TW202210061A

TW202210061A - 山葵葉萃取物用於抑制皮膚痤瘡形成及減少痤瘡桿菌分泌物之用途

Info

Publication number: TW202210061A
Application number: TW109130113A
Authority: TW
Inventors: 林詠翔; 姚采涵
Original assignee: 大江生醫股份有限公司
Priority date: 2020-09-02
Filing date: 2020-09-02
Publication date: 2022-03-16
Also published as: US20220062160A1; TWI809308B

Abstract

本發明提供一種山葵葉萃取物用於減緩皮膚老化及改善皮膚狀態的組合物之用途，其中該組合物用於抑制醣化終產物生成、增加肌膚含水量、改善肌膚緊緻度、減少肌膚皺紋、抑止肌膚皺紋生成、抑制皮膚斑點生成、抑制皮膚黑色素生成、抑制痤瘡生成。

Description

山葵葉萃取物用於改善肌膚之用途

本案係關於一種山葵葉萃取物的用途，特別是關於山葵葉用於製備減緩皮膚老化或改變皮膚狀態之組合物的用途。

皮膚對於人類個體之保護具有不可或缺之重要性，其提供了對抗陽光中紫外線輻射、病原體、摩擦力等環境因子的第一階段保護。皮膚由外向內依序包含表皮層、主要由結締組織所構成的真皮層、及皮下組織。其中，真皮層包含有充足的膠原蛋白（collagen）、彈力蛋白（elastin）、及玻尿酸（hyaluronic acid）等分子，因此年輕的肌膚具有較佳的支撐性以及彈性。

隨著年齡增長或環境因子的影響，皮膚會老化並產生各種受損的狀態。舉例而言，皮膚可能會因為膠原蛋白裂解，導致肌膚彈力下降、保水度不足（肌膚較為乾燥、無光澤）、毛孔粗大、皺紋等現象；以及例如因黑色素沉澱，使肌膚產生斑點及/或整體較為暗沈、蠟黃等老化態樣。

另外，可能因血液中多餘的糖分與蛋白質結合，形成加速老化的物質—醣化終產物（Advanced Glycation End-Products，AGE）。這些體內AGE的累積亦會造成皮膚呈現老化受損狀態。特別是現代生活中，人們常攝取過多糖分，加上缺乏運動或代謝緩慢等因素，造成肌膚老化更明顯、快速。

有鑑於此，研究或開發一種可減緩皮膚老化及損害的組合物，來維持或改善肌膚外觀乃有其必要。

緣此，本發明的一目的在於提供一種山葵葉萃取物用於製備減緩皮膚老化及改變皮膚狀態的組合物之用途。山葵（Wasabia japonica ）又稱為山嵛菜」，是一種屬於十字花科山萮菜屬的植物。山葵具有濃烈刺激味，然其辛辣與辣椒不同，辣椒的辣味刺激舌頭，而山葵的辣味卻刺激鼻竇。山葵葉可以食用，且具有山葵莖的辣味。山葵葉的料理方式包括用鹽醋醬汁醃製過夜後製成山葵沙拉，用醬油開水烹煮以作為下飯、下酒的小菜或卷壽司的材料食用，甚至可以蘸上澱粉漿後炸成天婦羅。

具體而言，本發明的一目的在於提供一種山葵葉萃取物用於製備抑制醣化終產物生成、增加肌膚含水量、改善肌膚緊緻度、減少肌膚皺紋、抑止肌膚皺紋生成、抑制皮膚斑點生成、抑制皮膚黑色素生成以及抑制痤瘡生成的組合物的用途。

在一些實施例中，該組合物係為醫藥組合物。

在一些實施例中，該組合物係進一步製備成保養品組合物、保健食品組合物、或化妝品組合物。

在一些實施例中，該組合物係用於製備一抑制皮膚痤瘡形成之組合物的用途。

在一些實施例中，該山葵葉萃取物係以一含水之溶劑萃取一山葵葉所獲得。

在一些實施例中，該山葵葉萃取物係透過降低AGE之形成以達到該減緩皮膚老化。

在一些實施例中，該山葵葉萃取物係透過調控抗發炎相關基因表現量達到該抑制皮膚痤瘡形成。

在一些實施例中，該山葵葉萃取物之濃度至少為0.5mg/mL。

在一些實施例中，該山葵萃取物可降低透過皮膚散失之水量、提升肌膚含水量、提升肌膚彈性增加、提升肌膚緊實度、淡化肌膚斑點、淡化肌膚紫外線斑點、改善肌膚紋理、改善肌膚毛孔狀態、淡化肌膚皺紋、減少肌膚原生紫質、或前述之任一組合。

如先前所述，血液內多餘的糖分會與蛋白質結合，形成AGE。AGE的不斷累積會導致發炎反應，進而產生自由基，攻擊肌膚，造成皮膚相關蛋白硬化、纖維斷裂，使得肌膚失去彈性，暗沉發黃、皺紋、粗糙並嚴重下垂而加速皮膚老化。

同時，當皮膚上之油脂與老廢細胞堆積時，細菌會滋生，造成皮膚輕微發炎。而隨著時間推移若不處理，皮膚之毛囊壁會受損，造成嚴重發炎，形成痤瘡，或俗稱之「青春痘」。在發炎反應中很重要的一環為前發炎細胞激素，若能減緩其分泌量，便能減緩發炎反應，達到抗痘之效果。

