CN117462585A - 制备绞股蓝叶提取物的方法和由此制备的绞股蓝叶提取物 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及制备绞股蓝叶提取物的方法、由该方法制备的绞股蓝叶提取物和用于提高运动表现能力的含有绞股蓝叶提取物作为活性成分的组合物。根据本公开的绞股蓝叶提取物表现出提高运动表现能力和增强肌肉力量、耐力和体力的卓越效果。此外，根据本公开的绞股蓝叶提取物具有提高AMPK活性、促进β氧化和促进葡萄糖摄取的功效，并因此具有降低体重和体脂以及预防、缓解或治疗糖尿病的卓越效果。由于本公开的组合物来自于天然产品，其可以有效和安全地用于药物、食品等而没有副作用。

Description

制备绞股蓝叶提取物的方法和由此制备的绞股蓝叶提取物
技术领域
本公开涉及制备绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)叶提取物的方法、通过该方法制备的绞股蓝叶提取物和含有绞股蓝叶提取物的组合物，该组合物用于提高运动表现能力，预防、缓解或治疗肌肉疾病或肌肉损伤，或减少体脂。
背景技术
在复杂的现代社会中，由于环境污染、精神压力增加、缺乏活动等原因，生活环境日益恶化，人们对促进健康的兴趣与日俱增。尽管运动是预防成人疾病或衰老最有效和最经济的措施，但那些由于日常生活繁忙、疲劳等原因而很少有时间进行养生保健的人，对作为运动替代品的各种功能性食品感兴趣。此外，运动员在科学训练和饮食之外，还使用增补剂来提高运动表现的效能。由于增补剂不仅能有效提高运动能力，还能消除体育活动中积累在体内并诱发疲劳的因素，因此除运动员外，普通人也普遍使用。
全球各地都在积极研究用于提高运动能力的功能性助剂。尽管包括类固醇、咖啡因、碳酸氢钠、柠檬酸钠等在内的功能性助剂能够提高运动能力，并为日常生活提供活力，但其效果只是暂时的，而且可能导致致命的副作用。
因此，利用植物提取物等安全性得到证实的天然产品来开发功能性助剂的必要性最近正在显露出来。
肌肉维持和保护骨骼和内部器官，并使其他组织的运动，如心跳。由于肌肉不仅极大地影响身体活动，而且还影响营养物质的代谢，因此它与代谢性疾病，如2型糖尿病、肥胖、心血管疾病等的发病密切相关。未经治疗的肌肉疾病会导致严重的健康问题，而由于肌肉流失发生的变化会导致身体健康状况恶化，从而造成体能表现不佳和有害的健康状况。
肌肉减少会加重关节炎、腰痛和慢性疼痛，以及通过腹部肥胖导致的尿失禁，而骨裂可能会增加老年人的抑郁症。因此，老年人的肌肉疏松症与各种疾病有关，是影响生活质量的主要因素。肌少症与骨质疏松症、胰岛素抵抗和关节炎等老年慢性疾病密切相关，因此可以通过预防或减轻肌少症来抑制因老化而导致的身体活动能力下降。
本公开的发明人对表现出提高运动能力和缓解或治疗肌肉疾病的卓越效果的物质进行了研究。在此过程中，他们发现在特定条件下用酸处理的绞股蓝叶提取物具有提高运动能力和缓解或治疗肌肉疾病的效果，并具有明显增强的减轻体重和体脂的效果，并完成了本公开。
[相关技术的参考]
[专利文件]
(专利文件001)KR 10-2064387B1。
发明内容
本公开旨在提供用于制备能够提高运动表现能力的绞股蓝叶提取物的方法。
本公开还旨在提供能有效提高运动表现能力的绞股蓝叶提取物。
本公开还旨在提供用于提高运动表现能力的食品组合物，其包含绞股蓝叶提取物作为活性成分。
本公开还旨在提供用于提高运动表现能力的药物组合物，其包含绞股蓝叶提取物作为活性成分。
本公开还旨在提供用于预防或治疗由肌肉功能下降、肌肉消瘦或肌肉萎缩引起的肌肉损伤的食品组合物，其包含绞股蓝叶提取物作为活性成分。
本公开还旨在提供用于降低体重和体脂的食品组合物，其包含绞股蓝叶提取物作为活性成分。
本公开还旨在提供用于预防或缓解糖尿病的食品组合物，其包含绞股蓝叶提取物作为活性成分。
本公开提供了制备含有重量比为100:20至100:80的绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI的绞股蓝叶提取物的方法，其包括：(1)通过用水、C1-C4低碳醇、或其混合溶剂提取干燥的绞股蓝叶，制备绞股蓝叶提取物的步骤；和(2)向绞股蓝叶提取物中加入有机酸，然后在60℃至100℃下进行酸处理的步骤。
根据本公开的示例性实施方案，步骤(1)可以包括：(a)通过用水、C1-C4低碳醇、或其混合溶剂提取绞股蓝叶，制备绞股蓝叶提取物的步骤；(b)通过用水、C1-C4低碳醇、或其混合溶剂提取在提取绞股蓝叶后剩余的残留物，制备绞股蓝叶提取物残留物的提取物的步骤；和(c)混合步骤(a)的提取物和步骤(b)的提取物的步骤。
根据本公开的示例性实施方案，步骤(1)的混合溶剂可以为20体积％至80体积％的甲醇、乙醇、丁醇或丙醇。
根据本公开的示例性实施方案，步骤(2)的有机酸可以是选自柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸和乙酸中的一种或多于一种。
根据本公开的示例性实施方案，步骤(2)的酸处理可在pH 2.0至4.5下进行。
根据本公开的示例性实施方案，绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI之和可以是10mg/g至100mg/g。
根据本公开的示例性实施方案，绞股蓝叶提取物可包含6mg/g至60mg/g的绞股蓝皂苷L和4mg/g至40mg/g的绞股蓝皂苷LI。
根据本公开的示例性实施方案，绞股蓝叶提取物还可包含基于100重量份的绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI的4重量份至10重量份的人参皂苷Rg3。
根据本公开的示例性实施方案，绞股蓝叶提取物可提高选自肌肉力量和耐力中的一种或多于一种的运动表现能力。
根据本公开的示例性实施方案，绞股蓝叶提取物可增加肌肉质量或抑制肌肉流失。
本公开还提供了通过上述方法制备的绞股蓝叶提取物，其包含重量比为100:20至100:80的绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI，其中绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI之和为10mg/g至100mg/g。
本公开还提供了用于提高运动表现能力的食品组合物，其包含绞股蓝叶提取物作为活性成分。
本公开还提供了用于提高运动表现能力的药物组合物，其包含绞股蓝叶提取物作为活性成分。
根据本公开的示例性实施方案，运动表现能力的提高可以是预防或治疗一种或多于一种由运动能力下降引起的疾病，所述疾病选自退行性疾病、线粒体病、耐力下降、敏捷性下降、嗜睡、肌肉消瘦和抑郁症。
本公开还提供了用于预防或缓解由肌肉功能下降、肌肉消瘦或肌肉萎缩引起的肌肉疾病或肌肉损伤的食品组合物，其包含绞股蓝叶提取物作为活性成分。
根据本公开的示例性实施方案，肌肉疾病可以是选自弛缓、肌肉萎缩、肌营养不良、肌无力、恶病质和肌少症中的一种或多于一种。
根据本公开的示例性实施方案，肌肉损伤可以是选自肌肉拉伤、肌肉断裂、肌肉撕裂、挫伤、扭伤、肩袖综合症和肌炎中的一种或多于一种。
本公开还提供了用于降低体重和体脂的食品组合物，其包含绞股蓝叶提取物作为活性成分。
本公开还提供了用于预防或缓解糖尿病的食品组合物，其包含绞股蓝叶提取物作为活性成分。
根据本公开的绞股蓝叶提取物表现出提高运动能力和增强肌肉力量、耐力和体力的卓越效果。此外，由于根据本公开的绞股蓝叶提取物表现出增加AMPK活性、促进β氧化、促进葡萄糖摄取等效果，其在降低体重和体脂以及预防或治疗糖尿病方面具有卓越效果。
因为本公开的组合物来自于天然产品，其可以有效且安全地用于药物、食品等而没有副作用。
附图说明
图1是说明根据本公开的示例性实施方案用于制备绞股蓝叶提取物的方法的流程图。
图2是显示根据实施例和对比例的绞股蓝叶提取物增加AMPK磷酸化的免疫印迹结果。
具体实施方式
绞股蓝是属于葫芦科的多年生藤本植物，其野生于山林或田野中。绞股蓝具有向侧面延伸的根茎以及白毛。它纠缠着生长，但也用卷须攀援。绞股蓝野生于韩国南部地区、济州岛和郁陵岛的山区。在韩国以外，它广泛分布于中国、日本、东南亚等地。它主要生长在潮湿的地方，如海岸、河边等。
