TW202103682A - 野櫻莓汁液用於抑止肌膚老化的用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種野櫻莓汁液用於抑止肌膚老化的組合物之用途，其中該組合物用於抑制黑色素生成、抑制活性氧物質生成、促進皮膚纖維母細胞增生。
Description
本案係關於一種野櫻莓汁液的用途。特別是關於野櫻莓汁液用於製備抑止肌膚老化的組合物的用途。
皮膚對於人類個體提供對抗陽光中紫外線（ultraviolet，UV）輻射、病原體、摩擦力等環境因子的第一階段保護。皮膚由外向內依序包含表皮層、主要由結締組織所構成的真皮層、及皮下組織。其中，真皮層包含有充足的膠原蛋白（collagen）、彈力蛋白（elastin）、及玻尿酸（hyaluronic acid）等分子，因此年輕的肌膚具有較佳的支撐性以及彈性。
肌膚原本即會隨年齡增長而正常老化，產生各種受損的肌膚狀態。例如因受環境中的活性氧物質（reactive oxygen species，ROS，亦稱自由基）影響，使肌膚中的膠原蛋白裂解，進而導致肌膚彈力下降、保水度不足（肌膚較為乾燥、無光澤）、毛孔粗大、皺紋等現象；以及例如因黑色素沉澱，使肌膚產生斑點及/或整體較為暗沈、蠟黃等老化態樣。
然而，在某些其他的環境因素下，則會加速肌膚老化的進程。舉例而言，一般常見的自然因素例如陽光中的紫外線。當暴露於紫外線中，紫外線將會促使肌膚細胞產生活性氧物質；此外，紫外線亦會誘發肌膚中的黑色素細胞產生黑色素，進而導致前述的各項肌膚老化態樣加速生成。
此外，由於在現代生活中，人們使用帶有螢幕的電子產品的時間大幅增加，螢幕所發出的具有較短波長、較高能量的可見光（後稱藍光）在長時間照射肌膚的情況下，也會產生與紫外線類似的效果。因此，對於肌膚老化，藍光亦成為不可被忽視的一項因素。
有鑑於此，研究或開發一種可減緩肌膚因紫外線或藍光所造成的損害，以提供肌膚對於紫外線以及藍光保護，進而減緩皮膚老化的組合物，來維持或改善肌膚外觀是有其需求的。
據此，本發明的一目的在於提供一種野櫻莓汁液用於製備抗肌膚老化的組合物的用途。具體而言，本發明的一目的在於提供一種野櫻莓汁液用於製備抑制自由基、抑制黑色素生成、以及促進纖維母細胞生長的組合物的用途。
在一些實施例中，該組合物用以增加肌膚彈性、增加肌膚含水量、改善肌膚毛孔狀態、減少肌膚皺紋、或抑止肌膚皺紋生成。
在一些實施例中，該組合物中糖度為65-68°Bx的野櫻莓汁液佔2wt%至10wt%。
在一些實施例中，該組合物係醫藥組合物。
在一些實施例中，該組合物係進一步製備成保養品組合物、保健食品組合物、或化妝品組合物。
在一些實施例中，該組合物為內服組合物或外用組合物。
在一些實施例中，該組合物中糖度為65-68°Bx的野櫻莓汁液佔0.5wt%。
而如先前所述，紫外線、藍光皆會以類似的機制使肌膚細胞中產生活性氧物質。又因活性氧物質具有高度活性，其將會與肌膚中的膠原蛋白分子產生反應，進而裂解膠原蛋白。由於膠原蛋白有如肌膚中的「支架」，係用以賦予肌膚支撐性以及彈性，當肌膚在缺乏膠原蛋白的情況下，將會加速肌膚老化，使肌膚產生彈力下降、保水度不足（肌膚較為乾燥、無光澤）、毛孔粗大、以及皺紋等現象。另一方面，紫外線與藍光亦會誘發肌膚中的黑色素細胞產生黑色素，使得肌膚產生斑點及/或整體較為暗沈、蠟黃，此亦為肌膚老化的常見現象之一。
而由於本案證實野櫻莓汁液可抑制自由基產生、抑制黑色素生成，故野櫻莓汁液可有效防止由紫外線或藍光所產生的多種肌膚老化現象，提供肌膚對於紫外線以及藍光的防護。
此外，本案另亦證實野櫻莓汁液可促進纖維母細胞的生長。而由於纖維母細胞可產生膠原蛋白，故野櫻莓汁液可間接提升膠原蛋白的生成量。據此，對於膠原蛋白而言，野櫻莓汁液不僅可被動地減少其受自由基影響的耗損，亦可主動地補充肌膚中的膠原蛋白，使肌膚狀態更為健康。
以下將描述本案的部分具體實施態樣。在不背離本案精神下，本案尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將保護範圍限於說明書所具體陳述的條件。
本案使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差（SD）表示，各組之間的差異以學生t
檢驗（student'st
-test）進行分析。
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在正負10%的範圍內，最佳為在正負5%的範圍內。
野櫻莓（學名：Aronia melanocarpa
，又名為Black chokeberry）是薔薇科的一種落葉灌木的果實。
在一些實施例中，由野櫻莓果實所榨取的汁液（有時亦稱之為「野櫻莓汁液」）可抑制自由基生成、可抑制黑色素生成、以及可促進皮膚纖維母細胞增生。因此，野櫻莓汁液可用於製備抑制自由基生成、抑制黑色素生成、以及促進皮膚纖維母細胞增生的組合物。
在一些實施例中，野櫻莓汁液可有效防止由紫外線或藍光所產生的多種肌膚老化現象，提供肌膚對於紫外線以及藍光的防護。此外，本申請另亦證實野櫻莓汁液可促進纖維母細胞的生長，故野櫻莓汁液可主動地補充肌膚中的膠原蛋白。
