡곡류는 별식이나 주식의 혼반용으로 이용되고 있는 실정이다 (Soh et al., 2002). 최근 들어 건강기능성 웰빙식품에 대한 관심이 증가하면서, 잡곡류의 기능성에 대한 관심, 잡곡의 재배 및 소비도 증가 추세에 있다. 그러나 잡곡류의 생리활성에 대한 체계적인 연구가 매우 부족하며, 특히 비만 및 당뇨병과 관련된 잡곡류의 효능에 대한 연구는 거의 이루어지지 않은 실정이다.

이에 본 발명자들은 생체에 부작용이 없으면서 식후 급격한 혈당 상승을 억제하는 작용이 우수한 물질을 찾고자, 식용피 추출물의 약리학적 효과를 실험한 결과, 식용피 추출물의 탁월한 α-아밀라아제 (amylase)와 α-글루코시다제 (glucosidase) 저해 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식용피 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 식용피 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 식용피의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 “조추출물”은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 60 내지 90% 에탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 “극성용매 가용 추출물”은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매, 바람직하게는 물 또는 부탄올, 보다 바람직하게는 부탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 “비극성용매 가용 추출물”은 헥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트, 바람직하게는 헥산, 메틸렌 클로라이드, 또는 에틸아세테이트, 보다 바람직하게는, 메틸렌 클로라이드 또는 에틸아세테이트 용매에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 당뇨병은 제1형 또는 제2형 당뇨병, 바람직하게는 제2형 당뇨병을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 식용피 추출물은 하기와 같이 제조될 수 있다. 식용피를 세척 및 세절 후 1분 내지 30분, 바람직하게는 5분 내지 20분간 마쇄하여 60% 내지 90% 에탄올 수회 섞은 다음에 30℃ 내지 150℃, 바람직하게는 50℃ 내지 100℃의 온도에서 환류추출하여 얻은 상기 추출액을 1,000rpm 내지 20,000rpm, 바람직하게는 5,000rpm 내지 15,000rpm의 속도로 5분 내지 30분, 바람직하게는 10분 내지 25분간 원심분리하여 상등액만을 따로 모아 감압 농축, 건조하여 본 발명의 식용피 조추출물을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 극성용매 또는 비극성용매 가용 추출물은 상기에서 얻은 조추출물, 바람직하게는 60 내지 90% 에탄올 조추출물 중량의 약 0.0005 내지 0.005배, 바람직하게는 0.05 내지 0.5배 부피(v/w%)의 물을 가한 후, n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 및 부탄올을 이용한 통상적인 분획과정을 수행하여 n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 등의 비극성 용매에 가용한 비극성 용매 가용 추출 분획물; 및 부탄올, 물 등의 극성용매에 가용한 극성용매 가용 추출 분획물을 수득할 수 있다.

본 발명자들은 상기 제조방법으로 수득되는 식용피 추출물을 대상으로 한 α-아밀라아제 (amylase) 및 α-글루코시다제 (glucosidase)의 탁월한 저해활성 효과를 확인함으로써 당뇨병의 예방 및 치료의 유용한 약학조성물 및 건강기능식품의 제공에 유용함을 확인하였다.

따라서 본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 식용피 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 식용피 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 식용피 추출물을 함유하는 당뇨병의 예방 및 치료를 위한 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50중량%로 포함한다.

본 발명의 식용피 추출물을 함유하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 식용피 추출물을 함유하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 분획물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.5 g/kg 내지 5 g/kg으로, 바람직하게는 1 g/kg 내지 3 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 식용피 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 당뇨의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 1 내지 5 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 식용피 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 식용피 추출물은 탄수화물의 소화효소인 α-아밀라아제 (amylase) 및 α-글루코시다제 (glucosidase)의 효소작용을 탁월하게 억제하는 효과를 보여 당뇨병의 치료 및 예방의 유용한 약학조성물 또는 건강기능식품으로서 사용할 수 있다.