绞股蓝属有几个种，其生长在不同的国家和地区。绞股蓝属约有30个种是已知的，它们的成分及其含量因栖息地不同而有很大差异。特别地，绞股蓝分布广泛，其成分及效果已被广泛研究。绞股蓝含有各种皂苷，称为绞股蓝皂苷或绞股蓝皂甙。绞股蓝皂苷的化学结构与人参皂苷相似，OH基团结合的部分除外。由于绞股蓝的皂苷含量高，绞股蓝叶代替人参被广泛用作滋补品。
已知绞股蓝的皂苷表现出提高脂质代谢、预防心血管疾病、降低血糖、作用于中枢神经系统、抗癌、抑制血小板聚集、提供补益等作用。此外，绞股蓝除了含有皂苷外，还含有糖苷，如茜黄樱草糖苷、槐糖苷、双糖链皂苷、龙胆二糖苷、芸香糖苷等，以及类固醇、糖类、色素等。
在本说明书中，“绞股蓝皂苷”是指三萜类皂苷。
在本说明书中，“运动表现能力”或“运动能力”是指在日常生活或体育活动中，如跑步、跳跃、投掷、游泳等，快速、有力、准确、长时间、熟练地进行身体活动的能力。运动表现能力是由肌肉力量、平衡感、运动协调性、敏捷性、耐力等因素定义的。术语“提高运动表现能力”是指提高或增强运动表现能力，具体是指提高或增强耐力、平衡感或肌肉力量。
具体地，运动表现能力的提高可以通过肌肉细胞的生长和分化、增加肌肉质量或增加线粒体的生物合成来实现。
同时，减少体内脂肪积累的各种机制包括通过促进从食物中摄入的脂肪或体内积累的脂肪的氧化来调节体内脂肪的机制。通过提高参与脂肪酸氧化的酶的活性来增强脂肪酸向线粒体的运输，并相应地促进线粒体中的β氧化，增加脂肪的能量生产。
具体地，在身体的能量消耗中，通过直接降解或氧化积累的脂肪产生能量和热量的燃烧过程是很重要的。这个过程涉及各种酶和基因。特别是，据报道AMPK在脂肪氧化中发挥重要作用。
通过激活AMPK的ACC的磷酸化在通过增加脂肪酸氧化减少身体脂肪的过程中非常重要。因此，通过用AMPK在脂肪酸合成的初始阶段调节ACC酶的活性，可以防止体内不必要的脂肪积累，从而防止体重的增加。也就是说，如果AMPK被激活，脂肪的合成就会减少，同时β氧化也会增加。因此，身体脂肪减少，从而使体重下降。
以下是对本公开内容的详细描述。
本公开涉及制备包含重量比为100:20至100:80的绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI的绞股蓝叶提取物的方法，其包括：(1)通过用水、C1-C4低碳醇、或其混合溶剂提取干燥的绞股蓝叶，制备绞股蓝叶提取物的步骤；和(2)向绞股蓝叶提取物中加入有机酸，然后在60℃至100℃下进行酸处理的步骤。
发明人一直在研究制备有效提高运动表现能力的绞股蓝叶提取物的方法。在此过程中，他们发现了通过以下方法制备的绞股蓝叶提取物具有提高运动能力和预防、缓解或治疗肌肉疾病或肌肉损伤的显著效果，并完成了本公开，该方法包括(1)通过用水、C1-C4低碳醇、或其混合溶剂提取干燥的绞股蓝叶，制备绞股蓝叶提取物的步骤；和(2)向绞股蓝叶提取物中加入有机酸，然后在60℃至100℃下进行酸处理的步骤。
首先，在步骤(1)中，用水、C1-C4低碳醇、或其混合溶剂提取经干燥的绞股蓝叶，制备绞股蓝叶提取物。
步骤(1)可包括：(a)通过用水、C1-C4低碳醇、或其混合溶剂提取绞股蓝叶，制备绞股蓝叶提取物的步骤；(b)通过用水、C1-C4低碳醇、或其混合溶剂提取提取绞股蓝叶后剩余的残留物，制备绞股蓝叶提取物残留物的提取物的步骤；和(c)混合步骤(a)的提取物和步骤(b)的提取物的步骤。
在步骤(a)的提取物和步骤(b)的提取物混合后，可将混合物过滤并浓缩。
具体地，可以用普通的过滤方法或设备从步骤(a)的提取物和步骤(b)的提取物的混合物中去除杂质。例如，可以通过离心或使用微滤器过滤来获得去除杂质的提取物。
此外，过滤后的绞股蓝叶提取物可以被浓缩。具体地，过滤后的绞股蓝叶提取物可以浓缩到10糖度至30糖度。
步骤(1)中的经干燥的绞股蓝叶是指已经干燥的绞股蓝叶，包括自然干燥的绞股蓝叶、半干燥的绞股蓝叶、经过烘烤或蒸煮后再干燥的绞股蓝叶等。
具体地，绞股蓝叶可以通过在90℃至300℃下烘烤或蒸煮新鲜的绞股蓝叶5分钟至120小时然后干燥得到。
由于绞股蓝叶的活性成分的前体主要是苷类，原则上可以预计，随着绞股蓝叶中含有的糖类或脂类的键断裂，活性成分的含量会在加热后增加。此外，通过烘烤等热处理，绞股蓝叶中含有的降解酶被去活，成分随时间的变化可以降到最低。
一般来说，烘烤是指在开放的容器中对鲜叶进行热处理，使其超过一定温度。这是通过杀死有害细菌来防止变质，并通过使残留在鲜叶中的降解酶失去活性来提高储存性、风味和口感的惯用方法。如果在高温下进行烘烤，由于产生过多的苯并芘，从前体到活性成分的转化率可能不稳定。此外，由于失水，转化为有效的低分子量皂苷的比率可能会下降。
因此，在本公开内容中，可以在90℃至300℃、特别地90℃至200℃、更特别地90℃至150℃下，进行20分钟至120小时、特别是30分钟至30小时、更特别是1小时至10小时的烘烤或蒸煮。当在上述温度范围内进行烘烤或蒸煮时，可以减少苯并芘的产生，同时防止绞股蓝叶中含有的活性成分的损失。
此外，烘烤或蒸煮等热处理可以更特别地是烘烤，考虑到减少苯并芘的含量和增加活性成分的含量。烘烤可以使用木火、气体火焰、电加热器等进行，但不特别限于此。对于使用木火的烘烤，绞股蓝叶可以在用木火加热的锅里烘烤。对于使用气体火焰的烘烤，绞股蓝叶可以在用适度气体火焰加热的锅里烘烤。对于使用电加热器的烘烤，绞股蓝叶可以在旋转盘式电加热器中烘烤。其中，就减少苯并芘的含量和增加活性成分的含量而言，优选使用电加热器进行烘烤。
如果绞股蓝叶只进行自然干燥而不进行烘烤，可能很难实现从糖苷皂苷到有效的低分子量皂苷的转化。
发明人发现，为了最大限度地提高绞股蓝叶片中有效低分子量皂苷的含量，应对新鲜叶片进行热处理，如烘烤。此外，他们基于皂苷前体和有效低分子量皂苷之间的关系推测(Chen等人，J.Chromatogr.B Analyt Technol Biomed Life Sci,969:pp.42-52)，通过烘烤新鲜绞股蓝叶，使降解皂苷的酶失活，可以保持总皂苷，通过高温热处理，它们可以转化为有效的低分子量皂苷。
经干燥的绞股蓝叶的含水量可以是0.01重量％至70重量％，特别是0.02重量％至50重量％，更特别是0.03重量％至15重量％。
本公开的绞股蓝叶提取物可以通过将绞股蓝叶与提取溶剂以1:1至1:100、特别是1:1至1:50、更特别是1:5至1:20、更特别是1:5至1:15的体积比混合，并在50℃至95℃、特别是60℃至90℃、更特别是70℃至90℃下，进行0.5小时至10小时、特别是1小时至5小时，更特别是1小时至3小时提取来制备。
如果提取温度低于下限，活性成分的提取率可能会下降。而且，如果超过上限，在这个过程中可能会由于溶剂的蒸气而出现问题。
此外，如果提取时间短于下限，活性成分的提取率可能下降。
提取溶剂是水、C1-C4低碳醇、或其混合溶剂。混合溶剂可以是20体积％至80体积％、特别地50体积％至80体积％的甲醇、乙醇、丁醇或丙醇。
就提取物对运动能力的提高而言，提取溶剂可以是50体积％至80体积％的乙醇，但并不特别限于此。
接下来，在步骤(2)中，向绞股蓝叶提取物中加入有机酸，并在60℃至100℃下进行酸处理。
在上述温度条件下，将步骤(1)中得到的绞股蓝叶提取物进行酸处理，本公开的绞股蓝叶提取物提高运动表现能力的效果达到最大。
酸处理温度可在60℃至100℃、特别地75℃至95℃、更特别地80℃至95℃、更特别地80℃至90℃下进行。如果酸处理温度低于下限，活性成分的产率可能会下降。而且，如果超过上限，由于绞股蓝叶提取物中与运动能力有关的活性成分在高温下被降解，绞股蓝叶提取物提高运动能力的效果会明显下降。
此外，酸处理时间可以是2小时至10小时，特别地4小时至8小时，更特别地6小时至8小时。如果酸处理时间短于下限，活性成分的产率可能会下降。而且，如果超过上限，由于绞股蓝叶提取物中与运动能力有关的活性成分被降解，绞股蓝叶提取物提高运动能力的效果可能反而下降。
有机酸可以是选自柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸和乙酸的一种或多于一种，特别是选自柠檬酸、琥珀酸和酒石酸的一种或多于一种，更特别是柠檬酸。
此外，酸处理可以在pH 2.0至4.5、特别地pH 2.5至4.5、更特别地pH 3.5至4.5下进行。
在上述的pH范围内，绞股蓝叶提取物提高运动能力的效果是最大的。在上述范围之外，绞股蓝叶提取物提高运动能力的效果下降。