在一些實施例中，野櫻莓汁液對肌膚多種受膠原蛋白影響的狀況或外觀，亦可具有改善效果。亦即，野櫻莓汁液可例如：(1)減少細紋或皺紋；(2)縮小皮膚毛孔大小；(3)改善皮膚厚度、飽滿度、及/或彈性；(4)改善膚色或光澤；(5)增加原膠原蛋白產生；(6)改善皮膚外觀；或(7)增加肌膚含水量等。因此，野櫻莓汁液可用於製備抑制改善皮膚狀態的組合物，其中改善皮膚狀態可為增加肌膚彈性、增加肌膚含水量、改善肌膚毛孔狀態、減少肌膚皺紋、抑止肌膚皺紋生成或其組合。
在一些實施例中，前述的組合物可為醫藥組合物、保養品組合物、食品組合物、保健食品組合物。
醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於經腸道地（enterally）、非經腸道地（parenterally）或局部地（topically）投藥的劑型。例如可為：注射品（injection）[例如，無菌的水性溶液（sterile aqueous solution）或分散液（dispersion）]、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation）或其他類似物。
醫藥組合物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。例如，醫藥上可接受的載劑可包含下列一種或多種載劑：乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。有關這些載劑的選用與數量是熟習此項技術人員可視情況進行選擇的。
在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可包含下列一種溶劑：水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝生理鹽水（phosphate buffered saline，PBS）、含有醇的水性溶液（aqueous solution containing alcohol）以及其他任何合適的溶劑。
在一些實施例中，該醫藥組合物可由下列所述的任一種非經腸道途徑（parenteral routes）來投藥：皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）以及病灶內注射（intralesional injection）。
在一些實施例中，醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑（external preparation）。舉例而言，其可為下列所述的任一種，但不限於此：乳劑（emulsion）、凝膠（gel）、軟膏（ointment）、乳霜（cream）、貼片（patch）、擦劑（liniment）、粉末（powder）、氣溶膠（aerosol）、噴霧（spray）、乳液（lotion）、乳漿（serum）、糊劑（paste）、泡沫（foam）、滴劑（drop）、懸浮液（suspension）、油膏（salve）以及繃帶（bandage）。
在一些實施例中，外部製劑是藉由將醫藥組合物與一為熟習此項技藝者所詳知的基底（base）相混合而製成。
在一些實施例中，該基底可包含下列一種或多種的添加劑（additives）：水、醇（alcohols）、甘醇（glycol）、碳氫化合物（hydrocarbons）[諸如石油膠（petroleum, jelly）以及白凡士林（white petrolatum,）]、蠟（wax）[諸如石蠟（paraffin）以及黃蠟（yellow wax）]、保存劑（preserving agents）、抗氧化劑（antioxidants）、界面活性劑（surfactants）、吸收增強劑（absorption enhancers）、安定劑（stabilizing agents）、膠凝劑（gelling agents）[諸如卡波普®974P （carbopol®974P）、微結晶纖維素（microcrystalline cellulose）以及羧基甲基纖維素（carboxymethylcellulose）]、活性劑（active agents）、保濕劑（humectants）、氣味吸收劑（odor absorbers）、香料（fragrances）、pH調整劑（pH adjusting agents）、螯合劑（chelating agents）、乳化劑（emulsifiers）、閉塞劑（occlusive agents）、軟化劑（emollients）、增稠劑（thickeners）、助溶劑（solubilizing agents）、滲透增強劑（penetration enhancers）、抗刺激劑（anti-irritants）、著色劑（colorants）以及推進劑（propellants）等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
在一些實施例中，保養品中可包含有一被廣泛地使用於保養品製造技術之可接受的佐劑（acceptable adjuvant）。例如，該可接受的佐劑可包含下列一種或多種佐劑：溶劑、膠凝劑、活性劑、防腐劑、抗氧化劑、遮蔽劑（screening agent）、螯合劑、界面活性劑、染色試劑（coloring agent）、增稠劑（thickening agent）、填料（filler）、香料以及氣味吸收劑。可根據實際需求對這些試劑的選用與數量進行合適的調整。
