WO2005012542A1 - カゼイン加水分解物、その製造法及びその用途 - Google Patents

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casein
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Seiichi Mizuno
Shingo Nishimura
Takanobu Gotou
Keiichi Matsuura
Tadashi Shinoda
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention is expected to have various functions such as angiotensin converting enzyme inhibitory activity and blood pressure lowering action obtained by hydrolyzing animal milk casein, and can be used for various foods, medicines, and the like.
  • the present invention relates to a casein hydrolyzate, a production method thereof and use thereof.
  • ACE angiotensin converting enzyme
  • ACE increases blood pressure by converting angiotensin I, a precursor, into angiotensin II, which has vasoconstrictive activity, in vivo.
  • peptides having ACE inhibitory activity are expected to exert a blood pressure lowering effect by inhibiting the production of angiotensin II in vivo by inhibiting ACE.
  • a functional peptide such as a peptide exhibiting blood pressure lowering activity using the ACE inhibitory activity as an index
  • the function expression effect is enhanced.
  • it is often necessary to perform complicated steps such as concentration, purification or isolation of the degradation product after the enzymatic degradation.
  • peptides that are absorbed into the blood from the gastrointestinal tract and have a functional expression in tissues in the living body are highly resistant to degradation by various degrading enzyme groups in the living body with high absorption efficiency into the living body. It is estimated that non-degradable peptides in the body are effective. However, details on what kind of peptide, etc. will increase the degradation resistance in vivo I don't understand. Therefore, for foods that can effectively express a desired function without necessarily performing complicated steps such as concentration, purification or isolation of the degradation product after enzymatic degradation with high degradation resistance in vivo. Development of enzyme-degraded products for pharmaceutical use and their production methods is desired.
  • Patent Document 1 a soybean protein is used as a raw material, and two or more enzymes having substantially no exoprotease activity and only endoprotease activity are caused to act simultaneously or sequentially to generate
  • a method for producing a low molecular weight peptide mixture having an amino acid content of 5% or less and having an average chain length of 3 or less, which is mainly composed of dipeptide and tripeptide, and excellent intestinal absorption.
  • Patent Document 2 discloses a dipeptide consisting of Ala Tyr, Gly Tyr Tyr, Ala Asp Phe, Ser Asp Phe, which is obtained by decomposing heat-modified soybean protein with an enzyme such as a protease derived from Aspergillus oryzae.
  • Patent Documents 3 and 4 describe a method for producing peptides having various functionalities for enzymatic degradation of animal milk casein with protease, beptidase, etc., and a specification having the functionality obtained by the production method. Peptides have been proposed.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 5-252979
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-210138
  • Patent Document 3 JP-A-6-128287
  • Patent Document 4 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-136995
  • An object of the present invention includes in vivo non-degradable peptides and free amino acids that minimize enzymatic degradation in vivo, and in particular, functions such as blood pressure lowering in vivo are expected. It is to provide a casein hydrolyzate that is awaited.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a casein hydrolyzate that can easily obtain the casein hydrolyzate without efficiently performing complicated steps.
  • Another object of the present invention is that it contains an in vivo non-degradable peptide and a free amino acid, and can be expected to have an excellent blood pressure lowering action in the living body, and has an ACE inhibitory activity or blood pressure lowering activity that can be used in various functional foods or medicines. It is in providing the agent which has.
  • non-degradable peptides having a Pro residue at the carboxy terminus can be expected to be highly resistant to degradation against in vivo peptidases, so that their functions can be fully exerted in vivo. Furthermore, since the ratio of peptides having good bioabsorbability such as dipeptides and tripeptides is high, it has been found that various functions such as blood pressure lowering effects in the casein hydrolyzate force organisms can be sufficiently expressed. The invention has been completed.
  • the present inventors have found that, in particular, a specific enzyme group has the casein of the present invention. It has also been found that the hydrolyzate can be produced more efficiently.
  • a casein hydrolyzate containing free amino acids and peptides obtained by hydrolyzing animal milk casein to an average chain length of 2.1 or less as the number of amino acid residues.
  • the peptide contains an in vivo non-degradable peptide consisting of a dipeptide having an Xaa Pro sequence and a tripeptide having an Xaa Pro Pro sequence, and the content ratio of the dipeptide having an Xaa Pro sequence is in the degradation product.
  • Casein hydrolysis is 5% by weight or more with respect to the total of peptides and free amino acids, and the content of tripeptides having the Xaa Pro Pro sequence is 1% by weight or more with respect to the total of peptides and free amino acids in the degradation product Things are provided.
  • Xaa means any amino acid.
  • a method for producing the casein hydrolyzate wherein an animal milk casein is produced using an enzyme group in which the average chain length of the casein hydrolyzate can be degraded to 2.1 or less as the number of amino acid residues.
  • a method for producing a casein hydrolyzate comprising the step (A) of hydrolyzing to an average chain length of 2.1 or less.
  • an agent having an ACE inhibitory activity or a blood pressure lowering action comprising the casein hydrolyzate as an active ingredient.
  • casein hydrolyzate for producing a functional food or a medicine having ACE inhibitory activity or blood pressure lowering action.
  • the casein hydrolyzate of the present invention is obtained by hydrolyzing animal milk casein to an average chain length of 2.1 or less as the number of amino acid residues, and a low molecular peptide such as a free amino acid and a non-degradable peptide in vivo. Therefore, for example, excellent in vivo absorbability and expression of various functions in the living body can be expected by oral administration. Therefore, it can be expected to be used for various functional foods, pharmaceuticals, and food additives.
  • the use of the hydrolyzate of the present invention as an active ingredient can be expected for an agent having an ACE inhibitory activity or a blood pressure lowering effect.
  • the production method of the present invention hydrolyzes animal milk casein to an average chain length of 2.1 or less using an enzyme group in which the average chain length of the casein hydrolyzate can be degraded to 2.1 or less as the number of amino acid residues. Since the step (A) is included, it is possible to easily and efficiently obtain the casein hydrolyzate of the present invention. Therefore, it is effective for industrial production of the casein hydrolyzate of the present invention.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of in vivo digestibility and degradation resistance evaluation of Xaa Pro and Xaa Pro Pro performed in Example 1.
  • FIG. 2 is a graph showing experimental results of dose-dependent blood pressure lowering action of casein hydrolyzate powder prepared in Example 1.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the elution pattern of bound protein and the proteolytic activity according to a linear concentration gradient of 0 0.6M performed in Analysis Example 1.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between the degradation time of casein by the enzyme group performed in Example 3 and the ACE inhibitory activity of the obtained casein hydrolyzate.
  • FIG. 5 is a graph showing the relationship between the average chain length of casein hydrolyzate by the enzyme group of casein and the ACE inhibitory activity performed in Example 3.
  • the casein hydrolyzate of the present invention is obtained by hydrolyzing animal milk casein with the number of amino acid residues so that the average chain length is within a specific range, and preferably free amino acids and peptides are added to the total amount of force zein hydrolyzate. On the other hand, it is 80% by weight or more, preferably 80 to 90% by weight.
  • the hydrolyzate contains, as a peptide, an in vivo non-degradable peptide consisting of a dipeptide having an Xaa Pro sequence and a tripeptide having an Xaa Pro Pro sequence at a specific ratio.
  • the peptide may be a peptide salt.
  • the average chain length is the total number of moles of peptides and free amino acids produced when hydrolyzing the same weight of animal milk casein with respect to the number of moles of total amino acids of caseinate hydrolyzate. It can be shown as a ratio.
  • a caseinate hydrolyzate is a product obtained by degrading casein protein into amino acids.
  • OPA o-phthalaldehyde
  • non-degradable peptide means that when it is absorbed from the intestinal tract of the living body, It means dipeptide Xaa Pro and tripeptide Xaa Pro Pro that have high degradation resistance to the thidase group and have Pro at the carboxy terminus.
  • the average chain length of the degradation product obtained by hydrolyzing animal milk casein is 2.1 or less, preferably 1.1 to 2.1, particularly preferably 1.3 to 2.1, as the number of amino acid residues.
  • the average chain length exceeds 2.1, the ratio of desired dipeptides and tripeptides, and further free amino acids is decreased, and the desired bioabsorbable and further non-degradable peptide content is in vivo. descend.
