CN112386621A - 苦丁汁液的用途 - Google Patents
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Abstract
一种苦丁汁液用于制备减少醣化终产物生成的组合物、用于制备抑制活性氧物质(ROS)生成的组合物、用于制备促进胶原蛋白合成的组合物、用于制备抑制胶原蛋白的降解的组合物或用于制备维持胞外基质的组合物的用途。
Description
技术领域
本发明是有关一种苦丁汁液的用途。特别是关于苦丁汁液用于制备减少醣化终产物生成的组合物、用于制备抑制活性氧物质(ROS)生成的组合物、用于制备促进胶原蛋白合成的组合物、用于制备抑制胶原蛋白的降解的组合物或用于制备维持胞外基质的组合物的用途。
背景技术
苦丁(Ilex Latifolia Thunb)已有2000多年的饮用历史，根据记载，宋仁宗品尝后，认为此茶先苦后甘、提振舒心，对苦丁茶的美味的口感无法忘怀，要求番邦年年进贡。而于《本草纲目》中亦有记载，苦丁能止渴明目、消炎利便、通肠、消暑解毒、化痰止咳以及消除口臭的作用。
苦丁环境适应性广、抗逆性强，根系发达且生长迅速，并且种植的过程中不会对环境造成伤害。因此，除饮用苦丁茶外，若能开发苦丁的其他功效以进一步更有效地利用苦丁，更是有益于全民的健康福祉。
发明内容
在一实施例中，一种苦丁汁液的用途，其是用于制备减少醣化终产物生成的组合物。
在一实施例中，一种苦丁汁液的用途，其是用于制备抑制活性氧物质 (ROS)生成的组合物。
在一实施例中，一种苦丁汁液的用途，其是用于制备促进胶原蛋白合成的组合物。
在一实施例中，其中苦丁汁液用以调节COL1A2及COL3A1其中至少一基因的表现量。
在一实施例中，一种苦丁汁液的用途，其是用于制备抑制胶原蛋白的降解的组合物。
在一实施例中，其中苦丁汁液用以调节TIMP1及MMP1其中至少一基因的表现量。
在一实施例中，一种苦丁汁液的用途，其是用于制备维持胞外基质的组合物。
在一实施例中，其中苦丁汁液用以调节FBN1基因的表现量。
在一实施例中，苦丁汁液是于50℃至80℃以水溶液提取，提取时间介于30分钟至90分钟之间。
在一实施例中，苦丁汁液的多酚含量大于3mg/mL。
因此，在一些实施例，苦丁汁液用于制备减少醣化终产物生成的组合物。在一些实施例，苦丁汁液用于制备抑制活性氧物质(ROS)生成的组合物。在一些实施例，苦丁汁液可调节COL1A2及COL3A1其中至少一基因的表现量，而可用于制备促进胶原蛋白合成的组合物。在一些实施例，苦丁汁液可调节TIMP1及MMP1其中至少一基因的表现量，而可用于制备抑制胶原蛋白的降解的组合物。在一些实施例，苦丁汁液可调节FBN1基因的表现量，而可用于制备维持胞外基质的组合物。
附图说明
图1为实验组与控制组相对醣化终产物量的实验结果图。
图2为实验组、对照组与控制组的ROS的相对产生量的实验结果图。
图3为实验组与控制组的COL1A1、COL3A1、TIMP1、FBN1的基因相对表现量。
图4为实验组与控制组的MMP1的基因相对表现量。
具体实施方式
以下将描述本案的部分具体实施态样。在不背离本案精神下，本案尚可以多种不同形式的态样来实践，不应将保护范围限于说明书所具体陈述的条件。
关于本文中所使用的浓度符号「wt％」通常是指重量百分浓度，而浓度符号「vol％」通常是指体积百分浓度。
图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在正负10％的范围内，最佳为在正负5％的范围内。
在一实施例中，苦丁汁液的用途，其是用于制备减少醣化终产物生成的组合物。
在一实施例中，苦丁汁液的用途，其是用于制备抑制活性氧物质 (ROS)生成的组合物。
在一实施例中，苦丁汁液的用途，其是用于制备促进胶原蛋白合成的组合物。其中，苦丁汁液用以调节COL1A2及COL3A1其中至少一基因的表现量。
在一实施例中，苦丁汁液的用途，用于制备抑制胶原蛋白的降解的组合物。其中苦丁汁液用以调节TIMP1及MMP1其中至少一基因的表现量。
在一实施例中，苦丁汁液的用途，用于制备维持胞外基质的组合物。
在一实施例中，苦丁汁液的用途，其是用于制备用以调节FBN1基因的表现量。
在一实施例中，苦丁汁液是于50℃至80℃提取以水溶液提取，提取时间介于30分钟至90分钟之间。
在一实施例中，苦丁汁液的多酚含量大于3mg/mL。
在一实施例中，前述的任一组合物可为医药组合物、保养品组合物或食品组合物。
在一实施例中，前述的医药组合物可利用熟习此技术人员所详知的技术而被制造成适合于经肠道地、非经肠道地(parenterally)、口服的、或局部地(topically)投药剂型。
