JP6606378B2 - コラーゲン産生促進剤 - Google Patents

Description

本発明はコラーゲン産生促進剤に関する。

コラーゲンは線維芽細胞から細胞外に分泌されるタンパク質である。コラーゲンは、生体における種々の結合組織に、力学的な強度を与えるのに役立っており、腱の主成分はコラーゲン繊維がきちんとすきまなく配列したもので、非常に強い力に耐える。また、皮膚においては、真皮の乾燥重量のうち約７０％をコラーゲンが占めているといわれ、皮膚の弾力性や柔軟性を維持するのに重要な役割を果たしている。また、コラーゲンが、それに接する細胞に対して、増殖、分化シグナルを与えるための情報伝達の働きも担っていることがわかってきている。コラーゲンには種々のタイプが存在することが知られており、３０種以上のタイプが報告されている。なかでもコラーゲンの線維性を構成する基本のタイプがＩ型コラーゲンであり、生体の主要構成成分である。脊椎動物では８５％〜９０％と最も大量に存在するコラーゲンであり、骨に大量に含まれ、骨に弾力性を持たせる働きをしている。また皮膚の真皮にも非常に多く、Ｉ型コラーゲンの太い線維にて皮膚の強さを生み出す働きがある。残り１０〜１５％のほとんどがIII型コラーゲンであり、III型コラーゲンの細かい線維がＩ型コラーゲンとそれぞれ架橋を形成することで弾力性を保持している。
近年、皮膚の弾力性や、シワの改善を目的としてコラーゲンやコラーゲンの加水分解物を経口摂取することが行われており、「美容ドリンク」や「美肌飲料」などの名称でコラーゲンやコラーゲンの加水分解物を含む飲料が市販されている。これらの飲料は、１回当たりコラーゲン換算で１０００〜１００００ｍｇを摂取することが効果的であるといわれている。
経口摂取したコラーゲンやコラーゲンペプチドがどのような作用機序で皮膚の弾力性やシワの改善に働くのか、詳細な機構は明らかになっていないが、一部のペプチドが、コラーゲンを経口摂取すると血液中に出現することが知られている。そしてそのペプチドが線維芽細胞のＩ型コラーゲンの産生を促進することも知られている。

特許文献１には、コラーゲンをコラゲナーゼで酵素分解した際に得られるＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐの構造を有するトリペプチド（コラーゲントリペプチド）が生体コラーゲン合成促進作用を有し、これを含むコラーゲン加水分解物をコラーゲン合成促進剤として利用する技術が記載されている。
特許文献２には、前記のコラーゲントリペプチドとフラボノイドの一種であるシリマリンとリンゴ抽出物が、コラーゲンと線維芽細胞からなるコラーゲンゲルを収縮させ、シワ改善に用いることができることが記載されている。
特許文献３には、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ、またはＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇの構造を有するコラーゲン由来のトリペプチドがシリビンと相乗的にＩ型コラーゲンの産生を促進することが記載されている。
特許文献４では、コラーゲンを経口摂取した直後に血液中に出現する複数のトリペプチド又はジペプチドを合成して、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐのジペプチドまたはトリペプチドが培養マウス線維芽細胞に対してコラーゲン合成を促進することを確認して、その結果に基づき、皮膚コラーゲン産生促進剤として利用することを提案している。
特許文献５にはＤ−アスパラギン酸とＤ−アラニンがコラーゲンの産生促進剤として有用であることが記載されている。
このように、これまでの研究開発から、コラーゲンタンパク質の加水分解物やコラーゲンペプチド、アミノ酸など多くの物質がコラーゲン産生促進作用を有することが明らかとなっており、引き続き有用な物質の探索が行われている。

特許第３８０２７２１号公報 特許第５５７２４０６号公報 特許第４０３３８７７号公報 特許第４９９５１５５号公報 国際公開第２０１１／０４０３６３号公報

本発明者は、コラーゲンをコラゲナーゼで加水分解したときに出現する多数のトリペプチドやジペプチドについて研究している。その過程で、従来あまり注目されていない構造のジペプチドやトリペプチドが、特異的に線維芽細胞のコラーゲン産生を促進させ、さらにコラーゲン分解酵素の活性を抑制し、コラーゲンゲルの収縮作用を有することを見出し、本発明を完成するにいたった。
本発明は新たなコラーゲン産生促進剤を提供することを課題とする。
さらに本発明の第２の課題はコラーゲン分解酵素の活性抑制剤を提供することである。
さらに又、本発明の第３の課題はコラーゲンゲルの収縮剤を提供することである。

