TWI809300B - 苦丁萃取物的用途 - Google Patents

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Abstract

一種苦丁萃取物用於製備減少醣化終產物生成的組合物、用於製備抑制活性氧物質（ROS）生成的組合物、用於製備促進膠原蛋白合成的組合物、用於製備抑制膠原蛋白的降解的組合物或用於製備維持胞外基質的組合物的用途。

Description

苦丁萃取物的用途
本發明是有關一種苦丁萃取物的用途。特別是關於苦丁萃取物用於製備減少醣化終產物生成的組合物、用於製備抑制活性氧物質(ROS)生成的組合物、用於製備促進膠原蛋白合成的組合物、用於製備抑制膠原蛋白的降解的組合物或用於製備維持胞外基質的組合物的用途。
苦丁(Ilex Latifolia Thunb)已有2000多年的飲用歷史，根據記載，宋仁宗品嘗後，認為此茶先苦後甘、提振舒心，對苦丁茶的美味的口感無法忘懷，要求番邦年年進貢。而於《本草綱目》中亦有記載，苦丁能止渴明目、消炎利便、通腸、消暑解毒、化痰止咳以及消除口臭的作用。
苦丁環境適應性廣、抗逆性強，根系發達且生長迅速，並且種植的過程中不會對環境造成傷害。因此，除飲用苦丁茶外，若能開發苦丁的其他功效以進一步更有效地利用苦丁，更是有益於全民的健康福祉。
在一實施例中，一種苦丁萃取物的用途，其是用於製備減少醣化終產物生成的組合物。
在一實施例中，一種苦丁萃取物的用途，其是用於製備抑制活性氧物質(ROS)生成的組合物。
在一實施例中，一種苦丁萃取物的用途，其是用於製備促進膠原蛋白合成的組合物。
在一實施例中，其中苦丁萃取物用以調節COL1A2及COL3A1其中至少一基因的表現量。
在一實施例中，一種苦丁萃取物的用途，其是用於製備抑制膠原蛋白的降解的組合物。
在一實施例中，其中苦丁萃取物用以調節TIMP1及MMP1其中至少一基因的表現量。
在一實施例中，一種苦丁萃取物的用途，其是用於製備維持胞外基質的組合物。
在一實施例中，其中苦丁萃取物用以調節FBN1基因的表現量。
在一實施例中，苦丁萃取物係於50℃至80℃以水溶液萃取，萃取時間介於30分鐘至90分鐘之間。
在一實施例中，苦丁萃取物的多酚含量大於3mg/mL。
因此，在一些實施例，苦丁萃取物用於製備減少醣化終產物生成的組合物。在一些實施例，苦丁萃取物用於製備抑制活性氧物質(ROS)生成的組合物。在一些實施例，苦丁萃取物可調節COL1A2及COL3A1其中至少一基因的表現量，而可用於製備促進膠原蛋白合成的組合物。在一些實施例，苦丁萃取物可調節TIMP1及MMP1其中至少一 基因的表現量，而可用於製備抑制膠原蛋白的降解的組合物。在一些實施例，苦丁萃取物可調節FBN1基因的表現量，而可用於製備維持胞外基質的組合物。
[圖1]為實驗組與控制組相對醣化終產物量的實驗結果圖。
[圖2]為實驗組、對照組與控制組的ROS的相對產生量的實驗結果圖。
[圖3]為實驗組與控制組的COL1A1、COL3A1、TIMP1、FBN1的基因相對表現量。
[圖4]為實驗組與控制組的MMP1的基因相對表現量。
以下將描述本案的部分具體實施態樣。在不背離本案精神下，本案尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將保護範圍限於說明書所具體陳述的條件。
關於本文中所使用之濃度符號「wt%」通常是指重量百分濃度，而濃度符號「vol%」通常是指體積百分濃度。
圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在正負10%的範圍內，最佳為在正負5%的範圍內。
在一實施例中，苦丁萃取物的用途，其是用於製備減少醣化終產物生成的組合物。
在一實施例中，苦丁萃取物的用途，其是用於製備抑制活性氧物質(ROS)生成的組合物。
在一實施例中，苦丁萃取物的用途，其是用於製備促進膠原蛋白合成的組合物。其中，苦丁萃取物用以調節COL1A2及COL3A1其中至少一基因的表現量。
在一實施例中，苦丁萃取物的用途，用於製備抑制膠原蛋白的降解的組合物。其中苦丁萃取物用以調節TIMP1及MMP1其中至少一基因的表現量。
在一實施例中，苦丁萃取物的用途，用於製備維持胞外基質的組合物。
在一實施例中，苦丁萃取物的用途，其是用於製備用以調節FBN1基因的表現量。