도 1은 아카보스 (acarbose) 와 보글리보스 (voglibose)의 구조를 나타내는 도이고,
도 2는 다양한 용매를 이용한 80% 에탄올 추출물의 분류 도식을 나타내는 도이고,
도 3은 α-아밀라아제 (amylase)에 대한 식용피를 비롯한 다양한 곡물의 80% 에탄올 추출물의 저해활성을 나타내는 도이고,
도 4는 α-글루코시다제 (glucosidase)에 대한 식용피를 비롯한 다양한 곡물의 80% 에탄올 추출물의 저해활성을 나타내는 도이고,
도 5는 α-글루코시다제 (glucosidase)에 대한 찰수수와 식용피의 유기 용매 분획물의 저해활성을 나타내는 도이고,
도 6는 (A) 다양한 곡물의 80% 에탄올 추출물 (B) 찰수수, 황금찰수수, 식용피, 기장의 유기 용매 분획물에서 총 페놀화합물의 정량을 나타내는 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 시약 및 기기

1-1. 식용피 조추출물 추출 시 사용한 시약 및 기기

식용피의 추출과 분획에 사용한 용매는 (95% ethanol (Duksan), 99.5% methylene chloride, 99.5% ethyl acetate, 96.0% n-hexane, 99.0% n-butanol (동양제철화학))을 사용하였으며, 사용한 기기는 회전 감압농축기 (Rotary vacuum evaporator; Heidolph LR 4000, Germany), aspirator (Eyela A-3S, Japan)를 사용하였다.

1-2. 실험에 사용한 작물의 획득

실험에 사용한 식용피 (Echinochloa crusgalli)는 국립식량과학원 기능성작물부 (경남 밀양)로부터 제공받았다. 식용피는 종자와 피가 있는 조곡의 형태와 피를 벗기고 종자만 남은 정곡의 형태로 분류하였다. 식용피는 조곡의 형태로 100 g을 제공받았다(표 1 참조).

No	작물명	시료형태	시료량(kg)
1	기장	정곡	1
2	노랑찰기장	조곡	1
3	찰수수	정곡	1
4	황금찰수수	조곡	1
5	흰찰수수	조곡	1
6	노란차조	정곡	0.4
7	메조	정곡	1
8	청차조	정곡	1
9	청차조	조곡	1
10	황금조	조곡	1
11	식용피	조곡	0.1
12	율무	정곡	1
13	팥	정곡	1

실시예 1. 식용피의 추출 및 분획

1-1. 식용피 조추출물의 분리

국립식량과학원 기능성작물부 (경남 밀양)로부터 제공받은 식용피의 종자 63g을 세척 및 세절 후 Blender 7012 (Dynamics Corporation, USA)로 10분간 마쇄하여 80% 에탄올 1000ml를 3회 (1회에 3시간씩) 섞은 다음에 80℃의 온도에서 환류냉각장치 (Corning 2560-400, USA)를 이용한 환류추출법을 수행하여 얻은 상기 추출액을 10,000 rpm의 속도로 20분간 원심분리하여 상등액만 따로 모아 회전식 감압농축기 (rotary vacuum evaporator)(Heidolph LR 4000, Germany)로 감압 농축, 건조하여 80% 에탄올 식용피 추출물(이하 “YP-2” 라 명명 함) 2.24g (수율 3.55%)을 수득하였다(도 2 ; 표 2 참조).

