JP6635498B2 - 保湿剤の製造方法及び整肌剤の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明のワサビの抽出物について、発明者はまず、抗酸化活性、抗菌活性、メラニン生合成阻害活性、リパーゼ阻害活性、抗アレルギー、抗炎症の各機能性などの、肌の状態を整える機能の有無を調べるため、葉ワサビの葉、茎、根の部位をそれぞれ比較し、評価した。
以下に行う試験に共通して用いられる試料は、以下のようにして得た。
葉ワサビを葉、茎、根に分け、マイナス20度で冷凍した後、凍結乾燥機にてフリーズドライになるまで凍結乾燥を行った。
具体的には、上記の振とう抽出後、吸引濾過にて抽出液を回収した。そして、ロータリーエバポレータにて抽出液を濃縮し、溶媒除去を行った。その後、溶媒除去した濃縮液をマイナス80℃のディープフリーザにて冷凍後、凍結乾燥機で乾固し、試料を得た。
体内に取り入れられた酸素の一部は、活性酸素となることはすでに知られている。この活性酸素が過剰に生成されると、フリーラジカルとなり、細胞機能を攻撃し、慢性疾患や疫病が発生する。
ORAC法を用いて、蛍光強度を図ることで抗酸化活性を測定した。
ORAC法は、フルオレセインの、485nmの波長を当てられて励起すると、520nm付近の波長の光を発するという性質を利用して行う測定法である。
試料を秤量し、濃度が(1mg/1mL)になるよう、リン酸緩衝液に溶解し、これを原液として、希釈した。
各部位の、抗酸化活性試験を行った結果を、図1に示す。図1は、抽出物 1mg中の相対ORAC値(平均±SD)(n=4)を表す。
図1において、もっとも高い、相対ORAC値を示したのが、葉部分の「0.041±0.0022(mgTE/mg)」であった。
抗菌活性は、皮膚表面の常在菌である、アレルギーの原因となる菌の増殖を防ぐ性質を有する。本試験では、大腸菌(E.coli)、及び黄色ブドウ球菌(S.aureus)の増殖に与える影響から、各部位の抗菌活性を評価した。
各部位の抽出物を、DMSO(dimethylsulfoxide ジメチルスルホキシド)に溶解させ、80mg/mLの濃度に調整した。また、抽出物を含まないDMSOをネガティブコントロールとして、ソルビン酸をポジティブコントロールとして用いた。
黄色ブドウ球菌による濁度を、各部位ごとの試料を用いて測定した結果を図2示すように、葉部分の試料が、最も濁度が低いという結果が出た。なお、図2の( )内は最終濃度(μg/mL)を表し、コントロールと各抽出物間の有意差はt検定により判定した。( :*P<0.05 **P<0.01)
皮膚に紫外線を浴びると、皮膚の基底層にあるメラノサイトからメラニンが作られ、シミの原因となる。メラニンは、メラノーマ細胞で作られるため、メラノーマ細胞のメラニン生合成を阻害することができれば、シミの発生を防止することができる。
葉ワサビの各部位の50%エタノール抽出物をDMSOに溶解させ、濃度を80mg/mL、濃度40mg/mL、及び濃度20mg/mLの、3種類の試料を、葉、茎及び根の部位ごとに全部で9種類作った。
上記のウェルプレートからEMEM培地(Eagle'S minimal essential medium イーグル最少必須培地)を除き、NaOH水溶液を加える。NaOH水溶液が強アルカリ性である性質を利用して、メラニンを溶出させるためである。
上記のウェルプレートからEMEM培地を除き、MTT−PBS溶液を加える。MTT−PBS溶液は、生きている細胞の中に取り込まれると、還元されて、色を発して沈殿する。この性質を利用して、生きた細胞の還元力を測定する。
以上の試験を行ったサンプルを、プレートリーダで測定した。その結果を、図3に示す。
なお、図3の白い棒グラフは、細胞生存率を示し、黒い棒グラフは、メラニン含有量を示す。
リパーゼは脂肪(トリグリセライド)を分解する酵素であることは、良く知られている。人間の皮膚に存在するリパーゼが、皮膚の脂肪分を分解すると、脂肪酸が産生され、毛穴の閉塞やニキビの原因となる。
トリグリセライドが膵リパーゼ溶液と反応し、エステル結合の部分で分離すると、蛍光物質が生じる。この蛍光物質は、355nmの波長の光を当てると、励起し、460nmの蛍光色の光を発する。この光の蛍光強度を測定することで、リパーゼ活性に与える影響を評価する。
葉、茎及び根の各部位ごとにそれぞれ、濃度0.6mg/ml、1.2mg/ml及び2.4mg/mlの、3種類の濃度について測定した結果を、図4に示す。なお、ポジティブコントロールとして用いたorlistatの濃度の単位は、μg/mlである。
細胞内にカルシウムが入り込み、生体内のカルシウムの濃度が高まると、アレルギー反応が引き起こされることは、既に知られている。
アレルギーの反応は、現在さまざまなタイプのものが確認されている。このため、本試験においては、アレルギー反応の主要なメカニズムである、A23187によるβ―ヘキソサミニダーゼの放出率と、DNP−BSAと抗DNP IgEによるβ―ヘキソサミニダーゼの放出率について試験を行った。