本発明の主な構成は次のとおりである。
（１）Ｇｌｙ−Ｐｒｏの配列を有するジペプチドを有効成分とするＩＩＩ型コラーゲンの産生促進剤。

本発明により、新たなコラーゲン産生促進剤、コラーゲン分解酵素の活性抑制剤、コラーゲンゲルの収縮剤が提供される。本発明のコラーゲン産生促進剤、コラーゲン分解酵素の活性抑制剤、コラーゲンゲルの収縮剤により、皮膚の基底層の線維芽細胞によってコラーゲンが産生され、コラーゲン分解が抑制され、さらにはコラーゲンゲルが収縮することで、皮膚のシワを改善することができる。コラーゲン産生能は、老化により若い細胞に比較して１／３に低下するが、本発明のコラーゲン産生促進剤は、この機能を回復させるため、老化によるシワの改善に効果を有する。

継代培養を繰り返した老化ヒト線維芽細胞と若いヒト線維芽細胞のコラーゲン産生量を測定した結果を示すグラフである。 コラーゲンをコラゲナーゼで加水分解した加水分解物中に存在する４種の合成ジペプチドの、ヒト線維芽細胞におけるＩ型コラーゲン産生に及ぼす効果を測定した結果のグラフである。 ジペプチドを構成するアミノ酸単独で添加した場合のＩ型コラーゲン産生量を測定したグラフである。 ジペプチドを構成するアミノ酸を２種類混合して添加した場合のＩ型コラーゲン産生量を測定したグラフである。 ジペプチドが、ヒト線維芽細胞のコラーゲン分解酵素活性抑制に示す効果を測定したグラフである。 ジペプチドが、ヒト線維芽細胞を含むコラーゲンゲルの収縮に示す効果を測定したグラフである。 ジペプチドＧｌｙ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−ＰｒｏがＩ型コラーゲン産生に示す効果を測定したグラフである。 ジペプチドＧｌｙ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｐｒｏがコラーゲン分解酵素活性抑制に示す効果を測定したグラフである。 Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−ＨｙｐがＩ型コラーゲン遺伝子の発現を促進させることを示す効果を測定したグラフである。 Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｈｙｐ、Ｐｒｏ−ＨｙｐがIII型コラーゲン遺伝子の発現を促進させることを示す効果を測定したグラフである。

本発明のコラーゲン産生促進剤に係るジペプチドは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｈｙｐのいずれかの配列を有するジペプチドである。これらのジペプチドは先頭に記載されたアミノ酸がアミド基を有しており、後に記載されたアミノ酸が、先に記載したアミノ酸のカルボキシル基にアミド結合した構造を有する。また、これらのジペプチドの表記は、本明細書においては簡略化して、それぞれＧｌｙＰｒｏ、ＰｒｏＧｌｙ、ＰｒｏＨｙｐ、ＨｙｐＧｌｙ、ＧｌｙＨｙｐと表記する場合がある。

本発明のコラーゲン分解酵素活性抑制剤に係るジペプチドは、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｈｙｐのいずれかの配列を有するジペプチドである。これらのジペプチドも、先頭に記載されたアミノ酸がアミド基を有しており、後に記載されたアミノ酸が、先に記載したアミノ酸のカルボキシル基にアミド結合した構造を有する。また、これらのジペプチドは、本明細書においては簡略化して、それぞれＰｒｏＧｌｙ、ＨｙｐＧｌｙ、ＧｌｙＨｙｐと表記する場合がある。