在一實施例中，苦丁萃取物係於50℃至80℃萃取以水溶液萃取，萃取時間介於30分鐘至90分鐘之間。
在一實施例中，苦丁萃取物的多酚含量大於3mg/mL。
在一實施例中，前述之任一組合物可為醫藥組合物、保養品組合物或食品組合物。
在一實施例中，前述之醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於經腸道地、非經腸道地(parenterally)、口服的、或局部地(topically)投藥劑型。
在一實施例中，經腸道或口服的投藥劑型可為，但不限於，錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)或類似之物。在一實施例中，非經腸道地或局部地投藥劑型可為，但不限於，注射品(injection)、無菌的粉末(sterile powder)、外部製劑(external preparation)或類似之物。在一實施例中，注射品的投藥方式可為皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)或病灶內注射(intralesional injection)。
在一實施例中，醫藥組合物可由下列所述的任一種非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。
在一實施例中，前述之醫藥品可包含被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptablecarrier)。在一實施例中，醫藥上可接受的載劑可為下列載劑中一種或多種：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕 劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。關於選用之載劑的種類與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在一實施例中，作為醫藥上可接受的載劑的溶劑可為水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline，PBS)、或含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)。
在一實施例中，醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)。舉例而言，外部製劑可為下列所述的任一種，但不限於此：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、油膏(salve)以及繃帶(bandage)。
在一實施例中，外部製劑是藉由將苦丁萃取物與一為熟習此項技藝者所詳知的基底(base)相混合而製成。
在一實施例中，前述之任一組合物可為食用組合物。換言之，食用組合物包含特定含量的苦丁萃取物。在一實施例中，前述之食用組合物可為食品產品或食品添加物(food additive)。在一實施例中，食品產品可為但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。
在一實施例中，前述之任一組合物可為化妝品或保養品。換言之，化妝品或保養品包含特定含量的苦丁萃取物。
在一實施例中，前述之化妝品或保養品組合物可為下列任一種型態：化妝水、凝膠、凍膜、泥膜、乳液、乳霜、唇膏、粉底、粉餅、蜜粉、卸妝油、卸妝乳、洗面乳、沐浴乳、洗髮精、護髮乳、防曬乳、護手霜、指甲油、香水、精華液及面膜。在一實施例中，前述之化妝品或保養品可視需要更包含外用品可接受成分。在一實施例中，外用品可接受成分可例如為乳化劑、滲透促進劑、軟化劑、溶劑、賦型劑、抗氧化劑、或其組合。
在一實施例中，保養品組合物可進一步包含有一被廣泛地使用於保養品製造技術之可接受的佐劑(acceptable adjuvant)。例如，可接受的佐劑可包含下列一種或多種佐劑：溶劑、膠凝劑、活性劑、防腐劑、抗氧化劑、遮蔽劑(screening agent)、螯合劑、界面活性劑、染色試劑(coloring agent)、增稠劑(thickening agent)、填料(filler)、香料以及氣味吸收劑。可根據實際需求對這些試劑的選用與數量進行合適的調整。
