WO2023054315A1 - コラーゲントリペプチド製造又は軟骨分解のための酵素剤 - Google Patents

コラーゲントリペプチド製造又は軟骨分解のための酵素剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2023054315A1
WO2023054315A1 PCT/JP2022/035843 JP2022035843W WO2023054315A1 WO 2023054315 A1 WO2023054315 A1 WO 2023054315A1 JP 2022035843 W JP2022035843 W JP 2022035843W WO 2023054315 A1 WO2023054315 A1 WO 2023054315A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
collagenase
amino acid
activity
acid sequence
enzyme
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/035843
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
正浩 掃部
寛之 谷内
佑記 石垣
Original Assignee
天野エンザイム株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 天野エンザイム株式会社 filed Critical 天野エンザイム株式会社
Priority to EP22876181.3A priority Critical patent/EP4410981A1/en
Priority to JP2023551502A priority patent/JPWO2023054315A1/ja
Priority to CN202280065067.6A priority patent/CN118159651A/zh
Publication of WO2023054315A1 publication Critical patent/WO2023054315A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24003—Microbial collagenase (3.4.24.3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
    • A23L13/40—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof containing additives
    • A23L13/48—Addition of, or treatment with, enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
    • A23L13/70—Tenderised or flavoured meat pieces; Macerating or marinating solutions specially adapted therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
    • A23L13/70—Tenderised or flavoured meat pieces; Macerating or marinating solutions specially adapted therefor
    • A23L13/72—Tenderised or flavoured meat pieces; Macerating or marinating solutions specially adapted therefor using additives, e.g. by injection of solutions
    • A23L13/74—Tenderised or flavoured meat pieces; Macerating or marinating solutions specially adapted therefor using additives, e.g. by injection of solutions using microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6402—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals
    • C12N9/6405—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals not being snakes
    • C12N9/6416—Metalloendopeptidases (3.4.24)