另一方面，紫外線與藍光亦會誘發肌膚中的黑色素細胞產生黑色素，使得肌膚產生斑點及/或整體較為暗沈、蠟黃，此亦為肌膚老化的常見現象之一。

而由於本案證實山葵葉萃取物可抑制AGE的形成、抑制前發炎細胞激素，特別是透過調控IL-8基因表現量抑制該前發炎細胞激素以及抑制黑色素生成，故本案之山葵葉萃取物可有效延緩皮膚老化以及抑制皮膚痤瘡之形成，亦可達到美白及對抗多種肌膚老化之現象。

以下將描述本案的部分具體實施態樣。在不背離本案精神下，本案尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將保護範圍限於說明書所具體陳述的條件。

本案使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差（SD）表示，各組之間的差異以學生t 檢驗（student'st -test）進行分析。

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在正負10%的範圍內，最佳為在正負5%的範圍內。

本案所稱之山葵，其學名為Wasabia japonica ，又稱為「山嵛菜」，是一種屬於十字花科山萮菜屬的植物。

在一些實施例中，山葵葉萃取物可用於減緩皮膚老化、抑制皮膚痤瘡形成、增加肌膚含水量、改善肌膚緊緻度、減少肌膚皺紋、抑止肌膚皺紋生成、抑制皮膚斑點生成、抑制皮膚黑色素生成。因此，山葵葉萃取物可用於製備減緩皮膚老化、抑制皮膚痤瘡形成、增加肌膚含水量、改善肌膚緊緻度、減少肌膚皺紋、抑止肌膚皺紋生成、抑制皮膚斑點生成、抑制皮膚黑色素生成的組合物。

在一些實施例中，山葵葉萃取物可透過降低AGE之形成、調控抗發炎相關基因表現量、調控IL-8基因表現量、調控MTF基因表現量、抑制酪胺酸酶的形成。

在一些實施例中，前述的組合物可為醫藥組合物、保養品組合物、食品組合物、保健食品組合物。

醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於經腸道地（enterally）、非經腸道地（parenterally）或局部地（topically）投藥的劑型。例如可為：注射品（injection）[例如，無菌的水性溶液（sterile aqueous solution）或分散液（dispersion）]、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation）或其他類似物。

醫藥組合物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。例如，醫藥上可接受的載劑可包含下列一種或多種載劑：乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。有關這些載劑的選用與數量是熟習此項技術人員可視情況進行選擇的。

在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可包含下列一種溶劑：水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝生理鹽水（phosphate buffered saline，PBS）、含有醇的水性溶液（aqueous solution containing alcohol）以及其他任何合適的溶劑。

在一些實施例中，該醫藥組合物可由下列所述的任一種非經腸道途徑（parenteral routes）來投藥：皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）以及病灶內注射（intralesional injection）。

在一些實施例中，醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑（external preparation）。舉例而言，其可為下列所述的任一種，但不限於此：乳劑（emulsion）、凝膠（gel）、軟膏（ointment）、乳霜（cream）、貼片（patch）、擦劑（liniment）、粉末（powder）、氣溶膠（aerosol）、噴霧（spray）、乳液（lotion）、乳漿（serum）、糊劑（paste）、泡沫（foam）、滴劑（drop）、懸浮液（suspension）、油膏（salve）以及繃帶（bandage）。

在一些實施例中，外部製劑是藉由將醫藥組合物與一為熟習此項技藝者所詳知的基底（base）相混合而製成。

在一些實施例中，該基底可包含下列一種或多種的添加劑（additives）：水、醇（alcohols）、甘醇（glycol）、碳氫化合物（hydrocarbons）[諸如石油膠（petroleum, jelly）以及白凡士林（white petrolatum,）]、蠟（wax）[諸如石蠟（paraffin）以及黃蠟（yellow wax）]、保存劑（preserving agents）、抗氧化劑（antioxidants）、界面活性劑（surfactants）、吸收增強劑（absorption enhancers）、安定劑（stabilizing agents）、膠凝劑（gelling agents）[諸如卡波普®974P （carbopol®974P）、微結晶纖維素（microcrystalline cellulose）以及羧基甲基纖維素（carboxymethylcellulose）]、活性劑（active agents）、保濕劑（humectants）、氣味吸收劑（odor absorbers）、香料（fragrances）、pH調整劑（pH adjusting agents）、螯合劑（chelating agents）、乳化劑（emulsifiers）、閉塞劑（occlusive agents）、軟化劑（emollients）、增稠劑（thickeners）、助溶劑（solubilizing agents）、滲透增強劑（penetration enhancers）、抗刺激劑（anti-irritants）、著色劑（colorants）以及推進劑（propellants）等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

在一些實施例中，保養品中可包含有一被廣泛地使用於保養品製造技術之可接受的佐劑（acceptable adjuvant）。例如，該可接受的佐劑可包含下列一種或多種佐劑：溶劑、膠凝劑、活性劑、防腐劑、抗氧化劑、遮蔽劑（screening agent）、螯合劑、界面活性劑、染色試劑（coloring agent）、增稠劑（thickening agent）、填料（filler）、香料以及氣味吸收劑。可根據實際需求對這些試劑的選用與數量進行合適的調整。