1-2. 극성 용매 및 비극성용매 가용 식용피 추출물의 분획

실시예 1-1에서 얻은 80% 에탄올 추출물의 소량을 남기고 나머지를 물 500 ml에 녹여서 (녹지 않는 부분을 n-헥산에 녹여 수층에 넣고 계속 분획하였다.) n-헥산(500 ml × 3 회)을 붓고 분별이 이루어진 후 n-헥산층을 농축하여 n-헥산 분획(이하 “YP-2HE” 라 명명 함)을 얻었다. 이어서 상기 수층을 메틸렌 클로라이드(500 ml × 3 회)로 추출하였으며, 메틸렌 클로라이드 층을 농축하여 메틸렌 클로라이드 분획(이하 “YP-2MC” 라 명명 함)을 얻었다. 이어서 수층을 에틸 아세테이트(500 ml × 3 회)로 추출하고 추출액을 농축하여 에틸 아세테이트 분획(이하 “YP-2EA” 라 명명 함)을 각각 얻었다. 이어서 상기 수층을 n-부탄올(500 ml × 3 회)로 추출하여 농축하여 n-부탄올 분획(이하 “YP-2BU” 라 명명 함)을 얻었다. 최종적으로 남은 상기 수층 또한 농축하여 수층분획(이하 “YP-2WA” 라 명명 함)을 얻었다 (도 2 ; 표 2 참조).

** Dry weight of ethanol extracts and various organic solvent fractions								(gram)
No	잡 곡	추출량	Ethanol	Hexane	Methylene chloride	Ethyl acetate	n- Butanol	d'H ₂ O
1	기장 정곡	500	28.3	-	3.81	0.05	0.48	0.62
2	노랑찰기장 조곡	500	26.48	3.08	0.75	0.97	0.80	1.10
3	찰수수 정곡	400	23.31	1.82	1.25	0.18	0.83	0.66
4	황금찰수수 조곡	400	23.24	2.28	0.34	0.77	1.52	4.49
5	흰찰수수 조곡	500	22.17	2.45	1.75	0.27	1.40	2.71
6	노란차조 정곡	250	15.01	1.23	0.79	0.67	2.61	1.28
7	메조 정곡	500	34.3	2.86	7.18	1.69	1.99	1.09
8	청차조 정곡	500	40.34	3.04	3.68	0.60	9.32	5.93
9	청차조 조곡	500	17.63	2.29	0.85	0.33	3.19	3.16
10	황금조 조곡	500	29.01	1.47	0.51	0.31	1.37	1.79
11	식용피 조곡	63	2.24	0.58	0.27	0.13	0.54	0.77
12	율무 정곡	500	37.96	0.89	1.65	0.72	0.68	2.32
13	팥 정곡	500	24.75	0.15	6.34	0.19	1.57	10.2

참고예2 . 탄수화물 소화효소 실험에 사용한 물질 및 기기

α-Amylase (from human salivary, A1031), α-glucosidase (from Brewer's yeast, G4634), 기질로 사용한 soluble starch, p-nitrophenyl-a-D-glucopyranoside와 이 두 효소의 저해제로 알려진 표준물질인 아카보스 (acarbose, A8980)는 Sigma (St, Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 식용피의 추출물에 함유된 폴리페놀화합물의 정량에 사용한 Folin-Ciocalteu's phenol reagent는 Fluka (Sigma-Aldrich, Schweiz, Switzerland)에서 구입하였고, 폴리페놀화합물 표준물질로 사용한 tannic acid는 Avondale Laboratories (Oxon, England)로부터 구입하였다.

실험예 1. α- 아밀라아제 저해활성 측정

상기 실시예 1에서 수득한 시료들의 α-아밀라아제 저해활성을 측정하기 위하여 하기와 같이 문헌에 개시된 방법을 응용하여 실험을 실시하였다 (Wilson et al., 1982).