在一些實施例中，保養品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚（skincare）或化妝（makeup）的形式，其可為下列中的任一種，但不限於此：水性溶液（aqueous solution）、水-醇溶液（aqueous-alcohol solution）或油性溶液（oily solution）、呈水包油型（oil-in-water type）、油包水型（water-in-oil type）或複合型之乳劑、凝膠、軟膏、乳霜、面膜（mask）、貼片、貼布（pack）、擦劑、粉末、氣溶膠、噴霧、乳液、乳漿、糊劑、泡沫、分散液、滴劑、慕斯（mousse）、防曬油（sunblock）、化妝水（tonic water）、粉底（foundation）、卸妝產品（makeup remover products）、肥皂（soap）以及其他身體清潔產品（body cleansing products）等。
在一些實施例中，保養品亦可與下列中之已知活性的外用劑（external use agents）的一種或多種一起合併使用：美白劑（whitening agents）[諸如維生素A酸（tretinoin）、兒茶素（catechin）、麴酸、熊果苷以及維生素C]、保濕劑、殺菌劑（bactericides）、紫外線吸收劑（ultraviolet absorbers）、植物萃取物（plant extracts）[諸如蘆薈萃取物（aloe extract）]、皮膚營養劑（skin nutrients）、麻醉劑（anesthetics）、抗痘劑（anti-acne agents）、止癢劑（antipruritics）、止痛劑（analgesics）、抗皮膚炎劑（antidermatitis agents）、抗過角化劑（antihyperkeratolytic agents）、抗乾皮膚劑（anti-dry skin agents）、抗汗劑（antipsoriatic agents）、抗老化劑（antiaging agents）、抗皺劑（antiwrinkle agents）、抗皮脂溢出劑（antiseborrheic agents）、傷口治療劑（wound-healing agents）、皮質類固醇（corticosteroids）以及激素（hormones）。有關這些外用劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
在一些實施例中，醫藥組合物可被當作食品添加物（food additive），藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。
在一些實施例中，食品的種類可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）、健康食品（health foods）以及膳食補充品（dietary supplements）。
在一些實施例中，「野櫻莓汁液」可為野櫻莓的果實經榨取而得的汁液。舉例而言，在一些實施例中，係將野櫻莓的果實經碾碎、擠壓並去除果渣與較細小的懸浮物後，再將其濃縮至一定糖度而得。在另一些實施例中，野櫻莓汁液於製備過程中亦可經過其他大致上不影響其產生本案所述功效的程序，例如發酵，以增添風味或其他用途。
在一些實施例中，「野櫻莓汁液」亦可為使用合適的萃取溶劑萃取野櫻莓的果實而得到的萃取液。舉例而言，可將野櫻莓浸泡於水中於常溫下經適當時間進行萃取，再經過濾去除固態雜質後可得到野櫻莓果實萃取液。
下列範例中的實驗步驟若無特別敘明，即在室溫（25±5℃）、常壓（1atm）下進行。
[例1]細胞實驗-野櫻莓汁液抑制ROS生成
於此，以螢光探針DCFH-DA配合流式細胞儀，測定人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk經野櫻莓汁液處理後，其活性氧物質含量的變化。
材料與儀器
1. 細胞株：人類皮膚纖維母細胞（Human skin fibroblast）CCD-966sk（生物資源保存及研究中心（BCRC），No. 60153）。
2. 培養基：將Eagle’s最低限度基本培養基（minimum essential medium，MEM，購自Gibco，15188-319）添加額外成分使其含有10 vol% FBS（fetal bovine Serum，購自Gibco，10437-028）、90 vol% 1mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate，購自Gibco，11360-070）、1.5g/L 碳酸氫鈉（購自Sigma）、0.1mM 非必需胺基酸（non-essential amino acid solution，購自Gibco，11140-050）。
3. 磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號10437-028。
4. DCFH-DA溶液：將二氯二氫螢光素二乙酸酯（2,7-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA；產品編號SI-D6883，購自Sigma）溶於二甲基亞碸（dimethyl sulfoxide，DMSO，購自Sigma，產品編號SI-D6883-50MG）以配製成5 mg/ml 的DCFH-DA溶液。