Definitions

  • the present invention relates to an enzymatic agent for collagen tripeptide production or cartilage degradation, which contains collagenase as an active ingredient, and uses thereof.
  • CTP collagen tripeptide
  • collagenases In order to efficiently produce CTP, a protease (collagenase) that can specifically cleave collagen or gelatin at the Gly residue position and degrade it to tripeptides is useful.
  • collagenases include collagenases derived from the genera Clostridium and Vibrio, and Bacillus cereus collagenase (belonging to Microbial collagenase (EC.3.4.24.3)).
  • EC.3.4.24.3 Bacillus cereus collagenase
  • a collagenase derived from the genus Streptomyces is known as a collagenase that can be used for food (Patent Document 1), but it is unknown whether it can be used for CTP production. Also, existing collagenases generally have poor stability. Vibrio hollisae-derived collagenase (Vibrio sp 1706B strain-derived collagenase in Patent Document 2) is known as a microorganism-derived collagenase that is said to have excellent stability and high specific activity. (Patent Document 2, Patent Document 3). However, the heat stability of collagenase derived from Vibrio hollisae is 30°C or less, which is insufficient for practical use.
  • collagenases with different properties.
  • two different collagenase types (I, II) are known among collagenases from the genus Clostridium histolyticum, and collagenase I has higher activity on collagen and gelatin than collagenase II, and is capable of producing short peptides. It has low activity against (Patent Document 4).
  • Clostridium histolyticum-derived collagenase has a low degradation rate for cleaving CTP from collagen-like sequences (Patent Document 5).
  • Collagenase suitable for producing CTP from collagen that can be used for food applications is required to have safe collagenase-producing bacteria, to have collagen-degrading or gelatin-degrading ability, and to have CTP-generating ability.
  • high stability is also required, but no collagenase is known that satisfies such conditions and has been put to practical use.
  • the object of the present invention is to provide a highly safe protease (collagenase) that is useful for food or medical applications, such as collagen tripeptide production or cartilage degradation, and uses thereof.
  • a highly safe protease (collagenase) that is useful for food or medical applications, such as collagen tripeptide production or cartilage degradation, and uses thereof.
  • the present inventors extensively screened enzymes derived from microorganisms, aiming to obtain a collagenase that has high CTP-producing ability, high cartilage-degrading ability, and high safety. As a result, it was found that a specific strain of Lysinibacillus fusiformis produced a collagenase that met the purpose.
  • the collagenase exhibited collagenase-degrading ability and CTP-generating ability, and had high cartilage-degrading ability, and was highly industrially useful. According to the present invention, the following inventions are provided.
  • An enzymatic agent for producing collagen tripeptide comprising as an active ingredient a collagenase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence equivalent thereto.
  • a collagenase consisting of an equivalent amino acid sequence has 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and a collagenase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and Gly-Glu-Arg from bovine bone gelatin.
  • the enzymatic agent according to ⁇ 1> which is a collagenase having the same production ability.
  • ⁇ 3> The enzymatic agent according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the collagenase is derived from Lysinibacillus fusiformis.
  • An enzymatic agent for producing collagen tripeptide which is derived from Lysinibacillus fusiformis and contains collagenase having the following physicochemical properties as an active ingredient.
  • Optimal temperature Around 40°C.
  • Temperature stability The relative residual activity is 80% or more from 4°C to 40°C, and 10% or less at 50°C, with the activity at the treatment temperature showing the highest activity being 100%.
  • Optimum pH The optimum pH is around 7.
  • the relative residual activity is 80% or more in the range of pH 6 to 8, and 10% or less at pH 5, with the activity at the processing pH where the activity was highest being 100%.
  • An enzymatic agent for meat tenderization and/or cartilage degradation comprising as an active ingredient a collagenase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence equivalent thereto.
  • Collagenase consisting of an equivalent amino acid sequence has an identity of 90% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and is equivalent to the collagenase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in decomposing chicken cartilage.
  • Optimal temperature Around 40°C.
  • Temperature stability The relative residual activity is 80% or more from 4°C to 40°C, and 10% or less at 50°C, with the activity at the treatment temperature showing the highest activity being 100%.
  • Optimum pH The optimum pH is around 7.
  • the relative residual activity is 80% or more in the range of pH 6 to 8, and 10% or less at pH 5, with the activity at the processing pH where the activity was highest being 100%.
  • a method for producing a collagen tripeptide comprising allowing the enzymatic agent according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4> to act on collagen or gelatin.
  • a method for tenderizing meat and/or degrading cartilage which comprises allowing the enzymatic agent according to any one of ⁇ 5> to ⁇ 8> to act on meat and/or cartilage.
  • FIG. 1 shows the optimum temperature of collagenase derived from Lysinibacillus fusiformis 7128 strain.
  • Figure 2 shows the temperature stability of collagenase from Lysinibacillus fusiformis strain 7128.
  • FIG. 3 shows the optimum pH of collagenase derived from Lysinibacillus fusiformis 7128 strain.
  • Figure 4 shows pH stability of collagenase from Lysinibacillus fusiformis strain 7128.
  • FIG. 5 shows the results of confirming the production ability (fish gelatin) of Gly-Pro-Hyp, which is a collagen tripeptide.
  • FIG. 1 shows the optimum temperature of collagenase derived from Lysinibacillus fusiformis 7128 strain.
  • Figure 2 shows the temperature stability of collagenase from Lysinibacillus fusiformis strain 7128.
  • FIG. 3 shows the optimum pH of collagenase derived from Lysin
  • FIG. 6 shows the results of confirming the production ability (fish gelatin) of Gly-Pro-Ala, which is a collagen tripeptide.
  • FIG. 7 shows the results of confirming the production ability (fish gelatin) of Gly-Glu-Arg, which is a collagen tripeptide.
  • FIG. 8 shows the results of confirming the ability (bovine bone gelatin) to produce Gly-Glu-Arg, which is a collagen tripeptide.
  • FIG. 9 shows the results of measuring cartilage degradation.
  • a first aspect of the present invention relates to an enzyme agent for collagen tripeptide production or meat tenderization and/or cartilage degradation.
  • the enzyme agent of the present invention (hereinafter also referred to as “this enzyme agent”) contains collagenase (hereinafter also referred to as “this enzyme”) as an active ingredient.
  • This enzyme contains collagenase (hereinafter also referred to as "this enzyme") as an active ingredient.
  • the enzymatic agent of the present invention is useful in collagen tripeptide production or meat tenderization and/or cartilage degradation (details will be described later).
  • the active ingredient, collagenase, ie, the present enzyme consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence equivalent thereto.
  • equivalent amino acid sequence refers to a partial difference from the reference amino acid sequence (amino acid sequence of SEQ ID NO: 1), but the difference has a substantial effect on protein function (here, collagenolytic activity). means an amino acid sequence that does not give a do. Therefore, enzymes with equivalent amino acid sequences catalyze the degradation reaction of collagen, have the ability to produce Gly-Glu-Arg from bovine bone gelatin, and/or have the ability to degrade chicken cartilage.
  • the collagen degradation activity, Gly-Glu-Arg production ability, and chicken cartilage degradability are not particularly limited as long as the collagenase function can be exhibited.
  • Equivalent ability to produce Gly-Glu-Arg from bovine bone gelatin means having ability to produce ⁇ 10%, preferably ⁇ 5% compared to collagenase having the reference amino acid sequence.
  • Equivalent chicken cartilage resolution refers to ⁇ 10% resolution, preferably ⁇ 5% resolution compared to collagenase having the standard amino acid sequence.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence (mature form) of collagenase derived from Lysinibacillus fusiformis.
  • the amino acid sequence of Lysinibacillus fusiformis-derived collagenase, which also has a signal peptide and a pro-sequence, is shown in SEQ ID NO:2.
  • Partial difference in amino acid sequence includes, for example, deletion or substitution of one or more amino acids in the amino acids constituting the amino acid sequence, addition or insertion of one or more amino acids to the amino acid sequence, or caused by any combination of Partial differences in the amino acid sequences are permissible as long as collagenolytic activity, Gly-Glu-Arg production ability, and/or poultry cartilage-degrading activity are maintained (activity may vary slightly). As long as this condition is satisfied, the positions where the amino acid sequences differ are not particularly limited. In addition, differences in amino acid sequences may occur at multiple sites (sites).
  • the number of amino acids that cause a partial difference in the amino acid sequence is, for example, a number corresponding to about 20% or less, preferably about 15% or less, more preferably a number corresponding to all amino acids constituting the amino acid sequence.
  • a number corresponding to about 0.3% or less is preferred, and a number corresponding to about 0.1% or less is more preferred.
  • an equivalent protein is, for example, about 80% or more, preferably about 85% or more, more preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more, more preferably about 97% or more, or more, than the reference amino acid sequence. preferably about 98% or more, more preferably about 99% or more, more preferably about 99.3% or more, more preferably about 99.5% or more, more preferably about 99.7% or more, even more preferably about 99% .9% or greater identity.
  • partial difference in amino acid sequence is 1 to 40 (preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 40) among the amino acids constituting the amino acid sequence.
  • 1 to 40 (preferably 1 to 30, more preferably 1 ⁇ 10, more preferably 1 to 7, still more preferably 1 to 5, still more preferably 1 to 3) amino acid addition, insertion, or a combination thereof resulting in mutation (change) in the amino acid sequence It is happening.
  • an equivalent amino acid sequence is obtained by making conservative amino acid substitutions at amino acid residues that are not essential for degrading collagen.
  • conservative amino acid substitution refers to substitution of an amino acid residue with an amino acid residue having a side chain with similar properties.
  • Amino acid residues can have, depending on their side chain, a basic side chain (e.g. lysine, arginine, histidine), an acidic side chain (e.g. aspartic acid, glutamic acid), an uncharged polar side chain (e.g. glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine). , cysteine), nonpolar side chains (e.g.
  • alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), beta-branched side chains (e.g. threonine, valine, isoleucine), aromatic side chains (e.g. tyrosine, phenylalanine, Tryptophan, histidine) are classified into several families. Conservative amino acid substitutions are preferably between amino acid residues within the same family.
  • the identity (%) of two amino acid sequences can be determined, for example, by the following procedure. First, the two sequences are aligned for optimal comparison (eg, gaps may be introduced in the first sequence to optimize alignment with the second sequence). When the molecule (amino acid residue) at a particular position in the first sequence is the same as the molecule at the corresponding position in the second sequence, the molecules at that position are said to be identical.
  • the collagenase which is the active ingredient of the enzymatic agent, that is, the enzyme may be part of a larger protein (eg, fusion protein).
  • Additional sequences in the fusion protein include, for example, sequences that aid in purification such as multiple histidine residues, additional sequences that ensure stability during recombinant production, and the like.
  • This enzyme can be obtained by culturing a microorganism that produces the collagenase (collagenase-producing strain), for example, Lysinibacillus fusiformis.
  • Collagenase-producing strains may be wild strains or mutant strains (for example, mutant strains obtained by ultraviolet irradiation).
  • This enzyme can be prepared from the culture solution and/or cells of microorganisms that produce this enzyme.
  • Culture conditions and culture methods are not particularly limited as long as the present enzyme is produced. That is, on the condition that the present enzyme is produced, a method and culture conditions suitable for culturing the microorganism to be used can be appropriately set.
  • a culture method either liquid culture or solid culture may be used, but liquid culture is preferably used. Taking liquid culture as an example, the culture conditions will be described.
  • the medium is not particularly limited as long as it allows the microorganisms to be used to grow.