  • the content ratio of the dipeptide having the Xaa Pro sequence contained in the casein hydrolyzate of the present invention is usually 5% by weight or more, preferably 525% by weight, based on the total of the peptide and free amino acids in the decomposed product. .
  • the content is less than 5% by weight, the desired in vivo absorbability and function expression may be lowered, which is not preferable.
  • the content ratio of the tripeptide having the Xaa Pro Pro sequence contained in the casein hydrolyzate of the present invention is usually 1% by weight or more, preferably 115% by weight, based on the total of the peptide and free amino acids in the decomposed product. It is. When the content ratio is less than 1% by weight, the desired in vivo absorbability and functional expression may be lowered, which is not preferable.
  • Xaa of the dipeptide having the Xaa Pro sequence and the tripeptide having the Xaa Pro Pro sequence may be any amino acid.
  • the casein hydrolyzate of the present invention includes, for example, lie Pro, Glu Pro, Arg Pro, Gin Pro, Met Pro and Tyr Pro as a dipeptide having a Xaa Pro sequence, and Ser peptide as a tripeptide having a Xaa Pro Pro sequence. Casein hydrolysates including Pro Pro, lie Pro Pro and Val Pro Pro are preferred.
  • the ACE inhibitory activity or blood pressure lowering action is effectively expressed by including such a dipeptide and tripeptide.
  • the casein hydrolyzate of the present invention contains a free amino acid in addition to the peptide, and the content of free amino acid is usually 35-50% by weight based on the total of the peptide and free amino acid in the decomposed product, Preferably it is 40 45 weight%.
  • hydrolyzate of the present invention in addition to the aforementioned peptides and free amino acids, lipids, ash, carbohydrates, dietary fiber, water, etc., which are usually contained in, for example, commercially available animal milk casein, etc. May be contained in an amount of about 10 to 20% by weight, and if necessary, some or all of the appropriate components may be removed.
  • animal milk casein is prepared using an enzyme group in which the average chain length of the casein hydrolyzate can be degraded to 2.1 or less as the number of amino acid residues.
  • the average chain length can be obtained by the production method of the present invention including the step (A) of hydrolysis to 2.1 or less.
  • Animal milk casein is a protein that has been confirmed to be safe for use in foods that contain a large amount of Pro, such as casein such as milk, horse milk, goat milk, and sheep milk, and milk power zein is particularly preferred. Can be used.
  • the concentration of casein when hydrolyzing animal milk casein is not particularly limited, but is preferably 3 to 19% by weight in order to efficiently produce the hydrolyzate of the present invention.
  • the enzyme group used in the production method of the present invention may be any enzyme group in which the average chain length of the casein degradation product is appropriately selected and combined with an enzyme capable of degrading to 2.1 or less as the number of amino acid residues.
  • an enzyme group (X) containing a peptidase capable of cleaving the Pro Xaa sequence at the carboxy terminus of Xaa Pro Xaa or Xaa Pro Pro Xaa is preferred.
  • the enzyme group (X) preferably includes a serine type proteinase having serine at the active center or a metal proteinase having metal at the active center.
  • metal proteases include neutral protease I, neutral protease II, leucine aminopeptidase, and the like, and the inclusion of at least one of these makes the desired hydrolyzate efficient and short. It is preferable in that it can be obtained by time and further by a one-step reaction.
  • the peptidase capable of cleaving the Pro Xaa sequence is preferably an enzyme whose isoelectric point shows an acidic region.
  • Examples of the enzyme group or enzyme group (X) include an extracellular enzyme group derived from Aspergillus oryzae such as Aspergillus oryzae.
  • Examples of such extracellular enzyme groups include an enzyme group obtained by culturing bacterial cells in an appropriate medium and extracting the enzyme produced outside the bacterial cells with water, in particular, bacterial cells derived from Aspergillus oryzae.
  • an enzyme group having an isoelectric point in an acidic region is preferable.
  • extracellular enzyme group derived from Aspergillus oryzae commercially available products can be used.
  • Sumiteam FP, LP or MP (Registered trademark, Shin Nippon Chemical Co., Ltd.), Ummamizym (Registered trademark, Amano Enzym Co., Ltd.), Sternzyme B11024, PROHIDROXY AMPL (above, trade name) , Manufactured by Higuchi Shokai Co., Ltd., Orientase ONS (registered trademark, manufactured by Hankyu Bio-Industry Co., Ltd.), Denateam AP (registered trademark, manufactured by Nagase Seikagaku Co., Ltd.), etc. , Shin Nippon Chemical Co., Ltd.) is preferable.
  • the enzyme group when hydrolyzing with the enzyme group is, for example, an enzyme group Z animal milk casein in an aqueous solution in which animal milk casein is dissolved in a weight ratio of 1Z1000 or more, preferably 1 / 10-1 / 1000,
  • the addition force can be particularly preferably 1 / 10-1 / 100, more preferably lZlO 1Z40.
  • the reaction conditions are such that the target casein hydrolyzate can be appropriately selected depending on the enzyme group. Usually at 25-60 ° C, preferably 45-55 ° C, pH is 3-10, preferably 5 It can be adjusted to 1, 9, particularly preferably 5-8.
  • the enzyme reaction time is usually 2-48 hours, preferably 7-15 hours.
  • the enzyme reaction can be terminated by inactivating the enzyme.
  • the enzyme can be inactivated at 60 to 110 ° C to stop the reaction.
  • a peptide having bitterness or odor can also be removed from the resulting hydrolyzate.
  • Such removal of bitter components and odor components can be performed using activated carbon, hydrophobic resin, or the like. For example, it can be carried out by adding activated carbon to a hydrolyzate obtained in an amount of 120% by weight based on the amount of casein used and reacting for 110 hours.
  • the used activated carbon can be removed by a known method such as centrifugation or membrane treatment.
  • the reaction liquid containing the casein hydrolyzate obtained in the step (A) can be added to a liquid product such as a beverage as it is.
  • a liquid product such as a beverage as it is.
  • the casein hydrolyzate of the present invention In order to enhance the usability, it is preferable that the reaction solution is concentrated and then dried to form a powder.
  • a powder can be used as various functional foods, additives, medicines or active ingredients thereof. S can.
  • the powder may contain various auxiliary additives in order to improve nutritional balance and flavor. For example, various carbohydrates, lipids, vitamins, minerals, sweeteners, fragrances, pigments, texture improvers and the like can be mentioned.
  • Such powder containing the casein hydrolyzate of the present invention can be used by adding to, for example, beverages, yogurt, liquid food, jelly, candy, retort food, tablet confectionery, cookies, castella, bread, biscuits, chocolate, etc. In addition, it can be used in the form of capsules, tablets, etc.
  • casein hydrolyzate of the present invention can be used as described above, a functional food imparting a health effect to various sports drinks, general drinks, general foods, nutritional supplements, nutritional functional foods, etc. It can be effectively used for the manufacture of pharmaceuticals and further for the manufacture of pharmaceuticals.
  • casein hydrolyzate of the present invention has ACE inhibitory activity and blood pressure lowering activity in the examples described later. It can be used as an agent for use.
  • the casein hydrolyzate of the present invention When the casein hydrolyzate of the present invention is used as an agent having an ACE inhibitory activity and an antihypertensive effect, the amount of free amino acids covering the peptide in the casein hydrolyzate of the present invention is ordinarily used in humans by oral administration. Therefore, it is desirable that the dose is 0.1-100 mg / kg, preferably 1 to 20 mg / kg. Therefore, when the casein hydrolyzate of the present invention or an agent having an ACE inhibitory activity and an antihypertensive activity is added to various beverages, foods and medicines, it can be appropriately selected based on the above dosage. .
  • a method for hydrolyzing animal milk casein by a one-step reaction using an enzyme group including the enzyme group (X) is Xaa Pro Pro, which is included in animal milk casein.
  • lie Pro Pro and / or Val Pro Pro whose various functions such as blood pressure lowering action and anti-stress action have already been confirmed, are close to the theoretical recovery rate by a one-step reaction compared to the conventional production method, for example, 60. / o or more, preferably 70% or more. Therefore, such a production method includes animal milk casein, young in addition to the method for producing the casein hydrolyzate of the present invention.
