JP4995155B2 - 生体コラーゲン合成促進剤並びに生体コラーゲン合成促進用化粧品及び医薬部外品 - Google Patents
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人工合成したAla−Hyp−Gly、Pro−Hyp−Gly、Pro−Hyp、Leu−Hyp、Ala−HypをNIH−3T3−L1(マウス線維芽細胞)を培養している培養液中に加え、培養液および細胞外マトリックスとして沈着したコラーゲンをELISA法およびウエスタンブロッティング法によって評価した。Ala−Hyp−Gly、Pro−Hyp−Gly、Pro−Hyp、Leu−Hyp、Ala−Hyp は、GL Biochem社においてFmoc合成法およびBoc合成法の組み合わせにより合成されたものを用いた。
各ウェルから回収した培養上清200μlに100μlのペプシン溶液(150mM 酢酸溶液、0.6mg/ml ペプシン)を加え、転倒混和により十分攪拌し4度で一晩インキュベートした。その後100μlの中和液(200mM Tris、150mM NaCl)を加え転倒混和により十分攪拌し測定資料とした。測定資料をNUNC MaxiSorp 96ウェルプレートに200μl/ウェル加え培養液中のタンパクを4度で一晩コーティングした。その後培養液を除き、ツィーン/リン酸緩衝液で洗浄しブロッキング溶液(5% ノンファット・ドライミルクを0.1% Tween−20を含むリン酸緩衝液も溶かしたもの)中で1時間インキュベートした。ブロッキング溶液を除きツィーン/リン酸緩衝液で洗浄後、1次抗体としてコラーゲンI抗体を1時間反応させた。1次抗体を除きツィーン/リン酸緩衝液で洗浄後、ホースラディッシュ結合2次抗体に1時間曝露した。2次抗体を除きツィーン/リン酸緩衝液で洗浄後発色剤(o-フェニレンジアミン、クエン酸/リン酸緩衝液、30%過酸化水素水)を加え発色反応を行い、反応停止液(2NH2SO4)を加えることで反応を停止させ、1420ARVOシリーズ・マルチレーベルカウンターで492nmにおける吸光度を測定した。表1においてコントロールに対する相対的なコラーゲン増加量を示した。表1で示すように、本発明で使用されるペプチドを添加した区では、添加していない区に比べて、約144〜187%で培養液中のコラーゲン量が増加している結果となった。
細胞溶解用の緩衝液に溶解した細胞の溶出液をポリアクリルアミドーSDSゲルで分画を行い、BIO CRAFT社のセミドライブロッターを用いてニトロセルロース膜にそのタンパク質を転写した。膜は、ブロッキング溶液(5% ノンファット・ドライミルクを0.1% Tween−20を含むリン酸緩衝液も溶かしたもの)と4度で一晩インキュベートさせた。膜を洗浄しコラーゲンIの1次抗体と1時間インキュベートさせ、その後ホースラディッシュ結合2次抗体に1時間曝露し、最後にGE Healthcare Bio−sciences社のELC Plus Western Blotting Detection Systemで検出を行った。同様の方法を用いて恒常的に発現することで知られるGlyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(以下、GAPDHと称する)を標準タンパクとして測定した。結果を図1に示す。図1に示すように、本発明で使用されるペプチドを添加した区では、細胞外マトリックスにおけるコラーゲンの発現が増加する結果となった。また、ジペプチドを添加した区では、トリペプチドを添加した区よりもコラーゲン産生量が多い結果となった。
本発明のAla−Hyp−Gly、Pro−Hyp−Gly、Pro−Hyp、Leu−Hyp、Ala−Hypのジペプチドペプチドまたはトリペプチドのいずれかを含有する生体コラーゲン合成促進剤、生体コラーゲン合成促進用化粧品、生体コラーゲン合成促進用医薬部外品、及び血管、関節痛、若しくは皮膚治療薬の製造について、上記評価結果に従い、以下にその処方例を示すが、各処方例は各製品の製造における常法により製造したもので良く、配合量のみを示した。また、本発明はこれらに限定されるわけではない。
Claims (3)
- Ala−Hyp−Gly、Leu−Hyp、Ala−Hypのジペプチドペプチドまたはトリペプチドのいずれかを含有する生体コラーゲン合成促進剤。
- Ala−Hyp−Gly、Leu−Hyp、Ala−Hypのジペプチドペプチドまたはトリペプチドのいずれかを含有する生体コラーゲン合成促進用化粧品。
- Ala−Hyp−Gly、Leu−Hyp、Ala−Hypのジペプチドペプチドまたはトリペプチドのいずれかを含有する生体コラーゲン合成促進用医薬部外品。
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