本発明のコラーゲンゲル収縮剤に係るジペプチドは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ又はＰｒｏ−Ｇｌｙ配列を有するジペプチドである。これらのジペプチドも、先頭に記載されたプロリンがアミド基を有しており、後に記載されたグリシンが、先頭に記載したプロリンのカルボキシル基にアミド結合した構造を有する。また、このジペプチドは、本明細書においては簡略化して、ＧｌｙＰｒｏ、ＰｒｏＧｌｙと表記する場合がある。

本発明に使用するそれぞれのジペプチドは蛋白質加水分解法、化学合成法、酵素法、発酵法のいずれかの方法によって製造することができ、特に製造方法を限定するものではない。

本発明に係るコラーゲン産生促進剤、コラーゲン分解酵素活性抑制剤、コラーゲンゲル収縮剤を製造するには、上記の方法で製造したジペプチド又は市販されている当該ジペプチドをそのまま、あるいは当該ジペプチドをふくむ組成物を原料として用いることができる。製剤化に当たっては、常法に従って公知の医薬用、あるいは化粧料用に用いられている無毒性担体と組み合わせて製剤化すればよい。

本発明に係るコラーゲン産生促進剤、コラーゲン分解酵素活性抑制剤、コラーゲンゲル収縮剤、シワ改善剤は、種々の剤型での投与が可能であり、例えば、経口投与剤としては錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤等が挙げられ、非経口投与剤としては、注射剤のほか、坐剤、噴霧剤、経皮吸収剤、外用剤、化粧用剤等の形態を挙げることができる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、アルブミン、水、生理食塩水、油脂等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、滑剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤等の慣用の添加剤を適宜添加することができる。

本発明に係るコラーゲン産生促進剤、コラーゲン分解酵素活性抑制剤、コラーゲンゲル収縮剤において、当該ジペプチドの投与量は、ジペプチドの特性、患者の年齢、体重、症状、症状の程度、投与スケジュール、製剤形態等により、適宜選択・決定されるが、例えば、１日あたり０．１〜１０，０００ｍｇ／ｋｇ体重程度とされ、１日１〜数回に分けて投与してもよい。
また、当該ジペプチドは、生体構成成分であり、すでに長年の使用経験があるコラーゲンの酵素分解物や、これを含む食品中にも含有される成分であることから安全性が高いと考えられる。

以下に、試験例、実施例を示して本発明を具体的に説明する。
＜第１回試験：各種ジペプチド、アミノ酸のコラーゲン産生促進作用、コラーゲン分解酵素活性抑制作用、コラーゲンゲル収縮作用の試験＞
（１）試験方法
・使用細胞
細胞株：正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）（クラボウ）

・試験サンプル
市販の次のジペプチドとアミノ酸を試験サンプルとした。
ジペプチド
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（和光純薬工業）、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（Ｂａｃｈｅｍ ＡＧ）、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（和光純薬工業）、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ（和光純薬工業）
各ペプチドも、上に述べたとおりＮ末端を先に表記している。

アミノ酸
Ｌ−グリシン（Ｇｌｙ：和光純薬工業）、Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ：和光純薬工業）、Ｌ−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ：和光純薬工業）

１）細胞培養
細胞は３７℃、５％二酸化炭素、９５％空気の雰囲気下にて培養を行った。培地は不活性化したウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０％、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）１％を添加したＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ，ｌｉｑｕｉｄ（ＤＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。通常培養には１００ｍｍディッシュに細胞を播種し８０〜９０％コンフルエント時に０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）にて剥離し継代を行った。また、老化した細胞は繰り返し３０回継代を行い作成した。

２）サンプル調整
サンプルはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅｓ（Ｄ−ＰＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に溶解した。ＤＭＥＭにおける溶媒含有量は１％とした。

３）細胞の形態観察
形態観察は倒立型システム顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ）を用いて行った。

４）細胞数の測定
６ｗｅｌｌプレートに細胞を４×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度に調整したＤＭＥＭ ２ｍＬを播種し、３日間培養した後、細胞数の測定を行った。細胞は上清を取り除き０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡを添加し、３７℃で１分間インキュベートし細胞を剥離した後にＤＭＥＭを１ｍＬ添加して回収した。回収した細胞は室温で、１２００ｒｐｍ、３分間遠心し上清を取り除いた。再度ＤＭＥＭにて縣濁した細胞溶液の細胞数をコールターカウンター（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）を用いて測定した。