  • it is an effective method for producing a target degradation product containing a large amount of Xaa Pro Pro or a purified product thereof from a food protein containing a large amount of the Xaa Pro Pro sequence.
  • Milk-derived casein (manufactured by NZMP, Japan) After adding lg to 99 g of distilled water adjusted to approximately 80 ° C and thoroughly stirring, add 1N sodium hydroxide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) solution to pH 7.0 The substrate solution was prepared by adjusting the temperature to 20 ° C.
  • the components contained in the powder obtained as described above were analyzed. Protein was measured by the Kelder method, and amino acids were measured by an amino acid analyzer. The amount of protein mass power minus amino acids was defined as the peptide amount. Furthermore, lipid was measured by acid decomposition method, ash was measured by direct ashing method, and moisture was measured by atmospheric pressure heating drying method. The remainder after subtracting each component from 100% was taken as the amount of carbohydrates. As a result, 35.8% by weight of amino acids, 45.7% by weight of peptides, 6.6% by weight of water, 0.2% by weight of lipids, 4.1% by weight of ash, and 7.6% by weight of carbohydrates.
  • the average chain length of amino acids and peptides contained in each of the obtained powders was measured in the same manner by measuring the number of moles using an OPA reagent that reacts with the free amino acids and peptide amino groups contained therein, and the caseinate was measured in the same manner. Evaluation was based on the ratio to the number of moles of decomposition products. The results are shown in Table 1.
  • the 1% casein enzyme hydrolyzate powder sample (Table 1) reacted with each enzyme is dissolved in an appropriate solvent at an appropriate concentration, centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes, and 50 ⁇ 50 of supernatant is separated. I took it. Subsequently, 1 ml of the above reagent was added, stirred well, allowed to stand at room temperature for 5 minutes, and then the absorption at 340 nm was measured with an absorptiometer (trade name Ubest-35, manufactured by JASCO Corporation).
  • a calibration curve was prepared by preparing a 1% caseinate hydrolyzate and measuring it in the same manner using an appropriately diluted solution. The relationship between absorbance and molar concentration was determined. The average chain length was calculated according to the following formula.
  • Average chain length (1. / 0 molar concentration of caseinate hydrolyzate) / (molar concentration of 1% casein enzyme hydrolyzate for each sample)
  • Example 2 The powder prepared in Example 1 is dissolved in an appropriate amount of distilled water and analyzed using an automatic peptide analyzer (trade name: PPSQ-10, manufactured by Shimadzu Corporation). It was investigated whether the amino acid was located. The results are shown in Table 2. Note that the automatic peptide analyzer does not detect free amino acids.
  • the total amino acid at the fifth residue was 120 pmol, and the total amino acid at the sixth residue was lOOpmol. From these results, it was found that most of the peptides contained in the powder were dipeptides and tripeptides. In addition, the peptide whose Prob is the second amino acid The total increased significantly to 49.5%. Furthermore, the percentage of peptides with Pro as the third amino acid was 29.8%.
  • the powder contains a large amount of Xaa Pro or Xaa Pro Pro, and it can be estimated that these peptides are optimal for use as functional peptides having high resistance to enzymatic degradation by in vivo proteases. .
  • Casein hydrolyzate powders prepared in Examples and Comparative Examples shown in Table 1 were orally administered to 5 each of 27-week-old spontaneously hypertensive rats SHR (male) at 32 mg / kg body weight.
  • the blood pressure before administration and 5 hours after administration was evaluated by measuring the tail pulse pressure using Tan_cuff PB-98 (manufactured by Softron), and the fluctuation of blood pressure was evaluated.
  • casein was administered instead of the above powders, and the same evaluation was performed.
  • the rats were warmed at 45 ° C for 8 minutes in a preheat box (CSI JAPAN). The results are shown in Table 3.
  • Example 1 From the results in Table 3, no change in blood pressure was observed in casein used as a control, whereas the powder administration of Example 1 confirmed the blood pressure lowering effect. On the other hand, no change in blood pressure was observed in any of the comparative powders. Therefore, it was found that the casein hydrolyzate of Example 1 having an average chain length of 2.1 or less containing a specific amount of Xaa Pro and Xaa Pro Pro is excellent in blood pressure lowering action.
  • Cushion-derived ACE (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in 0.1M boric acid buffer solution at pH 8.3 and 0.1 U to prepare an ACE solution.
  • diluted enzyme digestion solution 80 ⁇ 1 diluted with distilled water 50 times with each enzyme degradation product powder shown in Table 1 and 5 ⁇ m Hiprilhistidylleucine (Sigma) 200 ⁇ ⁇ solution 20 ⁇ of the ACE solution was added to a test tube and reacted at 37 ° C for 30 minutes.
  • ACE inhibitory activity (%) [(A-B) / A] X 100
  • the powder of the enzyme degradation product of Example 1 shown in Table 1 was diluted and dissolved in distilled water so as to be 10 mg / ml.
  • 25 / g / ml, 50 ig / ml and 100 / ig / ml solutions of various chemically synthesized standard peptides having the sequences shown in Table 5 were prepared and analyzed by LC / MS under the following measurement conditions.
  • peaks in the analysis of the powder solution those having the same molecular weight and retention time as the standard peptide were identified as the same sequence as the standard peptide. .
  • the ratio of the various peptides shown in Table 4 in the powder solution was determined. The results are shown in Table 5.
  • the amount of peptide and free amino acid in a solution obtained by diluting the powder with distilled water was 8.15 mg / ml, the amount of peptide was 4.57 mgZml, and the amount of Xaa Pro in the peptide was 514.5 ⁇ g.
  • the ratio of Xaa Pro to the total amount of peptide and free amino acid in the powder was 6.3% by weight, and the amount of Xaa Pro Pro in the peptide was 116.5 ⁇ g.
  • the ratio of Xaa Pro Pro to the amount was 1.4% by weight.
  • High-performance liquid chromatograph mass spectrometer LCMS_2010, System controller: SCL-10Advp, Autoinjector: SIL_10Advp, Feed pump: LC_10Advp X 2, Column oven: CT0_10Avp, Photodiode array detector: SPD_M10AVP, Online degasser: DGU-14A ( Product name, manufactured by Shimadzu Corporation), column: Develosil
  • Mobile phase 8 0.1 wt% formic acid aqueous solution
  • mobile phase B 100% acetonitrile solution
  • time program 0% B (0 min) _7.5% B (30 min) _80% ⁇ (30 ⁇ 01 min) _100% B (35 minutes) _0% B (35.1 minutes) — STOP (45 minutes)
  • sample injection volume 5 / il
  • column temperature 50 ° C
  • detection wavelength 200—300 nm
  • ionization mode ESI (+)
  • Atomization gas flow 4.5L / min
  • applied voltage + 4.5kV
  • CDL temperature 250 ° C
  • block heater temperature 200 ° C
  • CDL voltage 0.0V
  • Q-array voltage SCAN
  • Example 2 In addition to the extracellular enzyme derived from Aspergillus oryzae used in Example 1, the enzyme necessary for obtaining the casein hydrolyzate of the present invention was analyzed by the following method. The following operations were all performed at 4 ° C unless otherwise specified. In addition, special grade reagents manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. were used as reagents not particularly specified.
  • Sumiteam FP (registered trademark, manufactured by Shin Nippon Chemical Industry Co., Ltd.) is dissolved in 10 ml of 50 mM phosphoric acid buffer solution of pH 7.2, and cellulose acetate membrane (DISMIC_25cs, pore diameter 0.45 ⁇ m,
  • a product obtained by removing insolubles by Advantec Co., Ltd. was used as a crude enzyme solution.
  • FITC-casein fluorescent substance casein florcetin isothiocyanate
  • proteinase activity using FITC-casein as a substrate is eluted mainly in fraction 19-27 (0.1M-0.2M in NaCl), and proteinase activity plays an important role in the generation of ACE inhibitory components. It was shown that. From the above results, it was found that the proteinase activity plays an important role in the enzyme activity for purifying casein force ACE inhibitory components.
  • fraction 2 35 having proteinase activity was collected and dialyzed against 5 liters of 5 mM phosphate buffer at pH 7.2.