5. 流式細胞儀（Flow cytometry），Beckman，Catalog No.660519。
6. 藍光箱（波長400nm-500nm）。
7. 野櫻莓汁液：此實驗中所使用的野櫻莓汁液是野櫻莓果實的榨取汁液，係購自台灣綠源股份有限公司（Taiwan Green Nation Corp.），其野櫻莓汁液的糖度為65-68°Bx。
實驗步驟
實驗將會分為實驗組、空白控制組（未添加野櫻莓汁液、亦無經過藍光照射的組別）、以及對照組（未添加野櫻莓汁液，但經藍光照射的組別）三組進行，各組分別進行三重複試驗：
1. 將CCD-966sk細胞以每孔1×105
個的方式，接種於每孔含2ml培養基之6孔培養盤中。
2. 將培養盤置於5％CO2
、37℃下，培養24小時。
3. 移除培養基。
4. 實驗組：將野櫻莓汁液樣品0.625μL加入至每孔中，使其於37℃下反應1小時。其中，野櫻莓汁液樣品係將前述的野櫻莓汁液以水稀釋至糖度為20°Bx後，再以培養基配製成每毫升含0.0625毫克之稀釋野櫻莓汁液的溶液。
空白控制組：添加0.625μL的培養基至每孔中，使其於37℃下反應1小時。
對照組：添加0.625μL的培養基至每孔中，使其於37℃下反應1小時。
5. 添加濃度5μg/ml的DCFH-DA溶液2 μL於每孔中，使其處理細胞15分鐘。
6. 實驗組：將DCFH-DA溶液處理步驟的6孔培養盤移至藍光箱中，使其在室溫（25±5℃）下接受藍光照射15分鐘。
空白控制組：將DCFH-DA溶液處理步驟的6孔培養盤置於暗處，於室溫下靜置15分鐘。
對照組：將DCFH-DA溶液處理步驟的6孔培養盤移至藍光箱中，使其在室溫下接受藍光照射15分鐘。
7. 反應後，每孔以1 ml PBS溶液清洗細胞2次。
8. 將200μl胰蛋白酶（Trypsin-EDTA (10X)，購自Gibco；產品編號15400-054）加至每孔中並在暗處反應5分鐘。反應後，添加6 mL培養基溶液終止反應。
9. 將各孔中之細胞與培養基個別收集至對應的15ml離心試管內，並將含有細胞與培養基之離心試管以400 xg離心10分鐘。
10. 離心後，移除上清液，加入1ml PBS溶液與沉澱物混合。
11. 再以400 xg離心10分鐘。
12. 離心後，移除上清液，以1 ml PBS溶液於暗處再次懸浮細胞。
13. 使用流式細胞儀偵測DCFH-DA的螢光信號。進行螢光偵測之激發波長為450-490nm，放射波長為510-550nm。由於DCFH-DA進入細胞後會先被水解為DCFH（二氯二氫螢光素），再被活性氧物質氧化為可發出綠色螢光的DCF（二氯螢光素），經DCFH-DA處理之細胞的螢光強度可反映細胞內活性氧物質含量，並藉此得知細胞內活性氧物質高度表現的細胞數佔原細胞數的比例。因實驗係進行二重複，故將二重複實驗之結果平均後，顯示於圖1。
實驗結果
如圖1所示，由空白控制組、對照組的結果可知，在經過藍光照射後，具有高ROS表現（高螢光表現）的細胞比例將大幅增加，顯示藍光照射確實會導致細胞內產生活性氧物質，進而對纖維母細胞產生後續傷害。另一方面，根據對照組以及實驗組的結果可知，當細胞經過野櫻莓汁液處理後，具有高ROS表現的細胞比例相較於對照組即明顯減少約93％，甚至低於空白控制組。顯示野櫻莓汁液可有效減少活性氧物質在細胞內的產生或累積，可作為一種活性氧物質清除劑。亦即，野櫻莓汁液可透過降低細胞內活性氧物質含量，減少細胞受到藍光、紫外線等所導致的氧化傷害。
[例2]細胞實驗-野櫻莓汁液降低黑色素生成
於此，以ELISA讀盤機（enzyme-linked immunosorbent assay reader）測定黑色素瘤細胞株B16F10經野櫻莓汁液處理後，其黑色素含量的變化。
材料與儀器
1. 細胞株：小鼠黑色素瘤細胞株B16F10（ATCC CRL-6475），購自美國典型培養物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC）。
2. 培養基：將Dulbecco's modified minimal essential medium（DMEM，購自Gibco）添加額外成分使其含有1 vol%的抗生素溶液（Antibiotic Antimycotic Solution，購自Gibco，15240-062）、10 vol%的FBS（fetal bovine Serum，購自Gibco，10437-028）。
3. 磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號10437-028。
4. 以二次蒸餾水配製1N NaOH（購自Sigma，產品編號221465）溶液。
5. ELISA reader（BioTek，FLx 800）。
6. 藍光箱（波長400nm-500nm）。
7. 野櫻莓汁液：此實驗中所使用的野櫻莓汁液是野櫻莓果實的榨取汁液，係購自台灣綠源股份有限公司（Taiwan Green Nation Corp.），其野櫻莓汁液的糖度為65-68°Bx。
實驗步驟
實驗將會分為實驗組、空白控制組（未添加野櫻莓汁液、亦無經過藍光照射的組別）、以及對照組（未添加野櫻莓汁液，但經藍光照射的組別）三組進行，各組分別進行三重複試驗：
1. 將B16F10細胞以每孔1.5×105