在一些實施例中，保養品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚（skincare）或化妝（makeup）的形式，其可為下列中的任一種，但不限於此：水性溶液（aqueous solution）、水-醇溶液（aqueous-alcohol solution）或油性溶液（oily solution）、呈水包油型（oil-in-water type）、油包水型（water-in-oil type）或複合型之乳劑、凝膠、軟膏、乳霜、面膜（mask）、貼片、貼布（pack）、擦劑、粉末、氣溶膠、噴霧、乳液、乳漿、糊劑、泡沫、分散液、滴劑、慕斯（mousse）、防曬油（sunblock）、化妝水（tonic water）、粉底（foundation）、卸妝產品（makeup remover products）、肥皂（soap）以及其他身體清潔產品（body cleansing products）等。

在一些實施例中，保養品亦可與下列中之已知活性的外用劑（external use agents）的一種或多種一起合併使用：美白劑（whitening agents）[諸如維生素A酸（tretinoin）、兒茶素（catechin）、麴酸、熊果苷以及維生素C]、保濕劑、殺菌劑（bactericides）、紫外線吸收劑（ultraviolet absorbers）、植物萃取物（plant extracts）[諸如蘆薈萃取物（aloe extract）]、皮膚營養劑（skin nutrients）、麻醉劑（anesthetics）、抗痘劑（anti-acne agents）、止癢劑（antipruritics）、止痛劑（analgesics）、抗皮膚炎劑（antidermatitis agents）、抗過角化劑（antihyperkeratolytic agents）、抗乾皮膚劑（anti-dry skin agents）、抗汗劑（antipsoriatic agents）、抗老化劑（antiaging agents）、抗皺劑（antiwrinkle agents）、抗皮脂溢出劑（antiseborrheic agents）、傷口治療劑（wound-healing agents）、皮質類固醇（corticosteroids）以及激素（hormones）。有關這些外用劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

在一些實施例中，醫藥組合物可被當作食品添加物（food additive），藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。

在一些實施例中，食品的種類可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）、健康食品（health foods）以及膳食補充品（dietary supplements）。

在一些實施例中，「山葵葉萃取物」可為山葵的葉經一溶劑萃取而得，該溶劑可為水或含水之溶液。在一些實施例中，該萃取係於70°C ~100°C進行，萃取時間為30分鐘。在一些實施例中，「山葵葉萃取物」係山葵的葉子經適當溶劑萃取後，再擠壓並去除葉渣與較細小的懸浮物後，再將其濃縮至一定濃度而得。

在一些實施例中，「山葵葉萃取物」亦可由山葵之葉子直接經碾碎、擠壓並去除葉渣與較細小的懸浮物後，再將其濃縮至一定濃度而得。

下列範例中的實驗步驟若無特別敘明，即在室溫（25±5°C）、常壓（1atm）下進行。

[例1]山葵葉萃取物之製備

將山葵（產地：台灣阿里山及成都大邑縣）的葉經粉碎（Osterizer 品牌的10 speed blender）並以10目數（mesh）的篩網將其過篩，去除過大顆粒後取得山葵葉粉。在另一些實施例中，篩網的目數可為8目或12目。

接著，加熱程序中，以水為溶劑與山葵葉粉以15:1的重量比混合，並於85 ±5°C下萃取約30分鐘以形成含有固體的第一萃取液。

在另一些實施例中，溶劑與山葵葉的重量比亦可為10:1~20:1，浸泡時的溫度可為70°C-100°C，萃取時間可為15-45分鐘。若溶劑過少或萃取時間過短，則萃取效率將會明顯下降；若萃取時間過長，則萃取物中的有效成分可能會產生降解。

將前述第一萃取液以濃縮機（廠牌/型號：BUCHI -Rotavapor R-100），在60°C±5°C下進行減壓濃縮至溶液的白利糖度值（Degrees Brix）為8±0.5時停止濃縮，得到本案之山葵葉萃取物。在另一些實施例中，可於45°C-70°C下進行減壓濃縮。

[例2] 山葵葉萃取物抑制膠原蛋白醣化量檢測

當蛋白質經醣化反應後將生成多種醣化終產物（Advanced glycation end products，AGEs），其為不可還原之物質，並能改變及影響蛋白質的正常功能，進而加速皮膚老化。因此，若能抑止膠原蛋白醣化則可有效地降低膠原蛋白的流失速度，達到延緩皮膚老化之功效。而為確認山葵葉萃取物是否具有抑止膠原蛋白醣化的功效，進行膠原蛋白醣化量測試如下。

藥品配製：

使用前方例1中所製得山葵葉萃取物，以濃度200 mM的磷酸鹽緩衝生理鹽水（Phosphate-Buffered Saline，PBS，係以NaH₂ PO₃ （Honeywell，#04269）、Na₂ HPO₄ （Sigma，#V900061）與水配製而成，其pH值為7.4）作為溶劑，配製出濃度0.4 mg/mL的山葵葉萃取溶液。