在一实施例中，经肠道或口服的投药剂型可为，但不限于，锭剂 (tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊 (capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂 (elixir)、浓浆(slurry)或类似的物。在一实施例中，非经肠道地或局部地投药剂型可为，但不限于，注射品(injection)、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(externalpreparation)或类似的物。在一实施例中，注射品的投药方式可为皮下注射(subcutaneousinjection)、表皮内注射 (intraepidermal injection)、皮内注射(intradermalinjection)或病灶内注射 (intralesional injection)。
在一实施例中，医药组合物可由下列所述的任一种非经肠道途径 (parenteralroutes)来投药：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermalinjection)、皮内注射(intradermal injection)以及病灶内注射(intralesionalinjection)。
在一实施例中，前述的医药品可包含被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。在一实施例中，医药上可接受的载剂可为下列载剂中一种或多种：溶剂(solvent)、缓冲液 (buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂 (decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、粘结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体 (liposome)以及类似的物。关于选用的载剂的种类与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。在一实施例中，作为医药上可接受的载剂的溶剂可为水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)、或含有醇的水性溶液(aqueous solutioncontaining alcohol)。
在一实施例中，医药组合物可利用熟习此技术人员所详知的技术而被制造成一适合于局部地施用于皮肤上的外部制剂(external preparation)。举例而言，外部制剂可为下列所述的任一种，但不限于此：乳剂 (emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、贴片 (patch)、擦剂(liniment)、粉末(powder)、气溶胶(aerosol)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、乳浆(serum)、糊剂(paste)、泡沫 (foam)、滴剂(drop)、悬浮液(suspension)、油膏(salve)以及绷带 (bandage)。
在一实施例中，外部制剂是从而将苦丁汁液与一为熟习此项本领域技术人员所详知的基底(base)相混合而制成
在一实施例中，前述的任一组合物可为食用组合物。换句话说，食用组合物包含特定含量的苦丁汁液。在一实施例中，前述的食用组合物可为食品产品或食品添加物(foodadditive)。在一实施例中，食品产品可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)。
在一实施例中，前述的任一组合物可为化妆品或保养品。换言的，化妆品或保养品包含特定含量的苦丁汁液。
在一实施例中，前述的化妆品或保养品组合物可为下列任一种型态：化妆水、凝胶、冻膜、泥膜、乳液、乳霜、唇膏、粉底、粉饼、蜜粉、卸妆油、卸妆乳、洗面乳、沐浴乳、洗发精、护发乳、防晒乳、护手霜、指甲油、香水、精华液及面膜。在一实施例中，前述的化妆品或保养品可视需要更包含外用品可接受成分。在一实施例中，外用品可接受成分可例如为乳化剂、渗透促进剂、软化剂、溶剂、赋型剂、抗氧化剂、或其组合。
在一实施例中，保养品组合物可进一步包含有一被广泛地使用于保养品制造技术的可接受的佐剂(acceptable adjuvant)。例如，可接受的佐剂可包含下列一种或多种佐剂：溶剂、胶凝剂、活性剂、防腐剂、抗氧化剂、遮蔽剂(screening agent)、螯合剂、界面活性剂、染色试剂(coloring agent)、增稠剂(thickening agent)、填料(filler)、香料以及气味吸收剂。可根据实际需求对这些试剂的选用与数量进行合适的调整。