上記の試験の結果を図5Aないし図5Cに表わす。図5Aは、葉ワサビ抽出物にA23187を加え、βヘキソサミニダーゼの放出量を表した図である。図5Bは、葉ワサビ抽出物に、抗原であるDNPを加え、βヘキソサミニダーゼの放出量を表した図である。図5Cは、MTT試験による細胞毒性を測定した結果を表した図である。
なお、図5Cに示すように、葉ワサビの抽出物の細胞毒性は確認されなかったことを付言する。
葉ワサビの凍結乾燥物を約2g秤量し、エタノール0vol%(水100vol%)、エタノール25vol%(水75vol%)、エタノール50vol%(水50vol%)、エタノール75vol%(水25vol%)、エタノール100vol%(水0vol%)の、5種類の抽出溶媒それぞれについて、抽出を行った。
180rpmの回転速度で、48時間、浸透抽出を行った後、吸引濾過にて抽出液を回収した。さらに、抽出液をロータリーエバポレータにて濃縮後、デシケータ内でエタノールを完全に除去し、乾固物を得た。なお、エタノール0vol%(水100vol%)抽出の場合は、抽出後、遠心分離し、上澄みを凍結乾燥させて水抽出物とした。
繊維芽細胞は、ヒアルロン酸などの真皮の部分をつくりだすことで知られている。神経芽細胞の働きが落ちると、ヒアルロン酸は失われ、肌が保有する水分量が減少し、しわなどの原因となる。
上記の、5種類の各エタノール濃度で得た抽出物それぞれを、さらに、3つの濃度に調整し、合計で15個の試料を得た。
上記の試験の結果を、図6に示す。黒の棒グラフは、ヒアルロン酸産生量を示し、白の棒グラフは、細胞生存率を示す。折れ線グラフは、生存する細胞1個あたりのヒアルロン酸量を示す。
葉ワサビの各部位の機能性試験で行ったように、本試験においても、大腸菌(E.coli)と、黄色ブドウ球菌(S.aureus)の増殖に与える影響から、各抽出濃度の試料の抗菌活性を評価した。
各エタノール濃度の抽出物を、DMSO(dimethylsulfoxide)に溶解させた。また、抽出物を含まないDMSOをネガティブコントロールとして、保存料であるソルビン酸をポジティブコントロールとして用いた。
大腸菌及び黄色ブドウ球菌による濁度を、抽出濃度ごとの試料を用いて測定した結果を図7示す。なお、黒い棒グラフが大腸菌の濁度であり、白い棒グラフが黄色ブドウ球菌の濁度である。
本試験においては、葉ワサビの葉部分の効率的な利用のため、上記の、5種類の各エタノール濃度で得た抽出物それぞれを、さらに2つの濃度(400mg/ml、800mg/ml)に調整し、合計で10個の試料を得た。
<試験方法>
抽出物溶液25μLを0.1mM4−methylumbellifery oleate(4−メチルウンベリフェリルオレアート;4−MUO 13mM Tris−HCl,150mM NaCl,1.3mM CaCl2緩衝液)溶液50μLと、150μg/mL濃度の膵臓由来リパーゼ25μLを混合し、緩衝液に溶かした。
上記の試験結果を図8に示す。なお、葉ワサビの葉部分の抽出物を含まずに試験を行った結果を、コントロール(BL)100%として表示し、抗肥満薬として用いられるオルレイスタット(Orl)の値も表示した。
<試験方法>
ラジカル発生剤であるAAPH(2,2'−アゾビス(2−アミノプロパン)二塩酸塩)を用いて、ペルオキシラジカルを発生させる。ペルオキシラジカルによって、蛍光色素の一種であるフルオレセインが酸化されると、フルオレセインから発していた光は、消光する。
試料を秤量し、濃度が(1mg/1mL)になるよう、リン酸緩衝液に溶解し、これを原液として、希釈した。
上記の試験結果を図9に示す。エタノール濃度50vol%(水50vol%)で抽出した試料が最も抗酸化活性が高かった。なお、エタノール濃度75vol%(水25vol%)で抽出した試料は、二番目に抗酸化活性が高かった。
以上のすべての試験結果から、葉ワサビの葉部分は、抽出溶媒のエタノール濃度約75vol%(水25vol%)で抽出することで、ヒアルロン酸産生能、抗菌活性、リパーゼ阻害活性、抗酸化活性の機能を最も効率良く抽出することができることが明らかとなった。
Claims (2)
- 75vol%の値のエタノール濃度のエタノール含有溶媒を用いて、ワサビの葉部分からワサビ抽出物を抽出する抽出工程と、
該抽出工程で抽出された前記ワサビ抽出物を濃度6.25−25μg/mlに調整する調整工程とを備える、
保湿効果を有するワサビ抽出物からなる保湿剤の製造方法。 - 75vol%の値のエタノール濃度のエタノール含有溶媒を用いて、ワサビの葉部分からワサビ抽出物を抽出する抽出工程と、
該抽出工程で抽出された前記ワサビ抽出物を濃度6.25−25μg/mlに調整する調整工程とを備える、
保湿効果を有するワサビ抽出物からなる整肌剤の製造方法。
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