  • glucose, sucrose, gentiobiose, soluble starch, glycerin, dextrin, molasses carbon sources such as organic acids, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium phosphate, ammonium acetate, or gelatin, peptone, yeast extract, corn steep liquor.
  • Casein hydrolyzate, wheat bran, nitrogen sources such as meat extracts, and inorganic salts such as potassium salts, magnesium salts, sodium salts, phosphates, manganese salts, iron salts, zinc salts, etc. can be used.
  • the pH of the medium is adjusted to, for example, about 3 to 8, preferably about 4 to 7, and the culture temperature is usually about 20 to 40°C, preferably about 25 to 35°C, for 1 to 20 days, preferably 3 to 3. Incubate under aerobic conditions for about 10 days.
  • a shake culture method and an aerobic submerged culture method using a jar fermenter can be used.
  • the target enzyme is recovered from the culture solution or the bacterial cells.
  • the present enzyme can be obtained by separating and purifying by appropriately combining various chromatographic techniques.
  • the present enzyme can be obtained by, for example, crushing the cells by pressure treatment, ultrasonic treatment, etc., followed by separation and purification in the same manner as described above.
  • the series of steps may be performed after collecting the bacterial cells from the culture solution in advance by filtration, centrifugation, or the like.
  • This enzyme can be easily prepared by genetic engineering techniques. For example, it can be prepared by transforming a suitable host cell (eg, E. coli) with a DNA encoding the present enzyme and recovering the protein expressed in the transformant. The recovered protein is appropriately purified depending on the purpose. Various modifications are possible if the target enzyme is obtained as a recombinant protein in this way. For example, if a DNA encoding this enzyme and other suitable DNA are inserted into the same vector and a recombinant protein is produced using the vector, the recombinant protein consists of any peptide or protein linked thereto. This enzyme can be obtained. In addition of sugar chains and/or lipids, or modification that causes N-terminal or C-terminal processing may be performed. Such modifications enable extraction of recombinant proteins, simplification of purification, addition of biological functions, and the like.
  • a suitable host cell eg, E. coli
  • the recovered protein is appropriately purified depending on the purpose.
  • the target enzyme is obtained as a
  • an appropriate host-vector system is usually used to express the gene and recover the expression product (this enzyme), but a cell-free synthesis system may also be used.
  • the "cell-free synthesis system does not use living cells, but ribosomes derived from living cells (or obtained by genetic engineering techniques), It refers to the in vitro synthesis of mRNA or protein encoded by a template nucleic acid (DNA or mRNA) using transcription/translation factors.
  • a cell-free synthesis system generally uses a cell extract obtained by purifying a cell lysate as necessary.
  • Cell extracts generally contain various factors such as ribosomes and initiation factors necessary for protein synthesis, and various enzymes such as tRNA. When synthesizing proteins, other substances necessary for protein synthesis such as various amino acids, energy sources such as ATP and GTP, and creatine phosphate are added to the cell extract. Of course, ribosomes, various factors, and/or various enzymes prepared separately may be supplemented as necessary during protein synthesis.
  • cell-free transcription/translation system is used interchangeably with cell-free protein synthesis system, in vitro translation system or in vitro transcription/translation system.
  • In vitro translation systems use RNA as a template to synthesize proteins. Total RNA, mRNA, in vitro transcripts and the like are used as template RNA.
  • the other in vitro transcription/translation system uses DNA as a template.
  • the template DNA should contain a ribosome binding region and preferably contains a suitable terminator sequence.
  • conditions are set such that factors necessary for each reaction are added so that the transcription reaction and the translation reaction proceed continuously.
  • the purified enzyme obtained as described above can be powdered by, for example, freeze-drying, vacuum-drying, or spray-drying. At that time, the purified enzyme may be dissolved in advance in acetate buffer, phosphate buffer, triethanolamine buffer, Tris-HCl buffer, or GOOD buffer. Preferably, acetate buffers, phosphate buffers and triethanolamine buffers can be used.
  • the GOOD buffer includes PIPES, MES or MOPS.
  • the degree of purification of the enzyme is not particularly limited, for example, the Pz-peptide degradation activity is 1 to 20000 (U/g), preferably 10 to 10000 (U/g), more preferably 100 to 1000 (U/g). can be purified to Moreover, the final form may be liquid or solid (including powder).
  • Licinibacillus fusiformis-derived collagenase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 were determined as follows (for details, see Examples below). Therefore, this enzyme can also be specified by the following enzymatic chemical properties. Details of conditions for measuring collagenase activity, procedures for measuring collagenase activity, and the like when evaluating each enzymatic chemical property will be described in Examples below.
  • This enzyme is a collagenase that acts on collagen and gelatin to produce collagen tripeptides.
  • the optimum pH of this enzyme is about 7.
  • the optimum pH is, for example, pH 4-6 in acetate buffer, pH 6-7 in PIPES buffer, and pH 7-9 in Tris-HCl buffer (Tris-HCl). It is judged based on the measured results.
  • pH stability This enzyme exhibits stable activity in the pH range of pH6-8. For example, if the pH of the enzyme solution to be treated is within this range, the activity will be 70% or more of the maximum activity after treatment at 30°C for 30 minutes, while at pH 5 it will decrease to 10% or less of the maximum activity. This is useful in that the enzyme can be deactivated with relatively weak acidity so that the reaction does not proceed excessively. pH stability is measured, for example, in acetate buffer in the pH range of pH 4-6, in PIPES buffer in the pH range of pH 6-7, in Tris-HCl buffer (Tris-HCl) in the pH range of pH 7-9, In the pH range of pH 9-11, judgment is made based on the results of measurement in glycine buffer.
  • Collagen tripeptide Gly-X-Y CTP
  • Gly-Pro-Hyp Gly-Pro-Hyp
  • Gly-Pro-Ala Gly-Glu-Arg
  • Gly (glycine) Gly (glycine) at the N-terminus
  • This enzyme is characterized by a particularly high production of Gly-Glu-Arg when acted on collagen or gelatin.
  • the content of the active ingredient (the present enzyme) in the present enzymatic agent is not particularly limited. Amount can be set or adjusted.
  • the enzymatic agent of the present invention is usually solid (for example, granules, powders, immobilized enzymes obtained by immobilizing the enzyme on the surface or inside of a material such as silica or porous polymer) or liquid. provided.
  • the present enzyme preparation may contain excipients, buffers, suspending agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline, and the like. Examples of excipients that can be used include lactose, sorbitol, D-mannitol, maltodextrin, and sucrose.
  • Phosphate, citrate, acetate and the like can be used as buffers.
  • Propylene glycol, ascorbic acid and the like can be used as stabilizers.
  • Preservatives that can be used include phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben, and the like.
  • antiseptics benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
  • the present enzyme may be produced by obtaining a gene encoding the present enzyme and expressing the gene.
  • the gene encoding this enzyme consists of DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.
  • Specific examples of this aspect are DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:3 and DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:4.
  • the former DNA (SEQ ID NO: 3) encodes only the mature form amino acid sequence (SEQ ID NO: 1)
  • the latter DNA (SEQ ID NO: 4) contains the mature form (SEQ ID NO: 1 amino acid sequence), It encodes a signal peptide and prosequence.
  • the gene encoding this enzyme is typically used to prepare this enzyme. According to the genetic engineering preparation method using the gene encoding this enzyme, it is possible to obtain this enzyme in a more homogeneous state. In addition, the method can be said to be a suitable method for preparing a large amount of the present enzyme. The use of the gene encoding this enzyme is not limited to the preparation of this enzyme.
  • the nucleic acid can be used as an experimental tool for elucidating the mechanism of action of the present enzyme, or as a tool for designing or producing mutants (variants) of the present enzyme.
  • the term "gene encoding the present enzyme” refers to a nucleic acid from which the present enzyme is obtained when the gene is expressed, not to mention nucleic acids having a base sequence corresponding to the amino acid sequence of the present enzyme. , also includes nucleic acids that have sequences that do not encode amino acid sequences added to such nucleic acids. Codon degeneracy is also taken into account.
  • nucleic acids For nucleic acids, standard genetic engineering techniques, molecular biological techniques, biochemical techniques, chemical synthesis, and PCR (e.g., overlap PCR) are performed with reference to the sequence information disclosed in the present specification or the attached sequence listing. Alternatively, it can be prepared in an isolated state by a combination thereof.
  • a nucleic acid that has the same function as the protein encoded by the enzyme, but has a different base sequence in part (hereinafter referred to as "equivalent nucleic acid")
  • a base sequence that defines an equivalent nucleic acid is also referred to as an "equivalent base sequence"
  • An example of an equivalent nucleic acid is a base sequence containing one or more base substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions based on the base sequence of the nucleic acid encoding the present enzyme of the present invention, which is characteristic of the present enzyme.
  • DNA encoding a protein having a specific enzymatic activity (ie, collagenase activity). Substitution or deletion of bases may occur at multiple sites.
  • the term "plurality” as used herein means, for example, 2 to 40 bases, preferably 2 to 20 bases, more preferably 2 to 10 bases, although it varies depending on the positions and types of amino acid residues in the three-dimensional structure of the protein encoded by the nucleic acid. is.
  • the equivalent nucleic acid is, for example, 90% or more, preferably 92% or more, more preferably 94% or more, still more preferably 96% or more, still more preferably 96% or more, relative to the reference base sequence (SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4) have about 98% or greater identity, most preferably 99% or greater identity.
  • Equivalent nucleic acids such as those described above can be obtained by, for example, restriction enzyme treatment, treatment with exonuclease or DNA ligase, site-directed mutagenesis (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) or random mutation. It can be obtained by introducing a mutation by an introduction method (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Equivalent nucleic acids can also be obtained by other methods such as ultraviolet irradiation.
  • nucleic acid having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the gene encoding the present enzyme of the present invention may be used. Still another aspect of the present invention is at least about 90%, 92%, 94%, 96%, 98% or 99% of the nucleotide sequence of the gene encoding the present enzyme of the present invention, or the nucleotide sequence complementary thereto Nucleic acids with % identical base sequences are provided.
  • a nucleic acid having a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the gene encoding the present enzyme of the present invention or its equivalent nucleotide sequence may be used. good.
  • stringent conditions refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Such stringent conditions are known to those of skill in the art, see, for example, Molecular Cloning (Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) and Current protocols in molecular biology (edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987). can be set.
  • Stringent conditions include, for example, a hybridization solution (50% formamide, 10 ⁇ SSC (0.15M NaCl, 15mM sodiumcitrate, pH 7.0), 5 ⁇ Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate, 10 ⁇ g/ml denatured salmon Sperm DNA, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5)) is used for incubation at about 50°C, followed by washing with 0.1 x SSC, 0.1% SDS at about 65°C.
  • a hybridization solution 50% formamide, 10 ⁇ SSC (0.15M NaCl, 15mM sodiumcitrate, pH 7.0
  • 5 ⁇ Denhardt solution 1% SDS
  • 10% dextran sulfate 10 ⁇ g/ml denatured salmon Sperm DNA
  • 50 mM phosphate buffer pH 7.5
  • Further preferred stringent conditions include, for example, 50% formamide, 5 ⁇ SSC (0.15M NaCl, 15 mM sodiumcitrate, pH 7.0), 1 ⁇ Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate, 10 ⁇ g/ml as a hybridization solution. Conditions using denatured salmon sperm DNA, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5)) can be mentioned.
  • nucleic acid having a nucleotide sequence of the gene encoding the present enzyme of the present invention or a part of the nucleotide sequence complementary thereto may be used.