在酸处理步骤之后，还可以增加使用碱性溶液中和至pH 6.0或高于6.0、特别地pH6.0至7.5、更特别地pH 6.0至7.0的步骤。
碱性溶液可以是选自氢氧化钠、碳酸氢钠、氢氧化钙、氢氧化钾、氢氧化镁和氨水的一种或多于一种碱性氢氧化物(OH)化合物的浓度为0.01％(w/v)至2％(w/v)的蒸馏水溶液。
经证实，通过酸处理制备的绞股蓝叶提取物与通过100℃或高于100℃的高温和/或高压提取获得的绞股蓝叶提取物相比，具有更好的提高运动能力、预防、缓解或治疗肌肉疾病或肌肉损伤以及降低体重和体脂的效果。
在根据本公开的方法制备的绞股蓝叶提取物中，绞股蓝皂苷L是由化学式1表示的化合物。
[化学式1]
此外，绞股蓝皂苷LI是由化学式2表示的化合物，其是绞股蓝皂苷L的非对映异构体。
[化学式2]
绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI可以按100:20至100:80、特别地100:30至100:70、更特别地100:50至100:70的重量比包含在绞股蓝叶提取物中。
当绞股蓝皂苷LI与绞股蓝皂苷L的重量比在上述范围内时，根据本公开的绞股蓝叶提取物提高运动能力的效果是最大的。如果绞股蓝皂苷LI与绞股蓝皂苷L的重量比低于下限，则绞股蓝叶提取物提高运动能力的效果是轻微的。而且，如果超过上限，绞股蓝叶提取物提高运动能力的效果反而会下降。
本公开的绞股蓝叶提取物中含有的绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI之和可以是10mg/g至100mg/g，特别地10mg/g至50mg/g，更特别地13mg/g至40mg/g。当绞股蓝叶提取物中含有的绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI之和在上述范围内时，绞股蓝叶提取物提高运动能力的效果是最大的。如果绞股蓝叶提取物中含有的绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI之和低于下限，则绞股蓝叶提取物提高运动能力的效果是轻微的。而且，如果超过上限，绞股蓝叶提取物提高运动能力的效果反而会下降。
本公开的绞股蓝叶提取物可含有6mg/g至60mg/g、特别地8mg/g至50mg/g、更特别地10mg/g至30mg/g的绞股蓝皂苷L，并可含有4mg/g至40mg/g、特别地5mg/g至15mg/g的绞股蓝皂苷LI。当绞股蓝叶提取物中的绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI的含量在上述范围内时，绞股蓝叶提取物提高运动能力的效果可以达到最大化。
此外，本公开的绞股蓝叶提取物还可含有以绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI的重量为100份的4份至10份重量的人参皂苷Rg3。
当绞股蓝叶提取物中Rg3的基于绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI之和的重量比在上述范围内时，绞股蓝叶提取物提高运动能力的效果会进一步提高。如果Rg3的基于绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI的重量比低于下限，绞股蓝叶提取物提高运动能力的效果可能会下降。
绞股蓝叶提取物也可以被制备成浓缩物或干粉。具体地，过滤后的绞股蓝叶提取物可以浓缩到60糖度至70糖度。另外，绞股蓝叶提取物可以通过另外的工艺，如真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等，制备成粉末。
此外，本公开涉及绞股蓝叶提取物，该提取物由上述方法制备，其包含重量比为100:20至100:80的绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI，其中绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI之和为10mg/g至100mg/g。
本公开的绞股蓝叶提取物，其含有的绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷L的重量比为100:20至100:80，特别地100:30至100:70，更特别地100:50至100:70，具有非常优越的提高运动能力的效果。如果绞股蓝皂苷LI与绞股蓝皂苷L的重量比低于下限，绞股蓝叶提取物提高运动能力的效果是轻微的。而且，如果超过上限，绞股蓝叶提取物提高运动能力的效果反而明显下降。
此外，本公开的绞股蓝叶提取物中含有的绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI之和可以是10mg/g至100mg/g，特别地10mg/g至50mg/g，更特别地13mg/g至40mg/g，更特别地13mg/g至30mg/g，特别地15mg/g至30mg/g。当绞股蓝叶提取物中含有的绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI之和在上述范围内时，绞股蓝叶提取物提高运动能力的效果是最大的。如果绞股蓝叶提取物中含有的绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI之和低于下限，则绞股蓝叶提取物提高运动能力的效果是轻微的。而如果超过上限，绞股蓝叶提取物提高运动能力的效果反而可能下降。
本公开的绞股蓝叶提取物可有效提高选自肌肉力量和耐力、增加肌肉质量、抑制肌肉流失或减少体脂的一种或多于一种运动能力。
此外，本公开提供了用于提高运动表现能力的食品组合物，其中包含绞股蓝叶提取物作为活性成分。
在本说明书中，术语“作为活性成分包含”是指绞股蓝叶提取物的含量足以达到所需的疗效或活性。本公开的绞股蓝叶提取物的每日施用剂量可以是100mg/kg至2000mg/kg，特别地100mg/kg至1000mg/kg，更特别地200mg/kg至800mg/kg，更特别地200mg/kg至600mg/kg。如果本公开的绞股蓝叶提取物的施用剂量低于下限，可能达不到提高运动能力的效果。而且，如果超过了上限，提高运动能力的效果可能不会随着施用量的增加而增加。由于绞股蓝叶提取物是天然产品，即使过量施用也不会对人体产生副作用，本公开的组合物中绞股蓝叶提取物的含量上限可由本领域技术人员适当确定。
本公开的食品组合物包括所有类型，如功能性食品、功能性保健食品、营养补充剂、保健食品、食品添加剂等。各种类型的食品组合物可以按照本领域已知的常见方法制备成各种形式。
在本公开内容中，食品组合物可以是功能性保健食品组合物。
本公开内容中使用的术语“功能性保健食品”是指根据第6727号《功能性保健食品法》，使用具有对人体有用的功能的原料或成分制备或加工的食品，而术语“功能性”是指通过营养成分或生理作用对人体结构和功能的调整，获得对健康有用的效果。
功能性保健食品组合物可使用一种或多于一种载体、稀释剂、赋形剂和添加剂配制成选自片剂、丸剂、粉末、颗粒剂、散剂、胶囊和液体的一种。
此外，作为食品组合物的具体实例，本公开的绞股蓝叶提取物可以制备成茶、果汁、饮料等供饮用。此外，本公开的绞股蓝叶提取物可通过与已知具有提高运动能力、增加肌肉质量或抑制肌肉流失的作用的物质或活性成分混合制备成组合物。例如，本公开的食品组合物除了含有绞股蓝叶提取物外，还可以含有微量的矿物质、维生素、糖类和已知具有提高运动能力、增加肌肉质量或抑制肌肉流失作用的成分。
本公开的绞股蓝叶提取物可按照普通方法添加到食品中或与其他食品或食品成分一起使用。活性成分的混合量可根据使用目的(预防或缓解)适当确定。一般来说，食品组合物可按食品总重量的0.001重量％至100重量％、特别地0.01重量％至50重量％、更特别地0.1重量％至30重量％的量添加到食品中。然而，对于以提高运动能力或保健为目的的长期使用，其用量可低于上述范围。此外，活性成分的使用量可以高于上述范围，因为在安全性方面没有问题。
此外，本公开内容涉及用于提高运动表现能力的药物组合物，其包含绞股蓝叶提取物作为活性成分。
