TWI820448B

TWI820448B - 露莓萃取物用於製備調理肌膚的組合物之用途

Info

Publication number: TWI820448B
Application number: TW110124861A
Authority: TW
Inventors: 林詠翔; 李唯君
Original assignee: 大江生醫股份有限公司
Priority date: 2020-08-21
Filing date: 2021-07-06
Publication date: 2023-11-01
Also published as: TW202207964A

Abstract

本發明提供一種露莓萃取物用於製備調理肌膚的組合物之用途，其中該組合物用於減少細胞中的活性氧物質引起的氧化性損傷、減少肌膚的血色素含量、抑制黑色素生成、減少肌膚紅色斑點及提升肌膚的保濕能力。

Description

露莓萃取物用於製備調理肌膚的組合物之用途

本案係關於一種露莓(Rubus fruticosus)萃取物的用途，特別是關於露莓萃取物用於製備調理肌膚的組合物之用途。

隨著環境變遷，紫外線指數及空氣污染日益嚴重，陽光中紫外線輻射是造成肌膚損傷、老化、曬黑的主要原因，肌膚長期暴露在陽光下甚至會生成黑色素，形成斑點，難以消退。另外，陽光中紫外線輻射會促使肌膚細胞中產生活性氧物質(reactive oxygen species，ROS，亦稱自由基)影響，導致肌膚老化、失去光澤、乾燥等，甚至呈現泛紅的狀態。

另外，肌膚細胞隨著年紀而逐漸老化，膚質日漸變得粗糙並產生皺紋，由於肌膚細胞的代謝速度減緩而導致肌膚的復原速度日漸變慢，再加上長期受到空氣污染等外在的環境刺激，累積大量活性氧物質及黑色素等無法及時完全代謝，造成肌膚狀況無法得到改善。

習知的化妝品、保養品及健康食品大多由化學成分所製成，長期使用不但對人體健康有害無益，更對較敏感的肌膚造成刺激，加劇肌膚泛紅的情況，此外，製造過程對環境及生態不友善，造成環境污染，甚至通過排水系統而進入生態圈。

為了解決上述問題，本領域的技術人員亟需研發出具有對抗紫外線、抗氧化、抑制黑色素生成、減少肌膚紅色斑點、舒緩泛紅現象及提升肌膚的保濕能力的調理肌膚的組合物，以造福有此需求的廣大族群。

有鑑於此，本發明之目的是為提供一種露莓(Rubus fruticosus)萃取物用於製備調理肌膚的組合物之用途其中該組合物用於抑制黑色素生成及減少肌膚紅色斑點，透過減少細胞中的黑色素相關基因表現量達到該抑制黑色素生成，其中該組合物用於減少細胞中的活性氧物質引起的氧化性損傷而達成抗氧化作用，保護肌膚細胞，實現抗氧化、美白及減少肌膚紅色斑點。

本發明之另一目的是為提供一種露莓(Rubus fruticosus)萃取物用於製備調理肌膚的組合物之用途，減少肌膚的血色素含量，舒緩肌膚泛紅的現象，並且提升肌膚的保濕能力，增加肌膚的光澤度，延緩肌膚老化。

一種露莓(Rubus fruticosus)萃取物用於製備調理肌膚的組合物之用途，其中該露莓萃取物係以一含水之溶劑進行萃取。

在一些實施例中，該露莓(Rubus fruticosus)萃取物的總多酚的含量為8000至11000ppm之間。

在一些實施例中，該組合物用於減少細胞中的活性氧物質引起的氧化性損傷。

在一些實施例中，該組合物用於減少肌膚的血色素含量。

在一些實施例中，該組合物用於抑制黑色素生成。

在一些實施例中，該組合物用於透過減少細胞中的黑色素相關基因表現量達到該抑制黑色素生成。

在一些實施例中，該黑色素相關基因包括：酪氨酸酶相關蛋白-1(TYRP1)、酪胺酸酶(TYR)、小眼畸形相關轉錄因子(MITF)、黑素皮質素受體1(MC1R)。

在一些實施例中，該組合物用於減少肌膚紅色斑點。

在一些實施例中，該組合物用於提升肌膚的保濕能力。

在一些實施例中，該組合物用於透過增加細胞中的保濕相關基因表現量達到該提升肌膚的保濕能力。

在一些實施例中，該組合物係進一步製備成保養品組合物、保健食品組合物、化妝品組合物或皮膚外用劑。

綜上所述，任一實施例的露莓萃取物可抑制活性氧物質產生、透過減少細胞中的黑色素相關基因(例如：酪氨酸酶相關蛋白-1(TYRP1)、酪胺酸酶(TYR)、小眼畸形相關轉錄因子(MITF)、黑素皮質素受體1(MC1R))的表現量達到該抑制黑色素生成，故露莓萃取物可有效防止由紫外線所產生的多種肌膚老化現象，實現抗氧化、美白及減少肌膚紅色斑點，提供肌膚對於紫外線以及藍光的防護。

此外，該露莓萃取物減少肌膚的血色素含量，舒緩肌膚泛紅的現象，並且提升肌膚的保濕能力，增加肌膚的光澤度。

圖1係空白控制組、對照組、及實驗組的活性氧化物質(ROS)高度表現的細胞比例之結果比較圖。###p值<0.001，相較於空白控制組，***p值<0.001，相較於對照組。