５）コラーゲン産生促進作用確認試験
９６ｗｅｌｌプレートに細胞を１．５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度に調整したＤＭＥＭ１００μＬを播種した。１日間前培養の後、サンプルを添加して３日間培養し、細胞上清の回収を行った。回収した上清はポリプロピレン製の９６ｗｅｌｌプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ.Ｋ.）を用いて使用まで−２０℃で保管した。
上清は１％ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（和光純薬工業）／ＰＢＳにて５分の１に希釈し、バイオドットにてニトロセルロース膜に吸着させた。ニトロセルロース膜は５％スキムミルク／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０ ＰＢＳ（Ｔ−ＰＢＳ）に浸し室温で１時間振とうした。その後、５％スキムミルク／Ｔ−ＰＢＳで５０００分の１に希釈したＡｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ ＩＣ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＩＰ）, Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｃｌｏｎｅ ＰＣ５−５）（ＴａＫａＲａ）に浸し４℃で一晩振とうを行った。Ｔ−ＰＢＳにて５分間振とうを３回行い、洗浄した後、５％スキムミルク／Ｔ−ＰＢＳに１００００分の１に希釈したＡｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ抗体に浸し室温で１時間振とうした。Ｔ−ＰＢＳによる洗浄工程の後、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア）を１分間反応させ、ＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ（富士フィルム）を用いて検出を行った。ブロットされたコラーゲンのドットの濃さをＩｍａｇｅＪにて数値化し、細胞生存率あたりのコラーゲン産生量を算出し、サンプル添加時のＩ型コラーゲン産生量をサンプル無添加（ｃｏｎｔｒｏｌ）のＩ型コラーゲン産生量に対する百分率にて算出した。

６）コラーゲン分解酵素の活性測定
６ｗｅｌｌプレートに細胞を４×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度に調整したＤＭＥＭ ２ｍＬを播種し、１日間前培養の後、サンプル１ｍｇ／ｍＬを添加して３日間培養し、細胞上清の回収を行った。回収した上清は凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ）を用いて凍結乾燥した後に、Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．４％ ＮＰ−４０、ｃｏｍｐｌｅｔｅＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ））に溶解した。４℃、１００００ｒｐｍにて５分間遠心した上清をサンプルとして、タンパク量を統一した後に−２０℃保存した。
サンプルはＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ (Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ) に等量混合し、室温で１０分間静置した。サンプルはＮＯＶＥＸ（登録商標）Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１０倍希釈した溶液を泳動溶媒としてＮＯＶＥＸ１０％Ｚｙｍｏｇｒａｍ（Ｇｅｌａｔｉｎ）Ｇｅｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、１２５Ｖ定電圧にて電気泳動を行った。泳動後のゲルは、ＮＯＶＥＸ Ｚｙｍｏｇｒａｍ Ｒｅｎａｔｕｒｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の中で３０分間室温にて振とうした後、Ｎｏｖｅｘ Ｚｙｍｏｇｒａｍ Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて置換して室温で３０分間振とうした。新しいＤｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒに交換した後、３７℃で一晩インキュベートした。染色はゲルを精製水にて洗浄後ＣＢＢ Ｓｔａｉｎ Ｏｎｅ Ｓｕｐｅｒ（Ｒｅａｄｙ Ｔｏ Ｕｓｅ）（ナカライテスク）にて室温で１時間振とうして行った。コラーゲン分解酵素の酵素活性は、出現したコラーゲン分解酵素に相当するバンドをＩｍａｇｅＪにて数値化して、これをコラーゲン分解酵素活性量とした。サンプル添加時のコラーゲン分解酵素活性量をサンプル無添加（ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する百分率にて算出した。