個的方式，接種於每孔含3ml培養基之6孔培養盤中。
2. 將培養盤置於5％CO2
、37℃環境下，培養24小時。
3. 而後，在不干擾附著細胞的情況下，移除每孔之培養基。
4. 實驗組：於每孔中加入野櫻莓汁液樣品2 ml後，於37℃下培養24小時。其中，野櫻莓汁液樣品係將購得的野櫻莓汁液以水稀釋至糖度為20°Bx的稀釋野櫻莓汁液後，再以培養基與前述的稀釋野櫻莓汁液，配製成每毫升含0.0625毫克之稀釋野櫻莓汁液的溶液。
空白控制組：在37℃下，添加2 ml的培養基至每孔中，使其於37℃下培養24小時。
對照組：在37℃下，添加2 ml的培養基至每孔中，使其於37℃下培養24小時。
5. 實驗組：將經過野櫻莓培養基溶液處理步驟的6孔培養盤移至藍光箱中，使其在室溫（25±5℃）下接受藍光照射3小時。
空白控制組：將6孔培養盤移至暗室中，使其在室溫下靜置3小時。
對照組：將6孔培養盤移至藍光箱中，使其在室溫下接受藍光照射3小時。
6. 反應後，將細胞於37℃下培養48小時。
7. 而後，移除培養基，並以PBS溶液清洗細胞2次。
8. 將200μl胰蛋白酶（Trypsin-EDTA (10X)，購自Gibco；產品編號15400-054）加至每孔中反應3分鐘。反應後，添加6 mL培養基溶液終止反應。而後收集各孔中之懸浮細胞與培養基至對應的15ml離心試管內，將各離心試管以400 xg離心5分鐘使細胞沉澱。
9. 以PBS溶液清洗沉澱細胞二次後，再以200μL PBS溶液重新懸浮細胞。
10. 將細胞懸浮液以液態氮冷凍10分鐘，再置於室溫約30分鐘至完全解凍。
11. 完全解凍後，將試管以12,000g離心3分鐘。
12. 移除上清液，再以120μL 1N氫氧化鈉溶液重新懸浮細胞沉澱後，使試管於60℃乾浴1小時，以獲得待檢測樣本。
13. 將100μL待檢測樣本移入一96孔盤，使用ELISA讀盤機測量細胞溶液在450nm的光密度值（optical density，OD450
），作為吸光度。
實驗結果
實驗組、空白控制組、以及對照組的黑色素相對表現量係依下列公式計算：黑色素相對表現量（%）=（各組OD450
值/空白控制組OD450
值）×100%。因實驗係進行三重複，故將三重複實驗之結果平均後，顯示於圖2。
如圖2所示，由空白控制組、對照組的結果可知，在經過藍光照射後，細胞中的黑色素表現量將明顯增加，顯示藍光照射確實會促使黑色素瘤細胞產生黑色素，而這將使得肌膚產生斑點、或使肌膚整體較為暗沈。而另一方面，根據對照組以及實驗組的結果可知，當細胞經過野櫻莓汁液處理後，其在藍光下的黑色素表現量將低於未經過野櫻莓汁液處理的對照組（降低約16％），顯示野櫻莓汁液可有效減少黑色素細胞因藍光所生成之黑色素。
[例3]細胞實驗-野櫻莓汁液促進皮膚纖維母細胞增生
藉由Click-iT™ EdU方式（藉由EdU處理細胞、固定並透化細胞、使用與Edu結合螢光染劑檢測）來檢測細胞數目，藉此檢驗野櫻莓汁液對於纖維母細胞是否具有促進增生作用。
材料與儀器
1. 細胞株：人類纖維母細胞（Human skin fibroblast）CCD-966SK，購自美國典型培養物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC）。
2. 培養基：將Eagle’s最低限度基本培養基（minimum essential medium，MEM，購自Gibco，15188-319）添加額外成分使其含有10 vol% FBS（fetal bovine Serum，購自Gibco，10437-028）、90 vol% 1mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate，購自Gibco，11360-070）、1.5g/L 碳酸氫鈉（購自Sigma）、0.1mM 非必需胺基酸（non-essential amino acid solution，購自Gibco，11140-050）。
3. 細胞增殖檢測試劑盒（Cell proliferation assay kits，Click-iT™ Plus EdU Alexa Fluor™ 488 Flow Cytometry Assay Kit），購自Invitrogen，型號C10632，50 tests）
試劑盒中所含之藥品：
（a）5-乙炔-2’-脱氧尿苷（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）10 mg（成分A）
（b）Alexa Fluor™ 488 picolyl azide的DMSO溶液 130 μL（成分B）
（c）Dimethylsulfoxide（DMSO）4.5 mL（成分C）
（d）Click-iT™ 固定劑（fixative）（4% paraformaldehyde in PBS）5 mL（成分D）
（e）Click-iT™ 滲透及清洗試劑（fixative saponin-based permeabilization and wash reagent），10X 50 mL（成分E）
（f）濃度為100 mM的銅保護劑（Copper protectant）水溶液 0.5 mL（成分F）
（g）Click-iT™ EdU 緩衝添加劑（EdU buffer additive）400 mg（成分G）