  • S-mark hacryl S-300 HR (Amersham Biosciences) was suspended in 50 mM phosphate buffer solution with pH 7.2 containing 200 mM NaCl, and after sufficient degassing, a glass column with a diameter of 18 cm x 100 cm. Filled. This The column was maintained at a flow rate of 2 ml / min and was fully equilibrated with 50 mM phosphate buffer, pH 7.2, containing 200 mM NaCl. The sample after dialysis was applied to this column, and 100 fractions were collected in 10ml aliquots. These fractions were measured for absorption at 280 nm and proteinase activity using FITC-casein as a substrate.
  • the gel is soaked in a Comassie Brilliant Blue stain consisting of 0.25% Comassie Brilliant Blue R-250, 50% methanol and 7.5% acetic acid for 10 minutes, and the background completely removed with a decolorizing solution consisting of 5% methanol and 7.5% acetic acid.
  • the molecular weight was estimated from the mobility of each protein band using a molecular weight marker (manufactured by Amersham Biosciences) to estimate the molecular weight.
  • the fraction showing the activity of forming the ACE inhibitory component adsorbed on the anion exchange resin was subjected to gel filtration separation with Sephacryl S-300 resin, and activity was confirmed in the fraction corresponding to a molecular weight of about 45 kDa.
  • the fraction was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis using a 12.5% gel, almost single bands were obtained at 44 kDa and 40 kDa, and this band was cut out and subjected to N-terminal sequence analysis. From this band, the sequence was highly homologous to the known neutral protease I of Neisseria gonorrhoeae.
  • the 40 kDa band was highly homologous to the Neisseria gonorrhoeae neutral protease II.
  • the proteinase activity that generates the casein ACE inhibitory component adsorbed on the anion exchange resin contains at least two types of proteinases, neutral protease I and neutral protease II.
  • peptidases acting on peptides were analyzed as follows.
  • fractions 21-37 which had activity to produce ACE inhibitory components, were collected and dialyzed against 5 liters of 5 mM phosphate buffer at pH 7.2.
  • Hydroxyapatite (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is suspended in PH7.2 5 mM phosphate buffer, thoroughly degassed, then packed into a 1.5 cm x 12 cm diameter plastic column, and pH 7.2 5 mM phosphoric acid.
  • the buffer was washed by flowing more than 10 times the volume.
  • the hydroxyapatite column was subjected to the dialyzed ACE inhibitory component-producing active fraction, and all the fractions passed through were collected.
  • the measurement of aminopeptidase activity was performed as follows.
  • the synthesized peptide Val Val Val Pro Pro was dissolved in 50 mM phosphate buffer at pH 7.2 so as to be 50 ⁇ g Zml to obtain a substrate solution.
  • An appropriate amount was fractionated from this reaction solution and subjected to a high performance liquid chromatograph equipped with a mass spectrometer (manufactured by Shimadzu Corporation) to evaluate the amount of Val Pro Pro produced.
  • the leucine aminopeptidase which exhibits aminopeptidase activity that plays an important role in the ACE inhibitory component generation activity, is shown in the fraction showing the ACE inhibitory component generation activity adsorbed on the anion exchange resin. Was found to be included at least.
  • a substrate solution was prepared by dissolving the synthetic peptide Val Pro Pro Phe Leu in a 50 mM phosphate buffer solution at pH 7.2 so as to be 45 ⁇ g Zml. 50 ⁇ 1 of this substrate solution and 5 ⁇ 1 of the enzyme solution The mixture was allowed to react for 30 minutes in an incubator at 55 ° C and heated at 98 ° C for 5 minutes to stop the reaction. An appropriate amount was taken from this reaction solution and subjected to high-performance liquid chromatograph with mass spectrometer (manufactured by Shimadzu Corporation) to quantify the concentration of Val Pro Pro produced.
  • ACE inhibitory components adsorbed on the resin include 4 proteinase activities including at least neutral proteases I and II, aminopeptidase activity including leucine aminopeptidase, and activity that degrades the carboxy terminus to immediately after proline. It was found that two enzyme activities were included.