圖2係該空白控制組與該實驗組的保濕相關基因的表現量之結果比較圖。***p值<0.001，相較於空白控制組。

圖3係該空白控制組與該實驗組的黑色素相關基因的表現量之結果比較圖。**p值<0.01，***p值<0.001，相較於空白控制組。

圖4係該空白控制組、對照組、及該實驗組的黑色素含量之結果比較圖。***p值<0.001，相較於空白控制組。

圖5A及圖5B分別係受試者連續攝取含有該實驗組的飲品在第0週、第4週及第8週後的肌膚紫外線紅色斑點數量的結果比較圖以及以檢測儀所拍攝的圖像，以施用前受試者的紫外線紅色斑點的數量為100%。*p值<0.1，相較於0週。

圖6A及圖6B分別係受試者連續攝取含有該實驗組的飲品在第0週、第4週及第8週後的肌膚血色素指數以及以檢測儀所拍攝的圖像，以施用前受試者的肌膚血色素指數為100%。*p值<0.1，***p值<0.001，相較於0週。

圖7A及圖7B分別係受試者連續攝取含有該實驗組的飲品在第0週、第4週及第8週後的肌膚光澤度變化以及以檢測儀所拍攝的圖像，以施用前受試者的肌膚光澤度為100%。*p值<0.1，相較於0週。

以下將描述本案的部分具體實施態樣。在不背離本案精神下，本案尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將保護範圍限於說明書所具體陳述的條件。

本案使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示，各組之間的差異以學生t檢驗(student's t-test)進行分析。

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在正負10%的範圍內，最佳為在正負5%的範圍內。

如本文中所使用，術語“萃取物”係指藉由萃取作用所製備之產物。該萃取物可以溶於溶劑中之溶液形式呈現，或萃取物可為不含或大體上不含溶劑之濃縮物或精華呈現。

露莓(學名：Rubus fruticosus，又名黑莓)是薔薇科懸鉤子屬的一種灌木的果實。

如本文所用“露莓”通常係指植物果實，其中果實可包含原始、經乾燥或以其他物理方式加工以利於處理之果實，其可進一步包含完整、剁碎、切丁、碾磨、研磨或以其他方式經加工以影響原物料之大小及實體完整性之果實。

在一些實施例中，「露莓萃取物」可為露莓的果實經榨取而得的汁液。舉例而言，在一些實施例中，係將露莓的果實經碾碎、擠壓並去除果渣與較細小的懸浮物後，再將其濃縮至一定糖度而得。在另一些實施例中，露莓萃取物於製備過程中亦可經過其他大致上不影響其產生本文所述功效的程序，例如發酵，以增添風味或其他用途。

在一些實施例中，「露莓萃取物」亦可為使用合適的萃取溶劑萃取露莓的果實而得到的萃取液。舉例而言，可將露莓浸泡於水中於常溫下經適當時間進行萃取，再經過濾去除固態雜質後可得到露莓果實萃取液。

在一些實施例中，由露莓果實所榨取的汁液(有時亦稱之為「露莓萃取物」)可抑制自由基生成、減少肌膚的血色素含量、抑制黑色素生成、減少肌膚紅色斑點的數量以及提升肌膚的保濕能力。因此，露莓萃取物可用於製備抑制自由基生成、減少肌膚的血色素含量、抑制黑色素生成、減少肌膚紅色斑點的數量以及提升肌膚的保濕能力的肌膚調理的組合物。

在一些實施例中，前述的組合物可為醫藥組合物、保養品組合物、食品組合物、保健食品組合物。

醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於經腸道地(enterally)、非經腸道地(parenterally)或局部地(topically)投藥的劑型。例如可為：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、外部製劑(external preparation)或其他類似物。

醫藥組合物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，醫藥上可接受的載劑可包含下列一種或多種載劑：乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些載劑的選用與數量是熟習此項技術人員可視情況進行選擇的。

以口服劑型為例，可利用任何合宜之方法，將該醫藥組成物以適於口服投藥的劑型提供，其中，適於口服之液態劑型包括糖漿劑、口服液、懸浮液、酏劑等，適於口服之固態劑型則包括粉劑、顆粒劑、口含錠、糖衣錠、腸溶錠、咀嚼錠、發泡錠、膜衣錠、膠囊劑、長效緩釋錠等。於根據本發明所提供之該醫藥組成物中可含有任何不會不利影響活性成分(即，乳雙歧桿菌TCI604及/或其代謝產物)之所欲效益的醫藥上可接受之載劑。舉例言之，但不以此為限，前述液態劑型之醫藥上可接受之載劑的例子包括：水、食鹽水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其類似物、油(例如橄欖油、蓖麻油、棉籽油、花生油、玉米油、及胚芽油)、甘油、聚乙二醇、及前述之組合；前述固態劑型之醫藥上可接受之載劑的例子則包括：纖維素、澱粉、高嶺土(kaolinite)、膨潤土(bentonite)、檸檬酸鈉、明膠、瓊脂、羧甲基纖維素、阿拉伯膠、海藻膠、單硬脂酸甘油酯(glyceryl monostearate)、硬脂酸鈣(calcium stearate)、及前述之組合。

在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可包含下列一種溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline，PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及其他任何合適的溶劑。

在一些實施例中，該醫藥組合物可由下列所述的任一種非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。

在一些實施例中，醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)。舉例而言，其可為下列所述的任一種，但不限於此：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、油膏(salve)以及繃帶(bandage)。