使用前述濃度200 mM的磷酸鹽緩衝生理鹽水以及膠原蛋白粉末（膠原蛋白購自Rousselot，型號#P2000HD），配製濃度為60 mg/mL的膠原蛋白溶液。另加入疊氮化鈉於膠原蛋白溶液中，使膠原蛋白溶液中含有0.06wt％的疊氮化鈉。（疊氮化鈉購自Sigma，#S2002）

使用前述濃度200 mM的磷酸鹽緩衝生理鹽水與果糖（果糖購自Sigma，#F0127），配製濃度為1.5M的果糖溶液。

膠原蛋白醣化測試：

將前述山葵葉萃取溶液0.2 mL，分別與0.2 mL前述膠原蛋白溶液以及0.2 mL前述果糖溶液進行混合，配製出樣品溶液。

將0.2 mL的去離子水與0.2 mL前述膠原蛋白溶液以及0.2 mL前述果糖溶液進行混合，配製出空白溶液作為控制組。

將樣品溶液以及空白溶液於進行膠原蛋白醣化反應前，使用分光螢光計（spectrofluorometer，廠商/型號：BioTek FLx 800）測量其螢光強度（激發波長360 nm，放射波長460 nm）。

將樣品溶液以及空白溶液置於50℃反應24小時，使溶液進行膠原蛋白醣化反應。

將反應後的樣品溶液以及空白溶液，同樣以分光螢光計測量其螢光強度（激發波長360 nm，放射波長460 nm）。

依下列公式計算蛋白質醣化終產物相對生成率： [（樣品螢光強度_反應後 - 樣品螢光強度_反應前）/（控制組螢光強度_反應後 - 控制組螢光強度_反應前）]×100%

樣品相對於控制組的蛋白質醣化終產物相對生成率顯示於圖1。而如圖1所示，山葵葉萃取物具有抑止膠原蛋白的醣化終產物產生的效果。具體而言，蛋白質醣化終產物相對生成率僅為控制組的41%。顯示山葵葉萃取物確實可抑止膠原蛋白的醣化反應，減少醣化終產物的生成，進而降低體內膠原蛋白的流失，達到減緩肌膚老化的功效。

例3]細胞實驗-山葵葉萃取物調控IL-8基因表現量

於此，培養基採用VIVOTM 10 Serum-free hematopoietic cell medium （購自Lonza，瑞士，編號BE02-055Q）。首先，將人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial Cells，HUVEC)(由生物資源保存及研究中心獲得，BRBC編號H-UV001)進行血管內皮細胞IL-8基因表現量之實驗。首先以每孔1×10⁵ 個細胞量培養於含有2mL上述培養液之六孔培養盤中，並在37°C下培養16小時，然後將HUVEC細胞分為以下二組：實驗組與控制組。

實驗組：依照每毫升培養液含有1毫克由實施例1之方式製備而成之山葵葉萃取物的比例（即，濃度為1 mg/ml）製得含萃取物的培養液，將HUVEC細胞更換為含萃取物的培養液中繼續培養。

控制組：不作任何處理，即不額外添加其他化合物至含有培養後的HUVEC細胞的培養液中。

實驗組與控制組於培養48小時後，將培養後的實驗組及控制組細胞以細胞裂解液分別破細胞膜以形成二組的細胞溶液。

接著，使用RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，Lot No.FC24015-G）分別收集二組細胞溶液內之RNA。接著，每組取2000奈克（ng）所萃取出的RNA為模板，藉由SuperScript^® III反轉錄酶（購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051）以表一中之引子黏合進行反轉錄作用產生相應之cDNA。後續利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system （Thermo Fisher Scientific公司，美國），以及KAPA SYBR FAST （購自Sigma公司，美國，編號38220000000）將二組反轉錄後產物分別以表一之組合引子進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction）以觀察實驗組和控制組的HUVEC細胞的基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應1 秒，60°C反應20秒，總共40個迴圈，並使用2-ΔCt方法進行基因定量。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量各基因的mRNA表現量，進而推斷各基因編碼的蛋白質的表現量。

表一

引子名稱	序列編號	序列	長度
IL-8-F	SEQ ID NO:1	TTTTGCCAAGGAGTGCTAAAGA	22
IL-8-R	SEQ ID NO:2	AACCCTCTGCACCCAGTTTTC	21

下文述及之圖式中顯示的各基因的相對基因表現係以相對倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗（Student t-test）分析是否具有統計上的顯著差異。圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。

如圖2，當控制組的IL-8基因的表現量被視為1（即100%）時，實驗組相對於控制組的IL-8基因的表現量為0.258（即25.8%），代表實驗組的IL-8基因的表現量為控制組的0.258倍。

由此可知，當HUVEC細胞經山葵葉萃取物處理後，HUVEC細胞內IL-8基因的基因表現量降低，代表細胞內的發炎反應能有效被抑制，因而能有效地抑制痤瘡的形成，達到抗痘的效果。

[例4] 細胞實驗-山葵葉萃取物在抗皮膚發炎上的效用評估

已知介白素-8（interleukin-8，IL-8）為一種細胞激素，具有促進發炎反應之功能。當發炎反應產生時，發炎組織會釋放出該細胞激素以吸引特定功能的細胞至發炎部位。同時，發炎反應產生時，該部位會產生紅腫，甚至是疼痛現象。因此，若能抑制介白素-8之分泌量，便能緩和發炎反應，進而達到抑制皮膚痤瘡之效果。