1-1. 식용피 에탄올 추출물의 α- 아밀라아제 저해활성

인체 타액 유래의 α-아밀라아제는 PBS (Gibco 21600-010, USA)에 40 unit/ml로 용해시키고, α-아밀라아제의 기질로써 가용성 전분을 PBS에 1% 농도로 녹여서 사용하였으며, 또한 α-아밀라아제에 대한 저해제로써 식용피의 에탄올 추출물과 각 유기용매 분획물을 1 mg/ml 농도로 디메틸설폭사이드 (Dimethylsulfoxide; DMSO, Kanto chemical 10378-73, Japan)에 녹여 사용하였다. α-아밀라아제에 대한 저해활성을 측정하기 위해, 290 μl PBS, 10 μl α-아밀라아제 용액 (40 unit/ml) 및 50 μl 식용피 추출물 (1 mg/ml)을 혼합한 후 37℃의 온도에서 10분간 전배양 (preincubation)을 실시하였다. 이후 기질인 1% 가용성 전분용액을 350 μl를 첨가하고, 37℃의 온도에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 잔존하는 가용성 전분의 양을 측정하기 위해, 반응액 (700 μl)에 5% 요오드화 칼륨 (potassium iodide)용액에 요오드 (I₂)를 0.5%가 되도록 용해시킨 후, 0.05 N HCl 용액에 50배로 희석한 요오드 용액 (0.1% KI + 0.01% I2/0.05N HCl) 300 μl을 가하여 발색시키고 분광광도계 (Shimadzu UV-1650PC, Japan)를 이용하여 620 nm에서 흡광도 (optical density)를 측정하여 α-아밀라아제 저해활성을 조사하였다 (표 3 참조). 대조군 (control)은 기질인 가용성 전분과 효소인 α-아밀라아제, 그리고 식용피 유래 에탄올 추출물 및 각 유기용매 분획 대신에 추출물을 녹이는데 사용한 용매인 DMSO를 가하였고, 시료군 (sample)에는 기질인 가용성 전분과 효소인 α-아밀라아제, 그리고 식용피 유래 에탄올 추출물 및 각 유기용매 분획을 가하였다. 또한 블랭크 1 (blank 1)에는 기질인 가용성 전분과 식용피 유래 80% EtOH 추출물 및 각 유기용매 분획 대신에 추출물을 녹이는데 사용한 용매인 DMSO를 가하였고, 블랭크 2 (blank 2)에는 기질인 가용성 전분과 식용피 유래 에탄올 추출물 및 각 유기용매 분획을 가하였다. 한편, α-아밀라아제 저해제의 표준물질로서 아카보스도 50, 100 및 200 μg/ml의 농도로 DMSO에 녹여서 식용피 유래 시료 대신에 가하여 α-아밀라아제 저해활성을 시료들과 비교 조사하였다. 그 결과, α-아밀라아제 저해활성은은 하기 수학식 1과 같이 대조군 (control)의 흡광도와 블랭크 1 (blank 1)의 흡광도 차이에 대한 시료군 (sample)의 흡광도와 블랭크 2 (blank 2)의 흡광도의 차이의 비율을 먼저 계산한 다음, 그 값을 1에서 감한 후 100을 곱하여 백분율로 나타내었다.

	Control	Sample	Blank 1	Blank 2
α-Amylase solution	10 μl	10 μl	-	-
PBS	290 μl	290 μl	300 μl	300 μl
Inhibitor (Cereal extract)	-	50 μl	-	50 μl
DMSO	50 μl	-	50 μl	-
Preincubate at 37℃ for 10 min
1% Soluble starch solution	350 μl	350 μl	350 μl	350 μl
Incubate at 37℃ for 30 min
I₂ solution (0.1% KI + 0.01% I₂/0.05N HCl)	300 μl	300 μl	300 μl	300 μl
Read OD at 620 nm

상기 실험 결과, DMSO만을 첨가한 control 군에 비하여 식용피의 에탄올 추출물은 α-아밀라아제에 대한 19.9%의 저해활성을 보였다 (도 3 참조).

실험예 2. α- 글루코시다제 ( glucosidase ) 저해활성 측정

상기 실시예 1에서 수득한 시료들의 α-글루코시다제 저해활성을 측정하기 위하여 하기와 같이 문헌에 개시된 방법을 응용하여 실험을 실시하였다 (Kim et al., 2005; Park et al., 2008; Lee et al., 2008).