在一些實施例中，外部製劑是藉由將醫藥組合物與一為熟習此項技藝者所詳知的基底(base)相混合而製成。

在一些實施例中，該基底可包含下列一種或多種的添加劑(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氫化合物(hydrocarbons)[諸如石油膠(petroleum,jelly)以及白凡士林(white petrolatum,)]、蠟(wax)[諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、界面活性劑(surfactants)、吸收增強劑(absorption enhancers)、安定劑(stabilizing agents)、膠凝劑(gelling agents)[諸如卡波普®974P(carbopol®974P)、微結晶纖維素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纖維素(carboxymethylcellulose)]、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、氣味吸收劑(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH調整劑(pH adjusting agents)、螯合劑(chelating agents)、乳化劑(emulsifiers)、閉塞劑(occlusive agents)、軟化劑(emollients)、增稠劑(thickeners)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強劑(penetration enhancers)、抗刺激劑(anti-irritants)、著色劑(colorants)以及推進劑(propellants)等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

在一些實施例中，保養品中可包含有一被廣泛地使用於保養品製造技術之可接受的佐劑(acceptable adjuvant)。例如，該可接受的佐劑可包含下列一種或多種佐劑：溶劑、膠凝劑、活性劑、防腐劑、抗氧化劑、遮蔽劑(screening agent)、螯合劑、界面活性劑、染色試劑(coloring agent)、增稠劑(thickening agent)、填料(filler)、香料以及氣味吸收劑。可根據實際需求對這些試劑的選用與數量進行合適的調整。

在一些實施例中，保養品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚(skincare)或化妝(makeup)的形式，其可為下列中的任一種，但不限於此：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或複合型之乳劑、凝膠、軟膏、乳霜、面膜(mask)、貼片、貼布(pack)、擦劑、粉末、氣溶膠、噴霧、乳液、乳漿、糊劑、泡沫、分散液、滴劑、慕斯(mousse)、防曬油(sunblock)、防曬精華液、防曬乳霜、防曬噴劑、化妝水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妝產品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身體清潔產品(body cleansing products)等。

在本發明的一實施例中，提供化妝品組合物和個人護理產品，其包含能夠顯示變色的著色組合物，例如包含在載體和苯乙烯-馬來酸酐共聚物中的顏料顆粒的顏料研磨物。化妝品組合物可以是給人體皮膚提供色彩的任意化妝品或個人護理產品形式。例如，化妝品組合物可以是、但不限於唇膏、唇彩、保濕唇膏、指甲油、粉底、撲面粉、底粉、遮瑕膏、腮紅、眼影、眼線器、睫毛膏或古銅色化妝品。個人護理產品可以是給人體皮膚賦予色彩的任意適合的形式。例如，個人護理產品可以包括日霜或洗劑、晚霜或洗劑、防曬露、霜或油和其它SPF產品、增濕劑、油膏、軟膏、凝膠、體乳、人造褐變組合物、脫毛等。

本發明的化妝品組合物和個人護理產品施用於人皮膚系統，包括皮膚、唇、指甲、毛髮和其它角質表面。本文所用的術語“角質表面”是指包含角蛋白的人皮膚系統的部分，包括但不限於哺乳動物、優選人類的皮膚、唇、毛髮(包括頭皮、睫毛、眉毛、面毛和體毛和指甲(腳趾甲、指甲、甲上皮等)。

能夠顯示變色的化妝品或個人護理產品施用於皮膚的任意區域且優選面部、頸部、手、足或身體的另外的區域上，例如壁、腿和背部。

在一些實施例中，保養品亦可與下列中之已知活性的外用劑(external use agents)的一種或多種一起合併使用：美白劑(whitening agents)[諸如維生素A酸(tretinoin)、兒茶素(catechin)、麴酸、熊果苷以及維生素C]、保濕劑、殺菌劑(bactericides)、紫外線吸收劑(ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[諸如蘆薈萃取物(aloe extract)]、皮膚營養劑(skin nutrients)、麻醉劑(anesthetics)、抗痘劑(anti-acne agents)、止癢劑(antipruritics)、止痛劑(analgesics)、抗皮膚炎劑(antidermatitis agents)、抗過角化劑(antihyperkeratolytic agents)、抗乾皮膚劑(anti-dry skin agents)、抗汗劑(antipsoriatic agents)、抗老化劑(antiaging agents)、抗皺劑(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出劑(antiseborrheic agents)、傷口治療劑(wound-healing agents)、皮質類固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有關這些外用劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

在一些實施例中，醫藥組合物可被當作食品添加物(food additive)，藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。

在一些實施例中，食品的種類可為但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。

該根據本發明所提供之醫藥組成物係可呈任何合宜的型式，並無特殊限制，端視所欲之用途而呈對應之合宜劑型；舉例言之，但不以此為限，該醫藥組成物可以口服之投藥方式施用至有需要之個體上。視使用形式及用途而定，可選用醫藥上可接受之載劑以提供該醫藥組成物，其中，該載劑為熟悉製藥技術者所熟知，包括賦形劑、稀釋劑、輔助劑、安定劑、吸收促進劑、崩散劑、增溶劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、結合劑、增黏劑、分散劑、懸浮化劑、潤滑劑、吸濕劑等。

根據本發明所提供之食品組成物可為飲品、固態食品、或半固態食品，且可以健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品或特殊營養食品的形式提供。舉例言之，但不以此為限，該食品組成物可為乳製品、肉類加工品、麵包類、麵食品、餅乾、冰品、口含錠、膠囊、果汁類、茶類、氣泡水、酒精飲料、運動飲料、營養飲料、嬰幼兒離乳食品等產品。較佳地，該食品組成物係以健康食品或保健食品的形式提供。

此外，視使用形式及需求而定，可於根據本發明所提供之食品組成物中含有任何適宜之食品添加物。舉例言之，包括但不限於，防腐劑、殺菌劑、抗氧化劑、漂白劑、保色劑、膨脹劑、營養添加劑、著色劑、調味劑(例如：甜味劑)、黏稠劑、結著劑、食品工業用化學藥品、乳化劑、以及品質改良用、釀造用及食品製造用劑。