  • fraction 1 containing a large amount of proteinase activity fraction 1 to 35 in Fig. 3
  • fraction 11 containing a large amount of activity that degrades the carboxy terminus to immediately after proline Fig. 3
  • Fraction number 36-55 fraction III (fraction number 56-100 in Fig. 3)
  • non-adsorbed fractions showing proteinase activity were prepared.
  • each of the prepared fractions was added alone or in combination to 1 ml of a 1% milk-derived casein solution and reacted at 55 ° C. for 13 hours to prepare a casein hydrolyzate.
  • each casein hydrolyzate obtained was measured for ACE inhibitory activity and average chain length according to the same measurement method as in Example 1.
  • the same amount of 1Z10000 which was the amount of the crude enzyme solution used for purification, was sampled.
  • ACE inhibitory activity increased with increasing reaction time and decreased after 12 hours of reaction. Moreover, it was confirmed from the evaluation of the amount of peptide that the ACE inhibitory activity increased when the average chain length was about 1.3-2.1.

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Abstract

　本発明は、生体内での酵素分解作用を最小限に抑えた生体内非分解性ペプチド等のペプチド及び遊離アミノ酸を含み、特に、生体内での血圧降下作用等の機能発現が期待されるカゼイン加水分解物、その製造法及びその用途に関し、本発明のカゼイン加水分解物は、獣乳カゼインを平均鎖長がアミノ酸残基数として2.1以下に加水分解して得た、遊離アミノ酸及びXaa Pro及びXaa Pro Pro等の生体内非分解性ペプチド等のペプチドを含み、ACE阻害活性又は血圧降下作用を示す。

Description

明 細 書
カゼイン加水分解物、その製造法及びその用途
技術分野
[0001] 本発明は、獣乳カゼインを加水分解して得た、アンジォテンシン変換酵素阻害活 性、血圧降下作用をはじめとする様々な機能が期待でき、各種食品、医薬等に利用 可能なカゼイン加水分解物、その製造法及びその用途に関する。
背景技術
[0002] 従来から、血圧降下作用、抗菌活性、カルシウム可溶化作用、免疫調節作用等の 様々な機能を有するペプチドが多数報告され、食品及び医薬等に利用されている。 例えば、血圧降下作用を有するペプチドとしては、アンジォテンシン変換酵素 (以下 、 ACEと略す)阻害活性を有するペプチドの提案が多い。 ACEは、生体内において前 駆体であるアンジォテンシン Iから血管収縮活性を有するアンジォテンシン IIに変換し て血圧を上昇させる。このため、 ACE阻害活性を有するペプチドは、 ACEを阻害する ことで生体内においてアンジォテンシン IIの生産を抑えることから血圧降下作用を発 揮することが期待されている。通常、血圧降下作用を有するペプチドの開発にあたつ ては、まず、 ACE阻害活性を示すペプチドの探索が行なわれることが多いことから ACE阻害活性を指標とした血圧降下作用を有するペプチドの提案が多くなつている 。そして、このような ACE阻害活性を指標とした血圧降下剤が、今まで多く提案され、 高血圧症の予防や治療に利用されている。
前記 ACE阻害活性を指標とした血圧降下作用を示すペプチド等の機能性ペプチド の製造においては、例えば、食品用タンパク質を酵素分解して機能性ペプチドを製 造する場合、機能発現効果を高めるため等に、該酵素分解後にその分解物を濃縮、 精製又は単離する等の煩雑な工程を行なう必要が多い。
また、一般に消化管から血中に吸収され、生体内組織において機能発現するタイ プのペプチドは、生体内への吸収効率が高ぐ生体内での各種分解酵素群による分 解抵抗性が高い生体内非分解性ペプチドが有効であると推定される。しかし、どのよ うなペプチド等を含む場合に生体内での分解抵抗性が高くなるかについての詳細は 判っていない。そこで、生体内での分解抵抗性が高ぐ酵素分解後にその分解物を 濃縮、精製又は単離する等の煩雑な工程を必ずしも行なわなくても所望の機能を有 効に発現しうる食品用又は医薬用等の酵素分解物、及びその製造法の開発が望ま れている。
[0003] 例えば、特許文献 1には、大豆タンパク質を原料として、ェキソプロテアーゼ活性を 実質的に持たずエンドプロテアーゼ活性のみを持つ酵素の 2種以上を同時又は逐次 的に作用させ、生成する遊離アミノ酸が 5%以下であり、ジペプチド及びトリペプチド を主成分とする平均鎖長 3以下の腸管吸収性に優れた低分子ペプチド混合物の製 造法が提案されている。また、特許文献 2には、加熱変成させた大豆タンパク質を、ァ スペルギルス.オリゼー由来のプロテアーゼ等の酵素により分解してなる、 Ala Tyr、 Gly Tyr Tyr、 Ala Asp Phe、 Ser Asp Pheからなるジペプチド及びトリペプチドを有効 成分として含む、好ましくは平均ペプチド鎖長 2 4であり、遊離アミノ酸を 20 30重 量％含有する大豆タンパク質分解物を利用した機能性食品及びその製造法が提案 されている。
しかし、これら大豆タンパク質を原料とする酵素分解物は、獣乳カゼインを原料とす る酵素分解物とはその内容物が大きく異なる。従って、上記特許文献には、獣乳カゼ インを原料とした場合における、有効成分の濃度が高ぐ生体吸収性に優れ、更には 濃縮、精製、単離等の煩雑な工程を必ずしも行なうことなく利用できるカゼイン分解 物の製造法、並びにカゼイン加水分解物については示唆されていない。
[0004] 一方、特許文献 3及び 4には、獣乳カゼインをプロテアーゼ及びべプチダーゼ等に より酵素分解する各種機能性を有するペプチドの製造法、並びに該製造法で得られ た機能性を有する特定のペプチドが提案されてレ、る。
しかし、これら特許文献に記載されている酵素分解物は、特定の有効成分であるべ プチドを得るためのものであり、獣乳カゼインを平均鎖長 2.1以下に加水分解すること 、その具体的方法、更にはこのような特定の平均鎖長等を有するカゼイン加水分解 物の有効性にっレ、ては教示されてレヽなレ、。
特許文献 1：特開平 5 - 252979号公報
特許文献 2 :特開 2003 - 210138号公報 特許文献 3：特開平 6 - 128287号公報
特許文献 4 :特開 2001— 136995号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の課題は、生体内での酵素分解作用を最小限に抑えた生体内非分解性べ プチド及び遊離アミノ酸を含み、特に、生体内での血圧降下作用等の機能発現が期 待されるカゼイン加水分解物を提供することにある。
本発明の別の課題は、前記カゼイン加水分解物を、容易に、し力も煩雑な工程を 必ずしも行なうこと無く効率的に得ることが可能なカゼイン加水分解物の製造法を提 供することにある。
本発明の他の課題は、生体内非分解性ペプチド及び遊離アミノ酸を含み、生体に おける優れた血圧降下作用が期待でき、各種機能性食品又は医薬に利用可能な ACE阻害活性又は血圧降下活性を有する剤を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、獣乳カゼインを平 均鎖長がアミノ酸残基数で 2.1以下までに加水分解することにより、トリペプチド及び ジペプチド等の低分子ペプチド及び遊離アミノ酸を含むカゼイン加水分解物を得る ことができ、該加水分解物中には、カルボキシ末端に Pro残基を有する生体内非分 解性ペプチド分子及び遊離アミノ酸を効率的に含有させることができることを見出し た。
そして、該カルボキシ末端に Pro残基を有する生体内非分解性ペプチドは、生体内 ぺプチダーゼ群に対して分解抵抗性が高いことが期待できるため、その物の機能を 生体内において十分発揮できる可能性が高ぐ更に、ジペプチド及びトリペプチド等 の生体吸収性が良好なペプチドの割合が高いので、前記カゼイン加水分解物力 生 体における血圧降下作用等の各種機能を十分に発現しうることを見出し本発明を完 成した。