於此，以人類CXCL8/IL8之ELISA分析套組、紫外線照射室配合酵素免疫分析儀（ELISA reader），測定人類初代皮膚角質細胞HPEK-50經山葵葉萃取物處理後，其細胞中抗發炎因子的變化。

材料與儀器 1. 細胞株：人類初代皮膚角質細胞（Human primary epidermal keratinocytes）HPEKp（CELLnTEC公司（瑞士），HPEK-50）。 2. 培養基：無血清之角質細胞培養液（keratinocyte-SFM）（Gibco公司，美國，編號為#10724-011）。 3. 紫外線照射室（Vilber公司，產品編號BLX254）。 4. 人類CXCL8/IL8之ELISA分析套組：購自R&D systems，型號 D8000CD8000C，此套組中包含以下試劑： (1) 捕獲抗體（capture antibody） (2) 偵測抗體（detection antibody） (3) 鏈黴親和素-HRP（Streptavidin-HRP） (4) 清洗溶液（Washing buffer）：為磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液） (5) 受質溶液（四甲基聯苯胺 tetramethyl-benzidine,TMB） (6) 終止溶液（stop solution） 5. 酵素免疫分析儀（ELISA reader），購自BioTek公司。 6. substrate solution （R&D systems）。 7. H₂ SO₄ ，購自Sigma-Aldrich公司。 8. 細胞培養箱，購自Astec公司。 9. 振盪器（shaker），購自GenePure公司。 10. 山葵葉萃取物：此實驗中所使用的山葵葉萃取物是透過如上實施例1之置被方式所獲得。

實驗步驟

實驗將會分為1個對照組、1個UVB照射組、1個實驗組共三組進行，各組分別進行三重複試驗： 1. 將人類初代皮膚角質細胞以每孔5×10⁴ 個的方式，接種於每孔培養於每孔含0.5ml培養基之24孔培養盤中。 2. 將培養盤置於細胞培養箱，於37℃下培養24小時後，移除培養基。 3. 使用紫外線照射室，以300mJ/cm² 的強度對UVB照射組、實驗組，誘發發炎反應，並同時將1 mg/mL 山葵葉萃取物樣品添加至實驗組的細胞中，至於對照組的細胞則不做任何處理（不照UVB，亦不添加山葵葉萃取物）。前述之「山葵葉萃取物樣品」係將以例1之方式所製備之山葵葉萃取物以培養基稀釋，配製成每毫升含1毫克之山葵葉萃取物的溶液。 4. 各組細胞在37℃下培養24小時後，吸取120μL的細胞培養上清液做為樣品，使用人類CXCL8/IL8之ELISA分析套組對此些樣品中IL8進行分析。 5. 首先，以PBS稀釋捕獲抗體（capture antibody），將經稀釋的捕獲抗體以每孔100μL的量塗佈至96孔微盤底部，並於4℃作用過夜。 6. 接著，以200μL的清洗緩衝液（含0.05%吐溫20（Tween 20），製備於PBS）清洗96孔微盤3次。 7. 以300μL的阻斷緩衝液（Block buffer）（1% BSA製備於PBS）進行阻斷，接著於37℃下作用3小時。 8. 之後，以200μL的清洗緩衝液清洗96孔微盤3次。 9. 添加100μL的樣品及標準品（配置於稀釋液（0.1% BSA配於PBS）），接而於37℃下與捕捉抗體進行結合2小時。 10. 接著，以200μL的清洗緩衝液清洗96孔微盤3次。 11. 然後添加100μL的偵測抗體（detection antibody），接而於37℃下偵測捕捉抗體2小時。 12. 之後，以200μL的清洗緩衝液清洗96孔微盤3次。 13. 添加100μL的鏈黴親和素-HRP（Streptavidin-HRP），接而於室溫下作用20分鐘。 14. 之後，以200μL的清洗緩衝液清洗96孔微盤3次。 15. 然後添加100μL的受質溶液（substrate solution）（R&D systems），於室溫下作用20分鐘。 16. 接著，添加50μL的終止溶液（stop solution）來中止反應，最後以酵素免疫分析儀測量其450nm之吸光值。再以Excel軟體進行統計分析。

各組之間的統計學顯著差異是藉由史徒登氏t-試驗（Student’s t-test）來決定。本實施例的結果顯示於圖3。

圖3是本發明山葵葉萃取物在抗皮膚發炎上的功效之數據圖。由圖3可見，與對照組相較之下，UVB組的IL-8產生量有顯著的提升，這表示UVB會對人類初代皮膚角質細胞產生發炎反應。而與UVB組相較之下，實驗組的IL-8產生量降低14.3%。本實施例的結果顯示，本發明山葵葉萃取物具有抗皮膚發炎的功效，進而達到抑制皮膚痤瘡之形成，以及抗痘之效果。

[例5]細胞實驗-山葵葉萃取物降低黑色素生成

於此，以ELISA讀盤機（enzyme-linked immunosorbent assay reader）測定黑色素瘤細胞株B16F10經山葵葉萃取物處理後，其黑色素含量的變化。