７）コラーゲンゲルの収縮作用評価
細胞を包埋したコラーゲンゲルを、コラーゲンゲルキット（新田ゼラチン）を用いて作成した。
氷冷下にてＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ Ｔｉｐｅ１−Ａ（Ａ液）：１０倍濃度ＭＥＭハンクス（Ｂ液）：コラーゲンゲル再構築用緩衝溶液を８：１：１で泡立てないように混合し、そこに細胞溶液６×１０⁵ｃｅｌｌｓ/ｍＬを加え作成した。温度が上昇しないようにしながら、上記で作成したコラーゲンゲル溶液を１２ｗｅｌｌマルチプレート(住友ベークライト)に８００μＬ分注した。３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下で４時間インキュベートし、完全にゲル化を行った。ゲル化したコラーゲンゲルはスパチュラにてプレートより剥離し、ｗｅｌｌプレートにサンプル１ｍｇ/ｍＬを添加し５日間浮遊培養を行った。培養終了後のコラーゲンゲルは４％ホルマリン中で２４時間４℃にて固定を行った。コラーゲンゲル面積は、カメラによって撮影したコラーゲンゲルの画像をＩｍａｇｅＪによって画像解析し、表面面積を測定した。サンプル添加時の表面積をサンプル無添加(ｃｏｎｔｒｏｌ)の表面積に対する百分率にて算出し、これを収縮率とした。

８）データ解析
ｃｏｎｔｒｏｌに対する分散性をＦ検定にて確認後、等分散性と仮定できる場合Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ検定、仮定できない場合にはＷｅｌｃｈのｔ検定を用いて行った。なお有意差は＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５として結果に記載した。

（２）結果
１）老化によるヒト線維芽細胞の形態の変化とコラーゲン産生能の低下
継代を３０回繰り返したヒト線維芽細胞は老化により肥大することが観察された。
この細胞を老化細胞とみなし、この細胞を用いて、コラーゲン産生量を比較した。
図１に示すとおり、継代を３０回繰り返した老化細胞のコラーゲン産生能は、継代培養を繰り返す前の細胞のコラーゲン生産量を１としたとき約１／３に低下していることが明らかとなった。

２）ジペプチドによるヒト線維芽細胞のコラーゲン産生促進
図２にジペプチドを添加した細胞のコラーゲン産生促進効果を測定した結果を示す。図２の左上段Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、右上段Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、左下段Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、右下段Ｈｙｐ−Ｇｌｙの図が、夫々のジペプチドの添加による促進効果である。グラフは、コントロール（無添加）のコラーゲン産生量の測定値を１００とした百分率で表している。
ジペプチドのうち、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙは、Ｐ＜０．０１で有意なコラーゲン産生を促進した。またＧｌｙ−Ｐｒｏも濃度依存性のコラーゲン産生促進がみられた。
また、ジペプチドを構成するアミノ酸を単独で添加した場合の結果を図３に、ジペプチドを構成するアミノ酸を２種類混合して添加した結果を図４に示す。アミノ酸の単独添加、混合添加とも、コラーゲン産生量には効果を示さなかった。
以上のコラーゲン産生促進作用試験の結果から、各ジペプチドは、いずれも特異的にヒト線維芽細胞に作用してコラーゲンの産生を促進することがわかった。又この作用はアミノ酸によるものではないことも明らかになった。したがって、本試験に用いたジペプチドは、老化に伴って発生した皮膚のシワに作用し、皮膚基底部のヒト線維芽細胞のコラーゲンの産生を促進させ、シワ改善作用を示すことが予想される。

３）ジペプチドによる老化したヒト線維芽細胞のコラーゲン分解酵素活性抑制作用
図５に各ジペプチドを添加した場合のコラーゲン分解酵素の活性量を示す。コラーゲン分解酵素の活性量は、ジペプチド無添加の場合を１００とする百分率で表した。Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙはコラーゲン分解酵素の活性が、無添加の場合の７５％以下に抑制されており、強いコラーゲン分解酵素活性の抑制作用を有することがわかった。一方Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐはコラーゲン分解酵素の活性を抑制しなかった。

４）ジペプチドによるコラーゲンゲルの収縮作用
図６に試験結果を示す。ジペプチド１ｍｇ／ｍＬを添加すると、Ｇｌｙ−Ｐｒｏが８７％、Ｐｒｏ−Ｇｌｙが８２％収縮率を示した。このジペプチドが、ゲル収縮作用を有すると評価した。