  • a nucleic acid fragment can be used for detecting, identifying and/or amplifying a nucleic acid having the base sequence of the gene encoding the present enzyme of the present invention.
  • a nucleic acid fragment is, for example, a continuous nucleotide portion (for example, about 10 to about 100 bases long, preferably about 20 to about 100 bases long, more preferably about 30 to about 100 bases long) in the nucleotide sequence of the gene encoding the present enzyme of the present invention. base length) is designed to include at least a portion that hybridizes.
  • Nucleic acid fragments can be labeled when used as probes. For example, fluorescent substances, enzymes, and radioactive isotopes can be used for labeling.
  • a recombinant DNA containing the above-described gene may be used.
  • Recombinant DNA is provided, for example, in the form of a vector.
  • vector refers to a nucleic acid molecule capable of transporting a nucleic acid inserted into it into a target such as a cell.
  • E. coli host vectors include M13 phage or variants thereof, ⁇ phage or variants thereof, pBR322 or variants thereof (pB325, pAT153, pUC8, etc.), and yeast hosts include pYepSec1, pMFa, pYES2.
  • yeast hosts include pYepSec1, pMFa, pYES2.
  • vectors that use insect cells as hosts include pAc and pVL
  • vectors that use mammal cells as hosts include pCDM8 and pMT2PC.
  • the vector is preferably an expression vector.
  • expression vector refers to a vector into which a nucleic acid inserted therein can be introduced into a target cell (host cell) and expressed in the cell.
  • An expression vector usually contains a promoter sequence required for expression of the inserted nucleic acid, an enhancer sequence that promotes expression, and the like.
  • Expression vectors containing selectable markers can also be used. When such an expression vector is used, the presence or absence (and degree of introduction) of the expression vector can be confirmed using a selection marker.
  • Insertion of nucleic acids into vectors, insertion of selectable marker genes (if necessary), insertion of promoters (if necessary), etc. can be performed using standard recombinant DNA techniques (e.g., Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, a well-known method using restriction enzymes and DNA ligase).
  • microorganisms such as Escherichia coli (Escherichia coli), Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), and budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) from the viewpoint of ease of handling.
  • Escherichia coli Escherichia coli
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • budding yeast Sacharomyces cerevisiae
  • Any host cell that is replicable and capable of expressing the gene of the present enzyme can be used.
  • E. coli include E. coli BL21(DE3)pLysS when a T7 promoter is used, and E. coli JM109 when not.
  • budding yeast include budding yeast SHY2, budding yeast AH22, and budding yeast INVSc1 (Invitrogen).
  • microorganisms that possess recombinant DNA may be used.
  • Microorganisms can be obtained by transfection or transformation using the vectors described above.
  • the calcium chloride method J. Mol. Biol., Vol. 53, pp. 159 (1970)
  • the Hanahan method J. Mol. Biology, Vol. 166, 557 (1983)
  • the SEM method Gene, Vol. 96, p. 23 (1990)
  • the method of Chung et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, No. 86 2172 (1989)
  • calcium phosphate coprecipitation method electroporation (Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165 (1984))
  • lipofection Felgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. be able to.
  • a further aspect of the present invention relates to use of the present enzymatic agent.
  • a method for producing collagen tripeptide (CTP) (hereinafter referred to as “method for producing CTP”) is provided.
  • the enzymatic agent is allowed to act on collagen or gelatin (denatured collagen).
  • the present enzymatic agent is added to a collagen or gelatin solution, for example, under conditions of 20 to 50°C, preferably 30 to 40°C, for a predetermined time (for example, 1 hour to 48 hours, preferably 1 hour to 24 hours, more preferably 1 hour to 12 hours).
  • Collagen tripeptide is produced as a result of the decomposition reaction by collagenase, which is the active ingredient of this enzymatic agent.
  • the composition, ratio, etc. of CTP in the product may vary depending on the type and origin of the substrate (collagen or gelatin) used, but according to the production method of the present invention, a tripeptide having Gly at the N-terminus (e.g., , Gly-Pro-Hyp, Gly-Pro-Ala, Gly-Glu-Arg), ie CTP-containing, is obtained. It is also one of the characteristics of the present invention that CTP can be generated by using the present enzymatic agent alone. However, it is also possible to use other collagenase, protease, or peptidase in combination to improve production efficiency.
  • the origin of the collagen/gelatin used is not particularly limited, and examples include fish, pigs, cows, and chickens. Commercially available collagen or gelatin may be used.
  • the method for preparing collagen or gelatin is also not particularly limited. For example, raw materials (animal skin, bones, tendons, fish scales, etc.) are washed with water and dried, and then demineralized with hydrochloric acid or the like as necessary. After washing, crude collagen is treated with caustic soda, hydrochloric acid, or the like. get In addition, gelatin can be extracted by heat-treating the crude collagen.
  • purification treatment for example, filtration, ion exchange, activated carbon treatment
  • purification treatment for example, filtration, ion exchange, activated carbon treatment
  • the second use of this enzymatic agent is to improve the quality of meat (softening of meat, etc.), preferably to improve the quality of meat containing cartilage or to decompose cartilage.
  • Use of the enzymatic agent of the present invention can efficiently decompose cartilage, improve the texture of meat containing cartilage, and improve the texture of meat containing bone and cartilage. It can help separate the cartilage from the bone.
  • the meat to be reacted with the enzyme is not particularly limited as long as it contains cartilage.
  • the term "meat" is used to also include processed meat products.
  • the method is to immerse the meat in the enzyme solution (solution of the enzyme agent), pressurize the meat to allow the enzyme solution to permeate the meat, or inject the enzyme solution into the meat.
  • This enzymatic agent may be allowed to act on the meat by a method of injecting the enzymatic solution into the meat and tumbling (a treatment in which the enzymatic solution is mechanically permeated).
  • the temperature conditions for the action are, for example, 4°C to 40°C, and may be 4°C to 30°C, 4°C to 25°C, or 4°C to 20°C, or 10°C to 40°C, 20°C to 40°C, 30°C to 40°C, or 35°C to 40°C.
  • the action time is, for example, 1 hour to 1 day, and may be 1 hour to 12 hours, 1 hour to 6 hours, 1 hour to 3 hours, or 1 hour to 2 hours.
  • ⁇ Reference example> Screening of collagenase-producing strains In order to find collagenases that can be used in food, we first screened the library of Amano Enzyme Co., Ltd. based on collagenase activity as a primary screening, and produced biosafety level 1 (BSL1) strains that showed high activity. 113 species of bacteria were selected.
  • BSL1 biosafety level 1
  • the culture supernatant of the selected 113 kinds of producing bacteria was reacted with gelatin, the content of peptides with Gly at the N-terminus in the reaction products was evaluated, and 19 kinds of producing bacteria were selected.
  • the total peptide amount was quantified with a ninhydrin reagent.
  • the amount of peptides having Gly at the N-terminus was quantified using a collagen quantification kit (manufactured by Cosmo Bio).
  • tripeptides were partially purified by gel filtration chromatography from the culture supernatants of 19 kinds of producing bacteria and gelatin reaction products, and then analyzed by reversed-phase chromatography. After partially purifying the culture supernatant of a promising producer from the analytical results, the collagenase-producing strain Lysinibacillus fusiformis 57413 was finally selected by evaluating the ability of collagenase to generate CTP.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 is the amino acid sequence (mature form) of collagenase derived from Lysinibacillus fusiformis 57413 strain.
  • SEQ ID NO: 6 shows the amino acid sequence of collagenase derived from Lysinibacillus fusiformis strain 57413, which also has a signal peptide and a pro-sequence.
  • the DNA of SEQ ID NO: 7 encodes only the amino acid sequence of the mature form (SEQ ID NO: 5), and the DNA of SEQ ID NO: 8 contains the mature form (amino acid sequence of SEQ ID NO: 5), a signal peptide and a prosequence. is coded.
  • Upstream forward primer: GGAAACAATCTAAATGTGTCT (SEQ ID NO: 9)
  • Downstream Reverse primer: CCGCCTTTAAAGGCTCTCCGA (SEQ ID NO: 10)
  • An expression plasmid was constructed by introducing the 57413 strain collagenase gene into pColdIII (manufactured by Takara Bio Inc.). Using the constructed expression plasmid, Escherichia coli BL21 was transformed by a conventional method. After culturing the transformant in LB medium (added with ampicillin) overnight at 37°C, the culture solution was inoculated into LB medium (added with ampicillin) at 1% volume and cultured at 37°C for 2 hours. Cultivation was performed overnight at °C.
  • Collagenase activity was measured using PROTAZYME OL TABLETS (manufactured by Megazyme). 300 ⁇ L of the substrate solution suspended in 10 mM CaCl 2 200 mM Tris buffer per OL tablet was dispensed into a 1.5 mL tube with stirring and placed on ice. 100 ⁇ L of the enzyme solution was added to and mixed with the dispensed substrate solution, and the mixture was stirred for 30 minutes in a bioshaker set at 40° C. to cause a reaction. After 30 minutes of reaction, 1 mL of 2% trisodium phosphate solution was added to terminate the enzymatic reaction, followed by centrifugation (13000 g, 10 minutes). 200 ⁇ L of the supernatant was transferred to a microtiter plate and the absorbance at 590 nm was measured. The intensity of collagenase activity was judged by the 590 nm value that increased over 30 minutes.
  • Casein degradation activity was measured using PROTAZYME AK TABLETS (manufactured by Megazyme). 300 ⁇ L of the substrate solution suspended in 10 mM CaCl2 200 mM Tris buffer per 1 tablet of AK was dispensed into a 1.5 mL tube while stirring and placed on ice. 100 ⁇ L of the enzyme solution was added to and mixed with the dispensed substrate solution, and the mixture was stirred for 30 minutes in a bioshaker set at 40° C. to cause a reaction. After 30 minutes of reaction, 1 mL of 2% trisodium phosphate solution was added to terminate the enzymatic reaction, followed by centrifugation (13000 g, 10 minutes). 200 ⁇ L of the supernatant was transferred to a microtiter plate and the absorbance at 590 nm was measured. The intensity of casein degradation activity was judged by the 590 nm value that increased in 30 minutes.
  • 7128 Strain Collagenase Enzyme Powder A collagenase-producing Lysinibacillus fusiformis 7128 strain was selected according to "1. Screening for collagenase-producing strains" in Reference Example. Prepare 20 L of gelatin-containing medium (5% fish gelatin, 0.5% yeast extract, 2% NaCl) in a jar fermenter (30 L), steam sterilize, and add 200 mL of strain 7128 cultured overnight in SCD medium. , 30°C, 200 rpm agitation, and 0.5 vvm aeration for 36 hours. The resulting culture solution was subjected to diatomaceous earth filtration to obtain a crude enzyme solution.
  • gelatin-containing medium 5% fish gelatin, 0.5% yeast extract, 2% NaCl
  • This crude enzyme solution was filtered with 1% activated carbon to obtain a clear filtrate.
  • This clarified filtrate was subjected to ultrafiltration (molecular weight cutoff: 6000), added with 4 times the amount of water, and desalted and concentrated. This was subjected to diatomaceous earth filtration and membrane filter filtration (0.45 ⁇ m), and the resulting filtrate was freeze-dried to obtain 7128 strain collagenase enzyme powder.
  • sequence identification of 7128 strain collagenase The gene sequence was confirmed using primers designed based on the sequence information of collagenase derived from 57413 strain. Amino acid sequences were also determined from the gene sequences.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence (mature form) of collagenase derived from Lysinibacillus fusiformis 7128 strain.
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of collagenase derived from Lysinibacillus fusiformis strain 7128, which also has a signal peptide and a pro-sequence.
  • the DNA of SEQ ID NO: 3 encodes only the amino acid sequence of the mature form (SEQ ID NO: 1), and the DNA of SEQ ID NO: 4 contains the mature form (amino acid sequence of SEQ ID NO: 1), a signal peptide and a prosequence. is coded.
  • FIGS. 5-8 The results are shown in FIGS. 5-8. It was found that the enzyme of the present invention exhibits the ability to produce Gly-Pro-Hyp, Gly-Pro-Ala and Gly-Glu-Arg. In particular, it was found that the ability to produce Gly-Glu-Arg was excellent.
  • Degree of cartilage degradation (weight of dry residue of blank - weight of enzyme-treated dry residue) / weight of dry residue of blank x 100
  • the enzyme agent of the present invention contains collagenase derived from highly safe microorganisms as an active ingredient. Therefore, it is suitable for use in the fields of food and medical applications, and has high industrial utility value.
  • SEQ ID NO: 9 Artificial Sequence Description: Forward Primer
  • SEQ ID NO: 10 Artificial Sequence Description: Reverse Primer