在一實施例中，保養品組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚(skincare)或化妝(makeup)的型態。其中，適合於護膚或化妝的型態可為下列中的任一種，但不限於此：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)、油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或複合型之乳劑、凝膠、軟膏、乳霜、面膜 (mask)、貼片、貼布(pack)、擦劑、粉末、氣溶膠、噴霧、乳液、乳漿、糊劑、泡沫、分散液、滴劑、慕斯(mousse)、防曬油(sunblock)、化妝水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妝產品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身體清潔產品(body cleansing products)等。
在一實施例中，保養品組合物亦可進一步包含有下列中之已知活性的外用劑(external use agents)中的一種或多種：美白劑(whitening agents)[諸如維生素A酸(tretinoin)、兒茶素(catechin)、麴酸、熊果苷以及維生素C]、保濕劑、殺菌劑(bactericides)、紫外線吸收劑(ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[諸如蘆薈萃取物(aloe extract)]、皮膚營養劑(skin nutrients)、麻醉劑(anesthetics)、抗痘劑(anti-acne agents)、止癢劑(antipruritics)、止痛劑(analgesics)、抗皮膚炎劑(antidermatitis agents)、抗過角化劑(antihyperkeratolytic agents)、抗乾皮膚劑(anti-dry skin agents)、抗汗劑(antipsoriatic agents)、抗老化劑(antiaging agents)、抗皺劑(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出劑(antiseborrheic agents)、傷口治療劑(wound-healing agents)、皮質類固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有關這些外用劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
其中，前述的食品組合物包含苦丁萃取物。
在一實施例中，食品組合物可以口服方式施予個體。其中，食品組合物的型態可為粉末、顆粒、溶液、膠體或膏體。個體可為 人。
在一實施例中，食品組合物可為食品產品或食品添加物(food additive)。
在一實施例中，食品添加物可藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。
在一實施例中，食品產品可為但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)或膳食補充品(dietary supplements)。
在一些實施例中，苦丁萃取物可由水或甲醇作為萃取溶劑與苦丁進行一萃取程序所得。
在萃取程序的步驟如下：
1.將水或甲醇與苦丁的葉(產地：中國)以5：1至15：1的重量比混合，並於50~80℃下浸泡約30至90分鐘以萃取苦丁萃取物，形成含有固體的第一萃取液。
2.冷卻第一萃取液至室溫(25℃-30℃)。
3.將第一萃取液以400目數的濾網進行過濾，去除細微固體。
4.過濾後的第一萃取液以濃縮機(廠牌/型號：BUCHI -Rotavapor R-100)，於40至80℃(較佳地於45至70℃)下進行減壓濃縮至溶液的白利糖度值(Degrees Brix)為2.4±0.5時停止濃縮，得到苦丁 萃取物。
例一：苦丁萃取物萃取
步驟A-1：將水與苦丁的葉(產地：中國)以10：1的重量比混合，並於65±5℃下浸泡約60分鐘以萃取苦丁萃取物，形成含有固體的第一萃取液。
步驟A-2：冷卻第一萃取液至室溫(25℃-30℃)。