＜第２回試験：Ｇｌｙ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｐｒｏによるヒト線維芽細胞のコラーゲン産生促進作用、コラーゲン分解酵素活性抑制作用試験＞
１）試験方法
第１回試験に追加して、新たにＧｌｙ−Ｈｙｐおよび、Ｈｙｐ−Ｐｒｏの配列のジペプチドについてコラーゲン産生促進作用、コラーゲン分解酵素抑制作用について試験を行った。試験は全て第１回試験と同様の条件で実施した。なお Ｇｌｙ−ＨｙｐはＢａｃｈｅｍ ＡＧ製、Ｈｙｐ−ＰｒｏはＧｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ製を使用した。

２）結果
図７にヒト線維芽細胞のコラーゲン産生促進試験結果、図８にコラーゲン分解酵素活性抑制作用試験結果を示す。Ｇｌｙ−Ｈｙｐの配列を有するジペプチドはＩ型コラーゲンの産生を促進し、コラーゲン分解酵素の活性を抑制した。

＜第３回試験：各種ジペプチドによるヒト線維芽細胞の遺伝子レベルにおけるコラーゲン産生促進作用の確認試験＞
第１回試験、第２回試験で用いたジペプチドのコラーゲン産生促進作用を遺伝子レベルで解析するため、Ｉ型コラーゲン遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１）、III型コラーゲン遺伝子（Ｃｏｌ３ａ１）の発現量を個別に測定する試験を行った。

１）試験方法
６ｗｅｌｌプレートに細胞を細胞密度４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度になるようにＤＭＥＭに分散し、これを２ｍＬ播種し、１日間前培養の後、ジペプチド試験試料１ｍｇ/ｍＬを添加して３日間培養した。
培養終了後Ｄ−ＰＢＳで洗浄し、１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（登録商標） Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で細胞を溶解し、細胞溶解液を回収した。回収した細胞溶解液は−８０℃で保存し、１週間以内に順次全ＲＮＡ抽出を行った。
全ＲＮＡの抽出はＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔに添付のマニュアルに従って以下のように行った。

細胞溶解液を室温に５分間静置したのち、クロロホルム（和光純薬工業）２００μＬを加えて１５秒間激しく振盪混合した後、室温条件で３分間静置した。その後、１３０００ ｒｐｍ、５分間、４℃の条件で遠心分離した。この遠心分離操作終了後、上清を回収し、２−プロパノール（和光純薬工業）５００μＬを加えて室温に１０分間置き、次いで１３０００ｒｐｍ、１０分間、４℃の条件で再度遠心分離して、沈殿を回収した。この回収沈殿に７０容量％濃度のエタノール（和光純薬工業）を１ｍＬ添加し、再び１００００ｒｐｍ、４℃の条件で、５分間遠心分離して再度沈殿を回収した。回収した沈殿は風乾し、この風乾物にＤｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）２０μＬを加え溶解し、ＰＣＲ反応に用いた。
なおｃＤＮＡの合成は、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ：タカラバイオ）のマニュアルに従って、Ｉ型コラーゲン、III型コラーゲンの遺伝子配列に基づく合成プライマーの作成を行った。すなわち、５倍希釈のＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）：ｔｏｔａｌ ＲＮＡ：Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ （ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ）が１ : １ : ３の割合になるように混合し、サーマルサクラーで、３７℃１５分逆転写、８５℃５秒で逆転写酵素の熱失活を行った後、４℃で冷却した。

ＰＣＲ反応はＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ：タカラバイオ）のマニュアルに従って行った。ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）２倍希釈液に対し、ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ（終濃度０．４μＭ）、ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（終濃度０．４μＭ）を含む等量のＤｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ）を加え調整した。
その後、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、９５℃３０秒にて初期変性、９５℃５秒・６０℃３０秒を、４０サイクル繰り返しＰＣＲ反応を行わせた。また、９５℃５秒・６０℃１分、５０℃３０秒の冷却の条件で融解曲線分析を行った。
Ｉ型コラーゲン、III型コラーゲン遺伝子の発現量は、Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量で標準化を行った。そして、ジペプチド無添加の細胞の遺伝子発現量（ｃｏｎｔｒｏｌ）に対し、被験サンプル添加時の遺伝子発現量から相対比を算出した。