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明の課題は、コラーゲントリペプチド製造、又は軟骨分解など、食品又は医療用途に有用な安全性の高いプロテアーゼ（コラゲナーゼ）及びその用途等を提供することである。本発明によれば、配列番号１のアミノ酸配列又はそれと等価なアミノ酸配列からなるコラゲナーゼを有効成分とする、コラーゲントリペプチド製造のための酵素剤が提供される。

Description

コラーゲントリペプチド製造又は軟骨分解のための酵素剤
　本発明は、コラゲナーゼを有効成分とする、コラーゲントリペプチド製造又は軟骨分解のための酵素剤、及びその用途に関する。
　機能性ペプチドと知られているコラーゲンペプチドの世界市場は成長することが予測されている。コラーゲンペプチドの中でも、コラーゲンの最小単位であるトリペプチドGly-X-Y（コラーゲントリペプチド。以下、「CTP」と略称することがある)は体内への吸収性が高く、また、様々な機能性を有しているため、その利用価値が高いとされる。
　CTPを効率良く製造するためには、コラーゲン又はゼラチンのGly残基位置で特異的に切断し、且つトリペプチドまで分解できるプロテアーゼ（コラゲナーゼ）が有用である。コラゲナーゼの例として、Clostridium属やVibrio属由来のコラゲナーゼ、Bacillus cereusコラゲナーゼ(Microbial collagenase(EC.3.4.24.3)に属する)が知られているが、コラゲナーゼ生産菌がバイオセーフティーレベル２（BSL2）であり、その安全性が懸念されることから、食品用途や医療用途等に使用されるCTPの製造には適当ではないといえる。
　食品用途に利用可能なコラゲナーゼとして、ストレプトミセス（Streptomyces）属由来コラゲナーゼが知られている（特許文献１）が、CTP製造に利用可能であるかは分かっていない。また、既存のコラゲナーゼは概して安定性に難がある。安定性に優れ、比活性も高いとされる微生物由来コラゲナーゼとして、ビブリオ・ホリセー（Vibrio hollisae）由来コラゲナーゼ（特許文献２におけるビブリオ・エス・ピー（Vibrio sp）1706B菌株由来コラゲナーゼ）が知られている（特許文献２、特許文献３）。しかし、ビブリオ・ホリセー（Vibrio hollisae）由来のコラゲナーゼの熱安定性は30℃以下であり、実用上、不十分である。
　また、性質の異なる様々なコラゲナーゼが存在することが知られている。例えば、クロストリジウム・ヒストリチカム属由来のコラゲナーゼには2つの異なるコラゲナーゼタイプ（I、II）が知られており、コラゲナーゼＩは、コラゲナーゼIIよりコラーゲンおよびゼラチンに対して高い活性を有しかつ短鎖ペプチドに対して低い活性を有する（特許文献４）。さらにクロストリジウム・ヒストリチカム由来のコラゲナーゼはコラーゲン様配列からCTPを切り出す分解率は低いことが知られている（特許文献５）。
　食品用途で使用可能なCTPをコラーゲンから製造することに適したコラゲナーゼには、コラゲナーゼ生産菌が安全菌であること、コラーゲン分解能又はゼラチン分解能を有すること、及びCTP生成能を有することが求められ、また、好ましくは安定性が高いことも求められるが、このような条件を満たして実用化されているコラゲナーゼは知られていない。
　一方で、食品用途のためには高い軟骨分解能を有するコラゲナーゼが求められる場合もあるが、高い軟骨分解能を有するコラゲナーゼについては知られていない。
特公平５－１６８３２号公報 特開平８－７０８５３号公報 特開２０１０－２６３８８０号公報 特表２００１－５１０３３１号公報 特開２０１８－１８３１０６号公報
　上記背景の下で本発明は、コラーゲントリペプチド製造、又は軟骨分解など、食品又は医療用途に有用な安全性の高いプロテアーゼ（コラゲナーゼ）及びその用途等を提供することを課題とする。
　本発明者らは、CTP生成能が高く、軟骨分解能が高く、しかも安全性の高いコラゲナーゼの取得を目指し、微生物由来の酵素を広くスクリーニングした。その結果、Lysinibacillus fusiformisの特定の菌株が目的に合致したコラゲナーゼを産生することが判明した。当該コラゲナーゼはコラゲナーゼ分解能、CTP生成能を示し、軟骨分解能が高く、産業上の利用価値が高いものであった。本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　配列番号１のアミノ酸配列又はそれと等価なアミノ酸配列からなるコラゲナーゼを有効成分とする、コラーゲントリペプチド製造のための酵素剤。
＜２＞　等価なアミノ酸配列からなるコラゲナーゼが、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号１のアミノ酸配列からなるコラゲナーゼと牛骨ゼラチンからのGly-Glu-Argの生成能が同等であるコラゲナーゼである、＜１＞に記載の酵素剤。
＜３＞　コラゲナーゼがLysinibacillus fusiformis由来である、＜１＞又は＜２＞に記載の酵素剤。
＜４＞　Lysinibacillus fusiformisに由来し、以下の理化学的性質を有するコラゲナーゼを有効成分とする、コラーゲントリペプチド製造のための酵素剤。
（１）至適温度：４０℃付近である。
（２）温度安定性：最も活性が高かった処理温度での活性を１００％とした相対残存活性について４℃から４０℃までは８０％以上であり、５０℃では１０％以下である。
（３）至適ｐＨ：至適ｐＨは７付近である。
（４）ｐＨ安定性：最も活性が高かった処理ｐＨでの活性を１００％とした相対残存活性について、ｐＨが６～８の範囲では８０％以上であり、ｐＨ５では１０％以下である。
＜５＞　配列番号１のアミノ酸配列又はそれと等価なアミノ酸配列からなるコラゲナーゼを有効成分とする、食肉軟化及び／又は軟骨分解のための酵素剤。
＜６＞　等価なアミノ酸配列からなるコラゲナーゼが、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号１のアミノ酸配列からなるコラゲナーゼと鶏軟骨分解能が同等であるコラゲナーゼである、＜５＞に記載の酵素剤。
＜７＞　コラゲナーゼがLysinibacillus fusiformis由来である、＜５＞又は＜６＞に記載の酵素剤。
＜８＞　Lysinibacillus fusiformisに由来し、以下の理化学的性質を有するコラゲナーゼを有効成分とする、食肉軟化及び／又は軟骨分解のための酵素剤。
（１）至適温度：４０℃付近である。
（２）温度安定性：最も活性が高かった処理温度での活性を１００％とした相対残存活性について４℃から４０℃までは８０％以上であり、５０℃では１０％以下である。
（３）至適ｐＨ：至適ｐＨは７付近である。
（４）ｐＨ安定性：最も活性が高かった処理ｐＨでの活性を１００％とした相対残存活性について、ｐＨが６～８の範囲では８０％以上であり、ｐＨ５では１０％以下である。
＜９＞　＜１＞から＜４＞の何れか一に記載の酵素剤をコラーゲン又はゼラチンに作用させることを特徴とする、コラーゲントリペプチドの製造方法。
＜１０＞　＜５＞から＜８＞の何れか一に記載の酵素剤を食肉及び／又は軟骨に作用させることを特徴とする、食肉軟化及び／又は軟骨分解方法。
図１は、Lysinibacillus fusiformis 7128株由来のコラゲナーゼの至適温度を示す。 図２は、Lysinibacillus fusiformis7128株由来のコラゲナーゼの温度安定性を示す。 図３は、Lysinibacillus fusiformis 7128株由来のコラゲナーゼの至適pHを示す。 図４は、Lysinibacillus fusiformis7128株由来のコラゲナーゼのpH安定性を示す。 図５は、コラーゲントリペプチドであるGly-Pro-Hypの生成能（魚ゼラチン）を確認した結果を示す。 図６は、コラーゲントリペプチドであるGly-Pro-Alaの生成能（魚ゼラチン）を確認した結果を示す。 図７は、コラーゲントリペプチドであるGly-Glu-Argの生成能（魚ゼラチン）を確認した結果を示す。 図８は、コラーゲントリペプチドであるGly-Glu-Argの生成能（牛骨ゼラチン）を確認した結果を示す。 図９は、軟骨分解能を測定した結果を示す。
１．コラーゲントリペプチド製造又は軟骨分解のための酵素剤
　本発明の第１の局面は、コラーゲントリペプチド製造あるいは食肉軟化及び／又は軟骨分解のための酵素剤に関する。本発明の酵素剤（以下、「本酵素剤」とも呼ぶ）は、有効成分としてコラゲナーゼ（以下、「本酵素」とも呼ぶ）を含有する。本発明の酵素剤は、コラーゲントリペプチド製造あるいは食肉軟化及び／又は軟骨分解において有用である（詳細は後述する）。有効成分のコラゲナーゼ、即ち本酵素は、配列番号１に示すアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と等価なアミノ酸配列からなる。ここでの「等価なアミノ酸配列」とは、基準のアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸配列）と一部で相違するが、当該相違がタンパク質の機能（ここではコラーゲン分解活性）に実質的な影響を与えていないアミノ酸配列のことを意味し、本発明においてはさらに、牛骨ゼラチンからのGly-Glu-Argの生成能が同等であるアミノ酸配列、または鶏軟骨分解能が同等であるアミノ酸配列を意味する。従って、等価なアミノ酸配列を有する酵素はコラーゲンの分解反応を触媒し、牛骨ゼラチンからのGly-Glu-Argの生成能を有するか、および/又は鶏軟骨分解能を有する。上記のコラーゲン分解活性、Gly-Glu-Argの生成能、および鶏軟骨分解能の程度は、コラゲナーゼとしての機能を発揮できる限り特に限定されない。但し、基準となるアミノ酸配列からなる酵素（配列番号１のアミノ酸配列を有する）と同程度又はそれよりも高いことが好ましい。牛骨ゼラチンからのGly-Glu-Argの生成能が同等とは、基準のアミノ酸配列を有するコラゲナーゼと比較して、±１０％の生成能、好ましくは±５％の生成能を有することを言う。鶏軟骨分解能が同等とは、基準のアミノ酸配列を有するコラゲナーゼと比較して、±１０％の分解能、好ましくは±５％の分解能を有することを言う。
　配列番号１のアミノ酸配列はLysinibacillus fusiformis由来のコラゲナーゼのアミノ酸配列（成熟体）である。尚、シグナルペプチドとプロ配列も有する、Lysinibacillus fusiformis由来のコラゲナーゼのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
　「アミノ酸配列の一部の相違」は、例えば、アミノ酸配列を構成するアミノ酸の中の１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、アミノ酸配列に対して１又は複数のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの任意の組合せによって生じる。アミノ酸配列の一部の相違はコラーゲン分解活性、Gly-Glu-Argの生成能、および/又は鶏軟骨分解能が保持される限り許容される（活性の多少の変動があってもよい）。この条件を満たす限り、アミノ酸配列の相違する位置は特に限定されない。また、アミノ酸配列の相違が複数の箇所（場所）で生じていてもよい。
　アミノ酸配列の一部の相違をもたらすアミノ酸の数は、アミノ酸配列を構成する全アミノ酸の例えば約２０％以下に相当する数であり、好ましくは約１５％以下に相当する数であり、より好ましくは約１０％以下に相当する数であり、より好ましくは約５％以下に相当する数であり、より好ましくは約３％以下に相当する数であり、より好ましくは約２％以下に相当する数であり、より好ましくは約１％以下に相当する数であり、より好ましくは約０．７％以下に相当する数であり、より好ましくは約０．５％以下に相当する数であり、より好ましくは約０．３％以下に相当する数であり、さらに好ましくは約０．１％以下に相当する数である。従って、等価タンパク質は、基準のアミノ酸配列と、例えば約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９７％以上、より好ましくは約９８％以上、より好ましくは約９９％以上、より好ましくは約９９．３％以上、より好ましくは約９９．５％以上、より好ましくは約９９．７％以上、さらに好ましくは約９９．９％以上の同一性を有する。
　アミノ酸配列の一部の相違」の典型例の一つは、アミノ酸配列を構成するアミノ酸の中の１～４０個（好ましくは１～３０個、より好ましくは１～１０個、更に好ましくは１～７個、更に更に好ましくは１～５個、より一層好ましくは１～３個）のアミノ酸の欠失、置換、アミノ酸配列に対して１～４０個（好ましくは１～３０個、より好ましくは１～１０個、更に好ましくは１～７個、更に更に好ましくは１～５個、より一層好ましくは１～３個）のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異（変化）が生じていることである。
　好ましくは、コラーゲン分解能に必須でないアミノ酸残基において保存的アミノ酸置換が生じることによって等価なアミノ酸配列が得られる。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
　二つのアミノ酸配列の同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる（例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい）。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。二つの配列の同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（すなわち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数×１００）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数およびサイズも考慮に入れる。
　二つの配列の比較及び同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 87:2264-68に記載され、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。アミノ酸配列の同一性は例えば、National Center for Biotechnology Information（NCBI）のblastp(protein-protein BLAST)により得ることが出来る。パラメータはデフォルトのパラメータを用いれば良いが、例えばBLOSUM62マトリックスを使用してGap CostsをExistence:11、Extension:1に設定すればよい。
　本酵素剤の有効成分であるコラゲナーゼ、即ち本酵素は、より大きいタンパク質（例えば融合タンパク質）の一部であってもよい。融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組み換え生産の際の安定性を確保する付加配列等が挙げられる。
　本酵素は、当該コラゲナーゼを産生する微生物（コラゲナーゼ産生株）、例えば、リシニバシラス・フシフォルミス（Lysinibacillusfusiformis）を培養することにより得ることができる。コラゲナーゼ産生株は野生株であっても変異株（例えば紫外線照射によって変異株が得られる）であってもよい。
　本酵素は、本酵素を産生する微生物の培養液及び／又は菌体より調製することができる。培養条件や培養法は、本酵素が生産されるものである限り特に限定されない。即ち、本酵素が生産されることを条件として、使用する微生物の培養に適合した方法や培養条件を適宜設定できる。培養法としては液体培養、固体培養のいずれでも良いが、好ましくは液体培養が利用される。液体培養を例にとり、その培養条件を説明する。
　培地としては、使用する微生物が生育可能な培地であれば、特に限定されない。例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいは、ゼラチン、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。使用する微生物の生育を促進するためにビタミン、アミノ酸などを培地に添加してもよい。培地のpHは例えば約3～8、好ましくは約4～7程度に調整し、培養温度は通常約20～40℃、好ましくは約25～35℃程度で、1～20日間、好ましくは3～10日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャーファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。
　以上の条件で培養した後、培養液又は菌体より目的の酵素を回収する。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、イオン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。
　本酵素は、遺伝子工学的手法によっても容易に調製することができる。例えば、本酵素をコードするDNAで適当な宿主細胞（例えば大腸菌）を形質転換し、形質転換体内で発現されたタンパク質を回収することにより調製することができる。回収されたタンパク質は目的に応じて適宜精製される。このように組換えタンパク質として目的の酵素を得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、本酵素をコードするDNAと他の適当なDNAとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本酵素を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはN末端若しくはC末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。