步驟A-3：將第一萃取液以400目數的濾網進行過濾，去除細微固體。
步驟A-4：過濾後的第一萃取液以濃縮機(廠牌/型號：BUCHI -Rotavapor R-100)，60℃±5℃下進行減壓濃縮至溶液的白利糖度值(Degrees Brix)為2.4±0.5時停止濃縮，得到苦丁萃取物。
例二：總多酚含量測試
步驟B-1：秤取10.0mg的沒食子酸(gallic acid)(購自Sigma，型號G7384)置於10mL容量瓶中。
步驟B-2：然後以水(H2O)定量至10mL，以得到沒食子酸的儲備溶液(stock solution)。
步驟B-3：將沒食子酸的儲備溶液稀釋10倍，即100μL沒食子酸的儲備溶液加900μL的水，以得到100μg/mL沒食子酸的初始溶液(即含1000ppm的沒食子酸)。
步驟B-4：於玻璃試管中分別配製0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL及100μg/mL的沒食子酸標準溶液，配製方式顯示於表一。
Figure 109127838-A0305-02-0012-1
步驟B-5：分別將例一所得到的苦丁萃取物為樣本。將各樣本取100μL到玻璃試管中。
步驟B-6：接著，加入加500μL的佛蕭酚試劑(Folin-Ciocalteu’s phenol reagent；Merck 1.09001.0100)至玻璃試管中，與樣本均勻混合並靜置3分鐘，再加入400μL之7.5%碳酸鈉混合均勻後反應30分鐘以得到待測反應溶液。
步驟B-7：接著，將裝有待測反應溶液的玻璃試管經由漩渦(vortex)以確保無氣泡後，取200μL之待測反應溶液，並以ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，酵素結合免疫吸附法)讀取儀(廠牌：BioTek)測量待測反應溶液於750nm下之吸光值。
步驟B-8：接著，利用標準曲線與內插法將待測反應溶液的吸光值換算成總多酚含量。於此，可得到苦丁萃取物的總多酚含量為3mg/mL。
例三：抗醣化測試
實驗步驟：
步驟C-1：配置苦丁萃取物溶液、膠原蛋白溶液以及果糖溶液。配置步驟分別如下：苦丁萃取物溶液：以前例一得到的苦丁萃取物與濃度200 mM的磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate-Buffered Saline，PBS)，配置出濃度0.25mg/mL的苦丁萃取物溶液。其中，磷酸鹽緩衝生理鹽水係以1.995g的NaH2PO3(購自Honeywell，型號#04269)、11.8345g的Na2HPO4(購自Sigma，型號#V900061)與水配製至500g而成，並且此磷酸鹽緩衝生理鹽水的pH值為7.4。
膠原蛋白溶液是：前述濃度200mM的磷酸鹽緩衝生理鹽水以及膠原蛋白粉末(購自Rousselot，型號#P2000HD)，配製濃度為60mg/mL的膠原蛋白溶液。另加入疊氮化鈉於膠原蛋白溶液中，使膠原蛋白溶液中含有0.06wt%的疊氮化鈉(購自Sigma，型號#S2002)。
果糖溶液：以前述濃度200mM的磷酸鹽緩衝生理鹽水與果糖(果糖購自Sigma，型號#F0127)，配製濃度為1.5M的果糖溶液。
步驟C-2：配置樣品溶液與空白溶液。
樣品溶液：取步驟C-1的苦丁萃取物溶液0.2mL、膠原蛋白溶液0.2mL以及果糖溶液0.2mL進行混合。樣品溶液作為實驗組。
空白溶液：取0.2mL的去離子水、取步驟C-1膠原蛋白溶液以及0.2mL以及取步驟C-1果糖溶液0.2mL進行混合，配製出空白溶液。空白溶液為控制組。
步驟C-3：使用分光螢光計(spectrofluorometer，購自BioTek，型號FLx 800)對量測樣品溶液與空白溶液以激發波長360nm，放射波長460nm測定其螢光強度，以得到樣品溶液(實驗組)反應前與空白溶液(控制組)反應前的螢光強度。
步驟C-4：取0.6mL的將樣品溶液(實驗組)與0.6mL空白 溶液(控制組)置於50℃的環境反應24小時。
步驟C-5：將步驟C-4反應24小時候的樣品溶液(實驗組)空白溶液(控制組)以同於步驟C-3的分光螢光計以激發波長360nm，放射波長460nm測定其螢光強度，以得到樣品溶液(實驗組)反應後與空白溶液(控制組)反應後的螢光強度。
