JP6864539B2 - コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれるGly−X−Y配列量の測定方法、およびX−Y配列量の測定方法 - Google Patents
コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれるGly−X−Y配列量の測定方法、およびX−Y配列量の測定方法 Download PDFInfo
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Description
前記ペプチド溶液に含まれるGly−X−Y(式中、XおよびYは、同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。)の含有量を測定する工程を含む、前記ゼラチンまたはコラーゲン加水分解物に含まれるGly−X−Y配列量の測定方法を提供するものである。
本発明の測定対象は、コラーゲン、ゼラチンまたはコラーゲン加水分解物である。コラーゲンとしては、サカナ、ウシ、ブタ、ニワトリ、その他の動物のいずれに由来するコラーゲンであってもよい。また、コラーゲン型は現在I型からXXIX型までが知られているが、そのいずれであってもよく、将来発見されるコラーゲンであってもよい。コラーゲンは、分子量約100,000のポリペプチド3本が螺旋状に結合した構造であり、ゼラチンとは各ポリペプチドを複数に切断した組成物である。一般に、平均分子量3,000〜50,000、好ましくは5,000〜20,000のペプチドがゼラチンである。また、コラーゲン加水分解物とは、コラーゲンペプチドとも称され、ゼラチンより低分子量で、ゲル化能を有しないまでに分解されたペプチド組成物を意味する。なお、コラーゲン、ゼラチンまたはコラーゲン加水分解物の調製方法に限定はない。コラーゲン原料を酸やアルカリで処理してコラーゲンを抽出したもの、コラーゲンに各種コラゲナーゼを含むプロテアーゼなどの酵素を作用させ、および/または、酸、アルカリ、その他によってコラーゲンを構成するポリペプチド鎖を切断したものを広く含む。
本発明で使用するM9Aタイプバクテリアコラゲナーゼは、ペプチダーゼデータベースの一つであるMEROPSの分類によるM9Aに属するバクテリアコラゲナーゼである(非特許文献4参照)。M9はM9AとM9Bに大別され、M9Aには、ビブリオおよびビブリオ類縁属コラゲナーゼが含まれ、M9Bには、クロストリディウム属コラゲナーゼが含まれる。ビブリオ類縁属には、グリモンティア・ホリセーなどがある。本発明では、ビブリオやグリモンティア・ホリセーに由来するM9Aタイプバクテリアコラゲナーゼを使用する。本発明で使用するM9Aタイプバクテリアコラゲナーゼとして、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼがある(非特許文献5)。なお、グリモンティア・ホリセーは、例えばATCC No.33564やATCC No.33565として入手できる。本発明で使用するM9Aタイプバクテリアコラゲナーゼとしては、ビブリオやビブリオ類縁属が産生するコラゲナーゼの他、特許文献4記載の方法を参照し、当該コラゲナーゼ遺伝子で形質転換された組み換え体から得たコラゲナーゼであってもよい。さらに、市販品であってもよい。このような市販品として株式会社ニッピ製のブライターゼCがある。
本発明において、Gly−X−Y配列とは、XおよびYを同一でも異なってもよいアミノ酸残基とした場合に、N末端からGly、X、Yの順にアミド結合する配列であり、トリペプチドGly−X−Yの他、ポリペプチドに含まれる−(Gly−X−Y)−を含む。コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれるGly−X−Y配列量は、これらから生成しうる全Gly−X−Y量である。Gly−X−Y配列量がわかれば、これらを経口摂取した際のGly−X−Yなどの効果を予測することができる。
コラーゲン、ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物を緩衝液などの溶液に溶解し、前記M9Aタイプバクテリアコラゲナーゼを作用させてペプチド溶液を調製する。前記コラーゲン、ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物を溶解する緩衝液としては、例えばトリス緩衝液やGood緩衝液などがある。濃度は、0.1〜100mg/mlが好ましく、より好ましくは5〜40mg/mlである。得られた溶液に前記M9Aタイプバクテリアコラゲナーゼを0.001〜1mg/ml、より好ましくは0.005〜0.02mg/ml添加し、温度37℃で、12〜48時間、より好ましくは20〜24時間反応させる。これにより、前記コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれるコラーゲン様配列が分解されたペプチド溶液が得られる。塩酸でpHを下げ反応停止後、ペプチド溶液に含まれるGly−X−Yを定量する。