　通常は、以上のように適当な宿主－ベクター系を利用して遺伝子の発現～発現産物（本酵素）の回収を行うが、無細胞合成系を利用することにしてもよい。ここで、「無細胞合成系（無細胞転写系、無細胞転写／翻訳系）」とは、生細胞を用いるのではく、生細胞由来の（或いは遺伝子工学的手法で得られた）リボソームや転写・翻訳因子などを用いて、鋳型である核酸（DNAやmRNA）からそれがコードするmRNAやタンパク質をin vitroで合成することをいう。無細胞合成系では一般に、細胞破砕液を必要に応じて精製して得られる細胞抽出液が使用される。細胞抽出液には一般に、タンパク質合成に必要なリボソーム、開始因子などの各種因子、tRNAなどの各種酵素が含まれる。タンパク質の合成を行う際には、この細胞抽出液に各種アミノ酸、ATP、GTPなどのエネルギー源、クレアチンリン酸など、タンパク質の合成に必要なその他の物質を添加する。勿論、タンパク質合成の際に、別途用意したリボソームや各種因子、及び／又は各種酵素などを必要に応じて補充してもよい。
　タンパク質合成に必要な各分子（因子）を再構成した転写／翻訳系の開発も報告されている（Shimizu, Y.et al.: Nature Biotech., 19, 751-755, 2001）。この合成系では、バクテリアのタンパク質合成系を構成する３種類の開始因子、３種類の伸長因子、終結に関与する４種類の因子、各アミノ酸をtRNAに結合させる２０種類のアミノアシルtRNA合成酵素、及びメチオニルtRNAホルミル転移酵素からなる３１種類の因子の遺伝子を大腸菌ゲノムから増幅し、これらを用いてタンパク質合成系をin vitroで再構成している。本発明ではこのような再構成した合成系を利用してもよい。
　用語「無細胞転写／翻訳系」は、無細胞タンパク質合成系、in vitro翻訳系又はin vitro転写／翻訳系と交換可能に使用される。in vitro翻訳系ではRNAが鋳型として用いられてタンパク質が合成される。鋳型RNAとしては全RNA、mRNA、in vitro転写産物などが使用される。他方のin vitro転写／翻訳系ではDNAが鋳型として用いられる。鋳型DNAはリボソーム結合領域を含むべきであって、また適切なターミネータ配列を含むことが好ましい。尚、in vitro転写／翻訳系では、転写反応及び翻訳反応が連続して進行するように各反応に必要な因子が添加された条件が設定される。
　上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥や真空乾燥或いはスプレードライなどにより粉末化して提供することも可能である。その際、精製酵素を予め酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、トリス塩酸緩衝液やGOODの緩衝液に溶解させておいてもよい。好ましくは、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液を使用することができる。尚、ここでGOODの緩衝液としてはPIPES、MES又はMOPSが挙げられる。
　酵素の精製度は特に限定されないが、例えばPz-peptide分解活性が1～20000(U/g)、好ましくは10～10000(U/g)、より好ましくは100～1000(U/g)の状態に精製することができる。また、最終的な形態は液体状であっても固体状（粉体状を含む）であってもよい。
　本発明者らの検討によって、配列番号１のアミノ酸配列からなる、リシニバシラス・フシフォルミス由来コラゲナーゼの諸性質が以下の通り決定された（詳細は後述の実施例を参照）。従って、本酵素を以下の酵素化学的性質によっても特定することができる。尚、各酵素化学的性質を評価する際のコラゲナーゼ活性の測定条件、測定手順などの詳細は後述の実施例に示す。
　(1)作用
　本酵素はコラゲナーゼであり、コラーゲンやゼラチンに作用してコラーゲントリペプチドを生成する。
　(2)至適温度
　本酵素の至適温度は40℃である。
　(3)温度安定性
　本酵素はTris-塩酸緩衝液中、pH7の条件下、40℃以下（0℃～40℃）の条件で30分処理しても実質的な活性の低下はない。上記条件下において、50℃～60℃の条件で30分処理した場合には、活性は10%以下に低下する。これは、反応が過度に進行しないように酵素を失活させる際に比較的低温で失活できる点で有用である。
　(4)至適pH
　本酵素の至適pHは約7である。至適pHは、例えば、pH4～6のpH域では酢酸緩衝液中、pH6～7のpH域ではPIPES緩衝液中、pH7～9のpH域ではTris-塩酸緩衝液（Tris-HCl）中で測定した結果を基に判断される。
　(5)pH安定性
　本酵素はpH6～8のpH域で安定した活性を示す。例えば、処理に供する酵素溶液のpHがこの範囲内にあれば、30℃、30分の処理後、最大活性の70％以上の活性を示す一方、pH5では最大活性の10%以下に低下する。これは、反応が過度に進行しないように酵素を失活させる際に比較的弱酸性で失活できる点で有用である。pH安定性は、例えば、pH4～6のpH域では酢酸緩衝液中、pH6～7のpH域ではPIPES緩衝液中、pH7～9のpH域ではTris-塩酸緩衝液（Tris-HCl）中、pH9～11のpH域ではグリシン緩衝液中で測定した結果を基に判断される。
　本酵素をコラーゲン又はゼラチンに作用させることによって、Gly（グリシン）をN末端に有する、Gly-Pro-Hyp、Gly-Pro-Ala、Gly-Glu-Arg等のコラーゲントリペプチドGly-X-Y（CTP）を得ることができる。本酵素は、コラーゲン又はゼラチンに作用させた場合、特に、Gly-Glu-Argの生成量が高いことを特徴とする。
　本酵素剤における有効成分（本酵素）の含有量は特に限定されないが、例えば、本酵素剤1g当たりのPz-peptide分解活性が1U～500U、好ましくは10U～300Uになるように有効成分の含有量を設定ないし調整することができる。本発明の酵素剤は通常、固体状（例えば、顆粒、粉体、シリカや多孔質ポリマー等の表面又は内部に酵素を固定させうる素材に当該酵素を固定化した固定化酵素）又は液体状で提供される。本酵素剤は、有効成分（本酵素）の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としては乳糖、ソルビトール、D-マンニトール、マルトデキストリン、白糖等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
２．遺伝子
　本酵素は、本酵素をコードする遺伝子を取得し、当該遺伝子を発現させることにより製造してもよい。一態様において本酵素をコードする遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするDNAからなる。当該態様の具体例は、配列番号３に示す塩基配列からなるDNA、及び配列番号４に示す塩基配列からなるDNAである。前者のDNA（配列番号３）は成熟体のアミノ酸配列（配列番号１）のみをコードするものであり、後者のDNA（配列番号４）は、成熟体（配列番号１のアミノ酸配列）に加え、シグナルペプチドとプロ配列をコードしている。
　本酵素をコードする遺伝子は典型的には本酵素の調製に利用される。本酵素をコードする遺伝子を用いた遺伝子工学的調製法によれば、より均質な状態の本酵素を得ることが可能である。また、当該方法は大量の本酵素を調製する場合にも好適な方法といえる。尚、本酵素をコードする遺伝子の用途は本酵素の調製に限られない。例えば、本酵素の作用機構の解明などを目的とした実験用のツールとして、或いは本酵素の変異体（改変体）をデザイン又は作製するためのツールとして、当該核酸を利用することもできる。
　本明細書において「本酵素をコードする遺伝子」とは、それを発現させた場合に本酵素が得られる核酸のことをいい、本酵素のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有する核酸は勿論のこと、そのような核酸にアミノ酸配列をコードしない配列が付加されてなる核酸をも含む。また、コドンの縮重も考慮される。
　核酸は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法、化学合成、PCR法（例えばオーバーラップPCR）或いはこれらの組合せによって、単離された状態に調製することができる。
　本発明の他の態様では、本酵素をコードする遺伝子の塩基配列と比較した場合にそれがコードするタンパク質の機能は同等であるものの一部において塩基配列が相違する核酸（以下、「等価核酸」ともいう。また、等価核酸を規定する塩基配列を「等価塩基配列」ともいう）が提供される。等価核酸の例として、本発明の本酵素をコードする核酸の塩基配列を基準として１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、本酵素に特徴的な酵素活性（即ちコラゲナーゼ活性）を有するタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該核酸がコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば2～40塩基、好ましくは2～20塩基、より好ましくは2～10塩基である。等価核酸は、基準となる塩基配列（配列番号３又は配列番号４）に対して、例えば90％以上、好ましくは92%以上、より好ましくは94％以上、更に好ましくは96％以上、更に更に好ましくは約98％以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有する。
　以上のような等価核酸は例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやDNAリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13,Cold Spring HarborLaboratory Press, New York）やランダム突然変異導入法（MolecularCloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork）による変異の導入などによって得られる。また、紫外線照射など他の方法によっても等価核酸を得ることができる。
　本発明においては、本発明の本酵素をコードする遺伝子の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸を使用してもよい。本発明の更に他の態様は、本発明の本酵素をコードする遺伝子の塩基配列、或いはそれに相補的な塩基配列に対して少なくとも約90％、92％、94％、96％、98％又は99％同一な塩基配列を有する核酸を提供する。
　本発明においては、本発明の本酵素をコードする遺伝子の塩基配列又はその等価塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する核酸を使用してもよい。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold SpringHarbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols inmolecular biology（edited by Frederick M. Ausubel etal., 1987）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアミド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodiumcitrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl,15mM sodiumcitrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。
　本発明においては、本発明の本酵素をコードする遺伝子の塩基配列、或いはそれに相補的な塩基配列の一部を有する核酸（核酸断片）を使用してもよい。このような核酸断片は、本発明の本酵素をコードする遺伝子の塩基配列を有する核酸などを検出、同定、及び／又は増幅することなどに用いることができる。核酸断片は例えば、本発明の本酵素をコードする遺伝子の塩基配列において連続するヌクレオチド部分（例えば約10～約100塩基長、好ましくは約20～約100塩基長、更に好ましくは約30～約100塩基長）にハイブリダイズする部分を少なくとも含むように設計される。プローブとして利用される場合には核酸断片を標識化することができる。標識化には例えば、蛍光物質、酵素、放射性同位元素を用いることができる。
　本発明においては、上記した遺伝子（本酵素をコードする遺伝子）を含む組換えDNAを使用してもよい。組換えDNAは例えばベクターの形態で提供される。本明細書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいう。
　使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。大腸菌を宿主とするベクターとしてはM13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体（pB325、pAT153、pUC8など）等、酵母を宿主とするベクターとしてはpYepSec1、pMFa、pYES2等、昆虫細胞を宿主とするベクターとしてはpAc、pVL等、哺乳類細胞を宿主とするベクターとしてはpCDM8、pMT2PC等を例示することができる。
　ベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や、発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には、選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。
　核酸のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えDNA技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition,1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。
　宿主細胞としては、取り扱いの容易さの点から、大腸菌（エシェリヒア・コリ）、枯草菌(バチルス・サブティリス)、出芽酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）などの微生物を用いることが好ましいが、組換えDNAが複製可能で且つ本酵素の遺伝子が発現可能な宿主細胞であれば利用可能である。大腸菌の例としてT7系プロモーターを利用する場合は大腸菌BL21(DE3)pLysS、そうでない場合は大腸菌JM109を挙げることができる。また、出芽酵母の例として出芽酵母SHY2、出芽酵母AH22あるいは出芽酵母INVSc1（インビトロジェン社）を挙げることができる。
　本発明においては、組換えDNAを保有する微生物（即ち形質転換体）を使用してもよい。微生物は、上記のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって得ることができる。例えば、塩化カルシウム法（ジャーナルオブ モレキュラー バイオロジー(J.Mol. Biol.)、第53巻、第159頁 (1970)）、ハナハン（Hanahan）法（ジャーナルオブ モレキュラー バイオロジー、第166巻、第557頁 (1983)）、SEM法（ジーン（Gene)、第96巻、第23頁(1990)〕、チャング（Chung）らの方法（プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ USA、第86巻、第2172頁(1989)）、リン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter,H.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.84,7413-7417(1984))等によって実施することができる。尚、上記した微生物は、本発明の本酵素を生産することに利用することができる。
３．本酵素剤の用途
　本発明の更なる局面は本酵素剤の用途に関する。第１の用途として、コラーゲントリペプチド（CTP）の製造方法（以下、「CTP製造方法」と呼ぶ）が提供される。本発明のCTP製造方法では本酵素剤をコラーゲン又はゼラチン（変性コラーゲン）に作用させる。例えば、本酵素剤をコラーゲン又はゼラチンの溶液に添加し、例えば20～50℃、好ましくは30～40℃の条件下、所定時間（例えば、1時間～48時間、好ましくは1時間～24時間、より好ましくは1時間～12時間）反応させる。本酵素剤の有効成分であるコラゲナーゼによる分解反応の結果、コラーゲントリペプチドが生成する。使用する基質（コラーゲン又はゼラチン）の種類や由来等によって、製造物中のCTPの組成や比率等は変動し得るが、本発明の製造方法によれば、GlyをN末端に有するトリペプチド（例えば、Gly-Pro- Hyp、Gly-Pro-Ala、Gly-Glu-Arg）を含有する組成物、即ちCTP含有物が得られる。本酵素剤単独での使用によってCTPを生成させることができることは本発明の特徴の一つでもある。但し、別のコラゲナーゼやプロテアーゼ、或いはペプチダーゼを併用し、製造効率の向上等を図ることも可能である。