步驟C-6：依下列公式計算蛋白質醣化終產物相對生成率：[(樣品螢光強度反應後-樣品螢光強度反應前)/(控制組螢光強度反應後-控制組螢光強度反應前)]×100%。
實驗結果：請參照圖1所示，將依驟C-6公式得到的相對生成率數值，並以長條圖表示。由圖1可見，相較於控制組，實驗組明顯減少約47%的醣化終產物(Advanced glycation end products,AGEs)的形成量。由此可知，苦丁萃取物能有效抑制醣化終產物的形成，即具有抗醣化的作用。由於肌膚的膠原網絡會被醣化終產物破壞，進而導致肌膚老化現象發生(如皺紋、鬆弛、暗沉、乾燥)，苦丁萃取物能減少醣化終產物的形成，進而可達到減緩肌膚老化的功效。
例四：細胞實驗-抵抗藍光ROS傷害
材料與儀器
1.細胞株：人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk(BCRC，No.60153)，以下簡稱CCD-966sk細胞。
2.細胞培養基：將最低限度培養基(minimum essential medium，MEM，購自Gibco，型號Cat.61100-061)添加額外成分使其含有10vol %胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，購自Gibco，型號Cat.10437-028)、1mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate，購自Gibco，型號Cat.11360-070)、1vol % Antibiotic-Antimycotic(AA，購自Gibco，型號Cat.15240-062)。
3.磷酸緩衝鹽溶液(PBS溶液)(購自Gibco，型號Cat.14200-075)。
4.DCFH-DA溶液：將二氯二氫螢光素二乙酸酯(2,7-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA；購自Sigma，型號Cat.SI-D6883-50MG)溶於二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO，購自Sigma，型號Cat.D2650-100ML)以配製成5mg/ml的DCFH-DA溶液。
5.流式細胞儀(購自Beckman，型號660519)。
6.藍光箱(波長500nm-600nm)。
7.苦丁萃取物：由例一所製成。
實驗步驟
實驗將會分為實驗組、控制組(未添加苦丁萃取物、亦無經過藍光照射的組別)、以及對照組(未添加苦丁萃取物，但經藍光照射的組別)三組進行，各組分別進行二重複試驗
步驟D-1：將CCD-966sk細胞以每孔1×105個的方式，接種於每孔含2ml培養基之6孔培養盤中。
步驟D-2：將培養盤置於5%CO2、37℃下，培養24小時。
步驟D-3：移除培養盤的各孔中的細胞培養基。
步驟D-4：各組細胞於37℃下反應1小時。其中各組細胞處理如下：實驗組：每孔加入含0.25mg/ml苦丁萃取物的細胞培養基2mL。
控制組：每孔加入2mL的細胞培養基(不含苦丁萃取物)。
對照組：每孔加入2mL的細胞培養基(不含苦丁萃取物)。
步驟D-5：添加含有濃度5mg/ml的DCFH-DA溶液之2μL細胞培養基於每孔中，使DCFH-DA處理細胞15分鐘。
步驟D-6：於DCFH-DA處理後，各組以下述條件培養15分鐘。
實驗組：將DCFH-DA處理後的6孔培養盤移至藍光箱中，使其在室溫(25±5℃)下接受藍光照射4小時。
控制組：將DCFH-DA處理後的6孔培養盤移至暗處，使其在室溫(25±5℃)下靜置4小時。
對照組：將DCFH-DA處理後的6孔培養盤移至藍光箱中，使其在室溫(25±5℃)下接受藍光照射4小時。
步驟D-7：於步驟D-6反應4小時後，各組每孔以1mL的PBS溶液潤洗1次。
步驟D-8：將200μl胰蛋白酶(購自Gibco，型號Cat.15400-054)加至每孔中並在暗處反應5分鐘。反應後，添加6mL細胞培養基終止反應。
步驟D-9：終止反應後，將各組的各孔的細胞與與細胞培 養基個別收集至對應的15mL離心試管內，並將含有細胞與細胞培養基之離心試管以400 xg離心5分鐘。
步驟D-10：離心後，各組移除上清液，並以PBS溶液回溶細胞沉澱物為細胞懸浮液。各組細胞懸浮液以400 xg離心10分鐘。