4. 含有1 vol% BSA（Bovine serum albumin，牛血清白蛋白，購自Sigma；商品編號A9647）的PBS溶液，後方將略稱為1%BSA/PBS溶液。
5. 10 mM的EdU溶液：將試劑盒中的成分C取4 mL，加入至成分A中，並保存於-20℃。
6. 1X Click-iT™ 滲透及清洗試劑：將試劑盒中的成分E以1% BSA/PBS溶液稀釋10倍。
7. 10X Click-iT™ EdU 緩衝添加劑溶液：將2 mL的二次蒸餾水加入至試劑盒中的成分G，並保存於-20℃。
8. 磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號10437-028。
9. 流式細胞儀（Flow cytometry），Beckman，Catalog No.660519
10. 野櫻莓汁液：此實驗中所使用的野櫻莓汁液是野櫻莓果實的榨取汁液，係購自台灣綠源股份有限公司（Taiwan Green Nation Corp.），其野櫻莓汁液的糖度為65-68°Bx。
實驗步驟
實驗將會分為實驗組以及空白控制組（未添加野櫻莓汁液）兩組進行：
1. 將CCD-966sk以每孔1×105
個的方式，接種於每孔含2ml培養基之6孔培養盤中，並於5％CO2
、37℃環境下，培養24小時。
2. 實驗組：於室溫下，在每孔中加入2 mL野櫻莓汁液樣品，培養24小時。其中，野櫻莓汁液樣品係將購得的野櫻莓汁液以水稀釋至糖度為20°Bx的稀釋野櫻莓汁液後，再以培養基與前述的稀釋野櫻莓汁液，配製成每毫升含0.0625毫克之稀釋野櫻莓汁液的溶液。
空白控制組：於室溫下，在每孔中加入2 mL的培養基，培養24小時。
3. 將前述10 mM的EdU溶液以培養基稀釋為10 μM後，於每孔中加入2 mL 10 μM的EdU溶液並培養2小時。
4. 收集細胞。
5. 以1％BSA/PBS溶液清洗細胞一次，並移除上清液。
6. 添加試劑盒中的Click-iT™ 固定劑（成分D）100 μL至每孔中與細胞混合，在暗處中於室溫培養15分鐘。
7. 以1％BSA/PBS溶液清洗細胞一次，並移除上清液。
8. 添加1X Click-iT™ 滲透及清洗試劑100 μL至每孔中，在暗處中於室溫培養15分鐘。
9. 以1％BSA/PBS溶液清洗細胞一次，並移除上清液。
10. 以100 μL 1X Click-iT™ 滲透及清洗試劑，重新懸浮細胞。
11. 進行Click-iT™反應。
i. 準備1X Click-iT™ EdU 緩衝添加劑溶液：將10X Click-iT™ EdU 緩衝添加劑溶液，以二次蒸餾水稀釋為1X Click-iT™ EdU 緩衝添加劑溶液。
ii. 準備Click-iT™ Plus reaction 混合試劑（需於配製後15分鐘內進行使用）
（多孔盤的每一格使用500 μL的Click-iT™ Plus reaction 混合試劑，該500 μL的混合試劑以10 μL的銅保護劑（成分F）、2.5 μL picolyl azide的DMSO溶液（成分B）、50 μL 1X Click-iT™ EdU 緩衝添加劑溶液、以及438 μL的PBS溶液配製而成。）
iii. 於每格中加入500 μL的Click-iT™ Plus reaction 混合試劑。
iv. 於暗處室溫下，培養30分鐘。
v. 以1X Click-iT™ 滲透及清洗試劑清洗細胞一次，並移除上清液。
vi. 以500 μL 1X Click-iT™ 滲透及清洗試劑，重新懸浮細胞。
12. 以流式細胞儀對細胞進行分析
由於染料（成分B）將會與細胞中的核酸異性結合並產生綠色螢光，而螢光的強度將與細胞的數量成正比，故可透過測量螢光來量化細胞數目（激發波長：488 nm；發射波長：530/30（515-545 nm））。
將空白控制組的細胞增生率作為基準值（設為1.0）、以及實驗組的相對細胞增生率，繪示於圖3。由圖3中可知，經過野櫻莓汁液處理過的纖維母細胞，可具有較高的增生量。而由於纖維母細胞可產生膠原蛋白，因此野櫻莓汁液亦可間接提升肌膚中膠原蛋白的生成量，使肌膚更為緊緻有彈性。
由細胞實驗可知，野櫻莓汁液確實可降低皮膚纖維母細胞的自由基（ROS）生成，防止肌膚因藍光、紫外線而產生的傷害，抑制膠原蛋白的流失，減緩因藍光、紫外線產生的老化及皺紋生成。且野櫻莓汁液可抑制藍光造成的黑色素生成，減少皮膚黑斑，維持白淨肌膚。野櫻莓汁液另可促進皮膚纖維母細胞生成，使肌膚狀態更為健康，最終達到使肌膚抗老化的功效。
而為證實野櫻莓汁液對於人體的功效，亦進行相關人體實驗如下。
[例4]人體實驗-以外用方式使用野櫻莓汁液
使用樣品：含野櫻莓汁液面膜（以面膜布浸泡於含有野櫻莓汁液的精華液中，使其充分吸收後製得）以及安慰劑面膜（以相同型號的面膜布浸泡於與前述精華液中，但其中的野櫻莓汁液替換成等重的水），再使其充分吸收後製得。於此實施例中，各面膜係含20mL的對應精華液。
含有野櫻莓汁液的精華液成分：三仙膠 0.2wt%、馨鮮酮 0.6wt%、1,3-丁二醇 5wt%、三乙醇胺 0.1wt%、己二醇 0.6wt%、野櫻莓汁液 0.5wt%，其餘為水。其中，此野櫻莓汁液係指野櫻莓果實的榨取汁液，係購自台灣綠源股份有限公司（Taiwan Green Nation Corp.），其野櫻莓汁液的糖度為65-68°Bx。
受試者人數：7位30-55歲之受試者。