本公开的提高运动表现能力的药物组合物可用于预防或治疗由运动能力下降引起的疾病。该疾病可以是，例如，退行性疾病、线粒体病、耐力下降、敏捷性下降、嗜睡、肌肉消瘦、抑郁症等。本公开的组合物具有提高运动表现能力的作用，无论运动的类型和种类如何。
药物组合物还可包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以是常用的制剂，包括生理盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、环糊精、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体等。如有必要，还可含有另一种常用添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂等。此外，还可以通过额外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、黏合剂、润滑剂等来配制水溶液、悬浮剂、乳剂等。
药物组合物制剂可以是颗粒剂、散剂、片剂、包衣片剂、胶囊、栓剂、液体、糖浆剂、果汁、悬浮液、乳剂、药用滴剂、注射液等，但不特别限于此。例如，为了配制成片剂或胶囊，活性成分可与口服的、无毒的、药学上可接受的惰性载体，如乙醇、甘油、水等，一起使用。此外，如果需要或有必要，可以包含合适的黏合剂、润滑剂、崩解剂或着色剂。合适的黏合剂包括淀粉、明胶、天然糖如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然或合成胶如阿拉伯树胶、黄芪胶或油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂可以是淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等，但不限于此。
为了配制成液体溶液，组合物可与作为消毒的、生理和药学上可接受的载体的生理盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油和乙醇中的一种或多于一种混合。如有必要，可加入另一种常用添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂、杀菌剂等。此外，可通过进一步加入稀释剂、分散剂、表面活性剂、黏合剂或润滑剂来制备注射制剂，如水溶液、悬浮液、乳剂等，或药丸、胶囊、颗粒或片剂。
具体来说，可以根据特定的疾病或成分，使用Remington's PharmaceuticalScience(Mack Publishing Company，Easton PA)中描述的方法来制备合适的制剂。
本公开的药物组合物可以口服施用或肠外施用。肠外施用可通过静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射、经皮施用等方式进行。特别地，组合物可以口服施用。
本公开的药物组合物的适当施用剂量取决于诸如配制方法、施用方式、患者的年龄、体重、性别、病理状况和饮食、施用时间、施用途径、排泄率和响应灵敏度等因素而变化，通常熟练的医生可以很容易地确定和开出对所需治疗或预防有效的施用剂量。根据本公开的具体示例性实施方案，本公开的药物组合物的每日施用剂量可以是0.001g/kg至10g/kg。为了达到预期效果，本公开的绞股蓝叶提取物可以每天施用1次至3次，有效剂量为0.001mg/kg至400mg/kg，特别地0.01mg/kg至100mg/kg。施用剂量并不以任何方式限制本公开的范围。
此外，本公开涉及用于预防或缓解由肌肉功能下降、肌肉消瘦或肌肉萎缩引起的肌肉疾病或肌肉损伤的食品组合物，其包含绞股蓝叶提取物作为活性成分。本公开的组合物能有效地增加肌肉质量，而不考虑肌肉类型。
为避免不必要的冗余，将省略上述术语“绞股蓝叶提取物”、“食品组合物”和“功能性保健食品组合物”的描述。
肌肉疾病可以是选自弛缓、肌肉萎缩、肌营养不良、肌无力、恶病质和肌少症的一种或多于一种。
“弛缓”指的是强直性肌营养不良的情况。
“肌肉萎缩”是指肌肉组织的丧失或调节肌肉的神经元的损伤，包括逐渐的肌肉萎缩和肌肉无力。一般来说，由于肌力严重下降，废用肌肉往往逐渐发展至肌肉萎缩。此外，生活在无重力环境中或钙质减少常常导致肌力下降。
此外，由肌肉疾病引起的肌肉萎缩可包括重症肌无力、杜氏型肌肉萎缩、贝克尔型肌肉萎缩、肢体腰部型肌肉萎缩、面肩肱型肌肉萎缩、肌肉中发生的炎症等，由调节肌肉的神经元的损伤引起的肌肉萎缩可能包括脊髓性肌肉萎缩，如韦尔德尼希-霍夫曼病和库格尔贝格-韦兰德病，肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)，如卢伽雷氏病和脊髓性肌肉萎缩，如肯尼迪病。
“肌营养不良”是以肌肉纤维坏死为特征的退行性肌肉疾病。肌膜损伤引起的肌纤维坏死和变性导致肌肉力量下降和肌肉萎缩。肌营养不良包括迪谢内肌营养不良、贝克尔肌营养不良、肢体腰部肌营养不良、埃默里-德赖弗斯肌营养不良、面肩肱肌营养不良、强直性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端型肌营养不良、先天性肌营养不良等，根据部位不同可能出现不同形式。
“肌无力”是以肌肉神经病变引起的肌肉无力为特征的疾病。在早期阶段，会出现轻微的症状，如眼睑下垂(上睑下垂)和瞳孔活动受限。此外，说话可能含糊不清，吞咽可能困难。此外，面部肌肉也会减弱。如果肌无力的症状恶化，患者会发现难以举起重物，并且由于肢体活动受限而容易跌倒。此外，还可能出现呼吸困难或呼吸麻痹等危机。
“恶病质”是指全身性萎缩的状况。它是由恶性肿瘤、巴泽多病、垂体功能减退症、疟疾、肾上腺皮质功能减退症、胸腺病等引起的。主要的临床症状是全身无力、贫血和水肿。已知恶性肿瘤的贫血导致局部营养不良，并通过与宿主的代谢竞争而引起宿主的代谢紊乱，导致恶病质。
此外，肌肉消瘦或肌肉萎缩是由先天或后天因素、衰老等引起的，可能包括肌肉质量的逐渐丧失、肌肉特别是骨骼或自主肌肉和心肌的削弱和退化，以及由此导致的肌力下降。
“肌力下降”是指一块或多块肌肉的力量下降的情况。肌力的减弱可能局限于一块肌肉、身体的某个部位、上肢或下肢等，也可能发生在整个身体。此外，肌力下降的主观症状包括肌肉疲劳或肌肉疼痛，可以通过医学检查客观地量化。肌力下降的原因可能包括肌肉损伤、由于肌肉细胞表达减少等导致的肌肉质量下降、肌肉老化等，尽管不限于此。
在本公开内容中，“肌肉损伤”可指因受伤而造成的物理或化学破坏的任何损伤。
具体来说，肌肉损伤可以是选自肌肉拉伤、肌肉断裂、肌肉撕裂、挫伤、扭伤、肩袖综合症和肌炎的一种或多于一种。
肌肉细胞功能下降、能量代谢不平衡等可能导致肌肉损伤，同时出现肌肉功能下降、嗜睡等。
如果肌肉损伤继续下去，就会发展为肌肉疾病，并导致肌肉损失、肌肉消瘦、肌肉萎缩等。如果肌肉疾病没有得到适当的治疗，它可能发展成慢性疾病并引起严重的健康问题。此外，肌肉疾病还可能与代谢性疾病有关。
在本公开的实施例中，发现本公开的绞股蓝叶提取物不仅能增加肌肉的能量产生，还能促进肌肉细胞的增殖，表明它能通过肌肉细胞的增殖和生长对肌肉疾病和肌肉损伤表现出治疗效果。
此外，本公开涉及用于降低体重和体脂的食品组合物，其包含绞股蓝叶提取物作为活性成分。本公开的组合物通过增加β氧化有效地降低体重和体脂。
为避免不必要的冗余，将省略上述术语“绞股蓝叶提取物”、“食品组合物”和“功能性保健食品组合物”的描述。
下面，将通过实例对根据本公开的绞股蓝叶提取物进行详细描述。
<实施例>
初步试验1：绞股蓝叶乙醇提取物—活性成分含量分析
(1)在100g绞股蓝叶中加入1L 50％(v/v)的乙醇，在135℃下烘烤2小时，然后干燥，在80℃下进行2小时提取后，回收上清液。
(2)向提取后剩余的绞股蓝叶提取物残留物中加入1L 50％(v/v)的乙醇，在90℃下进行2小时提取后，回收上清液。
(3)将步骤(1)的绞股蓝叶乙醇提取物和步骤(2)的绞股蓝叶提取物残留物提取物混合，然后过滤。在减压下将滤液浓缩至固体含量为20％至25％后，通过冷冻干燥制备绞股蓝叶提取物。
在表1所述的条件下，通过HPLC分析所制备的绞股蓝叶提取物的活性成分，分析结果见表2。
将200mg绞股蓝叶提取物溶解在5mL 50％(v/v)的MeOH中，用于HPLC分析。