材料與儀器 1. 細胞株：小鼠黑色素瘤細胞株B16F10（ATCC CRL-6475），購自美國典型培養物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC）。 2. 培養基：將Dulbecco's modified minimal essential medium（DMEM，購自Gibco）添加額外成分使其含有1 vol%的抗生素溶液（Antibiotic Antimycotic Solution，購自Gibco，15240-062）、10 vol%的FBS（fetal bovine Serum，購自Gibco，10437-028）。 3. 磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號10437-028。 4. 以二次蒸餾水配製1N NaOH（購自Sigma，產品編號221465）溶液。 5. ELISA reader（BioTek，FLx 800）。 6. 山葵葉萃取物：以實施例1之製備方式而得。

實驗步驟

實驗將會分為實驗組、空白控制組（未添加山葵葉萃取物、二組進行，各組分別進行三重複試驗： 1. 將B16F10細胞以每孔1.5×10⁵ 個的方式，接種於每孔含2ml培養基之6孔培養盤中。 2. 將培養盤置於5％CO₂ 、37℃環境下，培養24小時。 3. 而後，在不干擾附著細胞的情況下，移除每孔之培養基。 4. 實驗組：於每孔中加入山葵葉萃取物樣品0.0225mL後，於37℃下培養48小時。其中，山葵葉萃取物樣品係將以例1之方式所製備之山葵葉萃取物以培養基稀釋配製成每毫升含1毫克之山葵葉萃取液的溶液。空白控制組：在37℃下，添加2 ml的培養基至每孔中，使其於37℃下培養48小時。對照組：在37℃下，添加2 ml的培養基至每孔中，使其於37℃下培養48小時。 5. 而後，移除培養基，並以PBS溶液清洗細胞2次。 6. 將200μl胰蛋白酶（Trypsin-EDTA (10X)，購自Gibco；產品編號15400-054）加至每孔中反應3分鐘。反應後，添加6 mL培養基溶液終止反應。而後收集各孔中之懸浮細胞與培養基至對應的15ml離心試管內，將各離心試管以400 xg離心5分鐘使細胞沉澱。 7. 以PBS溶液清洗沉澱細胞二次後，再以200μL PBS溶液重新懸浮細胞。 8. 將細胞懸浮液以液態氮冷凍10分鐘，再置於室溫約30分鐘至完全解凍。 9. 完全解凍後，將試管以12,000g離心3分鐘。 10. 移除上清液，再以120μL 1N氫氧化鈉溶液重新懸浮細胞沉澱後，使試管於60℃乾浴1小時，以獲得待檢測樣本。 11. 將100μL待檢測樣本移入一96孔盤，使用ELISA讀盤機測量細胞溶液在450nm的光密度值（optical density，OD₄₅₀ ），作為吸光度。

實驗結果

實驗組、空白控制組、以及對照組的黑色素相對表現量係依下列公式計算：黑色素相對表現量（%）=（各組OD₄₅₀ 值/空白控制組OD₄₅₀ 值）×100%。因實驗係進行三重複，故將三重複實驗之結果平均後，顯示於圖4。

如圖4所示，由空白控制組、對照組的結果可知，在經過藍光照射後，細胞中的黑色素表現量將明顯增加，顯示藍光照射確實會促使黑色素瘤細胞產生黑色素，而這將使得肌膚產生斑點、或使肌膚整體較為暗沈。而另一方面，根據對照組以及實驗組的結果可知，當細胞經過山葵葉萃取物處理後，其在藍光下的黑色素表現量將低於未經過山葵葉萃取物處理的對照組（降低約21％），顯示山葵葉萃取物可有效減少黑色素細胞因藍光所生成之黑色素。

[例6]細胞實驗-山葵葉萃取物抑制酪胺酸之形成

準備一6孔盤，於每一孔中種入2ml含B16F10細胞(ATCC:CRL: 6475)的培養液 [Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)、1%青黴素-鏈黴素(Penicillin-streptomycin，Gibco)、10%胎牛血清(Gibco)]，使每孔具有 1.5 x 10⁵ 個細胞，於37°C下，培養24小時。

之後，小心移除培養液而不要干擾到貼附之細胞。再於對照組（其中三孔）加入2ml的新鮮DMEM培養液，並於實驗組（另外三孔）加入2 ml濃度為1 mg/ml之山葵葉萃取液物樣品，反應48小時。前述之「山葵葉萃取物樣品」係將以例1之方式所製備之山葵葉萃取物以培養基與前述的稀釋山葵葉萃取液，配製成每毫升含1毫克之稀釋山葵葉萃取液的溶液。

接著，將培養液移除後，以1x PBS (Gibco)清洗兩次。再加入胰蛋白酶-EDTA對細胞作用3分鐘，回收懸浮的細胞於15 ml離心管，以400 xg離心5分鐘使細胞沉澱。

而後，再將沉澱細胞以1x PBS清洗兩次後，以200 μl細胞裂解液讓細胞懸浮，震盪混合後以12,000 xg離心20分鐘。

將上清液後取出至1.5 ml離心管中，進行蛋白質濃度的檢測：A. 將Bio-rad染劑與去離子水混合(體積比為1:4)，分裝500 μl至微量離心管中；B. 分別於前述微量離心管中，加入10、8、6、4、2、1與0 μl 2mg/ml的BSA以製備標準濃度蛋白質；C.加入2 μl測試樣本進行檢測。取出前述反應後之測試樣本200 μl於96孔盤中，以ELISA讀取儀(BioTek)測定595 nm的吸光值。