2-1. 식용피 에탄올 추출물의 α- 글루코시다제 저해활성

α-글루코시다제는 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8) (Dawson 외, Data for biochimecal research 참조하여 제조) 에 10 unit/ml의 농도로 stock soltion을 만들고, 처리 시 0.25 unit/ml의 농도로 희석한 다음 20 μl 씩 처리하였다. 기질은 p-나이트로페닐 (nitrophenyl)-α-D-글루코피라노사이드 (glucopyranoside)를 sodium phosphate buffer (50 mM, pH 6.8)에 3 mM의 농도로 녹여서 반응시켰다. 또한 α-글루코시다제에 대한 저해제로써 식용피의 에탄올 추출물을 10 mg/ml의 농도로 DMSO에 용해시켜 사용하였다. 먼저, 96-well plate (Corning CLS3595, USA)에서 20μl α-글루코시다제 희석액과 65μl sodium phosphate buffer (50 mM, pH 6.8), 15μl 식용피 에탄올 추출물을 혼합하고 37℃의 온도에서 10분간 전 배양을 실시한 후 기질인 3 mM p-나이트로페닐(nitrophenyl)-α-D-글루코피라노사이드 (glucopyranoside)용액 100 μl를 첨가하여 37℃의 온도에서 30분간 반응 하였다 (표4 참조). 반응 후에 microplate leader (Molecular devices Thermo max, USA)를 이용하여 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 저해율을 비교하였다. 이 때, 대조군(control)은 기질인 p-나이트로페닐(nitrophenyl)-α-D-글루코피라노사이드 (glucopyranoside)와 효소인 α-글루코시다제, 그리고 식용피 에탄올 추출물 및 각 유기용매 분획 대신 용매인 DMSO를 가하였고, 시료군 (sample) 에는 기질인 p-나이트로페닐(nitrophenyl)-α-D-글루코피라노사이드 (glucopyranoside)와 효소인 α-글루코시다제, 그리고 식용피 에탄올 추출물을 가하였다. 또한 블랭크 1 (blank 1)에는 기질인 p-나이트로페닐(nitrophenyl)-α-D-글루코피라노사이드 (glucopyranoside)와 식용피 에탄올 추출물 및 각 유기용매 분획 대신 용매인 DMSO를 가하였고, 블랭크 2 (blank 2)에는 기질인 p-나이트로페닐(nitrophenyl)-α-D-글루코피라노사이드 (glucopyranoside)와 식용피 에탄올 추출물을 가하였다. 한편, α-글루코시다제 저해제의 표준물질로써 아카보스도 5 mg/ml, 10 mg/ml의 농도로 DMSO에 녹여서 잡곡 유래의 시료 대신에 가하여 α-글루코시다제 저해활성을 시료들과 비교 조사하였다. 이때, 시료의 α-글루코시다제 저해능은 대조군 (control)의 흡광도와 블랭크 1 (blank 1)의 흡광도 차이에 대한 시료군 (sample)의 흡광도 블랭크 2 (blank 2)의 흡광도 차이의 비율을 먼저 계산한 다음, 그 값을 1에서 감한 후 100을 곱하여 하기 수학식 2와 같이 백분율을 계산하여 저해활성을 나타내었다.

	Control	Sample	Blank 1	Blank 2
α-Glucosidase solution	20 μl	20 μl	-	-
Phosphate buffer (pH 6.8)	65 μl	65 μl	85 μl	85 μl
Inhibitor (Cereal extract)	-	15 μl	-	15 μl
DMSO	15 μl	-	15 μl	-
Preincubate at 37℃ for 10 min
3 mM p-Nitrophenyl-a- D-glucopyranoside	100 μl	100 μl	100 μl	100 μl
Incubate at 37℃ for 30 min
Read OD at 405 nm

상기 실험 결과, 식용피 (조곡) 에탄올 추출물 10 mg/ml 농도에서 48.7%의 저해활성을 보여 같은 양의 표준물질인 아카보스 (10 mg/ml)의 저해율인 51.6%와 비슷한 저해율을 보였다. 식용피 (조곡)의 에탄올 추출물을 5 mg/ml 의 농도로 처리하여 저해율을 확인한 결과, 25.2%의 저해율을 나타내었다(도 4 참조).