在HPLC分析中，作为标准物的绞股蓝皂苷L(Gyp L，纯度99.42％)购自上海源叶生物科技有限公司(中国)，绞股蓝皂苷LI(Gyp LI，纯度99.33％)购自韩国生命工学研究院，人参皂苷Rg3(纯度98.24％)购自Ambo(韩国)。
[表1]
[表2]
初步试验2：绞股蓝叶乙醇提取物->用柠檬酸处理，活性成分的含量随pH的变化
将初步试验1的绞股蓝叶提取物稀释到固体含量为40％，并通过添加柠檬酸调节到pH 3.0、4.0或5.0，或者不添加柠檬酸，在90℃和100rpm下进行酸处理4小时，制备绞股蓝叶提取物。
按照初步试验1中描述的条件和方法，对制备的绞股蓝叶提取物进行HPLC分析，测得的活性成分含量见表3。
[表3]
Gyp L(mg/g) Gyp LI(mg/g) Gyp L∶Gyp LI Rg3(mg/g)
未经处理的(pH 5.65) 1.20 N/D - N/D
pH 3.0 12.63 8.83 100∶69.91 1.21
pH 4.0 15.36 9.78 100∶63.67 1.68
pH 5.0 2.46 1.25 100∶50.81 N/D
从表3可以看出，与没有经过酸处理的绞股蓝叶乙醇提取物相比，进行酸处理时活性成分的含量有所增加。特别是当pH被调整到3.0至4.0时，活性成分的含量明显增加。
初步试验3：绞股蓝叶乙醇提取物->用柠檬酸进行酸处理，活性成分的含量随酸处 理温度的变化
将初步试验1的绞股蓝叶提取物稀释到固体含量为40％，并通过加入柠檬酸调节到pH值为4.0后，在60℃、70℃、80℃、90℃或100℃和100rpm下进行酸处理4小时，制备绞股蓝叶提取物。
按照初步试验1中描述的条件和方法，对制备的绞股蓝叶提取物进行HPLC分析，测得的活性成分含量见表4。
[表4]
温度(℃) Gyp L(mg/g) Gyp LI(mg/g) Gyp L∶Gyp LI Rg3(mg/g)
60 1.96 0.98 100∶50.00 N/D
70 4.65 2.70 100∶58.06 N/D
80 12.36 7.75 100∶62.70 0.78
90 15.50 10.30 100∶66.45 1.52
100 15.47 12.05 100∶77.89 1.76
121 16.12 14.36 100∶89.08 1.82
从表4可以看出，在80℃至90℃下酸处理的绞股蓝叶乙醇提取物与在不同温度下酸处理的绞股蓝叶提取物相比，活性成分的含量明显增加，并且绞股蓝皂苷LI与绞股蓝皂苷L的重量比为100∶20至100∶80。
当酸处理温度为121℃时，绞股蓝叶提取物的活性成分含量明显增加，但绞股蓝皂苷LI与绞股蓝皂苷L的重量比不在100∶20至100∶80的范围内。
初步试验4：绞股蓝叶乙醇提取物->酸处理和活性成分含量随有机酸的变化
将初步试验1的绞股蓝叶提取物稀释到固体含量为40％，并通过加入柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、苹果酸或抗坏血酸调节到pH 4.0后，在90℃和100rpm下进行酸处理4小时，制备绞股蓝叶提取物。
按照初步试验1中描述的条件和方法，对制备的绞股蓝叶提取物进行HPLC分析，测得的活性成分含量见表5。
[表5]
有机酸 Gyp L(mg/g) Gyp LI(mg/g) Gyp L∶Gyp LI Rg3(mg/g)
未经处理的 0.52 N/D - N/D
柠檬酸 15.66 9.34 100∶59.64 1.34
琥珀酸 10.65 5.69 100∶53.42 0.88
酒石酸 10.15 5.30 100∶52.21 0.78
苹果酸 9.99 5.09 100∶50.95 0.78
抗坏血酸 9.13 4.85 100∶53.12 0.69
从表5可以看出，与其他有机酸相比，用柠檬酸处理的绞股蓝叶乙醇提取物的活性成分含量明显增加。
初步试验5：绞股蓝叶乙醇提取物->酸处理和活性成分的含量随酸处理时间的变 化
将初步试验1的绞股蓝叶提取物稀释到固体含量为40％，并通过加入柠檬酸调节到pH4.0后，在90℃和200rpm下进行酸处理0小时、2小时、4小时、6小时或8小时，制备绞股蓝叶提取物(图1)。
按照初步试验1中描述的条件和方法，对制备的绞股蓝叶提取物进行HPLC分析，测得的活性成分含量见表6。
[表6]
酸处理时间(小时) Gyp L(mg/g) Gyp LI(mg/g) Gyp L∶Gyp LI Rg3(mg/g)
0 0.52 N/D - 0.36
2 9.33 5.71 100∶61.20 0.66
4 10.93 6.75 100∶61.76 1.15
6 15.49 9.87 100∶63.71 1.39
8 15.30 9.42 100∶61.56 1.21
从表6可以看出，经酸处理3小时或大于3小时、特别是4小时或大于4小时、更特别是6小时或大于6小时的绞股蓝叶乙醇提取物，绞股蓝叶提取物的活性成分含量明显增加。
实施例1：绞股蓝叶提取物的制备--柠檬酸
(1)在100g绞股蓝叶中加入1L 50％(v/v)的乙醇，在135℃下烘烤2小时，然后干燥，在80℃下进行2小时提取，回收上清液。
(2)向提取后剩余的绞股蓝叶提取物残留物中加入1L 50％(v/v)的乙醇，然后在90℃下进行2小时提取，回收上清液。
(3)将步骤(1)的绞股蓝叶乙醇提取物和步骤(2)的绞股蓝叶提取物残留物提取物按体积比1∶1混合，然后过滤。通过在减压下将滤液浓缩至固体含量为20％至25％，制备绞股蓝叶提取物。
(4)在减压下将绞股蓝叶提取物浓缩至固体含量为40％，并通过加入柠檬酸将pH调至4.0，在90℃和100rpm下进行6小时酸处理。冷却10分钟后，用1M NaOH中和，通过冷冻干燥制备绞股蓝叶提取物。
实施例2：使用苹果酸
除了在步骤(4)中加入苹果酸而不是柠檬酸外，以与实施例1相同的方式制备绞股蓝叶提取物。
对比例1：绞股蓝叶乙醇提取物
以与初步试验1相同的方式制备绞股蓝叶乙醇提取物。
对比例2：在121℃下酸处理
以与实施例1相同的方式制备绞股蓝叶提取物，除了步骤(4)中的酸处理是在121℃下进行4小时，而不是在90℃下进行6小时。
对比例3：绞股蓝叶乙醇提取物->高温高压下处理
根据韩国专利注册号10-0930580中描述的制备绞股蓝叶提取物的方法(实施例1)制备绞股蓝叶提取物。
具体地，将100g绞股蓝鲜叶在135℃下烘烤2小时，然后将其干燥，加入1L 50％的乙醇，在90℃下进行第一次提取6小时，然后回收第一上清液。在剩余的绞股蓝叶提取物残留物中加入1L 50％的乙醇，在90℃下进行提取6小时，得到第二上清液。
将第一上清液和第二上清液混合后，用纱布过滤混合物，滤液在60℃减压下浓缩燥至固体含量为50％。通过在121℃和1.2大气压下对浓缩物进行1小时的热处理，然后冷冻干燥，制备绞股蓝叶提取物。
对比例4：高温高压下热水提取绞股蓝叶
将100g绞股蓝鲜叶在135℃下烘烤2小时并干燥后，加入1L水。浸泡1小时后，在135℃和1.2大气压下进行4小时提取，通过回收上清液得到第一热水提取物。在剩余的绞股蓝叶提取物残留物中加入1L水，并在135℃和1.2大气压下进行4小时提取后，通过回收上清液获得第二热水提取物。
在混合第一热水提取物和第二热水提取物并过滤混合物后，通过在60℃减压下浓缩得到的滤液，然后冷冻干燥来制备绞股蓝叶提取物。
对比例5：蒸煮绞股蓝叶->高温高压下用pH值为4的水进行热水提取
根据韩国专利注册号10-1969062中描述的制备绞股蓝叶提取物的方法(实施例2)制备绞股蓝叶提取物。
(1)使用电加热器在135℃下烘烤绞股蓝叶2小时，然后将其干燥并在121℃下蒸汽处理60分钟。在100g经过蒸汽处理的绞股蓝叶中加入1L水(用盐酸和碳酸氢钠将pH调至4)并浸泡1小时后，在121℃和1.2大气压下进行4小时提取，然后回收上清液，制备热水提取物。
(2)在100g绞股蓝叶热水提取后剩余的残留物中加入1L 50体积％的乙醇，并在80℃下进行3小时提取，通过回收上清液得到乙醇提取物。
(3)将步骤(1)的热水提取物和步骤(2)的乙醇提取物按体积比1:1混合，然后过滤，通过减压浓缩至固体含量为20重量％至25重量％，然后冷冻干燥，制备绞股蓝叶提取物。
<试验例>