在一实施例中，保养品组合物可利用熟习此技术人员所详知的技术而被制造成一适合于护肤(skincare)或化妆(makeup)的型态。其中，适合于护肤或化妆的型态可为下列中的任一种，但不限于此：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcoholsolution)、油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type) 或复合型的乳剂、凝胶、软膏、乳霜、面膜(mask)、贴片、贴布(pack)、擦剂、粉末、气溶胶、喷雾、乳液、乳浆、糊剂、泡沫、分散液、滴剂、慕斯(mousse)、防晒油(sunblock)、化妆水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妆产品(makeup removerproducts)、肥皂 (soap)以及其他身体清洁产品(body cleansing products)等。
在一实施例中，保养品组合物亦可进一步包含有下列中的已知活性的外用剂(external use agents)中的一种或多种：美白剂(whitening agents)[诸如维生素A酸(tretinoin)、儿茶素(catechin)、曲酸、熊果苷以及维生素 C]、保湿剂、杀菌剂(bactericides)、紫外线吸收剂(ultraviolet absorbers)、植物汁液(plant extracts)[诸如芦荟汁液(aloe extract)]、皮肤营养剂(skin nutrients)、麻醉剂(anesthetics)、抗痘剂(anti-acne agents)、止痒剂(antipruritics)、止痛剂(analgesics)、抗皮肤炎剂(antidermatitis agents)、抗过角化剂(antihyperkeratolytic agents)、抗干皮肤剂(anti-dry skin agents)、抗汗剂(antipsoriatic agents)、抗老化剂 (antiagingagents)、抗皱剂(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出剂 (antiseborrheic agents)、伤口治疗剂(wound-healing agents)、皮质类固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有关这些外用剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
其中，前述的食品组合物包含苦丁汁液。
在一实施例中，食品组合物可以口服方式施予个体。其中，食品组合物的型态可为粉末、颗粒、溶液、胶体或膏体。个体可为人。
在一实施例中，食品组合物可为食品产品或食品添加物(food additive)。
在一实施例中，食品添加物可通过习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。
在一实施例中，食品产品可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品 (fermentedfoods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)或膳食补充品(dietarysupplements)。
在一些实施例中，苦丁汁液可由水或甲醇作为提取溶剂与苦丁进行一提取程序所得。
在提取程序的步骤如下:
1.将水或甲醇与苦丁的叶(产地：中国)以5:1至15:1的重量比混合，并于50～80℃下浸泡约30至90分钟以提取苦丁汁液，形成含有固体的第一提取液。
2.冷却第一提取液至室温(25℃-30℃)。
3.将第一提取液以400目数的滤网进行过滤，去除细微固体。
4.过滤后的第一提取液以浓缩机(厂牌/型号：BUCHI-Rotavapor R- 100)，于40至80℃(较佳地于45至70℃)下进行减压浓缩至溶液的白利糖度值(Degrees Brix)为2.4±0.5时停止浓缩，得到苦丁汁液。
例一：苦丁汁液提取
步骤A-1：将水与苦丁的叶(产地：中国)以10:1的重量比混合，并于65±5℃下浸泡约60分钟以提取苦丁汁液，形成含有固体的第一提取液。
步骤A-2：冷却第一提取液至室温(25℃-30℃)。
步骤A-3：将第一提取液以400目数的滤网进行过滤，去除细微固体。
步骤A-4：过滤后的第一提取液以浓缩机(厂牌/型号：BUCHI- Rotavapor R-100)，60℃±5℃下进行减压浓缩至溶液的白利糖度值 (Degrees Brix)为2.4±0.5时停止浓缩，得到苦丁汁液。
例二：总多酚含量测试
步骤B-1：秤取10.0mg的没食子酸(gallic acid)(购自Sigma，型号 G7384)置于10mL容量瓶中。
步骤B-2：然后以水(H2O)定量至10mL，以得到没食子酸的储备溶液(stocksolution)。