實驗方式：受試者將全臉清潔後，依據不同檢測項目，使用對應的儀器及測量方式，紀錄左右半臉於使用面膜前之數值、或拍攝使用前的照片。而後，分別將野櫻莓汁液面膜以及安慰劑面膜貼敷於受試者的右半臉及左半臉上，經15分鐘後取下，再以指腹稍加按摩左半臉與右半臉。待面膜移除約5分鐘後，再以對應的儀器及測量方式，進行測量或拍攝照片，再與自身原左半臉、或右半臉之數值進行對照（使用前與使用後欲進行檢測時，受試者所在的測試區域的溫度與濕度為一致，以減少外界的溫濕度等因素會對皮膚所造成的影響）。
檢測項目：將分別對肌膚進行1.肌膚彈力測試、2.肌膚含水量測試、3.肌膚毛孔狀態、以及4.肌膚皺紋狀態之測試。
1. 肌膚彈力測試
使用購自德國Courage+Khazaka electronic公司之多功能皮膚測試儀（C+K Multi Probe Adapter System），並裝配有Cutometer®
MPA 580探頭。在本測試過程中，連接至皮膚測試儀的探頭將與受試者的皮膚待測區域接觸，藉由在皮膚表面形成負壓而將該待測區域吸入，並測量該待測區域被吸入的深度隨時間的變化以及回彈至原位的能力。該測試結果經過皮膚彈性測量儀所附軟體分析，可得到該待測區域之皮膚彈性指數。
由圖4可知，相較於使用安慰劑面膜的組別，在使用含野櫻莓汁液面膜後，肌膚彈力可顯著地提升約20.8％。基此可知，野櫻莓汁液以外用方式塗敷於肌膚上確實可提升肌膚的彈性。
2. 肌膚含水量測試
肌膚含水量係同樣使用購自德國Courage+Khazaka electronic公司之多功能皮膚測試儀，搭配Corneometer®
CM 825探頭。在測試過程中，使測量儀的探頭與受試者的皮膚待測區域接觸，並測量該待測區域的表皮層含水量。此方法採用電容法測試人體皮膚的水分含量，它的原理是基於水和其他物質的介電常數差異顯著，按照皮膚含水量不同，測得皮膚的電容值不同，其觀測數值可代表皮膚水分值。
由圖5可知，相較於使用安慰劑面膜的組別，使用含野櫻莓汁液面膜後，肌膚含水量可顯著增加約25.7％。基此可知，野櫻莓汁液以外用方式塗敷於肌膚上確實可提升肌膚的保水度。
3. 肌膚毛孔狀態
使用美國Canfield所販售之VISIA高階數位膚質檢測儀進行檢測，透過高解析度之相機鏡頭對面膜使用前、面膜使用後的面部肌膚進行拍攝。藉由標準白光照射，造成毛孔凹陷處產生陰影，毛孔會比周圍的膚色更黑，故可以此偵測毛孔，然後利用軟體根據毛孔數目、面積分析得到一數值，而數值越高則顯示其毛孔數量、面積較多。並且將使用含野櫻莓汁液面膜前、後之右半臉的實拍照片以軟體標記其中的毛孔部分。
由圖6可知，相較於使用含野櫻莓汁液的面膜前，在使用含野櫻莓汁液的面膜後，肌膚的毛孔情況顯著改善約14.9％，且毛孔情況改善人數比率達100％。由圖7與圖8明確顯示相較於使用含野櫻莓汁液的面膜前，使用含野櫻莓汁液的面膜後，使可被偵測之毛孔數量確實減少。基此可知，野櫻莓汁液以外用方式塗敷於肌膚上，確實可改善肌膚的毛孔情況，使毛孔縮小或減少。
4. 肌膚皺紋狀態測試
同樣使用VISIA高階數位膚質檢測儀進行檢測，透過高解析度之相機鏡頭對面膜使用前、面膜使用後的面部肌膚進行拍攝，藉由標準白光照射、偵測皮膚陰影的變化，即可偵測紋理位置並得到一數值，可代表皮膚的平滑程度。並且，將使用含野櫻莓汁液面膜前、後之右半臉的實拍照片以軟體標記其中的皺紋部。
由圖9可知，相較於使用含野櫻莓汁液的面膜前，在使用含野櫻莓汁液的面膜後，肌膚的皺紋情況顯著改善約9.1％，且肌膚的皺紋情況改善人數比率達100％。而由圖10與圖11則可明確顯示，相較於使用含野櫻莓汁液的面膜前，使用含野櫻莓汁液的面膜後，可使肌膚的紋理數量確實減少。基此可知，野櫻莓汁液以外用方式塗敷於肌膚上，確實可使肌膚紋理減少，並提升肌膚的平滑度。
[例5]人體實驗-以內服方式使用野櫻莓汁液
使用樣品：含野櫻莓汁液的飲品50g/瓶（以水以及野櫻莓汁液配製成每50g的飲品中含有1g的野櫻莓汁液，即佔2wt%）。在另一些其他的實施例中，每人一日可攝取野櫻莓汁液至多5g。其中，此野櫻莓汁液是野櫻莓果實的榨取汁液，係購自台灣綠源股份有限公司（Taiwan Green Nation Corp.），其野櫻莓汁液的糖度為65-68°Bx。
受試者人數： 8位20-60歲之受試者。
實驗方式：受試者每日飲用一瓶含野櫻莓汁液的飲品（每瓶含有1g 野櫻莓汁液），共飲用42日（即6週）。並於開始飲用前（臉部已清潔，第0週）以及飲用42日後，依據不同檢測項目，使用對應的儀器及測量方式，紀錄臉部肌膚之數值、並拍攝飲用前、後的照片。（於飲用前、後進行檢測時，受試者所在的測試區域的溫度與濕度為一致，以減少外界的溫濕度等因素會對皮膚所造成的影響）。
檢測項目：將分別對肌膚進行1.肌膚皺紋狀態、2.肌膚毛孔狀態、以及3.肌膚光澤。
1. 肌膚皺紋狀態
使用美國Canfield所販售之VISIA高階數位膚質檢測儀進行檢測，透過高解析度之相機鏡頭對飲用前、飲用後的面部肌膚進行拍攝，藉由標準白光照射、偵測皮膚陰影的變化，即可偵測紋理位置並得到一數值，可代表皮膚的平滑程度。其檢測結果顯示於圖12；飲用含野櫻莓汁液的飲品前（第0週）、飲用後（第6週）之臉部實拍照片，顯示於圖13與圖14（皺紋部分經由軟體進行標記）。
由圖12可知，當連續飲用含野櫻莓汁液的飲品6週後，相較於飲用前，面部肌膚的皺紋數值明顯下降約8.2％，且改善人數達75％。而由圖13與圖14則可明確顯示飲用含野櫻莓汁液的飲品後，可使肌膚的紋理數量確實減少、抑止皺紋生成。顯示野櫻莓汁液以內服方式，亦可使肌膚紋理減少，提升肌膚的平滑度。