之後於每孔中加入400 μg蛋白質，再加入90 μl細胞裂解液，包括控制組。在避光環境下，在37°C下加入10 ul 10M的 L-Dopa，每10分鐘觀察一次，直到懸浮液變黑。之後再測定405 nm的吸光值。

酪胺酸酶含量的分析公式為：酪胺酸酶抑制性（%）=（樣本吸光值/控制組吸光值）×100%。所得數值再以微軟EXCEL軟體，利用Student t檢定進行統計分析，其結果如圖5所示。

由圖5之結果可知，在含有本發明實施例之山葵葉萃取物的情況下，酪胺酸酶活性降低約24%。因此，藉由本發明實施例之山葵葉萃取物，確實可降低酪胺酸酶活性，進而可減少黑色素的生成，因而可應用於減少皮膚黑斑，使皮膚白淨的相關組合物的成分中。

[例7]人體實驗-以內服方式使用山葵葉萃取物

使用樣品：含本發明之山葵葉萃取物之飲品50g/瓶（以水以及山葵葉萃取物所配製成每50g的飲品中含有3g的山葵葉萃取，即佔6wt%）。在另一些其他的實施例中，每人一日可攝取山葵葉萃取物至多5g。其中，此山葵葉萃取物係由實施例1之方法所製備而成。其白利糖度值（Degrees Brix）為8。

受試者人數：10位25-40歲之受試者。

實驗方式：受試者每日飲用一瓶含本發明之山葵葉萃取物之飲品（每瓶含有3g山葵葉萃取），共飲用56日（即8週）。並於開始飲用前（臉部已清潔，第0週）以及飲用56日後，依據不同檢測項目，使用對應的儀器及測量方式，紀錄臉部肌膚之數值、並拍攝飲用前、後的照片。（於飲用前、後進行檢測時，受試者所在的測試區域的溫度與濕度為一致，以減少外界的溫濕度等因素會對皮膚所造成的影響）。

檢測項目：將分別對肌膚進行1.經皮水分散失率、2.肌膚含水量、3.肌膚彈性、4.肌膚緊實度、5.肌膚斑點、6.肌膚紫外線色斑、7.肌膚紋理、8.肌膚毛孔、9.肌膚皺紋、10.原生紫質（痤瘡桿菌分泌物）。

1.經皮水分散失率

使用購自德國Courage+Khazaka electronic公司之肌膚水分散失檢測探頭Tewameter® TM 300 (C+K Multi Probe Adapter System, Germany)進行檢測。該檢測探頭係使用兩端開放的圓柱形腔體在皮膚表面形成相對穩定的測試環境，通過測定不同兩點的水蒸氣壓梯度，計算出經表皮蒸發的水分量，以此來衡量皮膚表面水分流失情況。

2.肌膚含水量

使用購自德國Courage+Khazaka electronic公司之肌膚含水量檢測探頭Corneometer^® CM825 (C+K Multi Probe Adapter System, Germany) 進行檢測。該檢測探頭係基於電容的原理進行測量。當水分含量發生變化時，皮膚的電容值亦發生變化，故可通過測定皮膚電容值，分析皮膚表面的含水量。

3. 肌膚彈性（Elasticity）及4.緊實度（Firmness）

使用購自德國Courage+Khazaka electronic公司之肌膚彈力檢測探頭Cutometer® MPA580 (C+K Multi Probe Adapter System, Germany)進行檢測。測試原理是基於吸力和拉伸原理，在被測試的皮膚表面產生一個負壓將皮膚吸進一個測試探頭內，透過光學測試系統檢測皮膚被吸進探頭內的深度，並以軟體分析計算皮膚彈性與緊實度。

5.肌膚斑點

使用美國Canfield所販售之VISIA高階數位膚質檢測儀進行檢測，透過可見光拍攝高解析度之肌膚圖像，比對飲用前、飲用後的面部肌膚，並以內建軟體根據肉眼可見的色素斑點數量與面積進行分析。測量數值越高，說明可見斑點越多。

6.肌膚紫外線色斑

同樣使用美國Canfield所販售之VISIA高階數位膚質檢測儀進行檢測，其係以UV光進行臉部肌膚拍攝。紫外線可被黑色素吸收，提高色素斑的顯現度，偵測肉眼不可見的表皮層黑色素斑。測量數值越高，說明紫外線色斑越多。

7.肌膚紋理

肌膚紋理亦係使用美國Canfield所販售之VISIA高階數位膚質檢測儀進行檢測，其原理乃以可見光拍攝高解析度之肌膚影像，並以內建軟體根據皮膚的凹陷與凸起進行粗糙度分析。測量數值越高，說明皮膚越越粗糙。

8.肌膚毛孔狀態

使用美國Canfield所販售之VISIA高階數位膚質檢測儀進行檢測，透過高解析度之相機鏡頭對飲用前、飲用後的面部肌膚進行拍攝。藉由標準白光照射，造成毛孔凹陷處產生陰影，毛孔會比周圍的膚色更黑，故可以此偵測毛孔，然後利用軟體根據毛孔數目、面積分析得到一數值，而數值越高則顯示其毛孔數量、面積較多。