　使用するコラーゲン／ゼラチンの由来は特に限定されず、その例として魚、豚、牛、鶏を挙げることができる。市販されているコラーゲン又はゼラチンを使用することにしてもよい。コラーゲン又はゼラチンの調製法も特に限定されない。例えば、原料（動物の皮膚や骨、腱、或いは魚鱗など）を水洗・乾燥させた後、必要に応じて塩酸等を用いて脱灰処理し、洗浄後、苛性ソーダや塩酸等の処理により粗コラーゲンを得る。また、粗コラーゲンを熱処理することでゼラチンを抽出することができる。
　本酵素剤による酵素反応の後は、不溶成分の除去や純度の向上、或いは脱色、除臭等のために、必要に応じて精製処理（例えば、ろ過、イオン交換、活性炭処理）が行われる。
　本酵素剤の第２の用途は、食肉の品質改良（食肉の軟化など）、好ましくは軟骨を含有する食肉の品質改良又は軟骨の分解である。本発明の酵素剤を使用すると、軟骨を効率的に分解することができ、軟骨を含む食肉の場合には、食感を向上することができ、また骨と軟骨を含む食肉の場合には、骨から軟骨を分離しやすくすることができる。酵素を反応させる食肉は、軟骨を含む食肉であれば特に限定されない。用語「食肉」は食肉加工品も含むものとして使用される。本酵素剤で軟骨を含む食肉を処理する場合には、食肉を酵素液（酵素剤の溶液）に浸漬する方法、加圧処理して酵素液を食肉に浸透させる方法、酵素液を食肉に注入する方法、酵素液を食肉に注入してタンブリング（酵素液を機械的に浸透する処理）する方法等によって本酵素剤を食肉に作用させればよい。作用させる際の温度条件は例えば4℃～40℃であり、4℃～30℃、4℃～25℃、又は4℃～20℃でもよく、あるいは10℃～40℃、20℃～40℃、30℃～40℃、又は35℃～40℃でもよい。作用させる時間（反応時間）は例えば1時間～1日であり、1時間～12時間、1時間～6時間、1時間～3時間、又は1時間～2時間でもよい。
＜参考例＞
１．コラゲナーゼ産生株のスクリーニング
　食品利用可能なコラゲナーゼを見出すべく、まず1次スクリーニングとして天野エンザイム株式会社のライブラリーからコラゲナーゼ活性を指標にスクリーニングを実施し、高活性を示したバイオセーフティーレベル1（BSL1）生産菌113種を選抜した。
　次に2次スクリーニングとして、選抜した生産菌113種の培養上清をゼラチンと反応させ、反応産物中のGlyをN末端にもつペプチドの含有率を評価し、19種の生産菌を選抜した。総ペプチド量はニンヒドリン試薬にて定量した。一方で、GlyをN末端にもつペプチドの量は、コラーゲン定量キット(コスモ・バイオ製)を用いて定量した。
　3次スクリーニングとして、19種の生産菌の培養上清とゼラチン反応産物から、トリペプチドをゲル濾過クロマトグラフィーにより部分精製した後、逆相クロマトグラフィーにより分析した。分析結果から有望と思われた生産菌の培養上清を部分精製した後、コラゲナーゼのCTP生成能を評価することで、最終的にコラゲナーゼ生産菌Lysinibacillusfusiformis 57413株を選抜した。
２．57413株のコラゲナーゼ粗酵素液の調製および精製
　57413株をゼラチン含有培地(5%フィッシュゼラチン、0.5%酵母エキス、2%NaCl)で、30℃、2日間、通気撹拌培養した。得られた培養液を遠心分離した後、上清を珪藻土濾過して粗酵素液を得た。さらに疎水クロマトグラフィー（Pheny HP, GEヘルスケア ライフサイエンス社製)、陰イオン交換クロマトグラフィー(DEAE FF, GEヘルスケア ライフサイエンス社製)を用いて酵素を精製した。
３．57413株コラゲナーゼの遺伝子配列の確認
　57413株をSCD液体培地にて一晩30℃で培養を行った後、菌体を遠心分離にて回収した。回収した菌体をTE緩衝液で懸濁し、NucleoSpin（登録商標） Microbial DNA(タカラバイオ株式会社製)を用いてDNAを抽出した。抽出したDNAを鋳型として、以下の上流及び下流プライマーとPrimeSTAR（登録商標） Max DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いてPCRを実施した。増幅したPCR産物を、構造遺伝子内外と相同性のあるプライマーを用いた塩基配列解析を実施することで、配列を確認した。
　配列番号５のアミノ酸配列はLysinibacillus fusiformis57413株由来のコラゲナーゼのアミノ酸配列（成熟体）である。尚、シグナルペプチドとプロ配列も有する、Lysinibacillus fusiformis57413株由来のコラゲナーゼのアミノ酸配列を配列番号６に示す。
　配列番号７のＤＮＡは、成熟体のアミノ酸配列（配列番号５）のみをコードするものであり、配列番号８のＤＮＡは、成熟体（配列番号５のアミノ酸配列）に加え、シグナルペプチドとプロ配列をコードしている。
　上流：フォワードプライマー: GGAAACAATCTAAATGTGTCT（配列番号９）
　下流：リバースプライマー： CCGCCTTTAAAGGCTCTCCGA（配列番号１０）
４．コラゲナーゼの組換え発現
　57413株コラゲナーゼ遺伝子をpColdIII(タカラバイオ株式会社製)に導入することで、発現プラスミドを構築した。構築した発現プラスミドを用い、常法にて大腸菌BL21を形質転換した。形質転換体をLB培地（アンピシリン添加）で一晩37℃で培養後、その培養液をLB培地（アンピシリン添加）に1%容量接種し、37℃で2時間培養後、IPTGを添加し、15℃で一晩培養を行った。この培養液から遠心分離にて菌体を回収し、超音波破砕にて菌体を破砕した後、遠心分離にて上清を回収し、組換え粗酵素液とした。この粗酵素液の酵素活性を以下の測定方法で確認したところ、コラーゲン分解活性、pz-peptide分解活性、及びCTP生成能を有していることがわかった。さらに、カゼイン分解活性を有しておらず、コラーゲンやゼラチンに特異的に作用する可能性が極めて高い。
＜Pz-peptide分解活性＞
　1mg/mL Pz-peptide (Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-OH, BACHEM製), 20mM CaCl2 200mM トリス塩酸緩衝液900μLに酵素液100μLを添加し、37℃で反応開始した。反応開始後10分と20分で反応液を100μLサンプリングし、25mMクエン酸液200μLに添加することで反応停止液とした。この反応停止液に1mLの酢酸エチルを添加して10秒間撹拌後に遠心分離(12000×g 10分間)し、上清の酢酸エチル層を回収した。回収した上清の酢酸エチル層の320nmの吸光度を測定することで、コラゲナーゼによって遊離したPz-Pro-Leu量を求めた。酵素活性は、10分後と20分後のPz-Pro-Leu生成量から1分間当たりのPz-Pro-Leu生成速度を算出することで評価した。1分間に1μmol Pz peptideを分解する(1μmol Pz-Pro-Leuを遊離する)酵素量を1Uと定義した。
＜コラゲナーゼ活性＞
　コラゲナーゼ活性はPROTAZYME OL TABLETS (Megazyme社製)を用いて測定した。OL1錠に対して10mMCaCl2200mMトリス緩衝液にて懸濁した基質溶液を撹拌しながら1.5mLチューブに300μL分注し氷上に置いた。分注した基質溶液に酵素液100μLを添加混合し、40℃に合わせたバイオシェーカーにて30分間撹拌することで反応させた。反応30分後、2%リン酸三ナトリウム溶液1mLを添加することで酵素反応を停止させ、遠心分離(13000g, 10分間)した。上清200μLをマイクロタイタープレートに移し、590nmの吸光度を測定した。30分間で上昇した590nm値でコラゲナーゼ活性の強度を判断した。
＜カゼイン分解活性＞
　カゼイン分解活性はPROTAZYME AK TABLETS (Megazyme社製)を用いて測定した。AK1錠に対して10mMCaCl2200mMトリス緩衝液にて懸濁した基質溶液を撹拌しながら1.5mLチューブに300μL分注し氷上に置いた。分注した基質溶液に酵素液100μLを添加混合し、40℃に合わせたバイオシェーカーにて30分間撹拌することで反応させた。反応30分後、2%リン酸三ナトリウム溶液1mLを添加することで酵素反応を停止させ、遠心分離(13000g, 10分間)した。上清200μLをマイクロタイタープレートに移し、590nmの吸光度を測定した。30分間で上昇した590nm値でカゼイン分解活性の強度を判断した。
＜CTP生成能の確認＞
　段階希釈した酵素液とゼラチン(終濃度2%ゼラチン)を12時間反応させた後、10分間煮沸することで反応を停止した。この反応停止液を超純水にて10倍希釈した後にSuperdex peptide7.5/300にてゲル濾過分析を行うことでCTP生成量を確認した。ゲル濾過の条件は以下の通りである。
　Superdex_peptide7.5/300
　バッファー：0.25 M NaCl 含有 0.02 M リン酸 buffer, pH 7
　流速：0.28mL/min
　アプライ量：100μL
　検出：214 nm
　システム：AKTA/ 低温庫
＜実施例＞
１．7128株コラゲナーゼ酵素粉末の調製
　参考例の「１．コラゲナーゼ産生株のスクリーニング」により、コラゲナーゼ生産菌Lysinibacillusfusiformis 7128株を選抜した。
　ジャーファーメンター（30L容）に20Lのゼラチン含有培地(5%フィッシュゼラチン、0.5%酵母エキス、2%NaCl)を調製、蒸気殺菌し、これに一晩SCD培地で培養した7128株200mLを添加後、30℃、撹拌数200rpm、通気量0.5vvmで36時間培養した。得られた培養液を珪藻土濾過に供し粗酵素液を得た。この粗酵素液を1%活性炭でろ過し、清澄ろ液を得た。この清澄ろ液を限外ろ過（分画分子量6000）に供し、4倍量の水を添加し脱塩濃縮した。これを珪藻土ろ過、メンブレンフィルターろ過（0.45μm）に供し、得られたろ液を凍結乾燥させ、これを7128株コラゲナーゼ酵素粉末とした。
２．7128株コラゲナーゼの配列同定
　57413株由来コラゲナーゼの配列情報と基に設計したプライマーを用いて遺伝子配列を確認した。遺伝子配列からアミノ酸配列も決定した。
　配列番号１のアミノ酸配列はLysinibacillus fusiformis7128株由来のコラゲナーゼのアミノ酸配列（成熟体）である。尚、シグナルペプチドとプロ配列も有する、Lysinibacillus fusiformis7128株由来のコラゲナーゼのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
　配列番号３のＤＮＡは、成熟体のアミノ酸配列（配列番号１）のみをコードするものであり、配列番号４のＤＮＡは、成熟体（配列番号１のアミノ酸配列）に加え、シグナルペプチドとプロ配列をコードしている。
＜配列番号１＞
AEKTPYNVLQMKPIGIEMSKDEMVHSTMAEETLSYEERLEMGDFSQRPAPIMEQMDTQQLQEQYSMAELNNMSNRELIHTLGSIRWYQITDLFQFNDDTKAFYQNEERMQVIINELGNRGSSFTKDDSKGIETFVEVLRSAFYVAFYNNELGYLNERSFQDKCLPALNEIAKNPNFKLGTDEQDKVVSAYGKLIGNASSDVETVQHATNILKQYNENLSTYESENSKGQAIYDIIHGIDYDLQSYLYDTRKEANTTMWYGKIDSFIEEVNNIALIHNVTDSNSWLINNGIYYAGRLGQFHSNPNKGLEVVSQAMHMYPYLSEAYFVAVEQITTNYGGRDLNGNTVDLQKVREEGKKQYLPKTYTFDDGSIVFKTGDQVTEDKIQRLYWAAKEVKAQYHRVIGNDQALEPGNADDILTVVIYNSPDQYRLNRQLYGYETNNGGIYIEETGTFFTYERTPEQSIYSLEELFRHEYTHFLQGRFEVPGLFGTGDMYQNERLTWFQEGNAEFFAGSTRTNDVVPRKSIISGLSHDPSQRYTAEQTMFATYGSWDFYNYSFALQSYMYTHQFDMFDRIQDLIRANDVKNYDAYRDTLSKDSQLNMEYQAYMQQLIDNQETYEVPQVAEDYLMPHEPKALNEVQQEIVDIAHVKDANMTKHQSQFFNTFTLEGTYVGSATQGESQDWKTMSKQVNQMLEQLSQKEWSGYKTMTAYFVNYRVNAANQFEYDVVFHGVSTDDGETQAPIVQVNGPYTGMINEKIQFNSDGSKDTDGEIVSYLWDFGDGATSEAANPTHVYENEGTYKVTLTVKNNKGQESKGQTTATVQKGGQTGQEHAMTIPFNKPIKGSLIENDTNVYQFDITSLEEIDISVVNENQIGMTWVLYHESDKENYVAYGQEDGQTIKGKYNAKPGKYYLYVYKFDDENGTYTVQVQNSTKTEIEPNNRPEEATMLPFHTPLSGSLMEDDHTDVYEFNVTSPKEIDISVLNENQIGMTWVLYHESDSQNYASFGQEDGNMINGKLNAKPGKYYLYVYKFENENGTYTVHVQ
３．7128株コラゲナーゼの酵素学的性質
（１）至適温度
　本酵素の反応性に対する温度の影響を確認した。Pz-peptideを基質とした測定法を用い、反応時の温度を4℃から60℃まで変化させて活性を測定した。最大活性（活性の最高値）を100%とした相対活性（Relative activity）で評価した。図１に示す通り、至適温度は40℃付近であった。
（２）温度安定性
　本酵素の温度安定性を調べた。本酵素液を200mM PIPES緩衝液(pH7.0)で5倍希釈したサンプルを各温度(4℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃)で30分間処理した後にPz-peptideを基質とした測定法にて活性を測定した。最も活性が高かった処理温度での活性を100%とした相対残存活性（Relative residual activity）で評価した。図２に示す通り、4℃処理から40℃処理までは活性低下はなく、40℃まで安定であることがわかった。
（３）至適pH
　本酵素の反応性に対するpHの影響を調べた。Pz-peptideを溶解する緩衝液を200mMの各緩衝液（pH4、5、6は酢酸緩衝液、pH6、7はPIPES緩衝液、pH7、8、9はトリス塩酸緩衝液、pH9、10、11はグリシン緩衝液とし、活性を測定した。最大活性を100%とした相対活性（Relative activity）で評価した。図３に示す通り、至適pHは7付近であることがわかった。
（４）pH安定性
　本酵素のpH安定性を調べた。本酵素溶液を200mMの各緩衝液（pH4、5、6は酢酸緩衝液、pH6、7はPIPES緩衝液、pH7、8、9はトリス塩酸緩衝液、pH9、10、11はグリシン緩衝液を使用）で5倍希釈し、30℃で60分間処理した後、Pz-peptideを基質とした測定法にて活性を測定した。最も活性が高かった処理pHでの活性を100%とした相対残存活性（Relative residual activity）で評価した。図４に示す通り、pHが約6～約9 (Tris-HCl)の範囲で高い活性（80%以上）を維持しており、当該pH域で安定であることがわかった。
４．7128株コラゲナーゼのCTP生成能の確認
　7128株コラゲナーゼ(本発明の酵素)、57413株コラゲナーゼ及び比較用のStreptomyces由来コラゲナーゼを用いて、コラーゲントリペプチドの生成を確認した。
　段階希釈した酵素液と終濃度2%の魚ゼラチン又は終濃度2%の牛骨ゼラチン)を40℃で12時間反応させた後、10分間煮沸することで反応を停止した。この反応停止液を超純水にて10倍希釈した後にSuperdex peptide7.5/300にてゲル濾過分析を行うことでCTP生成量を確認した。ゲル濾過の条件は以下の通りである。
　Superdex_peptide7.5/300
　バッファー：0.25 M NaCl 含有 0.02 M リン酸 buffer, pH 7
　流速：0.28mL/min
　アプライ量：100μL
　検出：214 nm
　システム：AKTA/ 低温庫
　結果を図５～図８に示す。
　本発明の酵素は、Gly-Pro- Hyp、Gly-Pro-Ala、Gly-Glu-Argの生成能を示すことを見出した。特に、Gly-Glu-Argの生成能が優れていることを見出した。
５．7128株コラゲナーゼの鶏軟骨分解能
　5mm角にカットした鶏むね軟骨0.44gに8mg/mLの酵素溶液5mLを添加して、37℃で1.5時間振とう処理した。処理サンプルをガーゼでろ過して残渣を回収した。残渣を精製水で洗浄後、一晩室温で放置して乾燥させた。乾燥残渣の重量を測定した。ブランクとして、酵素溶液の代わりに精製水を用いて同様に実施した。比較対象として、57413株由来コラゲナーゼと市販の肉軟化剤である「スジまでやわらか職人」（株式会社キティー）を使用して同様に実施した。軟骨分解度を以下の式で算出した。
軟骨分解度（％）＝（ブランクの乾燥残渣の重量－酵素処理乾燥残渣の重量）÷ブランクの乾燥残渣の重量×100
＜結果＞
　結果を図９に示す。
　本発明の7128株由来のコラゲナーゼは、優れた軟骨分解能を有することが示された。
　本発明の酵素剤は、安全性の高い微生物に由来するコラゲナーゼを有効成分とする。従って、食品や医療用途の分野での使用に適し、産業上の利用価値は高い。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
　配列番号９：人工配列の説明：フォワードプライマー
　配列番号１０：人工配列の説明：リバースプライマー

