JP6517732B2 - Dpp−4阻害剤、血糖値上昇抑制剤およびdpp−4阻害用食品 - Google Patents
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本発明のDPP−4阻害剤は、X−Pro−Gln(式中、Xは、Gly、ValおよびPro以外のアミノ酸残基を示す。)、またはGln−Pro−Y(式中、Yは、Pro以外のアミノ酸残基を示す。)で示されるトリペプチドを有効成分とする。Xは、ロイシン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニンなどの疎水性アミノ酸や、アスパラギン、グルタミン、セリンなどの中性アミノ酸であることが好ましい。これらの中でも、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、セリンなどが好ましい。一方、Yはグリシンなどの中性アミノ酸や、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンなどの疎水性アミノ酸であることが好ましい。本発明で使用するトリペプチドとしては、Leu−Pro−Gln、Ile−Pro−Gln、Ala−Pro−Gln、Phe−Pro−Gln、Asn−Pro−Gln、Gln−Pro−Gln、Ser−Pro−Gln、Gln−Pro−Gly、Gln−Pro−Leu、Gln−Pro−Ile、Gln−Pro−Pheが好ましく、より好ましくはGln−Pro−Gln、Leu−Pro−Gln、Ser−Pro−Gln、Gln−Pro−Gly、Gln−Pro−Pheである。これらは1種を単独で使用してもよく、2種以上を混合して使用してもよい。
本発明で使用するトリペプチドの製造方法は、特に限定はない。したがって、従来公知の方法で化学合成したものを使用することができる。一方、豆類、魚類、肉類その他のタンパク質含有食品を酵素分解し、分解物の中から上記トリペプチドを分取して使用することもできる。このようなタンパク質含有食品として、グルテンを原料とすることが好適である。グルテンは、グリアジンとグルテニンからなるタンパク質複合体であり、グルタミン残基とプロリン残基の含有量が多いからである。更に、脂肪や糖分の含有量が少なく、分解物からトリペプチドを分取することも容易である。
ショウガ根茎由来酵素が、プロテアーゼ活性を有することは公知である(非特許文献1)。ショウガ根茎由来酵素であるジンジベインは、プロリン特異的システインプロテアーゼであり、N末端側から読んだときに、ProのC末端側に隣接するアミノ酸残基とその次のアミノ酸残基との間のペプチド結合を切断する(非特許文献2)。グルテンにこのショウガ根茎由来酵素を作用させると、X−Pro−Gln(式中、Xは、Gly、ValおよびPro以外のアミノ酸残基を示す。)、およびGln−Pro−Y(式中、Yは、Pro以外のアミノ酸残基を示す。)で示されるトリペプチドを含むペプチド組成物を生成することができる。なお、ショウガ根茎は、プロテアーゼ活性を有するものであれば特に制限はなく、市販のショウガ根茎を広く使用することができる。
本発明において、グルテンに添加するショウガ根茎由来酵素の量は、使用するショウガ根茎由来酵素の形状その他によって適宜選択することができ、例えばショウガ根茎の乾燥粉砕物の場合、グルテンの1〜30質量%、より好ましくは2〜20質量%、特に好ましくは5〜10質量%である。
50mMのトリス−塩酸バッファー(pH7.5)に試料を溶解したサンプル液35μlと、50mMのトリス−塩酸バッファー(pH7.5)に溶解したDPP−4(シグマ社製、豚腎臓由来;8.6mU/ml)15μlとをマイクロプレートウェル(NUNC社製、商品名「237015」)中で混合し37℃、10分間インキュベートした。
これに、予め37℃に保温しておいた基質溶液(グリシルプロリン−4−メチルクマリン−7−アミド(Gly−Pro−MCA)を10μMとなるよう50mMトリス−塩酸バッファー(pH7.5)に溶解したもの)50μlを添加および混合し、37℃で20分間反応させた。
DPP−4によって遊離される7−アミノ−4−メチルクマリン(AMC)の蛍光強度をマイクロプレートリーダー型蛍光検出器(コロナ電気社製、商品名「SH−9000」)で経時的に測定した。なお、測定波長は励起波長380nm、測定波長460nmで行った。なお、サンプルに代えて50mMのトリス−塩酸バッファー(pH7.5)を同量使用したものを対照として蛍光強度を測定した。
DPP−4の活性は、反応時間中における蛍光強度変化量の平均勾配で表し、DPP−4阻害率は、対照を100%とし、サンプルの活性を前記対照から差し引いた分を阻害率(%)として算出した。