9. 肌膚皺紋

使用美國Canfield所販售之VISIA高階數位膚質檢測儀進行檢測，透過高解析度之相機鏡頭對飲用前、飲用後的面部肌膚進行拍攝，藉由標準白光照射、偵測皮膚陰影的變化，即可偵測紋理位置並得到一數值，可代表皮膚的平滑程度。

10.原生紫質（痤瘡桿菌分泌物）

痤瘡桿菌在生長時會分泌紫質，紫質在紫外線照射中會產生螢光反應，因此可使用美國Canfield所販售之VISIA高階數位膚質檢測儀進行檢測。該儀器以UV光進行臉部肌膚拍攝，偵測皮膚紫質含量。測量數值越高，說明痤瘡桿菌生長旺盛，易產生痤瘡。

請參閱圖6。該圖係受試者在飲用含本案山葵葉萃取之飲品8周後之皮膚狀態之平均改善百分比，而改善比例佔總受試人數之100%。其中，經皮水分散失率改善12.9%、肌膚含水量增加12.6%、肌膚彈性增加5.1%、肌膚緊實度增加7.4%、肌膚斑點改善14%、肌膚紫外線斑改善16%、肌膚紋理改善20%、肌膚毛孔狀態改善13%、肌膚皺紋改善10%、肌膚原生紫質（痤瘡桿菌分泌物）改善16%。由此可見，本發明之山葵葉萃取物據具淡斑、保濕及改善皮膚細緻度之功效，且可幫助抑制痤瘡之生成。

綜合前述，本案除證實山葵葉萃取物可抑制醣化終產物之生成，有效延緩皮膚老化之外，亦可透過抑制IL-8基因之表現量及IL-8之分泌量達到抗發炎以及抑制痤瘡生成之效果。因此，本發明之山葵葉萃取物具抗醣化與抗痘之效果。同時，本案亦證實山葵葉萃取物可抑制酪胺酸脢，進而達到美白及抑制黑色素形成之功效。在人體試驗方面，本案證實了山葵葉萃取物能有效改善眾多皮膚老化之狀態，如降低透過皮膚散失之水量、提升肌膚含水量、提升肌膚彈性增加、提升肌膚緊實度、淡化肌膚斑點、淡化肌膚紫外線斑點、改善肌膚紋理、改善肌膚毛孔狀態、淡化肌膚皺紋及減少肌膚原生紫質。

無

圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。圖1係空白控制組及實驗組的醣化終產物相對生成量比例之結果比較圖。圖2係空白控制組及實驗組的IL-8基因相對表現量比例之結果比較圖。圖3係空白控制組、紫外線-B（Ultra Violet-B，UVB）對照組及實驗組之IL-8相對分泌量比例之結果比較圖。圖4係空白控制組、對照組及實驗組之黑色素相對含量比例之結果比較圖。圖5係空白控制組及實驗組之酪胺酸相對抑制性之結果比較圖。圖6係受試者在飲用含本發明之山葵葉萃取物之飲品前後，肌膚狀態（經皮水分散失率、肌膚保濕度、肌膚彈性、肌膚緊實度、斑點、紫外線色斑、肌膚紋理、肌膚毛孔、肌膚皺紋、原生紫質（痤瘡桿菌分泌物））改善比例之比較圖。

Claims

一種山葵葉（Wasabia japonica ）萃取物用於減緩皮膚老化之用途，其中該山葵葉萃取物係以一含水之溶劑萃取一山葵葉所獲得。
如請求項1所述之用途，其中該山葵葉萃取物係透過降低醣化終產物（Advanced Glycation End-Product）之形成以達到該減緩皮膚老化。
一種山葵葉（Wasabia japonica ）萃取物用於製備一抑制皮膚痤瘡形成之組合物的用途，且其中該山葵葉萃取物係以一含水之溶劑萃取一山葵葉所獲得。
如請求項3所述之用途，其中該山葵葉萃取物係透過調控抗發炎相關基因表現量達到該抑制皮膚痤瘡形成。
如請求項4所述之用途，其中該抗發炎基因為介白素-8（IL-8）基因。
一種山葵葉（Wasabia japonica ）萃取物用於製備一改善皮膚狀態之組合物的用途，其中該山葵葉萃取物係以一含水之溶劑萃取一山葵葉所獲得，且其中該改善皮膚狀態為降低透過皮膚散失之水量、提升肌膚含水量、提升肌膚彈性增加、提升肌膚緊實度、淡化肌膚斑點、淡化肌膚紫外線斑點、改善肌膚紋理、改善肌膚毛孔狀態、淡化肌膚皺紋、減少肌膚原生紫質、預防皮膚黑色素生成、抑制皮膚黑色素生成或其組合。
3或6中任一項所述的用途，其中該山葵葉萃取物之白利糖度值（Degrees Brix）為7.5~8.5。
3或6中任一項所述的用途，其中該組合物係進一步製備成保養品組合物、保健食品組合物、或化妝品組合物。
3或6中任一項所述的用途，其中該含水之溶劑與該山葵葉之液固比為10:1~20:1。
3或6中任一項所述的用途，其中該萃取係於70°C ~100°C進行。