Gly−X−Yの定量方法には特に限定はないが、例えば、LC−MSや、LC−MS−MSで測定することができる。質量分析の際に、Gly−X−Yの分子量を参照して目的の質量のGly−X−Y量を測定することができる。LC−MSやLC−MS−MSを適切に設定すれば、質量が同じGly−X−Yでもそれぞれ定量することができる。また、酵素分解を行わないコラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物溶液をLC−MSやLC−MS−MS分析し、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれるトリペプチドGly−X−Y量およびX−Y量を測定すれば、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に直接含まれるGly−X−Y量を測定することができる。
本発明によって測定したGly−X−Y配列量は、コラーゲン、ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物に含まれていたトリペプチドGly−X−Yと、ポリペプチドを構成するGly−X−Y配列との合計量である。これをAsとすれば、Asは、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれる全Gly−X−Y配列量である。一方、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物溶液に含まれるトリペプチドGly−X−Y量をAbとすれば、As−Abは、コラーゲン、ゼラチンまたはコラーゲン加水分解物に含まれておらず、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物が分解された後に生成できるGly−X−Y量を意味する。コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物が潜在的に含有するGly−X−Y量といえる。本発明では、これを潜在的Gly−X−Y量と称する。本発明によれば、As−Abを算出することで、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれる潜在的Gly−X−Y量を求めることができる。
本発明において、X−Y配列とは、XおよびYを同一でも異なってもよいアミノ酸残基とした場合に、N末端からX、Yの順にアミド結合する配列であり、ジペプチドX−Yの他、ポリペプチドに含まれる−X−Y−を含む。例えば、Pro−Hyp、Ala−Hyp、Lue−Hypなどがある。
本発明では、上記したGly−X−Y配列量の測定方法に準じて、X−Y配列量を測定することができる。上記と同様にしてペプチド溶液を調製し、ペプチド溶液に含まれるGly−X−Y配列量を測定し、これをAsとする。その後、AsにX−Y分子量/Gly−X−Y分子量を乗じると、Gly−X−Y配列由来のX−Y配列量を算出することができる。これをCsとする。本発明によれば、コラーゲン様配列からX−Yを切り出す酵素を使用することなく、これらに含まれるX−Y配列量を測定することができる。一方、前記ペプチド溶液には、M9Aタイプバクテリアコラゲナーゼの酵素反応で生じたジペプチドX−Yが含有する場合がある。そこで、ペプチド溶液に含まれるGly−X−Y量の測定に加えて、X−Y量も測定する。X−Y量をBsとする。Bsはペプチド溶液に含まれるX−Y量であり、Csは、ペプチド溶液に含まれるGly−X−Y配列量に由来するX−Y量であるから、ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物に含まれる全X−Y配列量は、Bs+Csで算出される。なお、酵素分解を行わないコラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物溶液をLC−MSやLC−MS−MS等で分析すれば、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれるジペプチドX−Y量を測定することができる。
本発明によって測定したX−Y配列量(Bs+Cs)は、コラーゲン、ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物に含まれる全X−Y配列量である。一方、コラーゲン、ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物に含まれるジペプチドX−Y量をBbとすれば、(Bs+Cs)−Bbは、コラーゲン、ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物に含まれておらず、コラーゲン、ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物から生成可能なX−Y量であり、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物が潜在的に含有するX−Y量といえる。本発明では、これを潜在的X−Y量と称する。本発明によれば、(Bs+Cs)−Bbを算出することで、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれる潜在的X−Y量を求めることができる。