步骤B-3：将没食子酸的储备溶液稀释10倍，即100μL没食子酸的储备溶液加900μL的水，以得到100μg/mL没食子酸的初始溶液(即含 1000ppm的没食子酸)。
步骤B-4：于玻璃试管中分别配制0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、 60μg/mL、80μg/mL及100μg/mL的没食子酸标准溶液，配制方式显示于表一。
表一
步骤B-5：分别将例一所得到的苦丁汁液为样本。将各样本取100μL到玻璃试管中。
步骤B-6：接着，加入加500μL的佛萧酚试剂(Folin-Ciocalteu’s phenolreagent；Merck 1.09001.0100)至玻璃试管中，与样本均匀混合并静置3分钟，再加入400μL的7.5％碳酸钠混合均匀后反应30分钟以得到待测反应溶液。
步骤B-7：接着，将装有待测反应溶液的玻璃试管经由漩涡(vortex) 以确保无气泡后，取200μL的待测反应溶液，并以ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，酵素结合免疫吸附法)读取仪(厂牌：BioTek)测量待测反应溶液于750nm下的吸光值。
步骤B-8：接着，利用标准曲线与内插法将待测反应溶液的吸光值换算成总多酚含量。于此，可得到苦丁汁液的总多酚含量为3mg/mL。
例三：抗醣化测试
实验步骤：
步骤C-1：配置苦丁汁液溶液、胶原蛋白溶液以及果糖溶液。配置步骤分别如下：
苦丁汁液溶液：以前例一得到的苦丁汁液与浓度200mM的磷酸盐缓冲生理盐水(Phosphate-Buffered Saline，PBS)，配置出浓度0.25mg/mL的苦丁汁液溶液。其中，磷酸盐缓冲生理盐水是以1.995g的NaH2PO3(购自 Honeywell，型号#04269)、11.8345g的Na2HPO4(购自Sigma，型号 #V900061)与水配制至500g而成，并且此磷酸盐缓冲生理盐水的pH值为7.4。
胶原蛋白溶液是：前述浓度200mM的磷酸盐缓冲生理盐水以及胶原蛋白粉末(购自Rousselot，型号#P2000HD)，配制浓度为60mg/mL的胶原蛋白溶液。另加入迭氮化钠于胶原蛋白溶液中，使胶原蛋白溶液中含有 0.06wt％的迭氮化钠(购自Sigma，型号#S2002)。
果糖溶液：以前述浓度200mM的磷酸盐缓冲生理盐水与果糖(果糖购自Sigma，型号#F0127)，配制浓度为1.5M的果糖溶液。
步骤C-2：配置样品溶液与空白溶液。
样品溶液：取步骤C-1的苦丁汁液溶液0.2mL、胶原蛋白溶液0.2mL 以及果糖溶液0.2mL进行混合。样品溶液作为实验组。
空白溶液：取0.2mL的去离子水、取步骤C-1胶原蛋白溶液以及0.2 mL以及取步骤C-1果糖溶液0.2mL进行混合，配制出空白溶液。空白溶液为控制组。
步骤C-3：使用分光萤光计(spectrofluorometer，购自BioTek，型号 FLx 800)对量测样品溶液与空白溶液以激发波长360nm，放射波长460nm 测定其萤光强度，以得到样品溶液(实验组)反应前与空白溶液(控制组) 反应前的萤光强度。
步骤C-4：取0.6mL的将样品溶液(实验组)与0.6mL空白溶液(控制组)置于50℃的环境反应24小时。
步骤C-5：将步骤C-4反应24小时候的样品溶液(实验组)空白溶液 (控制组)以同于步骤C-3的分光萤光计以激发波长360nm，放射波长460 nm测定其萤光强度，以得到样品溶液(实验组)反应后与空白溶液(控制组)反应后的萤光强度。
步骤C-6：依下列公式计算蛋白质醣化终产物相对生成率：
[(样品萤光强度反应后-样品萤光强度反应前)/(控制组萤光强度反应后-控制组萤光强度反应前)]×100％。
实验结果：
请参照图1所示，将依骤C-6公式得到的相对生成率数值，并以长条图表示。由图1可见，相较于控制组，实验组明显减少约47％的醣化终产物 (Advanced glycation endproducts,AGEs)的形成量。由此可知，苦丁汁液能有效抑制醣化终产物的形成，即具有抗醣化的作用。由于肌肤的胶原网络会被醣化终产物破坏，进而导致肌肤老化现象发生(如皱纹、松弛、暗沉、干燥)，苦丁汁液能减少醣化终产物的行程，进而可达到减缓肌肤老化的功效。
例四：细胞实验-抵抗蓝光ROS伤害
材料与仪器
1.细胞株：人类皮肤纤维母细胞CCD-966sk(BCRC，No.60153)，以下简称CCD-966sk细胞。
2.细胞培养基：将最低限度培养基(minimum essential medium， MEM，购自Gibco，型号Cat.61100-061)添加额外成分使其含有10vol％胎牛血清(fetal bovineserum，FBS，购自Gibco，型号Cat.10437-028)、1 mM丙酮酸钠(sodium pyruvate，购自Gibco，型号Cat.11360-070)、1 vol％Antibiotic-Antimycotic(AA，购自Gibco，型号Cat.15240-062)。