更に、本発明者らは、公知の各種酵素群から本発明のカゼイン加水分解物を効率 的に得ることができる酵素を探索した結果、特に、特定の酵素群が、本発明のカゼィ ン加水分解物をより効率的に産生しうることも見出した。
[0007] 本発明によれば、獣乳カゼインを平均鎖長がアミノ酸残基数として 2.1以下に加水 分解して得た、遊離アミノ酸及びペプチドを含むカゼイン加水分解物が提供される。 特に、前記ペプチドが、 Xaa Pro配列を有するジペプチド及び Xaa Pro Pro配列を有 するトリペプチドからなる生体内非分解性ペプチドを含み、且つ Xaa Pro配列を有す るジペプチドの含有割合が分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計に対して 5 重量％以上であり、 Xaa Pro Pro配列を有するトリペプチドの含有割合が分解物中の ペプチド及び遊離アミノ酸の合計に対して 1重量％以上であるカゼイン加水分解物が 提供される。尚、 Xaaは任意のアミノ酸を意味する。
また本発明によれば、前記カゼイン加水分解物の製造法であって、カゼイン加水分 解物の平均鎖長がアミノ酸残基数として 2.1以下に分解しうる酵素群を用いて、獣乳 カゼインを、該平均鎖長 2.1以下に加水分解する工程 (A)を含むカゼイン加水分解物 の製造法が提供される。
更に本発明によれば、前記カゼイン加水分解物を有効成分として含む、 ACE阻害 活性又は血圧降下作用を有する剤が提供される。
更にまた本発明によれば、 ACE阻害活性又は血圧降下作用を有する機能性食品 又は医薬を製造するための、前記カゼイン加水分解物の使用が提供される。
発明の効果
[0008] 本発明のカゼイン加水分解物は、獣乳カゼインを平均鎖長がアミノ酸残基数として 2.1以下に加水分解して得た、遊離アミノ酸及び生体内非分解性ペプチド等の低分 子ペプチドを含有するので、例えば、経口により優れた生体内吸収性及び生体にお ける各種機能発現が期待できる。従って、種々の機能性食品、医薬品、食品添加物 への利用が期待できる。例えば、本発明の加水分解物を有効成分とする、 ACE阻害 活性又は血圧降下作用を有する剤への使用が期待できる。
本発明の製造法は、カゼイン加水分解物の平均鎖長がアミノ酸残基数として 2.1以 下に分解しうる酵素群を用いて、獣乳カゼインを、該平均鎖長 2.1以下に加水分解す る工程 (A)を含むので、本発明のカゼイン加水分解物を容易に、しかも効率的に得る こと力 Sできる。従って、本発明のカゼイン加水分解物の工業的生産に有効である。 図面の簡単な説明
[0009] [図 1]実施例 1で行なった Xaa Pro, Xaa Pro Proの生体内消化吸収性及び分解抵抗 性評価結果を示すグラフである。
[図 2]実施例 1で調製したカゼイン加水分解物粉末の用量依存的な血圧降下作用の 実験結果を示すグラフである。
[図 3]分析例 1において行なった 0 0.6Mの直線濃度勾配による結合タンパク質の溶 出パターンとタンパク質分解活性との関係を示すグラフである。
[図 4]実施例 3で行なったカゼインの酵素群による分解時間と得られるカゼイン加水 分解物の ACE阻害活性との関係を示すグラフである。
[図 5]実施例 3で行なったカゼインの酵素群によるカゼイン加水分解物の平均鎖長と ACE阻害活性との関係を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明のカゼイン加水分解物は、獣乳カゼインをアミノ酸残基数として平均鎖長が 特定範囲になるように加水分解して得た、遊離アミノ酸及びペプチドを、好ましくは力 ゼイン加水分解物全量に対して 80重量％以上、好ましくは 80 90重量％含む。特に 、該加水分解物が、ペプチドとして、 Xaa Pro配列を有するジペプチド及び Xaa Pro Pro配列を有するトリペプチドからなる生体内非分解性ペプチドを特定割合で含むこ とが好ましい。但し、ペプチドはペプチド塩であっても良い。
[0011] ここで、平均鎖長とは、カゼイン酸加水分解物の総アミノ酸のモル数に対する、同 重量の獣乳カゼインを加水分解した際に生産されるペプチド及び遊離アミノ酸の合 計モル数の比で示すことができる。カゼイン酸カ卩水分解物とは、カゼインタンパク質を アミノ酸にまで分解したものである。
該平均鎖長は、例えば、ァミノ基に反応して発色する OPA(o-フタルアルデヒド)試薬 を用いた OPA法により、加水分解物中のモル濃度を評価し、平均鎖長 = (カゼイン酸 加水分解物中のモル数)/ (カゼイン酵素加水分解物中のモル数)として求めることが できる。
また、生体内非分解性ペプチドとは、生体の腸管から吸収された際に、生体内ぺプ チダーゼ群に対して分解抵抗性が高レ、、カルボキシ末端に Proを有するジペプチド Xaa Pro及びトリペプチド Xaa Pro Proを意味する。
[0012] 本発明において、獣乳カゼインを加水分解して得られる分解物の平均鎖長は、アミ ノ酸残基数として 2.1以下、好ましくは 1.1一 2.1、特に好ましくは 1.3— 2.1である。該平 均鎖長が 2.1を超える場合には、所望のジペプチド及びトリペプチド、更には遊離アミ ノ酸の割合が低下し、所望の生体吸収性、更には生体内非分解性ペプチドの含有 割合が低下する。
本発明のカゼイン加水分解物中に含まれる Xaa Pro配列を有するジペプチドの含 有割合は、分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計に対して通常 5重量％以上 、好ましくは 5 25重量％である。該含有割合が 5重量％未満の場合には、所望の生 体内吸収性及び機能発現が低下する恐れがあるので好ましくない。
本発明のカゼイン加水分解物中に含まれる Xaa Pro Pro配列を有するトリペプチド の含有割合は、分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計に対して通常 1重量％ 以上、好ましくは 1一 5重量％である。該含有割合力 1重量％未満の場合には、所望 の生体内吸収性及び機能発現が低下する恐れがあるので好ましくない。
[0013] 本発明のカゼイン加水分解物にぉレ、て、前記 Xaa Pro配列を有するジペプチド及 び Xaa Pro Pro配列を有するトリペプチドの Xaaは、任意のアミノ酸であって良い。 本発明のカゼイン加水分解物は、例えば、 Xaa Pro配列を有するジペプチドとして、 lie Pro, Glu Pro, Arg Pro, Gin Pro, Met Pro及び Tyr Proを含み、 Xaa Pro Pro配列を 有するトリペプチドとして、 Ser Pro Pro, lie Pro Pro及び Val Pro Proを含むカゼイン加 水分解物が好ましく挙げられる。
本発明のカゼイン加水分解物においては、このようなジペプチド及びトリペプチドを 含むことにより、特に、 ACE阻害活性又は血圧降下作用が有効に発現される。
[0014] 本発明のカゼイン加水分解物は、ペプチド以外に遊離アミノ酸を含むが、遊離アミ ノ酸の含有割合は、分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計に対して通常 35— 50重量％、好ましくは 40 45重量％である。
本発明のカゼイン加水分解物には、前記ペプチド及び遊離アミノ酸の他に、例えば 市販の獣乳カゼイン等に通常含まれる、脂質、灰分、炭水化物、食物繊維、水分等 が 10— 20重量％程度含まれていても良ぐまた、必要に応じてこれらのうちの適当な 成分の一部若しくは全部を除去しても良レ、。
[0015] 本発明のカゼイン加水分解物を製造するには、例えば、カゼイン加水分解物の平 均鎖長がアミノ酸残基数として 2.1以下に分解しうる酵素群を用いて、獣乳カゼインを 、該平均鎖長 2.1以下に加水分解する工程 (A)を含む本発明の製造法により得ること ができる。
獣乳カゼインは、 Proを多く含む食品等に用いられる安全性が確認されたタンパク 質であり、例えば、牛乳、馬乳、山羊乳、羊乳等のカゼインが挙げられ、特に牛乳力 ゼインが好ましく使用できる。
獣乳カゼインを加水分解する際のカゼイン濃度は、特に限定されないが本発明の 前記加水分解物を効率良く生産するために、 3— 19重量％が好ましい。
[0016] 本発明の製造法に用いる前記酵素群としては、カゼイン分解物の平均鎖長がアミノ 酸残基数として 2.1以下に分解しうる酵素を適宜選択して組合せた酵素群であれば 良ぐ例えば、 Xaa Pro Xaa又は Xaa Pro Pro Xaaのカルボキシ末端の Pro Xaa配列が 切断可能なぺプチダーゼを含む酵素群 (X)が好ましく挙げられる。
前記酵素群 (X)は、活性中心にセリンを持つ、セリンタイプのプロティナーゼもしくは 、活性中心に金属を持つ金属プロティナーゼを含むことが好ましい。金属プロティナ ーゼとしては、中性プロテアーゼ I、中性プロテアーゼ II及びロイシンアミノぺプチダー ゼ等が挙げられ、これらの少なくとも 1種を更に含むことが、所望の加水分解物を効 率良ぐ且つ短時間で、更には 1段階反応で得ることができる点で好ましい。また前 記 Pro Xaa配列が切断可能なぺプチダーゼとしては、等電点が酸性域を示す酵素で あることが好ましい。