上記したDPP−4阻害率の測定方法に準じて、サンプル濃度を変化させて得た阻害率から、反応系1ml換算におけるDPP−4活性の50%阻害濃度(IC50値)を算出した。
ショウガ根茎を、皮を剥いてから細切して−30℃で凍結した後、凍結ショウガに対して5倍量(容量/重量)の冷アセトンを添加し、ポリトロンホモジナイザーで十分粉砕してスラリーを得た。前記スラリーをろ過してアセトンを除去し、更にこの残渣を5倍量(容量/重量)の冷アセトンで洗浄、ろ過してから風乾し、ショウガ粉末を得た。
pH4.4の0.1M酢酸ナトリウムバッファーで小麦グルテン(東京化成工業製)2質量%懸濁溶液を調製した。この溶液に、製造例1で調製したショウガ粉末を、グルテンに対して質量換算で1/10倍量加え、ジチオスレイトール(和光純薬工業製)を2mMとなるように添加し、50℃で振盪、攪拌しながら16h反応させた。反応終了後0.80μmフィルターを通してペプチド溶液を得た。
得られたペプチド溶液を下記LC/MS測定条件で分離し、トリペプチドの一部の含有量を定量した。結果を表1に示す。グルテンをショウガ根茎由来酵素で分解することで、分解物からGln−Pro−Gln、Leu−Pro−Gln、Ser−Pro−Gln、Gln−Pro−GlyおよびGln−Pro−Pheを製造することができた。
高速液体クロマトグラフ:1200Series(Agilent Technologies)、
質量分析装置:3200QTRAP(AB Sciex)、
分析カラム:Ascentis Express F5 5μm, 4.6mmi.d.×250mm(SUPELCO)、
カラム温度:40℃
移動相:A液;0.1%ギ酸、B液;100%アセトニトリル、
グラジエント条件:
0〜2.5分:A液100%、
2.5〜15分:A液100〜5%;B液0〜95%、
15〜17.5分:A液5%;B液95%、
17.5〜20分:A液100%、
流速:0.6mL/min、
(2)質量分析条件:
イオン化:ESI、ポジティブ、
分析モード:Multiple Reaction Monitoring(MRM)モード、
イオンスプレー電圧:3kV、
イオンソース温度:700℃
実施例1で、ショウガ粉末によるグルテンの分解により生成が確認されたGln−Pro−Gln、Leu−Pro−Gln、Ser−Pro−Gln、Gln−Pro−GlyおよびGln−Pro−Pheについて、Anygen社のカスタム合成サービスによりこれらトリペプチドを化学合成し、上記測定法にてそのDPP−4阻害率とIC50値とを測定した。測定したIC50値およびペプチド濃度0.1mg/ml時の阻害率を表2に示す。また、Ser−Pro−GlnのDPP−4阻害曲線を図1に示す。
Anygen社のカスタム合成サービスにより、N末端にアセチル基を導入したAc−Gln−Pro−Gly、Ac−Gly−Pro−Gln、およびAc−Pro−Gly−Glnを化学合成した。これらアセチル化トリペプチドについて、実施例2と同様に操作して、DPP−4阻害率とIC50値とを測定した。なお、DPP−4阻害作用が弱くIC50値を算出できなかったため、ペプチド濃度0.1mg/ml時の阻害率を記載した。結果を表2に示す。
表2に示すように、X−Pro−Gln(式中、Xは、Gly、ValおよびPro以外のアミノ酸残基を示す。)、またはGln−Pro−Y(式中、Yは、Pro以外のアミノ酸残基を示す。)で示されるGln−Pro−Gln、Leu−Pro−Gln、Ser−Pro−Gln、Gln−Pro−GlyおよびGln−Pro−Pheは、IC50値が低く、DPP−4阻害活性に優れた。
また、Gln−Pro−Glyにおける0.1mg/ml時の阻害率は、85.3%であるが、N末端をアセチル化したAc−Gln−Pro−Glyの同阻害率は5.1%と極めて低値であった。本発明で使用するトリペプチドは、アセチル基を導入したトリペプチドと比較し、ペプチド濃度0.1mg/ml時で約17倍もDPP−4阻害活性に優れた。なお、表2に示すように、N末端にアセチル基を導入したトリペプチドは、いずれもDPP−4阻害活性が低い結果となった。
Claims (3)
- Gln−Pro−Gln、Leu−Pro−Gln、Ser−Pro−Gln、Gln−Pro−GlyおよびGln−Pro−Pheからなる群から選択されるいずれか1種以上のトリペプチドを有効成分とするDPP−4阻害剤。
- Gln−Pro−Gln、Leu−Pro−Gln、Ser−Pro−Gln、Gln−Pro−GlyおよびGln−Pro−Pheからなる群から選択されるいずれか1種以上のトリペプチドを有効成分として含有する血糖値上昇抑制剤。
- 請求項1記載のDPP−4阻害剤を含む、DPP−4阻害用食品(黄酒を除く)。
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