２）結果
図９にＩ型コラーゲン遺伝子の発現量の相対値、図１０にIII型コラーゲン遺伝子の発現量の相対値を示す。
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−ＨｙｐがＩ型コラーゲン遺伝子の発現を促進させた。またＧｌｙ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｈｙｐ、Ｐｒｏ−ＨｙｐがIII型コラーゲン遺伝子の発現を促進させた。

以上の試験結果から、ジペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｈｙｐは、コラーゲン産生促進剤として有用であることがわかった。また、ジペプチドＰｒｏ−Ｇｌｙ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ又はＧｌｙ−Ｈｙｐは、コラーゲン分解酵素産生抑制剤として有用であることがわかった。さらにまた、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙはコラーゲンゲル収縮剤として有用であることがわかった。
特に、Ｐｒｏ−Ｇｌｙは、コラーゲン産生促進作用とコラーゲン分解酵素活性抑制作用、コラーゲンゲル収縮作用を併せ持つ重要なジペプチドであることがわかった。

以下に代表的なジペプチドとしてＰｒｏ−Ｇｌｙを配合した、コラーゲン産生促進剤、コラーゲン分解酵素活性抑制剤、コラーゲンゲル収縮剤、シワ改善剤の処方例を示す。この処方は、その他のジペプチドであっても同様に配合することができる。
［処方例１］クリーム
下記の処方（単位は質量％）により、外用クリームを製造した。
（１） ステアリルアルコール ６．０
（２） ステアリン酸 ２．０
（３） 水添ラノリン ４．０
（４） スクワラン ９．０
（５） オクチルドデカノール １０．０
（６） ＰＯＥ（２５）セチルアルコールエーテル ３．０
（７） モノステアリン酸グリセリン ２．０
（８）Ｐｒｏ−Ｇｌｙ ０．１
（９） 防腐剤 適量
（１０）香料 適量
（１１）１，３ブチレングリコール ６．０
（１２）ＰＥＧ１５００ ４．０
（１３）精製水 残余
〔製法〕上記成分（１）〜（１０）を８０℃に加熱溶解し油相とする。成分（１１）〜（１３）を７０℃に加熱溶解し水相とする。油相に水相を徐々に加え乳化し、攪拌しながら４０℃まで冷却し、さらに３０℃まで攪拌冷却して外用クリームを得た。

［処方例２］錠剤
下記の処方（単位は質量％）により、錠剤を製造した。
（１）Ｐｒｏ−Ｇｌｙ ２．０
（２）乳糖 ８３．０
（３）コーンスターチ １４．０
（４）グアーガム １．０

［処方例３］外用乳液
下記の処方（単位は質量％）により、乳液を製造した。
（１）ジプロピレングリコール ９．０００
（２）Ｐｒｏ−Ｇｌｙ １．０００
（３）（ヒドロキシエチルアクリル酸／アクリルジメチルタウリンＮａ）
コポリマー ０．１８８
（４）スクワラン ０．１２７
（５）ポリソルベート６０ ０．０２８
（６）ラウロイルグルタミン酸ジ（フィトステリル／オクチルドデシル） １．０００
（７）グリセリン ５．０００
（８）ジメチコン ３．０００
（９）精製水 ７４．７４２
（１０）カルボマー ０．２００
（１１）ベタイン ２．０００
（１２）エタノール ３．０００
（１３）水酸化カリウム ０．０６５
（１４）精製水 ０．６５０
〔製法〕上記成分（１）に（２）を加え８０℃に加熱溶解する。成分（３）〜（８）を加え、８０℃に加熱溶解し油相とする。成分（９）〜（１１）を７０℃に加熱溶解し水相とする。油相に水相を徐々に加え乳化し、攪拌しながら３０℃まで冷却する。さらに成分（１２）および（１３）を（１４）に攪拌溶解したものを加え、攪拌冷却して外用乳液を得た。

Claims (1)

1. Ｇｌｙ−Ｐｒｏの配列を有するジペプチドを有効成分とするＩＩＩ型コラーゲンの産生促進剤。

Images