3.磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)(购自Gibco，型号Cat.14200- 075)。
4.DCFH-DA溶液：将二氯二氢萤光素二乙酸酯(2,7-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA；购自Sigma，型号Cat.SI-D6883-50MG) 溶于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，购自Sigma，型号 Cat.D2650-100ML)以配制成5mg/ml的DCFH-DA溶液。
5.流式细胞仪(购自Beckman，型号660519)。
6.蓝光箱(波长500nm-600nm)。
7.苦丁汁液：由例一所制成。
实验步骤
实验将会分为实验组、控制组(未添加苦丁汁液、亦无经过蓝光照射的组别)、以及对照组(未添加苦丁汁液，但经蓝光照射的组别)三组进行，各组分别进行二重复试验
步骤D-1：将CCD-966sk细胞以每孔1×105个的方式，接种于每孔含2 ml细胞培养基的6孔培养盘中。
步骤D-2：将培养盘置于5％CO2、37℃下，培养24小时。
步骤D-3：移除培养盘的各孔中的细胞培养基。
步骤D-4：各组细胞于37℃下反应1小时。其中各组细胞处理如下：
实验组：每孔加入含0.25mg/ml苦丁汁液的细胞培养基2mL。
控制组：每孔加入2mL的细胞培养基(不含苦丁汁液)。
对照组：每孔加入2mL的细胞培养基(不含苦丁汁液)。
步骤D-5：添加含有浓度5mg/ml的DCFH-DA溶液的2μL细胞培养基于每孔中，使DCFH-DA处理细胞15分钟。
步骤D-6：于DCFH-DA处理后，各组以下述条件培养15分钟。
实验组：将DCFH-DA处理后的6孔培养盘移至蓝光箱中，使其在室温 (25±5℃)下接受蓝光照射4小时。
控制组：将DCFH-DA处理后的6孔培养盘移至暗处，使其在室温(25 ±5℃)下静置4小时。
对照组：将DCFH-DA处理后的6孔培养盘移至蓝光箱中，使其在室温 (25±5℃)下接受蓝光照射4小时。
步骤D-7：于步骤D-6反应4小时后，各组每孔以1mL的PBS溶液润洗1次。
步骤D-8：将200μl胰蛋白酶(购自Gibco，型号Cat.15400-054)加至每孔中并在暗处反应5分钟。反应后，添加6mL细胞培养基终止反应。
步骤D-9：终止反应后，将各组的各孔的细胞与与细胞培养基个别收集至对应的15mL离心试管内，并将含有细胞与细胞培养基的离心试管以400 xg离心5分钟。
步骤D-10：离心后，各组移除上清液，并以PBS溶液回溶细胞沉淀物为细胞悬浮液。各组细胞悬浮液以400xg离心10分钟。
步骤D-11：离心后，各组再次移除上清液，并以PBS溶液回溶细胞沉淀物为细胞悬浮液。
步骤D-12：使用流式细胞仪检测各孔的待测细胞液中DCFH-DA的萤光信号。进行萤光检测的激发波长为450-490nm，放射波长为510-550 nm。由于DCFH-DA进入细胞后会先被水解为DCFH(二氯二氢萤光素)，再被活性氧物质氧化为可发出绿色萤光的DCF(二氯萤光素)，经 DCFH-DA处理的细胞的萤光强度可反映细胞内活性氧物质含量，并藉此得知细胞内活性氧物质高度表现的细胞数占原细胞数的比例。因实验进行二重复，故将各组的二重复实验的量测结果平均以得平均值，然后以控制组的平均值为100％的相对ROS的生成量，将对照组与实验组的平均值换算为相对 ROS的生成量，如图2所示。
实验结果
请参照图2所示，由控制组、对照组的结果可知，在经过蓝光照射后，具有高ROS表现(高萤光表现)的细胞比例将大幅增加，显示蓝光照射确实会导致细胞内产生活性氧物质，进而对纤维母细胞(CCD-966sk)产生后续伤害。
其中，实验组的ROS相对产生量约为1.76％，而对照组的ROS相对产生量约为88.8％，可以知道，当细胞经过苦丁汁液处理后，与对照组相比，实验组能显著降低ROS的产生。显示苦丁汁液可有效减少活性氧物质在细胞内的产生或累积，可作为一种活性氧物质清除剂。亦即，苦丁汁液可透过降低细胞内活性氧物质含量，减少细胞受到蓝光、紫外线等所导致的氧化伤害。
例五：细胞实验-促进胶原蛋白合的基因表现
例五检测人类皮肤纤维母细胞CCD-966sk(BCRC，No.60153)(以下简称CCD-966sk细胞)在施予苦丁汁液后，其胶原蛋白相关基因以及胞外基质相关的基因表现量。