可於根據本發明所提供之健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充食品或特殊營養食品的外包裝上標示建議使用量、特定族群(例如：孕婦、兒童等)的使用標準及條件、或與其他食品或醫藥共同服用的建議事項，以利使用者在無醫師、藥師或相關執事人員指導下自行服用而無安全疑慮。

下列多個實施例中的實驗步驟若無特別敘明，即在室溫(25±5℃)、常壓(1atm)下進行。

[實施例1]：露莓(Rubus fruticosus)的萃取物之製備

首先，將露莓(Rubus fruticosus)(來自於智利(Chile))的果實切成12mm的大小，接而以水作為萃取溶劑對露莓同時進行均質及萃取，其中萃取的溫度介於75℃至95℃，較佳為80℃~90℃，萃取溶劑與露莓的體積比介於5~20：1~5，較佳為5：1。萃取溫度界於50℃~100 ℃，較佳為80℃~90℃。本實施例中萃取時間為0.5~3小時，較佳為1小時。

經上述萃取步驟所得露莓萃取物冷卻至室溫後，可進一步以800~1300rpm之轉速在15℃~25℃下離心5~10分鐘而獲得一上清液，該上清液可以400目(mesh)之濾網過濾，以移除殘餘固體物。進一步在55℃~65℃進行減壓濃縮而獲得一濃縮產物。在一實施例中，為獲得固態的露莓萃取物，可將前述經減壓濃縮的露莓萃取物以噴霧乾燥方式去除溶劑，因此獲得露莓萃取物粉末。在另一實施例中，將2.5g的上述經濃縮的露莓萃取物加入到50mL的水或飲料中，得到濃度為0.05mg/mL的露莓萃取物飲品，該露莓萃取物飲品的糖度為5.0±0.3 °Bx。

[實施例2]：露莓萃取物的總黃酮及總多酚含量檢測

總黃酮含量檢測的分析方法主要是參考Zhishen Jia et al.,(1999),Food Chemistry,64：555-559所述方法並加以修飾，取200μL之適當稀釋後的樣品加入1000μL之H₂O，混合均勻後，加入200μL之5%檸檬酸鈉(Sodium nitrite)，靜置6分鐘後加入200μL之10%硝酸鋁(Aluminum nitrate)，再靜置6分鐘。最後加入2mL之4%氫氧化鈉(Sodium hydroxide)與1.4mL之H₂O，混合均勻，於500nm下進行分析，以芸香素(Rutin)為標準品繪製標準曲線。在本實施例中，實施例1之露莓萃取物的總黃酮的含量具體地為2248.9ppm。

總多酚含量檢測的分析方法是將各樣本以水稀釋10倍後取100mL到離心管中。接著，加入500μL之Folin-Ciocalteu酚試劑至離心管中與稀釋後的樣本混合並靜置3分鐘後，再加入400μL之7.5%碳酸鈉混勻靜置30分鐘後以得到待測反應溶液。於二次靜置後，取200μL之待測反應溶液至96孔板中，並測量待測反應溶液於750nm下之吸光值。並且，以沒食子酸(Gallic acid)作為標準品製作標準曲線。在本實施例中，實施例1之露莓萃取物的總多酚的含量具體地為9364.6ppm。

[實施例3]：細胞實驗-露莓萃取物抑制活性氧物質(ROS)生成

於此，以螢光探針DCFH-DA配合流式細胞儀，測定人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk經露莓萃取組合物處理後，其活性氧物質含量的變化。

材料與儀器

1.細胞株：人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk(生物資源保存及研究中心(BCRC)，No.60153)，以下簡稱CCD-966sk細胞。

2.培養基：含有10vol% FBS(fetal bovine serum，購自Gibco)之基礎培養基。其中，基礎培養基是由Eagle’s最低限度基本培養基(Eagle’s minimum essential medium(MEM)，購自Gibco，產品編號15188-319)額外添加成分使其含有1mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate，購自Gibco)、1.5g/L碳酸氫鈉(sodium bicarbonate，購自Sigma)及0.1mM非必需胺基酸(non-essential amino acid solution，購自Gibco)所配製而成。

3.磷酸緩衝鹽溶液(PBS溶液)：購自Gibco，產品編號10437-028。

4.DCFH-DA溶液：將二氯二氫螢光素二乙酸酯(2,7-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA；產品編號SI-D6883，購自Sigma)溶於二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO，購自Sigma，產品編號SI-D6883-50MG)以配製成5mg/mL的DCFH-DA溶液。

5.流式細胞儀(Flow cytometry)，Beckman，Catalog No.660519。

6.雙氧水(H₂O₂)：購自Sigma-Aldrich，產品型號95299-1L。

7.胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)：10X Trypsin-EDTA(購自Gibco)以1X PBS溶液稀釋10倍。

8.露莓萃取物：此實驗中所使用的露莓萃取物是透過如上實施例1所獲得。

實驗步驟

實驗將會分為實驗組、空白控制組(未添加露莓萃取物、亦無經過雙氧水處理的組別)、以及對照組(未添加露莓萃取物，但經過雙氧水處理的組別)三組進行，各組分別進行二重複試驗：