2. 肌膚毛孔狀態
同樣使用美國Canfield所販售之VISIA高階數位膚質檢測儀進行檢測，透過高解析度之相機鏡頭對飲用前、飲用後的面部肌膚進行拍攝。藉由標準白光照射，造成毛孔凹陷處產生陰影，毛孔會比周圍的膚色更黑，故可以此偵測毛孔，然後利用軟體根據毛孔數目、面積分析得到一數值，而數值越高則顯示其毛孔數量、面積較多。而其檢測結果顯示於圖15；飲用前（第0週）、飲用後（第6週）之臉部實拍照片，顯示於圖16與圖17（毛孔部分經由軟體進行標記）。
由圖15可知，在飲用含野櫻莓汁液的飲品連續6週後，相較於飲用前，肌膚的毛孔情況顯著改善約12.9％，且毛孔情況改善人數比率達75％。而由圖16與圖17則明確顯示飲用含野櫻莓汁液的飲品後，使可被偵測之毛孔數量確實減少。顯示野櫻莓汁液以內服之方式，亦可改善肌膚的毛孔情況，使毛孔縮小或減少。
3. 肌膚光澤
使用購自德國Courage+Khazaka electronic公司之肌膚光澤儀GL 200進行檢測，透過高解析度之相機鏡頭對飲用前、飲用後的面部肌膚進行拍攝。藉由標準白光照射，測量肌膚的反射光和散射光，從而精確地測試皮膚的光澤度。其檢測結果顯示於圖18；而使用含野櫻莓汁液飲品前、後之臉部實拍照片，顯示於圖19與圖20。
由圖18可知，在連續飲用含野櫻莓汁液的飲品6週後，相較於飲用前，肌膚的光澤提升約6％，且改善人數比率達75％。而由圖19與圖20則顯示飲用含野櫻莓汁液的飲品後，可增加肌膚的光澤。顯示野櫻莓汁液以內服之方式，確實可改善肌膚的暗沈，提升肌膚的光澤度。
綜合前述，本案除證實野櫻莓汁液可抑制自由基產生、抑制黑色素生成，故野櫻莓汁液可有效防止由紫外線或藍光所產生的多種肌膚老化現象，提供肌膚對於紫外線以及藍光的防護外，本案另亦證實野櫻莓汁液可促進纖維母細胞的生長，而由於纖維母細胞可產生膠原蛋白，故野櫻莓汁液可間接提升膠原蛋白的生成量。據此，野櫻莓汁液可以內服或外用方式，使肌膚整體減少老化特徵，並防止肌膚受到藍光或紫外線的傷害，抑止肌膚老化。
無
圖1係空白控制組、對照組、及實驗組的活性氧化物質（ROS）高度表現的細胞比例之結果比較圖。**p值＜0.01，相較於對照組。
圖2係空白控制組、對照組、及實驗組的黑色素生成量結果比較圖。***p值＜0.01，相較於對照組。
圖3係空白控制組及實驗組之細胞增生率結果比較圖。*p值＜0.05，相較於對照組。
圖4係將安慰劑組及實驗組的面膜使用於受試者臉部肌膚後，其各組的肌膚彈性變化比較圖。**p值＜0.01，相較於基準線。##p值＜0.01，相較於安慰劑組。
圖5係將安慰劑組及實驗組的面膜使用於受試者臉部肌膚後，其各組的肌膚保水度變化比較圖。**p值＜0.01；***p值＜0.001，相較於基準線。#p值＜0.05，相較於安慰劑組。
圖6係將安慰劑組及實驗組的面膜使用於受試者臉部肌膚後，其各組的肌膚毛孔狀態變化比較圖。***p值＜0.001，相較於基準線。
圖7與圖8分別為受試者在使用含野櫻莓汁液的面膜前、含野櫻莓汁液的面膜後的實拍照片（毛孔部分經由軟體進行標記）。
圖9係將安慰劑組及實驗組的面膜使用於受試者臉部肌膚後，其各組的肌膚皺紋變化比較圖。
圖10與圖11分別為受試者在使用含野櫻莓汁液的面膜前、含野櫻莓汁液的面膜後的實拍照片（紋理部分經由軟體進行標記）。
圖12係受試者連續6週飲用含有野櫻莓汁液的飲品前、後，受試者肌膚皺紋狀態比較圖。
圖13與圖14分別為受試者飲用前（第0週），以及連續6週飲用含有野櫻莓汁液的飲品後（第6週）的實拍照片（紋理部分經由軟體進行標記）。
圖15係受試者連續6週飲用含有野櫻莓汁液的飲品前、後，受試者肌膚的毛孔狀態比較圖。*p值＜0.05，相較於第0週。
圖16與圖17分別為受試者飲用前（第0週），以及連續6週飲用含有野櫻莓汁液的飲品後（第6週）的實拍照片（毛孔部分經由軟體進行標記）。
圖18係受試者連續6週飲用含有野櫻莓汁液的飲品前、後，受試者的肌膚光澤狀態比較圖。
圖19與圖20分別為受試者飲用前（第0週），以及連續6週飲用含有野櫻莓汁液的飲品後（第6週）的實拍照片。
Claims (10)
- 一種野櫻莓汁液用於製備抑制黑色素生成的組合物的用途。
- 一種野櫻莓汁液用於製備抑制活性氧物質（ROS）生成的組合物的用途。
- 一種野櫻莓汁液用於製備促進皮膚纖維母細胞增生的組合物的用途。
- 如請求項2或請求項3所述的用途，其中該組合物用以增加肌膚彈性、增加肌膚含水量、改善肌膚毛孔狀態、減少肌膚皺紋、抑止肌膚皺紋生成或其組合。
- 如請求項1至請求項3中任一項所述的用途，其中該組合物中糖度為65-68°Bx的野櫻莓汁液佔2wt%至10wt%。
- 如請求項1至請求項3中任一項所述的用途，其中該組合物係醫藥組合物。
- 如請求項1至請求項3中任一項所述的用途，其中該組合物係進一步製備成保養品組合物、保健食品組合物、或化妝品組合物。
- 如請求項1至請求項3中任一項所述的用途，其中該組合物為內服組合物。
- 如請求項1至請求項3中任一項所述的用途，其中該組合物為外用組合物。
- 如請求項9所述的用途，其中該組合物中糖度為65-68°Bx的野櫻莓汁液佔0.5wt%。
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