[0017] 前記酵素群又は酵素群 (X)としては、例えば、ァスペルギルス ·オリゼー (Aspergillus oryzae)等の麹菌由来の菌体外酵素群が挙げられる。このような菌体外酵素群は、 適当な培地で菌体を培養し、菌体外に生産される酵素を水抽出した酵素群等が挙 げられ、特に、ァスペルギルス 'ォリゼ一由来の菌体外酵素群のうちの等電点が酸性 域を示す酵素群が好ましく挙げられる。
前記ァスペルギルス 'ォリゼ一由来の菌体外酵素群としては、市販品を利用するこ とができ、例えば、スミチーム FP、 LP又は MP (以上、登録商標、新日本化学 (株)製)、 ゥマミザィム (登録商標、天野ェンザィム (株)製）、 Sternzyme B11024、 PROHIDROXY AMPL (以上、商品名、株式会社樋口商会製）、オリエンターゼ ONS (登録商標、阪急 バイオインダストリ一 (株)製)、デナチーム AP (登録商標、ナガセ生化学社製)等が挙げ られ、特に、スミチーム FP (登録商標、新日本化学 (株)製)の使用が好ましい。
これら市販の酵素群を用レ、る場合には、通常、至適条件が設定されているが、前記 本発明のカゼイン加水分解物が得られるように条件、例えば、使用酵素量や反応時 間等を用いる酵素群に応じて適宜変更して行なうことができる。
[0018] 前記酵素群により加水分解する際の酵素群は、例えば、獣乳カゼインを溶解した 水溶液に、酵素群 Z獣乳カゼインが重量比で 1Z1000以上、好ましくは 1/10— 1/ 1000、特に好ましくは 1/10— 1/100、更に好ましくは lZlO 1Z40の割合で添加 すること力 sできる。
反応条件は、酵素群に応じて目的のカゼイン加水分解物が得られるように適宜選 択できる力 通常 25— 60°C、好ましくは 45— 55°Cにおいて、 pHを 3— 10、好ましくは 5 一 9、特に好ましくは 5— 8に調整して行なうことができる。また、酵素反応時間は、通 常 2— 48時間、好ましくは 7— 15時間にて行うことができる。
[0019] 前記酵素反応の終了は、酵素を失活させることにより行なうことができ、通常、 60— 110°Cで酵素を失活させ、反応を停止させることができる。
前記酵素反応停止後、必要に応じて沈澱物を、遠心分離除去や各種フィルター処 理により除去することが好ましい。
また、必要に応じて、得られる加水分解物から苦味や臭味を有するペプチドを除去 することもできる。このような苦味成分や臭味成分の除去は、活性炭又は疎水性樹脂 等を用いて行なうことができる。例えば、活性炭を、使用したカゼイン量に対して 1一 20重量％得られた加水分解物中に添加し、 1一 10時間反応させることにより行なうこと ができる。使用した活性炭の除去は、遠心分離や膜処理操作等の公知の方法により 行なうことができる。
[0020] 前記工程 (A)により得られるカゼイン加水分解物を含む反応液は、そのまま飲料等 の液体製品に添加利用することができる。また、本発明のカゼイン加水分解物の汎 用性を高めるために、前記反応液を濃縮後、乾燥し粉末の形態とすることが好ましい このような粉末は、各種機能性食品、その添加物、医薬又はその有効成分として利 用すること力 Sできる。また、前記粉末には、栄養的バランスや風味等を改善するため に、各種補助添加剤を含有させることもできる。例えば、各種炭水化物、脂質、ビタミ ン類、ミネラル類、甘味料、香料、色素、テクスチユア改善剤等が挙げられる。
このような本発明のカゼイン加水分解物を含む粉末は、例えば、飲料、ヨーグルト、 流動食、ゼリー、キャンディ、レトルト食品、錠菓、クッキー、カステラ、パン、ビスケット 、チョコレート等に添加して使用できる他、カプセル、錠剤等の形態に成型等して利 用することちできる。
[0021] 本発明のカゼイン加水分解物は、上記の使用法が可能であるので、各種スポーツ 飲料、一般飲料、一般食品、栄養補助食品、栄養機能食品等に保健効果を付与し た機能性食品の製造に、更には医薬の製造に有効に利用できる。
例えば、本発明のカゼイン加水分解物は、後述する実施例において、 ACE阻害活 性及び血圧降下作用を有することを確認してレ、るので、これらを有する機能性食品 の製造用又は医薬の製造用等の剤として使用することができる。
本発明のカゼイン加水分解物を ACE阻害活性及び血圧降下作用を有する剤として 用いる場合の投与量は、通常、経口投与によるヒトの場合、本発明のカゼイン加水分 解物中のペプチド及ぶ遊離アミノ酸量で、 1回あたり 0.1— 100mg/kg、好ましくは 1一 20mg/kg摂取し得る量が望ましい。従って、本発明のカゼイン加水分解物や ACE阻 害活性及び血圧降下作用を有する剤を各種飲料、食品、医薬に添加して使用する 場合には、上記投与量を目安に適宜選択することができる。
[0022] 本発明の前記製造法において、前記酵素群 (X)を含む酵素群を用いて獣乳カゼィ ンを 1段階反応により加水分解する方法は、獣乳カゼインに含まれる Xaa Pro Pro,特 に、血圧降下作用、抗ストレス作用等の各種機能が既に確認されている lie Pro Pro 及び/又は Val Pro Proが従来の製造法に比して 1段階反応により理論回収率に近 レ、、例えば、 60。/o以上、好ましくは 70%以上の高効率で得ることができる。従って、こ のような製造法は、本発明のカゼイン加水分解物の製造法の他に、獣乳カゼイン、若 しくは Xaa Pro Pro配列を多く含む食品タンパク質から、 目的とする Xaa Pro Proを多く 含む分解物又はその精製物の製造法としても有効な方法である。
実施例
[0023] 以下、本発明を実施例、分析例及び比較例により更に詳細に説明するが、本発明 の範囲はこれらに限定されない。
実施例 1、比較例 1一 8
牛乳由来カゼイン（日本 NZMP社製) lgを約 80°Cに調整した蒸留水 99gに加えて充 分に撹拌した後、 1N水酸化ナトリウム (和光純薬社製)溶液を添加して pH7.0とし、また 温度を 20°Cに調整して基質溶液を調製した。
得られた基質溶液に表 1に示す市販の各種酵素を、酵素/カゼインの重量比が 1 /25となるように添加して、 50°Cで 14時間反応させ、次いで 110°Cで 10分間のオート クレープを行い酵素を失活させ、カゼイン酵素分解物溶液を得た。次に、得られた酵 素分解物溶液をスプレードライヤーにより乾燥し、粉末を調製した。
上記のように得られた粉末中の含有成分の分析を行なった。タンパク質はケルダ一 ル法で測定し、アミノ酸についてはアミノ酸分析装置にて測定した。また、該タンパク 質量力 アミノ酸を引いた量をペプチド量とした。更に、脂質は酸分解法で、灰分は 直接灰化法で、水分は常圧加熱乾燥法でそれぞれ測定した。尚、 100%から各成分 を引いた残りを炭水化物量とした。その結果、アミノ酸は 35.8重量％、ペプチドは 45.7 重量％、水分は 6.6重量％、脂質は 0.2重量％、灰分は 4.1重量％及び炭水化物は 7.6重量％であった。
[0024] ぐ平均鎖長の測定 >
得られた各粉末に含まれるアミノ酸及びペプチドの平均鎖長は、それに含まれる遊 離アミノ酸及びペプチドのァミノ基に反応する OPA試薬でモル数を測定し、同様に測 定したカゼイン酸カ卩水分解物のモル数との比で評価した。結果を表 1に示す。
メタノール lmlに 0-フタルアルデヒド (蛍光分析用特級試薬、ナカライテスタ社製
)40mgを溶解させ、 -メルカプトエタノール 100 /i lを加えた。予め調製しておいた lOOmMの四ホウ酸ナトリウム溶液 25mlに、 20%ドデシル硫酸ナトリウム 2.5mlを加えた ものを用いて、上記溶解した 0-フタルアルデヒドを 25mlに希釈し、更に蒸留水で 50ml とすることで OPA試薬を調製した。
前記各酵素を反応させた 1%カゼイン酵素加水分解物粉末試料 (表 1)を、適当な溶 媒に適当な濃度で溶解し、 15000rpmで 10分間遠心分離を行い、上清 50 μ ΐを分取し た。続いて、上記 ΟΡΑ試薬を lml加え、よく撹拌し、室温で 5分間放置した後、吸光光 度計 (商品名 Ubest-35、 日本分光 (株)製)で 340nmの吸収を測定した。
検量線は 1 %のカゼイン酸加水分解物を調製し、適切に希釈したものを用いて同様 に測定した結果から、吸光度とモル濃度の関係を求めた。そして、平均鎖長は以下 の式に従って計算した。
平均鎖長 = (1。/0カゼイン酸加水分解物のモル濃度)/ (各試料 1 %カゼイン酵素加水 分解物のモル濃度）
[表 1]
Figure imgf000013_0001
1),3),8)，9)は新日本化学工業社製、 2)は樋口商会社製、 4)は天野ェンジム社製
5)はナガセ産業社製、 6)は大和化成社製、 7)はノボザィムジャパン社製 <ペプチド構成アミノ酸の測定 >
実施例 1で調製した粉末を適量の蒸留水に溶解し、自動ペプチド分析機 (商品名 PPSQ-10(株)島津製作所製)を用いて解析し、粉末中において N末端側から順に如 何なるアミノ酸が位置するかを調べた。結果を表 2に示す。尚、 自動ペプチド分析機 は遊離アミノ酸を検出しない。
また、 5残基目のアミノ酸の合計は 120pmol、 6残基目のアミノ酸の合計は lOOpmolで あった。これらの結果より、前記粉末中に含まれるペプチドのほとんどがジペプチド及 びトリペプチドであることが判った。また、 2残基目のアミノ酸が Proであるペプチドの割 合が 49.5%と顕著に上昇していた。更に 3残基目のアミノ酸が Proであるペプチドの割 合も 29.8%と多かった。