1.將CCD-966sk細胞以每孔1×10⁵個的方式，接種於每孔含2mL培養基之6孔培養盤中。

2.將培養盤置於5%CO₂、37℃下，培養24小時。

3.移除培養基。

4.加入2mL實驗培養基至培養盤的各孔中，並於37℃下培養1小時。

實驗組的實驗培養基為添加有5μL的露莓萃取物之2mL細胞培養基(即露莓萃取物佔細胞培養基的體積百分比為0.25%)。

控制組的實驗培養基為單純的2mL細胞培養基(即不含露莓萃取物)。

對照組的實驗培養基為單純的2mL細胞培養基(即不含露莓萃取物)。

5.添加濃度為5μg/mL的DCFH-DA溶液2μL於每孔中的細胞培養基，使DCFH-DA處理細胞15分鐘。

6.於DCFH-DA處理後，於實驗組的實驗培養基以及對照組的實驗培養基分別加入H₂O₂，並於37℃下反應1小時。具體來說，35% wt的雙氧水先稀釋成100mM(將10μL的雙氧水加入990μL的二次蒸餾水)，再取20μL的100mM的雙氧水加入2mL的細胞培養盤中。

7.反應後，每孔以1mL的1X PBS溶液潤洗2次。

8.將200μL胰蛋白酶加至每孔中並在暗處反應5分鐘。反應後，添加6mL細胞培養基終止反應。

9.將各孔中之細胞與細胞培養基收集至個別對應的1.5mL離心管內，並將含有細胞與培養基之離心管以400 xg離心10分鐘。

10.離心後，移除上清液，並以1X PBS溶液回溶細胞沉澱物。

11.再以400 xg離心10分鐘。

12.離心後，移除上清液，於暗處以以1mL的1X PBS溶液再次懸浮細胞，以得到待測細胞液。

13.使用流式細胞儀偵測各孔的待測細胞液中DCFH-DA的螢光信號。進行螢光偵測之激發波長為450-490nm，放射波長為510-550nm。由於DCFH-DA進入細胞後會先被水解為DCFH(二氯二氫螢光素)，再被活性氧物質氧化為可發出綠色螢光的DCF(二氯螢光素)，經DCFH-DA處理之細胞的螢光強度可反映細胞內活性氧物質含量，並藉此得知細胞內活性氧物質高度表現的細胞數佔原細胞數的比例。因實驗係進行二重複，故將各組的二重複實驗之量測結果平均以取得平均值，然後以控制組的平均值為100%之相對ROS的生成量，將對照組與實驗組的平均值換算為相對ROS的生成量，如圖1所示。

實驗結果

如圖1所示，由比較控制組、對照組的結果可知，在經過雙氧水處理後，相對ROS的生成量通過高螢光表現會大幅增加約280%；其顯示雙氧水處理確實會導致細胞內產生活性氧物質，進而對皮膚纖維母細胞產生後續傷害。另一方面，根據比較對照組以及實驗組的結果可知，當細胞經過露莓萃取物處理後，相對ROS的生成量明顯減少約29%，甚至低於控制組；其顯示露莓萃取物可有效減少活性氧物質在細胞內的產生或累積。換言之，露莓萃取物可作為一種活性氧物質清除劑。亦即，露莓萃取物可透過降低細胞內活性氧物質含量，減少細胞受到活性氧物質等所導致的氧化傷害。

[實施例4]細胞實驗-露莓萃取物提升保濕基因的表現量

此實施例以RNA萃取套組、反轉錄酶、KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組配合定量PCR儀，實驗方法請參照實施例3，測定人類黑色素瘤細胞受經露莓萃取物處理後，細胞中保濕基因的變化。

舉例來說，保濕相關基因為KRT10基因(Gene ID：3858)、KRT1基因(Gene ID：3848)及SMPD1基因(Gene ID：6609)。

其中，角蛋白10(keratin 10，KRT10)及角蛋白1(keratin 1，KRT1)是負責編碼角蛋白，皮膚的主要構成物，而鞘磷脂磷酸二酯酶(Sphingomyelin Phosphodiesterase 1，SMPD1)、酪胺酸酶相關蛋白-1(tyrosinase related protein-1，TYRP1)是負責編碼鞘磷脂磷酸二酯酶，將鞘磷脂轉化為神經酰胺。

材料與儀器

1.細胞株：細胞株：人類初代皮膚角質細胞HPEK-50(Human primary epidermal keratinocytes)(CELLnTEC公司(瑞士)，HPEK-50)。

2.培養基：Keratinocyte-SFM(購自Thermo公司，編號17005042)。

3.RNA萃取試劑套組(購自Geneaid公司，台灣，Lot No.FC24015-G)。

4.反轉錄酶(SuperScript® III Reverse Transcriptase)(Invitrogen公司，美國，編號18080-051)。

5.測量標的基因引子，其中包含SRD5A1基因、SRD5A2基因、AR基因、KROX20基因、SCF基因、VEGF基因、IGF1基因、TGF-B基因，另包括內部控制組(TBP基因)。

6.KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組(購自Sigma公司，美國，編號38220000000)。

7.ABI StepOnePlusTM即時PCR系統(ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美國))。

實驗步驟

首先，取1.5x105個人類初代皮膚角質細胞至每孔含有2毫升上述培養基的六孔細胞培養盤中，於37℃下培養24小時，將每孔培養後的人類初代皮膚角質細胞依據下列測試條件分為控制組以及實驗組(共二組)來處理每孔培養後的人類初代皮膚角質細胞。

測試條件

控制組是單純使用2毫升培養液來培養人類初代皮膚角質細胞，未再加入其他添加成分。實驗組是將如上實施例所製備的露莓萃取物0.25mg/mL濃度的培養基2mL，培養人類初代皮膚角質細胞24小時，每組進行三重複。