在试验例中，所有的测量重复3次，结果以平均值±标准差表示。统计分析使用SPSS软件(ver.20.0,SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)进行。通过单因素方差分析(ANOVA)检查组间差异。P<0.05被认为是显著的。在数据中，*、**和***表示与对照组或正常组有显著差异，分别为P<0.05、P<0.01和P<0.001(学生t检验)，#、##和##表示与阴性对照组或肌肉萎缩组有显著差异，分别为P<0.05、P<0.01和P<0.001(学生t检验)。
试验例1：活性成分的含量分析
根据初步试验1中描述的条件和方法，实施例和对比例的绞股蓝叶提取物的HPLC结果见表7。
[表7]
从表7可以看出，根据本公开的实施例的绞股蓝叶提取物的绞股蓝皂苷L(Gyp L)和绞股蓝皂苷LI(Gyp LI)的重量比在100:20至100:80范围内，并且绞股蓝皂苷L(Gyp L)和绞股蓝皂苷LI(Gyp LI)之和为10.0mg/g或大于10.0mg/g。
相反，对于对比例1，绞股蓝皂苷LI(Gyp LI)的含量低于检测限或非常低。
此外，对于对比例2和对比例5，绞股蓝皂苷L(Gyp L)和绞股蓝皂苷LI(Gyp LI)之和为10.0mg/g或大于10.0mg/g，但绞股蓝皂苷L(Gyp L)和绞股蓝皂苷LI(Gyp LI)的重量比远远大于100:80。
对于对比例3和对比例4，绞股蓝皂苷L(Gyp L)和绞股蓝皂苷LI(Gyp LI)的重量比在100:20至100:80范围内，但绞股蓝皂苷L(Gyp L)和绞股蓝皂苷LI(Gyp LI)之和低于10.0mg/g。
试验例2：绞股蓝叶提取物对肌肉生成的激活作用
已知mTOR蛋白在肌肉细胞的PI3K/Akt信号通路中被磷酸化激活后，可以诱导参与肌肉蛋白合成的蛋白质的活化，增加肌肉质量。因此，为了确定绞股蓝叶乙醇提取物对肌肉生成的诱导作用，使用mTOR夹心ELISA试剂盒(Cell Signaling Technology,Beverly,MA,USA)对mTOR的活性进行研究。
L6肌细胞(ATCC；Manassas,VA,USA)以1x105个细胞/mL被接种到6孔板上，并在含有10％胎牛血清(FBS；Hyclone,Logan,UT,USA)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM；Hyclone)中培养24小时。培养结束后，将培养基从孔中取出，用含有2％马血清(HS；Hyclone)的DMEM(Hyclone)替换。然后，通过进一步培养6天，将L6细胞分化为肌管。随后，用浓度为40μg/mL的实施例或对比例的绞股蓝叶提取物处理细胞，并培养12小时。培养结束后，用细胞裂解缓冲液处理细胞进行裂解。用Bradford测定法(Bio-Rad LaboratoriesInc.,Hercules,CA,USA)对获得的细胞裂解液中的蛋白质进行定量后，将50μL的细胞裂解液以1mg/mL的浓度转移到微孔中，将抗mTOR抗体附着到微孔中，然后在37℃下孵育2小时。孵育后，用洗涤缓冲液清洗细胞裂解液共4次，然后用检测抗体处理后在37℃下孵育1小时。用洗涤缓冲液共洗涤4次后，加入HRP(辣根过氧化物酶)结合的第二抗体，在37℃下孵育30分钟。最后，用洗涤缓冲液共洗涤4次，并在每个孔中加入TMB底物，在37℃下孵育10分钟，然后通过加入终止缓冲液停止TBM反应。2分钟后，通过在450nm处测量吸光度来确定用绞股蓝叶提取物处理的肌管中的mTOR水平。结果显示在表8中。
[表8]
相对mTOR活性(占对照组的百分比)
对照组 100
实施例1 172.6±13.4＊＊＊
实施例2 154.3±14.8＊＊
对比例1 121.6±11.2
对比例2 122.3±10.3
对比例3 113.1±6.4
对比例4 117.4±12.8
对比例5 137.4±10.5＊
从表8可以看出，用根据本公开的实施例的绞股蓝叶提取物处理的L6肌肉细胞中，mTOR的活性明显增加。这意味着本公开的绞股蓝叶提取物具有增加肌肉细胞生成的卓越能力。
试验例3：绞股蓝叶提取物对肌肉蛋白降解的抑制作用
L6肌细胞(ATCC)以2x105个细胞/mL被接种到6孔板上，然后在含有10％FBS(Hyclone)的DMEM(Hyclone)中进行培养。当细胞密度达到约80％至85％时，将L6细胞分化为肌管，方法是将培养基从孔中取出，用含2％HS(Hyclone)的DMEM(Hyclone)替换。分化总共进行6天，每隔一天更换一次新鲜培养基。分化后，将实施例或对比例的绞股蓝叶提取物以40μg/mL的浓度溶于含有50ng/mL的TNF-α的DMEM中，并对细胞进行处理。6小时后，用TRIzol试剂(Takara，Osaka，Japan)分离总RNA。使用NanoDrop 1000(Thermo FisherScientific Inc.，Waltham，MA，USA)对分离的总RNA进行定量。将16μL定量的RNA与逆转录酶预混物(ELPIS-Biotech)混合，使用PCR仪器(Gene Amp PCR System 2700；AppliedBiosystems，Foster City，CA，USA)在42℃、55分钟和70℃、15分钟的条件下合成cDNA。将4μL合成的cDNA与表9中描述的正向和反向引物对(Bioneer，Deajeon，Korea)和PCR预混合液(ELPIS-Biotech)混合后，通过重复30个在95℃下30秒、60℃下1分钟和72℃下1分钟的循环进行PCR。
将PCR扩增的cDNA在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，用G：BOX EF成像系统(Syngene)鉴定cDNA条带。结果显示在表10中。
[表9]
[表10]
MuRF-1(占对照组的百分比) Atrogin-1(占对照组的百分比)
对照组 100 100
TNF-α(50ng/mL) 411.5±32.7＊＊＊ 248.5±26.4＊＊
实施例1 125.0±11.6### 109.0±10.3###
实施例2 156.5±12.8### 121.2±9.6###
对比例1 329.2±24.3# 198.8±16.7#
对比例2 312.3±23.1# 184.3±12.3#
对比例3 373.4±22.6# 204.6±17.2#
对比例4 349.2±21.8# 193.2±19.5#
对比例5 256.9±16.7## 151.6±11.4##
从表10可以看出，用根据本公开的实施例的绞股蓝叶提取物处理，导致L6肌肉细胞中atrogin-1和MuRF-1mRNA的表达减少。这意味着本公开的绞股蓝叶提取物具有抑制肌肉细胞中肌肉蛋白降解的卓越能力。
试验例4：绞股蓝叶提取物对肌肉分化的促进作用
将L6肌细胞(ATCC)以2x105个细胞/mL接种到6孔板上，并在含有10％ FBS(Hyclone)的DMEM(Hyclone)中进行培养。当细胞密度达到约80％至85％时，从孔中取出培养基，用以40μg/mL的浓度溶于含2％HS的DMEM(Hyclone)中的实施例或对比例的绞股蓝叶提取物处理细胞，使其分化为肌管。对照组用0.01％ DMSO代替样品进行处理。通过重复该过程3次，每次2天，共分化6天后，用TRIzol试剂(Takara)分离出总RNA。按照与试验例3相同的方法由分离的RNA合成cDNA后，通过进行PCR鉴定MyoD和myogenin mRNA的转录水平。用于PCR的引物(Bioneer)的序列在表11中描述。PCR扩增的cDNA在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，用G:BOX EF成像系统(Syngene)鉴定cDNA条带。结果见表12。
[表11]
[表12]
MyoD(占对照组的百分比) Myogenin(占对照组的百分比)
对照组 100 100
实施例1 373.8±42.4＊＊＊ 623.7±29.3＊＊＊
实施例2 323.4±31.6＊＊＊ 472.8±33.7＊＊＊
对比例1 169.6±26.3＊ 212.1±19.4＊
对比例2 183.2±24.6＊ 270.3±32.6＊
对比例3 172.4±15.8＊ 258.6±26.4＊
对比例4 157.3±19.1＊ 249.3±16.7＊
对比例5 223.6±24.7＊＊ 317.5±34.5＊＊
从表12可以看出，用根据本公开的实施例的绞股蓝叶提取物处理后，L6肌肉细胞中MyoD和myogenin mRNA的表达明显增加。这意味着本发明的绞股蓝叶提取物具有促进肌肉细胞分化的卓越能力。