步驟D-11：離心後，各組再次移除上清液，並以PBS溶液回溶細胞沉澱物為細胞懸浮液。
步驟D-12：使用流式細胞儀偵測各孔的待測細胞液中DCFH-DA的螢光信號。進行螢光偵測之激發波長為450-490nm，放射波長為510-550nm。由於DCFH-DA進入細胞後會先被水解為DCFH(二氯二氫螢光素)，再被活性氧物質氧化為可發出綠色螢光的DCF(二氯螢光素)，經DCFH-DA處理之細胞的螢光強度可反映細胞內活性氧物質含量，並藉此得知細胞內活性氧物質高度表現的細胞數佔原細胞數的比例。因實驗係進行二重複，故將各組的二重複實驗之量測結果平均以得平均值，然後以控制組的平均值為100%之相對ROS的生成量，將對照組與實驗組的平均值換算為相對ROS的生成量，如圖2所示。
實驗結果
請參照圖2所示，由控制組、對照組的結果可知，在經過藍光照射後，具有高ROS表現(高螢光表現)的細胞比例將大幅增加，顯示藍光照射確實會導致細胞內產生活性氧物質，進而對纖維母細胞(CCD-966sk)產生後續傷害。
其中，實驗組的ROS相對產生量約為1.76%，而對照組的ROS相對產生量約為88.8%，可以知道，當細胞經過苦丁萃取物處理 後，與對照組相比，實驗組能顯著降低ROS的產生。顯示苦丁萃取物可有效減少活性氧物質在細胞內的產生或累積，可作為一種活性氧物質清除劑。亦即，苦丁萃取物可透過降低細胞內活性氧物質含量，減少細胞受到藍光、紫外線等所導致的氧化傷害。
例五：細胞實驗-促進膠原蛋白合成之基因表現
例五偵測人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk(BCRC，No.60153)(以下簡稱CCD-966sk細胞)在施予苦丁萃取物後，其膠原蛋白相關基因以及胞外基質相關的基因表現量。
步驟E-1：以每孔1×105個細胞量將CCD-966sk細胞培養基於含有2mL細胞培養基之六孔盤中，並在37℃下培養16小時。其中，細胞培養基為Eagle’s最低限度基本培養基(minimum essential medium，MEM，購自Gibco，型號15188-319)添加額外成分使其含有10vol% FBS(fetal bovine serum，購自Gibco，型號10437-028)、90vol% 1mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate，購自Gibco，型號11360-070)、1.5g/L碳酸氫鈉(購自Sigma)、0.1mM非必需胺基酸(non-essential amino acid solution，購自Gibco，型號11140-050)。
步驟E-2：配置實驗組與控制組。
實驗組：例1製成之苦丁萃取物(即，濃度為0.25mg/ml)以1mg/mL的比例添加於細胞培養液中，將步驟E-1的細胞培養液更換為含萃取物的培養液，並於37℃繼續培養48小時。
控制組：更換步驟E-1的細胞培養液後，不添加苦丁萃取物，並於37℃繼續培養48小時。
步驟E-3：將培養後的實驗組及控制組，去除包含苦丁萃取物的細胞培養液或純培養液，取下清洗後的細胞並以裂解液(購自Geneaid台灣，附於步驟E-4的RNA萃取試劑套組)破細胞後，形成實驗組細胞溶液及控制組細胞溶液。
步驟E-4：用RNA萃取試劑套組(購自Geneaid台灣，型號Lot No.FC24015-G)分別收集二組細胞溶液內之RNA。接著，每組取2000奈克(ng)所萃取出的RNA為模板，藉由SuperScript® III反轉錄酶(購自Invitrogene美國，型號18080-051)以表二中之引子黏合進行反轉錄作用產生相應之cDNA。後續利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system(購自Thermo Fisher Scientific美國)，以及KAPA SYBR FAST(購自Sigma美國，型號38220000000)將二組反轉錄後產物分別以表二之組合引子進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction)以觀察實驗組和控制組的細胞的基因的表現量。其中，表二的引子對包含COL1A2、TIMP1、FBN1、MMP1以及GAPDH(作為內部對照組)。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95℃反應1秒，60℃反應20秒，總共40個迴圈，並使用2-ΔCt方法進行基因定量。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量各基因的mRNA表現量，進而推斷各基因編碼的蛋白質的表現量。