將處理後的人類初代皮膚角質細胞(即控制組及實驗組)以細胞裂解液分別破細胞膜以形成二組的細胞溶液。接著，以RNA萃取試劑套組(購自Geneaid公司，台灣，Lot No.FC24015-G)分別萃取四組細胞溶液內的RNA。接著，每組取1000奈克(ng)的萃取出的RNA作為模板，透過SuperScript^® III反轉錄酶(購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051)將萃取出的RNA反轉錄為相應之cDNA。再藉由ABI StepOnePlus^TM即時PCR系統(ABI StepOnePlus^TM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美國))、KAPA SYBR FAST(購自Sigma公司，美國，編號38220000000)及表1的引子(SEQ ID NO：1~8)對兩組的cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction)以觀察二組的人類初代皮膚角質細胞內的KRT10基因、KRT1基因及SMPD1基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95℃反應20秒，接著95℃反應3秒，60℃反應30秒，並重複40個迴圈，並使用2-△Ct方法進行基因定量。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量KRT10基因、KRT1基因及SMPD1基因的mRNA表現量，進而推斷KRT10基因、KRT1基因及SMPD1基因編碼的蛋白質的表現量。

需要特別說明的是，下文述及之圖式中顯示的KRT10基因、KRT1基因及SMPD1基因的相對基因表現係以相對倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗(Student t-test)分析是否具有統計上的顯著差異。圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。

請參閱圖2。將控制組的TBP基因的表現量視為1倍，實驗組相對於控制組的KRT10基因的表現量為31.6倍、實驗組相對於控制組的KRT1基因的表現量為34.7倍、實驗組相對於控制組的SMPD1基因的表現量為9.9倍。由此可知，當人類黑色素瘤細胞以含有0.25mg/mL露莓萃取物處理後，由於KRT10基因、KRT1基因與角蛋白形成呈現正相關，角蛋白中有天然保濕因子NMF，使細胞間的空隙變少，抵禦外界刺激入侵，保護真皮層，避免皮膚受損和發炎。結果如圖2所示，本發明之露莓萃取物可提升細胞的保濕基因(KRT10基因、KRT1基因及SMPD1基因)的基因表現，而使露莓萃取物對肌膚具有保濕效果。

[實施例5]細胞實驗-露莓萃取物降低黑色素基因的表現量

此實施例以RNA萃取套組、反轉錄酶、KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組配合定量PCR儀，測定人類黑色素瘤細胞受經露莓萃取物處理後，細胞中美白基因的變化。

舉例來說，黑色素相關基因為TYR基因(Gene ID：7299)、TYRP1基因(Gene ID：7306)、MITF基因(Gene ID：4286)及MC1R基因(Gene ID：4157)。

其中，小眼畸形相關轉錄因子(microphthalamia-associated transcription factor，MITF)是皮膚正常黑色素細胞發育時所需之轉錄因子，其可調控其他數種參與黑色素形成的蛋白質的基因表現，如酪胺酸酶(tyrosinase，TYR)、酪胺酸酶相關蛋白-1(tyrosinase related protein-1，TYRP1)等基因的表現。黑素皮質素受體(melanocortin 1-receptor，MC1R)基因是人類皮膚合成黑色素過程中的關鍵基因。

因此，本實施例中以TYR基因、TYRP1基因、MITF基因及MC1R基因作為分析標的。

材料與儀器

1.細胞株：人類黑色素瘤細胞(human melanoma cell)A375.S2(ATCC，編號CRL-1872)。

2.培養基：含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(GIBCO公司，編號10438-026，美國)、1%抗生素-抗黴菌素(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco公司，編號15240-062)、1mM丙酮酸鈉 (Gibco公司，編號11360-070)的MEM-NAA培養基(Gibco公司，編號41500-03)。

3.RNA萃取試劑套組(購自Geneaid公司，台灣，Lot No.FC24015-G)。

5.測量標的基因引子，其中包含TYRP1基因、TYR基因、MITF基因及MC1R基因，另包括內部控制組(GAPDH基因)。

實驗步驟

首先，取1.5x105個人類黑色素瘤細胞至每孔含有2毫升上述培養基的六孔細胞培養盤中於37℃下培養24小時，並將每孔培養後的人類黑色素瘤細胞依據下列測試條件分為控制組以及實驗組(共二組)來處理每孔培養後的人類黑色素瘤細胞。

測試條件：

實驗控制組是單純使用2毫升培養液來培養人類黑色素瘤細胞，未再加入其他添加成分。實驗組是將如上實施例所製備的露莓萃取物0.125mg/mL濃度的培養基2mL，培養人類黑色素瘤細胞24小時。

將處理後的人類黑色素瘤細胞(即控制組及實驗組)以細胞裂解液分別破細胞膜以形成二組的細胞溶液。接著，以RNA萃取試劑套組(購自Geneaid公司，台灣，Lot No.FC24015-G)分別萃取四組細胞溶液內的RNA。接著，每組取1000奈克(ng)的萃取出的RNA作為模板，透過SuperScript® III反轉錄酶(購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051)將萃取出的RNA反轉錄為相應之cDNA。再藉由ABI StepOnePlusTM即時PCR系統(ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美國))、KAPA SYBR FAST(購自Sigma公司，美國，編號38220000000)及表2的引子(SEQ ID NO：9~18)對每組的cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction)以觀察三組的人類黑色素瘤細胞內的TYRP1基因、TYR基因、MITF基因及MC1R基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95℃反應20秒，接著95℃反應3秒，60℃反應30秒，並重複40個迴圈，並使用2-△Ct方法進行基因定量。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量TYRP1基因、TYR基因、MITF基因及MC1R基因的mRNA表現量，進而推斷TYRP1基因、TYR基因、MITF基因及MC1R基因編碼的蛋白質的表現量。