Claims (10)

  1. 　配列番号１のアミノ酸配列又はそれと等価なアミノ酸配列からなるコラゲナーゼを有効成分とする、コラーゲントリペプチド製造のための酵素剤。
  2. 　等価なアミノ酸配列からなるコラゲナーゼが、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号１のアミノ酸配列からなるコラゲナーゼと牛骨ゼラチンからのGly-Glu-Argの生成能が同等であるコラゲナーゼである、請求項１に記載の酵素剤。
  3. 　コラゲナーゼがLysinibacillus fusiformis由来である、請求項１又は２に記載の酵素剤。
  4. 　Lysinibacillus fusiformisに由来し、以下の理化学的性質を有するコラゲナーゼを有効成分とする、コラーゲントリペプチド製造のための酵素剤。
    （１）至適温度：４０℃付近である。
    （２）温度安定性：最も活性が高かった処理温度での活性を１００％とした相対残存活性について４℃から４０℃までは８０％以上であり、５０℃では１０％以下である。
    （３）至適ｐＨ：至適ｐＨは７付近である。
    （４）ｐＨ安定性：最も活性が高かった処理ｐＨでの活性を１００％とした相対残存活性について、ｐＨが６～８の範囲では８０％以上であり、ｐＨ５では１０％以下である。
  5. 　配列番号１のアミノ酸配列又はそれと等価なアミノ酸配列からなるコラゲナーゼを有効成分とする、食肉軟化及び／又は軟骨分解のための酵素剤。
  6. 　等価なアミノ酸配列からなるコラゲナーゼが、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号１のアミノ酸配列からなるコラゲナーゼと鶏軟骨分解能が同等であるコラゲナーゼである、請求項５に記載の酵素剤。
  7. 　コラゲナーゼがLysinibacillus fusiformis由来である、請求項５又は６に記載の酵素剤。
  8. 　Lysinibacillus fusiformisに由来し、以下の理化学的性質を有するコラゲナーゼを有効成分とする、食肉軟化及び／又は軟骨分解のための酵素剤。
    （１）至適温度：４０℃付近である。
    （２）温度安定性：最も活性が高かった処理温度での活性を１００％とした相対残存活性について４℃から４０℃までは８０％以上であり、５０℃では１０％以下である。
    （３）至適ｐＨ：至適ｐＨは７付近である。
    （４）ｐＨ安定性：最も活性が高かった処理ｐＨでの活性を１００％とした相対残存活性について、ｐＨが６～８の範囲では８０％以上であり、ｐＨ５では１０％以下である。
  9. 　請求項１から４の何れか一項に記載の酵素剤をコラーゲン又はゼラチンに作用させることを特徴とする、コラーゲントリペプチドの製造方法。
  10. 　請求項５から８の何れか一項に記載の酵素剤を食肉及び／又は軟骨に作用させることを特徴とする、食肉軟化及び／又は軟骨分解方法。
PCT/JP2022/035843 2021-09-28 2022-09-27 コラーゲントリペプチド製造又は軟骨分解のための酵素剤 WO2023054315A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP22876181.3A EP4410981A1 (en) 2021-09-28 2022-09-27 Enzyme agent for collagen tripeptide production or cartilage degradation
JP2023551502A JPWO2023054315A1 (ja) 2021-09-28 2022-09-27
CN202280065067.6A CN118159651A (zh) 2021-09-28 2022-09-27 用于制造胶原三肽或者分解软骨的酶剂

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021157337 2021-09-28
JP2021-157337 2021-09-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023054315A1 true WO2023054315A1 (ja) 2023-04-06

Family

ID=85782699

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/035843 WO2023054315A1 (ja) 2021-09-28 2022-09-27 コラーゲントリペプチド製造又は軟骨分解のための酵素剤

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP4410981A1 (ja)
JP (1) JPWO2023054315A1 (ja)
CN (1) CN118159651A (ja)
WO (1) WO2023054315A1 (ja)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0516832B2 (ja) 1984-03-09 1993-03-05 Akira Endo
JPH0870853A (ja) 1994-09-05 1996-03-19 Nippi:Kk ビブリオ属に属する新規な微生物ならびに当該微生物から生産される新規なコラーゲン分解酵素およびその利用
JP2001131084A (ja) * 1999-11-05 2001-05-15 Fancl Corp 生体コラーゲン合成促進剤
JP2001510331A (ja) 1996-11-19 2001-07-31 ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー クロストリジウム・ヒストリチカム由来の組換えコラゲナーゼタイプ▲ｉ▼および細胞と細胞群の単離へのその使用
JP2002255847A (ja) * 2001-02-26 2002-09-11 Miyagi Kagaku Kogyo Kk コラーゲン産生促進剤、それを含む機能性食品および医薬品
JP2010263880A (ja) 2009-04-16 2010-11-25 Nippi:Kk 微生物由来の新規コラゲナーゼ遺伝子
JP2013034423A (ja) * 2011-08-05 2013-02-21 Guthy-Renker Japan Co Ltd 健康食品
JP2018183106A (ja) 2017-04-27 2018-11-22 株式会社ニッピ コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量の測定方法、およびＸ−Ｙ配列量の測定方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0516832B2 (ja) 1984-03-09 1993-03-05 Akira Endo
JPH0870853A (ja) 1994-09-05 1996-03-19 Nippi:Kk ビブリオ属に属する新規な微生物ならびに当該微生物から生産される新規なコラーゲン分解酵素およびその利用
JP2001510331A (ja) 1996-11-19 2001-07-31 ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー クロストリジウム・ヒストリチカム由来の組換えコラゲナーゼタイプ▲ｉ▼および細胞と細胞群の単離へのその使用
JP2001131084A (ja) * 1999-11-05 2001-05-15 Fancl Corp 生体コラーゲン合成促進剤
JP2002255847A (ja) * 2001-02-26 2002-09-11 Miyagi Kagaku Kogyo Kk コラーゲン産生促進剤、それを含む機能性食品および医薬品
JP2010263880A (ja) 2009-04-16 2010-11-25 Nippi:Kk 微生物由来の新規コラゲナーゼ遺伝子
JP2013034423A (ja) * 2011-08-05 2013-02-21 Guthy-Renker Japan Co Ltd 健康食品
JP2018183106A (ja) 2017-04-27 2018-11-22 株式会社ニッピ コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量の測定方法、およびＸ−Ｙ配列量の測定方法

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Current protocols in molecular biology", 1987, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
CHUNG, PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE USA., vol. 86, 1989, pages 2172
DATABASE UniProtKB/TrEMBL 8 May 2019 (2019-05-08), ANONYMOUS : " Microbial collagenas", XP093053391, retrieved from Uniprot Database accession no. A0A410MLN5 *
FELGNER, P. L. ET AL., PROC. NATL., vol. 84, 1984, pages 7413 - 7417
GENE, vol. 96, 1990, pages 23
HOA BACH THI MAI, PHAM THANH HUYEN, DINH TRUONG SON, TAKAGI HIROSHI: "Characterization of collagenase found in the nonpathogenic bacterium Lysinibacillus sphaericus VN3", BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND BIOCHEMISTRY, JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY, JP, vol. 84, no. 11, 1 November 2020 (2020-11-01), JP , pages 2293 - 2302, XP093053394, ISSN: 0916-8451, DOI: 10.1080/09168451.2020.1799748 *
J. MOL. BIOL., vol. 166, 1983, pages 557
JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY (J. MOL. BIOL., vol. 53, 1970, pages 159
KARLINALTSCHUL, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 87, 1990, pages 2264 - 68
KARLINALTSCHUL, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 5873 - 77
POTTER, H. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 81, 1984, pages 7161 - 7165
SHIMIZU, Y. ET AL., NATURE BIOTECH., vol. 19, 2001, pages 751 - 755

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2023054315A1 (ja) 2023-04-06
CN118159651A (zh) 2024-06-07
EP4410981A1 (en) 2024-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3130671B1 (en) New protein deamidase
EP0693556B1 (en) Transglutaminase originating in japanese oyster
CN108699549B (zh) β-半乳糖苷酶
ES2595500T3 (es) Nuevas proteasas que pueden hidrolizar péptidos y proteínas de gluten a un pH ácido, procedentes del actinomiceto Actinoallomurus
JP6161190B2 (ja) 耐熱性ケラチナーゼ酵素、その製造方法、およびそれをコードするｄｎａ
JP5006380B2 (ja) 新規なα−ガラクトシダーゼ
JP5447761B2 (ja) キチン・キトサンを分解する新種の微生物及びその利用方法
JP4663631B2 (ja) 放線菌由来のａｍｐデアミナーゼ及びその利用
JPWO2009087826A1 (ja) シュウ酸脱炭酸酵素の生産に利用される組換え発現プラスミドベクター及び組換え菌、並びに組換えシュウ酸脱炭酸酵素の生産方法
JP5392942B2 (ja) 新規なアルカリアルギン酸リアーゼとその利用
WO2021200955A1 (ja) コラゲナーゼ剤及びその用途
CN107460176B (zh) 一种过氧化物酶DyP35基因及其表达蛋白和应用
WO2023054315A1 (ja) コラーゲントリペプチド製造又は軟骨分解のための酵素剤
JP5094461B2 (ja) ヒアルロン酸加水分解酵素をコードする遺伝子
WO2021256518A1 (ja) 新規トランスグルタミナーゼ
JP4259169B2 (ja) 新規α−１，２−マンノシダーゼおよびその遺伝子、ならびに該酵素を用いたα−マンノシル糖化合物の製造方法
JPWO2012111810A1 (ja) キチン分解酵素遺伝子および該遺伝子によりコードされるキチン分解酵素
JP6821155B2 (ja) Ｌ−リシンα−オキシダーゼの製造方法
CN116323937A (zh) 使用了新型酮糖－3－差向异构酶的酮糖的制造方法
WO2024071388A1 (ja) 酵素剤及びその応用
WO2022264963A1 (ja) トランスグルタミナーゼを含む酵素剤及びその用途
WO2021193749A1 (ja) ペプチドグリカン分解活性を有するタンパク質および該タンパク質をコードするｄｎａ、微生物分解製剤ならびに微生物分解方法
JP2011152075A (ja) Ｄ−，ｌ−ペプチドの立体選択的合成法
JP2023027412A (ja) エラスチン分解酵素
JP2023057968A (ja) ヒドロキシプロリル－グリシンの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22876181

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023551502

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202280065067.6

Country of ref document: CN

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022876181

Country of ref document: EP

Effective date: 20240429