步骤E-1：以每孔1×105个细胞量将CCD-966sk细胞培养基于含有2 mL细胞培养基的六孔盘中，并在37℃下培养16小时。其中，细胞培养基为Eagle’s最低限度基本培养基(minimum essential medium，MEM，购自 Gibco，型号15188-319)添加额外成分使其含有10vol％FBS(fetal bovine serum，购自Gibco，型号10437-028)、90vol％1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate，购自Gibco，型号11360-070)、1.5g/L碳酸氢钠(购自 Sigma)、0.1mM非必需胺基酸(non-essential amino acid solution，购自 Gibco，型号11140-050)。
步骤E-2：配置实验组与控制组。
实验组：例1制成的苦丁汁液(即，浓度为0.25mg/ml)以1mg/mL 的比例添加于细胞培养液中，将步骤E-1的细胞培养液更换为含汁液的培养液，并于37℃继续培养48小时。
控制组：更换步骤E-1的细胞培养液后，不添加苦丁汁液，并于37℃继续培养48小时。
步骤E-3：将培养后的实验组及控制组，去除包含苦丁汁液的细胞培养液或纯培养液，取下清洗后的细胞并以裂解液(购自Geneaid中国台湾，附于步骤E-4的RNA提取试剂套组)破细胞后，形成实验组细胞溶液及控制组细胞溶液。
步骤E-4：用RNA提取试剂套组(购自Geneaid中国台湾，型号Lot No.FC24015-G)分别收集二组细胞溶液内的RNA。接着，每组取2000奈克(ng)所提取出的RNA为模板，通过
III反转录酶(购自Invitrogene美国，型号18080-051)以表一中的引子粘合进行反转录作用产生相应的cDNA。后续利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system(购自Thermo Fisher Scientific美国)，以及KAPA SYBR FAST(购自Sigma 美国，型号38220000000)将二组反转录后产物分别以表一的组合引子进行定量即时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chainreaction)以观察实验组和控制组的细胞的基因的表现量。其中，表一的引子对包含COL1A2、TIMP1、FBN1、MMP1以及GAPDH (作为内部对照组)。定量即时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为 95℃反应1秒，60℃反应20秒，总共40个回圈，并使用2-ΔCt方法进行基因定量。于此，通过cDNA进行定量即时反转录聚合酶连锁反应可间接定量各基因的mRNA表现量，进而推断各基因编码的蛋白质的表现量。
表一
| 引子名称 | 序列编号 | 序列 |
| COL1A2-F | SEQ ID NO:1 | GGCCCTCAAGGTTTCCAAG |
| COL1A2-R | SEQ ID NO:2 | CACCCTGTGGTCCAACAACTC |
| TIMP1-F | SEQ ID NO:3 | AGAGTGTCTGCGGATACTTCC |
| TIMP1-R | SEQ ID NO:4 | CCAACAGTGTAGGTCTTGGTG |
| FBN1-F | SEQ ID NO:5 | TTTAGCGTCCTACACGAGCC |
| FBN1-R | SEQ ID NO:6 | CCATCCAGGGCAACAGTAAGC |
| MMP1-F | SEQ ID NO:7 | GGGGCTTTGATGTACCCTAGC |
| MMP1-R | SEQ ID NO:8 | TGTCACACGCTTTTGGGGTTT |
| GAPDH-F | SEQ ID NO:9 | CTGGGCTACACTGAGCACC |
| GAPDH-R | SEQ ID NO:10 | AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG |
文述及的图式中显示的各基因的相对基因表现是以相对倍率呈现，其中使用Excel软体的STDEV公式计算标准差，并在Excel软体中以单尾学生t 检验(Student t-test)分析是否具有统计上的显著差异。图式中「*」代表p 值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。
实验结果
请参照图3所示，与控制组相比较，实验组的COL1A2、COL3A1、 TIMP1以及FBN1的基因表现量有显著的提升。
详细来说，当控制组的COL1A2的基因表现量为1时，实验组的 COL1A2表现量约为1.19；当控制组的COL3A1的基因表现量为1时，实验组的COL3A1基因表现量约为1.37。COL1A2为胶原蛋白的主要结构， COL1A2基因可促进COL1A2胶原蛋白合成；COL3A1可促进纤维胶原蛋白(fibrillar collagen)合成。因此，苦丁汁液能促进胶原蛋白合成，并可用于制备促进胶原蛋白合成的组合物。