需要特別說明的是，下文述及之圖式中顯示的TYR基因、TYRP1基因、MITF基因及MC1R基因的相對基因表現係以相對倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗(Student t-test)分析是否具有統計上的顯著差異。圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。

請參閱圖3。將控制組的GAPDH基因的表現量視為1，實驗組相對於控制組的TYR基因的表現量為0.12倍、實驗組相對於控制組的TYRP1基因的表現量為0.86倍、實驗組相對於控制組的MITF基因的表現量為0.75倍、實驗組相對於控制組的MC1R基因的表現量為0.65倍，代表實驗組的TYR基因的表現量相較於控制組減少了88%，實驗組的TYRP1基因的表現量相較於控制組減少了14%，實驗組的MITF基因的表現量相較於控制組減少了25%，實驗組的MC1R基因的表現量相較於控制組減少了35%。由此可知，當人類黑色素瘤細胞以含有0.125mg/mL露莓萃取物處理後，由於MC1R、MITF基因與黑色素形成呈現正相關，結果如圖3所示，本發明之露莓萃取物可抑制黑色素瘤細胞TYR基因、TYRP1基因、MC1R基因、MITF基因的基因表現，而使露莓萃取物對黑色素形成具有抑制效果。

[實施例6]細胞實驗-露莓萃取物降低黑色素生成

於此，以ELISA讀盤機(enzyme-linked immunosorbent assay reader)測定黑色素瘤細胞株B16F10經露莓萃取物處理後，其黑色素含量的變化。

材料與儀器

1.細胞株：小鼠黑色素瘤細胞B16F10，購自美國典型培養物保存中心(American Type CμLtureCollection，ATCC®，No.6475)，以下簡稱B16F10細胞。

2.培養基：將Dulbecco's modified minimal essential medium(DMEM，購自Gibco，Cat.12100-038)添加額外成分使其含有1 vol%的抗生素溶液(Antibiotic Antimycotic Solution，購自Gibco，15240-062)及10vol%的FBS(fetal bovine Serum，購自Gibco，10437-028)。

3.磷酸緩衝鹽溶液(PBS溶液)：購自Gibco，產品編號10437-028。

4.以二次蒸餾水配製1N NaOH(購自Sigma，產品編號221465)溶液。

5.ELISA reader(購自BioTek，產品編號FLx 800)。

6.露莓萃取物：此實驗中所使用的露莓萃取物是透過如上實施例1所獲得。

實驗步驟

實驗將會分為實驗組、控制組及對照組三組進行，各組分別進行三重複試驗：

1.將B16F10細胞以每孔1.5×10⁵個的方式，接種於每孔含3mL培養基之6孔培養盤中。

2.將培養盤置於5%CO₂、37℃環境下，培養24小時。

3.而後，在不干擾附著細胞的情況下，移除每孔之培養基。

4.本實驗分為控制組、對照組、實驗組。其中，各組加入2mL的新鮮DMEM培養液。而對照組之培養液額外加入麴酸(Kojic acid)，使其濃度為0.25mg/mL，其中麴酸已被廣泛認知為具有降低黑色素生成效果之物質；實驗組之培養液額外加入露莓萃取物，使其濃度為0.25mg/mL。各組進行三重複，並使其於37℃下培養24小時。

5.將反應完畢之實驗組及對照組移至藍光箱中，使其在室溫(25±5℃)下接受藍光照射3小時。另外，控制組移至暗室中，使其在室溫下靜置3小時。

6.反應後，將細胞於37℃下培養48小時。

7.而後，移除培養基，並以PBS溶液清洗細胞2次。

8.將200μl胰蛋白酶(Trypsin-EDTA(10X)，購自Gibco；產品編號15400-054)加至每孔中反應3分鐘。反應後，添加6mL培養基溶液終止反應。而後收集各孔中之懸浮細胞與培養基至對應的15mL離心試管內，將各離心試管以400 xg離心5分鐘使細胞沉澱。

9.以PBS溶液清洗沉澱細胞二次後，再以200μL PBS溶液重新懸浮細胞。

10.將細胞懸浮液以液態氮冷凍10分鐘，再置於室溫約30分鐘至完全解凍。

11.完全解凍後，將試管以12,000g離心3分鐘。

12.移除上清液，再以120μL 1N氫氧化鈉溶液重新懸浮細胞沉澱後，使試管於60℃乾浴1小時，以獲得待檢測樣本。

13.將100μL待檢測樣本移入一96孔盤，使用ELISA讀盤機測量細胞溶液在450nm的吸光值。

實驗結果

實驗組以及控制組的黑色素相對表現量係依下列公式計算：黑色素相對表現量(%)=(各組OD₄₅₀值/控制組OD₄₅₀值) ×100%。因實驗係進行三重複，故將三重複實驗之結果平均後，顯示於圖4。

如圖4所示，在本發明之露莓萃取物的處理下，可達到降低黑色素生成的功效。具體而言，實驗組(露莓萃取物)相對控制組之黑色素生成量為78.81%，對照組相對控制組之黑色素生成量為67.42%，實驗組與控制組相比黑色素生成降低約21.19%，且本案露莓萃取物之功效近似於麴酸之降低黑色素生成之效果。因此，本發明實施例所製備之露莓萃取物，確實可有效減少黑色素細胞所生成之黑色素，故可應用於減少皮膚黑斑、提升肌膚光澤、白皙度肌膚美白的相關組合物的成分中。

由以上多個細胞實驗可知，露莓萃取物確實可降低皮膚纖維母細胞的活性氧物質(ROS)生成，防止肌膚因紫外線而產生的傷害。且露莓萃取物可減少黑色素相關基因(TYRP1基因、MC1R基因、MITF基因)的表現量，並且抑制黑色素生成，減少藍光造成的皮膚黑斑，維持白淨肌膚。