试验例5：绞股蓝叶提取物对运动表现能力的提高
为了评估绞股蓝叶提取物的运动表现能力，通过荧光素酶试验研究PGC-1α的活性。COS7猴肾细胞(ATCC)在24孔板上以1.5x105个细胞/孔培养，然后用Lipofector(Aptabio，Yongin，Korea)将pGL3-PGC-1α-Luc质粒(Addgene，Cambridge，MA，USA)转染给细胞。4小时后，将细胞稳定24小时。然后，用以40μg/mL的浓度溶于DMEM中的实施例或对比例的绞股蓝叶提取物处理细胞24小时。24小时后，用NP-40缓冲液(ELPIS-Biotech)裂解细胞，测量细胞裂解液中荧光素酶的活性。结果显示在表13中。
[表13]
相对荧光素酶活性(占对照组的百分比)
对照组 100
实施例1 162.4±14.7＊＊＊
实施例2 145.3±11.6＊＊
对比例1 104.2±9.4
对比例2 109.5±12.3
对比例3 111.6±12.1
对比例4 108.4±6.9
对比例5 121.3±10.5＊
从表13可以看出，根据本公开的实施例的绞股蓝叶提取物明显提高了PGC-1α的活性，而PGC-1α是参与运动表现能力的一个主要因素。这意味着本发明的绞股蓝叶提取物具有增强运动能力的卓越能力。
试验例6：绞股蓝叶提取物对线粒体生物合成的促进作用
实验按照与试验例4相同的方法进行。通过用浓度为40μg/mL的实施例或对比例的绞股蓝叶提取物处理，诱导L6细胞分化成肌管。对照组用0.01％DMSO代替样品进行处理。用于PCR的引物(Bioneer)的序列在表14中描述。PCR扩增的cDNA在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，用G：BOX EF成像系统(Syngene)识别cDNA条带。结果见表15。
[表14]
[表15]
从表15可以看出，用根据本公开的实施例的绞股蓝叶提取物处理后，L6肌肉细胞中PGC-1α、ERRα、NRF-1和Tfam mRNA的表达明显增加。这意味着本公开的绞股蓝叶提取物具有增加肌肉细胞中线粒体生物合成相关基因表达的卓越效果，这些基因与运动表现能力密切相关。
试验例7：提高经肌肉萎缩诱导的动物模型的运动能力的效果
7-1：动物育种和诱导肌肉萎缩
7周大的雄性小鼠(C57BL/6N；Young Bio)被用作实验动物。所有的动物都被安置在笼子里，条件是23℃±2℃和相对湿度55％±10％。实验开始前，共40只小鼠被随机分为正常组、肌肉萎缩组、实施例1施用组、对比例1施用组、对比例2施用组、对比例3施用组、对比例4施用组和对比例5施用组，每组有5只小鼠。适应1周后，通过腹腔注射325mg/kg的三溴乙醇(Sigma-Aldrich)对小鼠进行麻醉。麻醉后，用皮肤缝合器(Unidus，Chungcheongbuk-do，Korea)将肌肉萎缩组以及实施例和对比例施用组小鼠的右后肢腓肠肌和右脚板订住，以损伤肌肉，并防止右后肢移动。这种状态维持一周。一周后，拆除固定在腓肠肌和脚板上的钉子，通过每天口服浓度为300mg/kg的实施例或对比例的绞股蓝叶提取物，诱导恢复，持续一周。正常组和肌肉萎缩组用生理盐水代替样品进行口服施用。
7-2：肌肉力量的测量
在口服施用结束后，用肌肉力量计(Chatillon测力系统；Columbus Instrument，Columbus，OH，USA)测量小鼠的肌肉力量。以恒定的力量拉动小鼠的尾巴，直到小鼠松开肌肉力量计的杆。每只小鼠共连续进行5次测试，结果见表16。
[表16]
肌肉力量(g)
正常组 267.5±12.7
肌肉萎缩组 191.4±10.3＊＊
实施例 253.4±15.6##
对比例1 190.5±14.1
对比例2 202.2±8.4
对比例3 204.3±16.4
对比例4 195.8±5.9
对比例5 206.1±12.7
从表16可以看出，虽然与正常组相比，肌肉萎缩组的肌肉力量明显下降(**，p<0.01)，但根据本公开的实施例1的绞股蓝叶提取物施用后，肌肉力量明显增加(##，p<0.01)。这意味着本公开的绞股蓝叶提取物具有增加因肌肉萎缩而下降的肌肉力量的优越效果。同时，根据对比例1至5的绞股蓝叶提取物并没有明显增加肌肉力量。
7-3：耐力的测量
实验动物的运动能力是用跑步机(LE8710MTS；Panlab，Barcelona，Spain)来评估的。速度从8米/分钟以1米/分钟的速度增加。当小鼠到达冲击网时，跑步机被设置为施加0.2mA的电流。当小鼠在接受电击10秒后也没有再跑动时，实验停止，并测量时间和距离。结果显示在表17中。
[表17]
运动时间(秒) 运动距离(m)
正常组 1220.4±125.2 342.1±44.7
肌肉萎缩组 843.6±92.3＊＊ 213.5±46.2＊＊
实施例1 1194.2±119.4## 326.4±47.3##
对比例1 864.2±81.6 236.7±34.6
对比例2 872.1±88.3 251.3±29.7
对比例3 892.3±91.4 256.1±33.4
对比例4 912.5±101.7 264.5±41.3
对比例5 1023.7±127.8# 283.2±37.1#
从表17可以看出，与正常组相比，肌肉萎缩组的运动时间和运动距离明显减少(**，p<0.01)，而根据本公开的实施例1的绞股蓝叶提取物，运动时间和运动距离明显增加(##，p<0.01)。这说明本公开的绞股蓝叶提取物对提高因肌肉萎缩而下降的耐力有非常优越的效果。
7-4：肌肉重量的测量
在测量完肌肉力量和运动表现能力后，通过腹腔注射325mg/kg的三溴乙醇(Sigma-Aldrich)对实验动物进行麻醉，然后通过心脏采血牺牲。确认心跳停止后，从右后肢取出未受伤的胫骨前肌并称重。结果显示在表18中。
[表18]
胫骨前肌重量(g)
正常组 51.4±3.8
肌肉萎缩组 37.4±6.5＊＊
实施例1 48.9±5.7##
对比例1 38.1±2.6
对比例2 38.4±5.1
对比例3 37.9±4.4
对比例4 39.2±3.2
对比例5 41.6±2.9
从表18可以看出，与正常组相比，肌肉萎缩组的肌肉重量明显下降(**，p<0.01)，而根据本公开的实施例1的绞股蓝叶提取物施用时，肌肉重量明显增加(##，p<0.01)。这意味着本公开的绞股蓝叶提取物具有增加因肌肉萎缩而减少的肌肉质量的优越效果。
试验例8：绞股蓝叶提取物降低血糖和减少体脂的作用
8-1：葡萄糖摄取的促进
用实施例或对比例的绞股蓝叶提取物处理L6肌肉细胞后，研究了对细胞内葡萄糖摄取的影响。将L6细胞以1x104个细胞/mL播种到96孔板上后，将细胞培养24小时。然后，用含有2％FBS的培养基替换来诱导细胞分化，并培养4天。然后，在更换为含有样品的培养基并进一步培养2小时后，用葡萄糖摄取比色法试剂盒(Bio Vision)测量葡萄糖的摄取情况。
结果是在用根据本公开的绞股蓝叶提取物处理的细胞中葡萄糖摄取量增加(表19)。这一结果证实了根据本公开内容的绞股蓝叶提取物通过降低血糖具有卓越的抗糖尿病效果。
[表19]
葡萄糖摄取量(占对照组的百分比)
对照组 1.00
实施例1 2.00±0.07＊＊＊
实施例2 1.80±0.06＊＊
对比例3 1.75±0.05＊
对比例4 1.15±0.12
8-2：β氧化的促进
用实施例或对比例的绞股蓝叶提取物处理L6肌肉细胞后，用Hwang等人的方法(Hwang等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.377，1253-1258)研究了对脂肪酸β氧化的影响。
结果是用根据本公开的绞股蓝叶提取物处理导致了β氧化的增加。该结果显示在表20中。
[表20]
β氧化(占对照组的百分比)
对照组 100
实施例1 188.2±3.10＊＊＊
实施例2 165.4±5.02＊＊
对比例3 160.0±2.00＊
对比例4 104.3±6.40
8-3：AMPK磷酸化的增加