当控制组的TIMP1的基因表现量为1时，实验组的TIMP1基因表现量为1.12。TIMP1的基因表现能抑制MMP酵素的活性，因此，苦丁汁液能抑制胶原蛋白降解，并能用于制备抑制胶原蛋白降解的组合物。
当控制组的FBN1的基因表现量为1时，实验组的FBN1基因表现量为 1.32。FBN1的基因表现提升有助于维持胞外基质，因此，苦丁汁液能可调节胞外基质，并能用于制备调节胞外基质的组合物。
请参照图4所示，与控制组相比较下，实验组的MMP1基因表现量有显著的下降。详细来说，当控制组的MMP1的基因表现量为1时，实验组的MMP1表现量为0.86。MMP1的基因能促进胶原蛋白分解酵素的产生。因此，苦丁汁液能抑制胶原蛋白降解，并能用于制备抑制胶原蛋白降解的组合物。
综上所述，在一些实施例，苦丁汁液用于制备减少醣化终产物生成的组合物。在一些实施例，苦丁汁液用于制备抑制活性氧物质(ROS)生成的组合物。在一些实施例，苦丁汁液可调节COL1A2及COL3A1其中至少一基因的表现量，而可用于制备促进胶原蛋白合成的组合物。在一些实施例，苦丁汁液可调节TIMP1及MMP1其中至少一基因的表现量，而可用于制备抑制胶原蛋白的降解的组合物。在一些实施例，苦丁汁液可调节FBN1基因的表现量，而可用于制备维持胞外基质的组合物。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。
【序列表】
<110> 大江生医
<120> 苦丁汁液的用途
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COL1A2-F
<400> 1
ggccctcaag gtttccaag 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COL1A2-R
<400> 2
caccctgtgg tccaacaact c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TIMP1-F
<400> 3
agagtgtctg cggatacttc c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TIMP1-R
<400> 4
ccaacagtgt aggtcttggt g 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FBN1-F
<400> 5
tttagcgtcc tacacgagcc 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FBN1-R
<400> 6
ccatccaggg caacagtaag c 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP1-F
<400> 7
ggggctttga tgtaccctag c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP1-R
<400> 8
tgtcacacgc ttttggggtt t 21
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH-F
<400> 9
ctgggctaca ctgagcacc 19
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH-R
<400> 10
aagtggtcgt tgagggcaat g 21
Claims (10)
1.一种苦丁汁液的用途，其是用于制备减少醣化终产物生成的组合物。
2.一种苦丁汁液的用途，其是用于制备抑制活性氧物质(ROS)生成的组合物。
3.一种苦丁汁液的用途，其是用于制备促进胶原蛋白合成的组合物。
4.如权利要求3所述的用途，其中该苦丁汁液用以调节COL1A2及COL3A1其中至少一基因的表现量。
5.一种苦丁汁液的用途，其是用于制备抑制胶原蛋白的降解的组合物。
6.如权利要求5所述的用途，其中该苦丁汁液用以调节TIMP1及MMP1其中至少一基因的表现量。
7.一种苦丁汁液的用途，其是用于制备维持胞外基质的组合物。
8.如权利要求7所述的用途，其中该苦丁汁液用以调节FBN1基因的表现量。
9.如权利要求1至8中任一项所述的用途，其中该苦丁汁液是于50℃至80℃以水溶液提取，提取时间介于30分钟至90分钟之间。
10.如权利要求1至8中任一项所述的用途，其中该苦丁汁液的多酚含量大于3mg/mL。
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