市販のブタ皮由来コラーゲンペプチド(株式会社ニッピ製、商品名「豚皮由来コラーゲンペプチドPS−1」)とテラピア鱗由来コラーゲンペプチド(株式会社ニッピ製、商品名「テラピア鱗由来コラーゲンペプチドFCP−A」)を、10mM HEPES、40mM NaCl、1mM CaCl2を含むpH7.5の反応溶媒に溶解して2%コラーゲンペプチド溶液を調製した。
装置:
液体クロマトグラフ:アジレントテクノロジー社製、「1200シリーズ」
カラム:Ascentis F5(スペルコ社製、φ4.6mm×250mm)
三重連四重極質量分析装置(Sciex社製、「3200QTRAP」)
条件:MRM(multiple reaction monitoring)、イオン化法:ESI、ポジティブ
Gly−Pro−Hypの検出条件;Q1=286、Q3=127
Pro−Hypの検出条件;Q1=229、Q3=70
イオンスプレー電圧:3.5kV
イオンソース温度:600℃
移動相:A液;0.1%ギ酸、B液;100%アセトニトリル
グラジエント条件:0−2分:A液98%、2−6分:A液98−40%、6.1−8分:A液40−10%、8.1−10分:A液98%
流速:600μl/min
カラム温度:40℃
注入量:10μl
グリモンティア属由来コラゲナーゼに代えて、M9Bに分類されるバクテリアコラゲナーゼであるクロストリジウム属由来コラゲナーゼ(株式会社ロッシュ製、Liberase−C)を使用して、実施例1と同様に操作した。結果を表4、表5およ表6に示す。
Claims (6)
- ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物にM9Aタイプバクテリアコラゲナーゼを作用させてペプチド溶液を調製し、前記ペプチド溶液に含まれるGly−X−Y(式中、XおよびYは、同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。)の含有量を測定する工程を含む、前記ゼラチンまたはコラーゲン加水分解物に含まれるGly−X−Y配列量の測定方法。
- ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物にM9Aタイプバクテリアコラゲナーゼを作用させてペプチド溶液を調製し、前記ペプチド溶液に含まれるGly−X−Y(式中、XおよびYは、同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。)の含有量(As)を測定する工程と、
前記ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物に含まれる前記Gly−X−Yの含有量(Ab)を測定する工程と、
前記含有量(As)と前記含有量(Ab)との差を算出する工程とを含む、前記ゼラチンまたはコラーゲン加水分解物に含まれる潜在的Gly−X−Y配列量の測定方法。 - 前記Gly−X−Yが、Gly−Pro−Hypである、請求項1または2に記載の測定方法。
- ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物にM9Aタイプバクテリアコラゲナーゼを作用させてペプチド溶液を調製し、前記ペプチド溶液に含まれるGly−X−Y(式中、XおよびYは、同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。)の含有量を測定し、得られた測定値に、(X−Yの分子量/Gly−X−Yの分子量)を乗じてX−Y配列量とする換算工程を含む、前記ゼラチンまたはコラーゲン加水分解物に含まれるX−Y配列量の測定方法。
- ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物にM9Aタイプバクテリアコラゲナーゼを作用させてペプチド溶液を調製し、前記ペプチド溶液に含まれるGly−X−Y(式中、XおよびYは、同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。)の含有量(As)およびX−Yの含有量(Bs)を測定する工程と、
前記含有量(As)に、(X−Yの分子量/Gly−X−Yの分子量)を乗じてX−Y配列量(Cs)とする換算工程と、
前記ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物に含まれるX−Yの含有量(Bb)を測定する工程と、
含有量(Bs)+含有量(Cs)−含有量(Bb)を算出する工程とを含む、
前記ゼラチンまたはコラーゲン加水分解物に含まれる潜在的X−Y配列量の測定方法。 - 前記X−Yが、Pro−Hypである、請求項4または5に記載の測定方法。
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