ACC是调节肝脏和肌肉组织中的脂质代谢的重要的酶。这种酶使乙酰-CoA羧化，产生丙二酰-CoA。丙二酰-CoA是调节线粒体中脂肪酸的β氧化的最重要因素。如果丙二酰-CoA的浓度增加，线粒体膜中CPT-1(肉碱棕榈酰-CoA转移酶)的活性就会下降，脂肪酸的β氧化就会受到抑制。相反，如果丙二酰-CoA浓度增加，β氧化就会增加，因此有利于减少体内脂肪。ACC是AMPK活性的子目标蛋白。AMPK的激活通过磷酸化促进了ACC酶的失活，从而降低了丙二酰-CoA的浓度。因此，线粒体膜中CPT-1的活性增加，脂肪酸的β氧化增加。
因此，研究了实施例或对比例的绞股蓝叶提取物对AMPK磷酸化增加的影响。用绞股蓝叶提取物处理分化的L6肌肉细胞(L6肌管细胞)2小时后，根据Hwang等人的方法(Hwang等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.371，289-293，2008)，通过免疫印迹检测确定AMPKα子单元的苏氨酸172残基的磷酸化增加。结果证实，与对照组相比，用绞股蓝叶提取物处理导致L6肌肉细胞中AMPK磷酸化的增加(见图2)。
8-4：体脂的减少：体内实验
实验是在容纳特定的无病原体雄性C57BL/6N小鼠1周后进行的。将健康动物随机分为(G1)对照饮食组、(G2)高脂肪饮食对照组、(G3)高脂肪饮食+300mg/kg体重(BW)实施例1施用组、(G4)高脂肪饮食+300mg/kg体重对比例3施用组，每组10只实验动物。在整个试验期间，对照饮食组(G1)和高脂肪饮食组(G2、G3、G4)分别用从Research Diets,Inc.(NewBrunswick,NJ,USA)购买的对照食物(能量比(千卡％)为蛋白质:碳水化合物:脂肪＝20:70:10)和高脂肪饮食(能量比(千卡％)为蛋白质:碳水化合物:脂肪＝20:20:60)喂养。允许自由接触食物和饮水。试验物质在生理盐水中溶解后口服，持续8周，时间不变(G3、G4)。对于G1和G2，口服不含试验物质的生理盐水。在试验期间，每周在恒定时间内测量实验动物的体重。每隔一天测量一次实验动物的食物摄入量，并根据试验期间的食物摄入量计算每日食物摄入量和每日能量摄入量。食物效率比(FER)的计算方法是用试验期间的体重增长量除以同期的食物摄入量，按以下等式计算。结果见表21。
[等式]
食物效率比(FER)＝体重增长量(g)/食物摄入量(g)。
[表21]
从表21可以看出，与高脂肪饮食对照组G2或施用对比例3的G4组相比，施用本公开的实施例1的G3组的体重增长量明显减少。
<制备例>
制备例1：片剂的制备
将8mg实施例1的绞股蓝叶提取物、9mg维生素E、9mg维生素C、200mg半乳寡糖、60mg乳糖和140mg麦芽糖混合并使用流化床干燥器造粒后，加入6mg糖酯。按照普通的方法，将500mg所得组合物制备成片剂。
制备例2：软胶囊的制备
按照普通方法制备软胶囊，将8mg实施例1的绞股蓝叶提取物、9mg维生素C、2mg棕榈油、8mg氢化植物油、4mg黄蜂蜡和9mg卵磷脂混合在一起，将混合物装入明胶胶囊。
制备例3：丸剂的制备
将实施例1的绞股蓝叶提取物粉碎并通过200目筛子得到粉末。将5mg绞股蓝叶粉末与蜂蜜、糊精、淀粉、微晶纤维素、CMC钙等混合，制备成丸剂。
制备例4：饮料的制备
将20mg实施例1的绞股蓝叶提取物、9mg维生素E、9mg维生素C、10g葡萄糖、0.6g柠檬酸和25g低聚糖糖浆混合后，加入300mL纯化水。每个瓶子里装200mL的混合物。然后，通过在130℃下对瓶子进行4秒至5秒的消毒来制备饮料。
制备例5：颗粒剂的制备
将8mg实施例1的绞股蓝叶提取物、9mg维生素E、9mg维生素C、250mg无水结晶葡萄糖和550mg淀粉混合，用流化床造粒机成型，然后装入小袋制备成颗粒剂。
制备例6：注射剂的制备
用上述组成以普通方法制备注射剂。
制备例7：浓缩茶的制备
将实施例1的绞股蓝叶提取物通过加水稀释到固体含量为15％。在90℃下加热后，以绞股蓝叶提取物的重量为100份，加入10份重量的γ-环糊精。通过将混合物浓缩到60％来制备浓缩茶。
制备例8：功能性饮料的制备
将上述成分按照常见的健康饮料制备方法进行混合，并在85℃下搅拌加热约1小时。将制备的溶液过滤并转移到灭菌的2L容器中。密封和灭菌后，用于制备功能性饮料组合物。
以上描述的组合物是作为适用于混合饮料的具体实例提供的。但是，可以根据地区和民族的喜好，如消费阶层、国家、使用目的等，根据需要改变该组合物。
本公开内容所属技术领域的普通技术人员将从上述描述中理解，本公开内容可以体现为其他具体形式，而不改变其技术思想或基本特征。在这方面，上面描述的具体示例性实施方案应理解为示例性的，而不是限制性的。应当理解的是，本公开的范围包括所附权利要求的含义和范围，以及由其等价物衍生的所有变化或修改。

Claims (15)

1.一种制备绞股蓝叶提取物的方法，所述提取物包含重量比为100:20至100:80的绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI，所述方法包括：
(1)通过用水、C1-C4低碳醇、或其混合溶剂提取干燥的绞股蓝叶，制备绞股蓝叶提取物的步骤；和
(2)向绞股蓝叶提取物中加入有机酸，然后在60℃至100℃下进行酸处理的步骤。
2.根据权利要求1所述的制备绞股蓝叶提取物的方法，其中步骤(1)包括：
(a)通过用水、C1-C4低碳醇、或其混合溶剂提取绞股蓝叶，制备绞股蓝叶提取物的步骤；
(b)通过用水、C1-C4低碳醇、或其混合溶剂提取在提取绞股蓝叶后剩余的残留物，制备绞股蓝叶提取物残留物的提取物的步骤；和
(c)混合步骤(a)的提取物和步骤(b)的提取物的步骤。
3.根据权利要求1所述的制备绞股蓝叶提取物的方法，其中步骤(1)的混合溶剂为20体积％至80体积％的甲醇、乙醇、丁醇或丙醇。
4.根据权利要求1所述的制备绞股蓝叶提取物的方法，其中步骤(2)的有机酸是选自柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸和乙酸中的一种或多于一种。
5.根据权利要求1所述的制备绞股蓝叶提取物的方法，其中步骤(2)的酸处理是在pH2.0至4.5下进行的。
6.根据权利要求1所述的制备绞股蓝叶提取物的方法，其中绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI之和为10mg/g至100mg/g。
7.根据权利要求1所述的制备绞股蓝叶提取物的方法，其中绞股蓝叶提取物包含6mg/g至60mg/g的绞股蓝皂苷L和4mg/g至40mg/g的绞股蓝皂苷LI。
8.根据权利要求1所述的制备绞股蓝叶提取物的方法，其中绞股蓝叶提取物还包含基于100重量份的绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI的4重量份至10重量份的人参皂苷Rg3。
9.根据权利要求1所述的制备绞股蓝叶提取物的方法，其中绞股蓝叶提取物提高选自肌肉力量和耐力中的一种或多于一种的运动表现能力，或者其中绞股蓝叶提取物增加肌肉质量或抑制肌肉流失。
10.一种通过根据权利要求1所述的方法制备的绞股蓝叶提取物，其包含重量比为100:20至100:80的绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI，其中绞股蓝皂苷L和绞股蓝皂苷LI之和为10mg/g至100mg/g。
11.一种用于提高运动表现能力的组合物，其包含根据权利要求10所述的绞股蓝叶提取物作为活性成分。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中提高运动表现能力是预防或治疗一种或多于一种由运动能力下降引起的疾病，所述疾病选自退行性疾病、线粒体病、耐力下降、敏捷性下降、嗜睡、肌肉消瘦和抑郁症。
13.一种用于预防或缓解由肌肉功能下降、肌肉消瘦或肌肉萎缩引起的肌肉疾病或肌肉损伤的组合物，其包含根据权利要求10所述的绞股蓝叶提取物作为活性成分。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中肌肉疾病是选自弛缓、肌肉萎缩、肌营养不良、肌无力、恶病质和肌少症中的一种或多于一种，其中肌肉损伤是选自肌肉拉伤、肌肉断裂、肌肉撕裂、挫伤、扭伤、肩袖综合症和肌炎中的一种或多于一种。
15.一种用于降低体重和体脂的组合物，其包含根据权利要求10所述的绞股蓝叶提取物作为活性成分。
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