Figure 109127838-A0305-02-0019-2
Figure 109127838-A0305-02-0020-3
文述及之圖式中顯示的各基因的相對基因表現係以相對倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗(Student t-test)分析是否具有統計上的顯著差異。圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。
實驗結果
請參照圖3所示，與控制組相較之下，實驗組的COL1A2、COL3A1、TIMP1以及FBN1的基因表現量有顯著的提升。
詳細來說，當控制組的COL1A2的基因表現量為1時，實驗組的COL1A2表現量約為1.19；當控制組的COL3A1的基因表現量為1時，實驗組的COL3A1基因表現量約為1.37。COL1A2為膠原蛋白的主要結構，COL1A2基因可促進COL1A2膠原蛋白合成；COL3A1基因可促進纖維膠原蛋白(fibrillar collagen)合成。因此，苦丁萃取物能促進膠原 蛋白合成，並可用於製備促進膠原蛋白合成的組合物。
當控制組的TIMP1的基因表現量為1時，實驗組的TIMP1基因表現量為1.12。TIMP1的基因表現能抑制MMP酵素的活性，因此，苦丁萃取物能抑制膠原蛋白降解，並能用於製備抑制膠原蛋白降解的組合物。
當控制組的FBN1的基因表現量為1時，實驗組的FBN1基因表現量為1.32。FBN1的基因表現提升有助於維持胞外基質，因此，苦丁萃取物能可調節胞外基質，並能用於製備調節胞外基質的組合物。
請參照圖4所示，與控制組相較之下，實驗組的MMP1基因表現量有顯著的下降。詳細來說，當控制組的MMP1的基因表現量為1時，實驗組的MMP1表現量為0.86。MMP1的基因能促進膠原蛋白分解酵素的產生。因此，苦丁萃取物能抑制膠原蛋白降解，並能用於製備抑制膠原蛋白降解的組合物。
綜上所述，在一些實施例，苦丁萃取物用於製備減少醣化終產物生成的組合物。在一些實施例，苦丁萃取物用於製備抑制活性氧物質(ROS)生成的組合物。在一些實施例，苦丁萃取物可調節COL1A2及COL3A1其中至少一基因的表現量，而可用於製備促進膠原蛋白合成的組合物。在一些實施例，苦丁萃取物可調節TIMP1及MMP1其中至少一基因的表現量，而可用於製備抑制膠原蛋白的降解的組合物。在一些實施例，苦丁萃取物可調節FBN1基因的表現量，而可用於製備維持胞外基質的組合物。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003

Claims (8)

  1. 一種苦丁萃取物的用途，其是用於製備抑制活性氧物質(ROS)生成的組合物，其中該苦丁萃取物係於50℃至80℃以水萃取，萃取時間介於30分鐘至90分鐘之間。
  2. 一種苦丁萃取物的用途，其是用於製備促進膠原蛋白合成的組合物，其中該苦丁萃取物係於50℃至80℃以水萃取，萃取時間介於30分鐘至90分鐘之間。
  3. 如請求項2所述的用途，其中該苦丁萃取物用以調節COL1A2及COL3A1其中至少一基因的表現量。
  4. 一種苦丁萃取物的用途，其是用於製備抑制膠原蛋白的降解的組合物，其中該苦丁萃取物係於50℃至80℃以水萃取，萃取時間介於30分鐘至90分鐘之間。
  5. 如請求項4所述的用途，其中該苦丁萃取物用以調節TIMP1及MMP1其中至少一基因的表現量。
  6. 一種苦丁萃取物的用途，其是用於製備維持胞外基質的組合物，其中該苦丁萃取物係於50℃至80℃以水萃取，萃取時間介於30分鐘至90分鐘之間。
  7. 如請求項6所述的用途，其中該苦丁萃取物用以調節FBN1基因的表現量。
  8. 如請求項1至7中任一項所述的用途，其中該苦丁萃取物的多酚含量大於3mg/mL。
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