而為證實野露莓萃取物對於人體的功效，亦進行相關人體實驗如下。

[實施例7]肌膚紫外線紅色斑點(UV斑)相對量檢測

以VISIA Complexion Analysis System(Canfield scientific,USA)的UV光進行臉部肌膚拍攝，紫外線可被黑色素吸收，提高色素斑的顯現度，偵測肉眼不可見的表皮層黑色素斑。測量數值越高，說明紫外線色斑越多。

將本案露莓萃取物與水配製成露莓萃取物飲品，以提供受試者合適的有效劑量。於此實施例中，請7位受試者(20~65歲的一般男女性)以每日食用一瓶濃度為0.005mg/mL的露莓萃取物飲品(50mL)的攝取劑量飲用所配製的露莓萃取物飲品，共持續8週。並於實驗開始前(第0週，尚未飲用)、第4週以及第8週對受試者已清潔過的面部肌膚，以全臉膚質檢測儀(7th Generation VISIA Complexion Analysis System；Canfield，USA)測定該些受試者的全臉皮膚的紅色斑點數量以及面積。

關於受試者肌膚紅色斑點數量以及實際的外觀變化，分別顯示於圖5A以及圖5B。圖5A係以受試者攝取露莓萃取物飲品前，由儀器根據紅色斑點數量以及面積所測得之數值為100%，並記錄受試者攝取露莓萃取物飲品4週、8週後的根據紅色斑點數量/面積所測得之數值。圖5B係其中一位受試者臉部肌膚在第0週、第4週及第8週以檢測儀所拍攝的圖像。

如圖5A所示，當受試者攝取露莓萃取物飲品4週後，即可開始觀察到紅色斑點數量/面積的減少，當連續攝取4週後，面部肌膚的紅色斑點數量即下降至原本的2.4%，而當連續攝取8週後，面部肌膚的紅色斑點數量即下降至原本的4.1%。圖5B的實拍影像中亦可發現，隨著攝取露莓萃取物飲品的期間增加，肌膚上的紅色斑點數量及面積明顯減少，改善人數達86%，具有抵抗色斑生成的功效。

[實施例8]肌膚泛紅的血色素相對量檢測

以VISIA Complexion Analysis System(Canfield scientific,USA)的RBX偏振光技術進行對上述實施例7中的受試者的臉部肌膚拍攝，偵測皮膚深層血管或血紅素。測量數值越高，說明皮膚泛紅狀況越嚴重。

如圖6A所示，當受試者攝取露莓萃取物飲品4週後，即可開始觀察到血色素相對量的減少，當連續攝取4週後，面部肌膚的血色素指數即下降至原本的7.4%，而當連續攝取8週後，面部肌膚的血色素指數即下降至原本的9.3%。圖6B的實拍影像中亦可發現，隨著攝取露莓萃取物飲品的期間增加，肌膚上的血色素指數明顯減少，改善人數達100%，該結果顯示本發明之露莓萃取物飲品能有效改善個體皮膚泛紅，能使皮膚維持穩定的健康狀況，具有良好的肌膚舒緩功效。

[實施例9]肌膚光澤度檢測

肌膚光澤度檢測探頭Glossymeter GL200(C+K Multi Probe Adapter System,Germany)是由照射到上述實施例7中的受試者的皮膚表面的光的直接反射和散反射來反映的。測量數值越高，說明皮膚越具有光澤。

如圖7A所示，當受試者攝取露莓萃取物飲品4週後，即可開始觀察到光澤度的增加，當連續攝取4週後，面部肌膚的光澤度即增加至原本的4.2%，而當連續攝取8週後，面部肌膚的血色素指數即增加至原本的9.4%。圖7B的實拍影像中亦可發現，隨著攝取露莓萃取物飲品的期間增加，肌膚上的光澤度明顯增加，改善人數達86%，該結果顯示本發明之露莓萃取物飲品具有提亮肌膚的功效。

綜上所述，本案除證實露莓萃取物可抑制自由基產生，並且透過減少細胞中的黑色素相關基因(例如：酪氨酸酶相關蛋白-1(TYRP1)、酪胺酸酶(TYR)、小眼畸形相關轉錄因子(MITF)、黑素皮質素受體1(MC1R))的表現量達到該抑制黑色素生成，故露莓萃取物可有效防止由紫外線所產生的多種肌膚老化現象，提供肌膚對於紫外線以及藍光的防護外，本案另亦證實露莓萃取物可減少因紫外線引起的紅色斑點、舒緩肌膚泛紅的現象、增加肌膚的光澤感，並且提升肌膚的保濕能力。據此，露莓萃取物可以使肌膚整體達到抗氧化、美白及有光澤，並防止肌膚受到紫外線的傷害，防止肌膚老化。

Claims

一種露莓(Rubus fruticosus)萃取物用於製備調理肌膚的組合物之用途，其中該露莓萃取物係以水為溶劑於75℃至95℃對露莓進行萃取0.5~3小時所得，其中該調理肌膚係提升肌膚的保濕能力。
如請求項1所述的用途，其中該露莓萃取物的總多酚的含量為9364.6ppm。
如請求項1所述的用途，其中該調理肌膚更包括減少肌膚的血色素含量。
如請求項1所述的用途，其中該調理肌膚更包括抑制黑色素生成。
如請求項1所述的用途，其中該組合物係進一步製備成保養品組合物、保健食品組合物、化妝品組合物或皮膚外用劑。