2-2. 식용피의 유기용매 분획의 α- 글루코시다제 저해활성

α-글루코시다제 저해활성 실험에서 높은 저해활성을 보인 식용피 (조곡)의 유기용매 분획을 10, 5, 2.5 mg/ml로 각각 처리하여 실험을 수행하였다.

상기 실험 결과, 식용피 (조곡)의 80% 에탄올 추출물은 10 mg/ml에서 50.4%의 저해활성을 나타내었고, 이는 아카보스 5 mg/ml의 저해활성 45.7%와 비슷한 저해활성을 보였다. 식용피 (조곡)의 n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 부탄올 분획물은 10 mg/ml에서 각각 40.0%, 53.8%, 73.7% 51.1%의 저해활성을 나타내었다. 에틸 아세테이트 분획물의 경우 같은 양의 아카보스 보다 약 1.4배 더 강한 α-글루코시다제 저해활성을 나타내었으며, 수층은 8.0%의 낮은 저해활성을 나타내었다 (도 5 참조).

실험예 3. 식용피 추출물의 페놀화합물 정량

상기 실시예 1에서 얻은 시료들의 80% 에탄올 추출물에 함유된 페놀화합물의 양을 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 개시된 방법을 응용하여 실험을 실시하였다 (Folin and Denis, 1912).

식용피의 80% 에탄올 추출물 및 각 유기용매 분획물을 100 μl씩 분주한 후, Folin-Ciocalteu's phenol reagent (Sigma-Aldrich, Schweiz, Switzerland)를 500 μl씩 첨가하였다. 이 혼합액을 상온에서 5분간 반응시킨 후 7.5%의 Na₂CO₃ (Hanawa 190-01825, Japan)용액을 400 μl씩 첨가하였다. 이 혼합액을 50℃의 온도에서 5분간 반응시킨 후 13,200 rpm에서 2분간 원심분리기 (Eppendorf 5415R, Germany)로 원심분리하여 생성된 불용성 침전물을 제거하였다. 침전물이 제거된 용액을 분광광도계 (Shimadzu UV-1650PC, Japan)로 760nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때 탄닌산 (tannic acid)을 표준물질로 이용하여 표준곡선 (standard curve)을 작성한 후, 식용피 추출물의 흡광도를 공식에 대입하여 페놀화합물 (phenolic compounds)을 정량하였다.

상기 실험 결과, 식용피 (조곡)은 66.8 μg/mg의 phenolic compound 함량을 나타내었다. 식용피 (조곡)의 유기용매 분획별 페놀화합물의 함량은 에틸 아세테이트와 부탄올 분획에서 높은 함량을 나타내었다. 식용피의 경우, α-글루코시다제 저해활성이 가장 강하게 나타난 에틸 아세테이트 분획에서 가장 많은 198.7 mg/mg의 페놀화합물 함량을 나타내었고, 메틸렌 클로라이드와 부탄올 분획에서 각각 117.8 mg/mg, 137.9 mg/mg의 페놀화합물 함량을 나타내었다. 페놀화합물 정량결과와 α-아밀라아제 및 α-글루코시다제 저해활성을 비교해 보았을 때, 페놀화합물 함량이 높은 분획과 α-아밀라아제 및 α-글루코시다제 저해활성이 높은 분획이 일치하지 않았다. 이러한 결과는 식용피 추출물에 함유된 성분으로서 α-아밀라아제 및 α-글루코시다제의 저해활성을 가지는 물질은 페놀화합물의 일종이 아님을 시사한다(도 6 참조).

하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

YP-2 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

YP-2MC 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

YP-2HE 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

YP-2WA 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na2HPO4,12H2O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

YP-2MC 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

YP-2BU 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

YP-2 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

식용피(Echinochloa crusgalli)의 메틸렌 클로라이드 또는 에틸아세테이트에 가용한 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 및 치료용 약학조성물.
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식용피(Echinochloa crusgalli)의 메틸렌 클로라이드 또는 에틸아세테이트에 가용한 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 및 개선용 건강기능식품.
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