従って、前記粉末には、 Xaa Pro又は Xaa Pro Proが多く含まれ、これらペプチドは 生体内プロテアーゼによる酵素分解作用に対する抵抗性が高ぐ機能性ペプチドと しての利用に最適であるものと推定できる。
[表 2]
Figure imgf000014_0001
< Xaa Pro, Xaa Pro Proの生体内消化吸収性及び分解抵抗性評価 >
表 1に示す実施例 1で調製したカゼイン酵素分解物の粉末中に含まれる Xaa Pro及 び Xaa Pro Pro配列を有するペプチドの生体内での消化吸収性及び分解抵抗性を 確認するためにラットにおける経口投与後の血中移行性を以下のとおり試験した。 まず、 6週齢の SDラット 2匹に、 Xaa Pro Proの例として Val Pro Proを、また Proを有さ ないジペプチドとして Gly Glyをそれぞれ 500mg/匹で経口投与し、門脈からの経時 的採血における各種ペプチドの血中移行性を測定した。結果を図 1に示す。
図 1より、 Gly Glyは容易に生体内で分解を受け Glyが検出された力 Val Pro Proは 比較的安定に血液中に吸収されることが確認された。この結果より、 Xaa Pro及び Xaa Pro Pro配列のジペプチド及びトリペプチドは、生体内での消化吸収性及び分解抵 抗性が高レ、ものと推定できる。
[0029] <血圧降下作用の評価 >
表 1に示す実施例及び比較例で調製したカゼイン加水分解物粉末を、 27週齢の自 然発症高血圧ラット SHR (雄)各 5匹に体重 lkgあたり 32mg経口投与した。投与前と投 与 5時間後の血圧を、 Tan_cuff PB-98(Softron社製)を用いて尾部脈圧を測定すること により行なレ、、血圧の変動を評価した。また、コントロールとして前記各粉末の代わり にカゼインを投与して同様な評価を行なった。尚、血圧測定前にはプレヒートボックス (CSI JAPAN社製)にてラットを 45°Cで 8分間加温した。結果を表 3に示す。
表 3の結果から、コントロールとして使用したカゼインでは全く血圧の変動が観測さ れなかったのに対し、実施例 1の粉末投与により血圧降下作用が確認された。一方、 比較例の粉末では、いずれも血圧値の変動は観測されな力 た。従って、 Xaa Pro及 び Xaa Pro Proを特定量含む平均鎖長力 2.1以下である実施例 1のカゼイン加水分解 物は、血圧降下作用に優れることが判った。
また、実施例 1で調製したカゼイン加水分解物粉末を用いて上記方法に準じて、該 粉末の用量依存的な血圧降下作用の実験を行った。結果を表 4及び図 2に示す。
[0030] <ACE阻害活性の評価 >
ゥシ肺由来の ACE (和光純薬株式会社製)を 0.1Uとなるように pH8.3、 0.1Mホウ酸緩 衝液に溶解し、 ACE溶液を調製した。表 1に示す各酵素分解物の粉末を蒸留水で 50 倍に希釈した希釈酵素分解溶液 80 μ 1と、 5mMヒプリルヒスチジルロイシン (シグマ社 製) 200 μ ΐの溶液と、上記で調製した ACE溶液 20 μ ΐとを試験管に添カ卩し、 37°Cで 30 分間反応させた。その後、 1N塩酸 250 μ ΐを添加して反応を停止させた後、酢酸ェチ ノレ 1.7mlをカ卩え、撹拌後、酢酸ェチル層 1.4mlを試験管に採取し、 120°Cで約 60分間 蒸発乾燥させた。乾燥物に lmlの蒸留水を加えて、酢酸ェチル中に抽出されたヒプリ ル酸の 228nmでの吸光度を測定した。また、対照として、希釈酵素分解溶液を添加し なかったもの、及び希釈酵素分解溶液及び ACE溶液を添カ卩しなかったものにっレ、て も吸光度を測定した。これらの吸光度から ACE阻害活性を以下の式にて算出した。 結果を表 3に示す。
ACE阻害活性 (％)= [ (A-B) /A] X 100
A： (希釈酵素分解溶液を添加せずに ACE溶液を添加したものにおける吸光度)一 (希 釈酵素分解溶液及び ACE溶液を添加しなかったものにおける吸光度）
B : (希釈酵素分解溶液及び ACE溶液を添加したものにおける吸光度) - (希釈酵素分 解溶液を添カ卩し、 ACE溶液を添加しなかったものにおける吸光度）
[表 3]
Figure imgf000016_0001
[表 4]
Figure imgf000016_0002
<酵素分解物中に含まれるペプチドの測定 >
表 1に示す実施例 1の酵素分解物の粉末を、 10mg/mlとなるように蒸留水に希釈 溶解した。一方、表 5に示す配列を有する各種の化学合成標準ペプチドの 25 / g/ ml、 50 i g/ml及び 100 /i g/ml溶液を作成し、これらを下記測定条件による LC/MS により分析した。前記粉末溶液の分析におけるピークのうち、標準ペプチドと分子量 及びリテンションタイムが一致するものを、標準ペプチドと同一の配列として同定した 。標準ペプチドのピークと対比することにより、前記粉末溶液中に表 4に示す各種べ プチドが含まれる割合を求めた。結果を表 5に示す。
また、前記粉末を蒸留水で希釈溶解した溶液中のペプチド及び遊離アミノ酸量が 8.15mg/mlであり、ペプチド量が 4.57mgZmlであり、該ペプチド中の Xaa Pro量が 514.5 μ gであったので、粉末中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対する Xaa Proの割合は 6.3重量％であり、該ペプチド中の Xaa Pro Pro量が 116.5 μ gであったの で、粉末中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対する Xaa Pro Proの割合は 1.4 重量％であった。
[0034] <使用機器 >
高速液体クロマトグラフ質量分析計： LCMS_2010、システムコントローラー： SCL-10Advp,オートインジェクター： SIL_10Advp、送液ポンプ： LC_10Advp X 2、カラ ムオーブン： CT0_10Avp、フォトダイオードアレイ検出器： SPD_M10AVP、オンライン デガッサ： DGU-14A (以上、商品名、（株)島津製作所製)、カラム： Develosil
C30-UG-3(2.0mmI.D. X 150mmL)(野村化学 (株)製)。
<測定条件 >
移動相八: 0.1重量％蟻酸水溶液、移動相 B : 100%ァセトニトリル溶液、タイムプログ ラム： 0%B(0分) _7.5%B(30分) _80%Β(30·01分) _100%B(35分) _0%B(35.1分)— STOP(45分)、試料注入量： 5 /i l、カラム温度： 50°C、検出波長： 200— 300nm、イオン 化モード： ESI( + )、霧化ガス流量： 4.5L/分、印加電圧： +4.5kV、 CDL温度： 250°C、 ブロックヒーター温度： 200°C、 CDL電圧： 0.0V、 Q-array電圧： SCAN、分析モード： SIM測定、分析範囲： EP(m/z = 245.2)、 IP(m/z = 229.3)、 MP(m/z = 247.3)、 QP(m /z = 244.2)、 RP(m/z = 272.3), SPP(m/z = 300.3), VPP(m/z = 312.1), IPP(m/z = 326.1)、取り込み時間： 0.5秒 ZCh。
[0035] [表 5]
Figure imgf000018_0001
分析例 1
<酵素の特定 >
実施例 1で使用したァスペルギルス ·オリゼー由来の菌体外酵素にぉレ、て、本発明 のカゼイン加水分解物を得るために必要な酵素を以下の方法により分析した。尚、 以下の操作は特に断りのない限り全て 4°Cで行った。また特に指定のない試薬は全 て和光純薬 (株)製の特級試薬を用いた。
(各種阻害剤による酵素群への影響）
スミチーム FP (登録商標、新日本化学工業社製) 2000mgを、 pH7.2の 50mMリン酸緩 衝液 10mlに溶解し、セルロースアセテート膜 (DISMIC_25cs、ポア径 0.45 μ m、
Advantec (株)製)により不溶物を除去したものを粗酵素溶液とした。
この粗酵素溶液を実施例 1と同様に 1%カゼインと反応させた。この際、金属プロテ ァーゼの阻害剤である、 EDTA (エチレンジァミン四酢酸)もしくは、セリンプロテアーゼ の阻害剤である、 PMSF (フエニルメタンスルホン酸フルオタド)を加えて反応させると、 平均鎖長が大きくなり、 目的の加水分解物は得られなかった。このため、本発明の力 ゼイン加水分解物の生成には、金属プロテアーゼもしくはセリンプロテアーゼが重要 な働きをしているものと考えられる。
(イオン交換樹脂による分離）
陰イオン交換樹脂である DEAE sephacel (アマシャムバイオサイエンス (株)製) 20mlを 活性化し、 pH7.2の 50mMリン酸緩衝液によって平衡化を行い、直径 1.5cm X 12cmの ガラスカラムに充填した。溶出する試料は全て未吸着試料として回収しつつ、 1.0ml /分の流速で前述の粗酵素溶液を吸着させ、 PH7.2の 50mMリン酸緩衝液をゲル体 積の 10倍量用いて充分洗浄した後、 0 600mM NaClを含む pH7.2の 50mMリン酸緩 衝液 200mlで直線濃度勾配溶出した。溶出液は 5mlずつ 100本に分けて分画し、各画 分の 280nmの吸収とプロティナーゼ活性測定、 ACE阻害活性をそれぞれ評価した。
[0037] (プロティナーゼ活性の測定方法）
蛍光物質であるカゼインフロレツセインイソチオシァネート (FITC-カゼイン、シグマ 社製) 25mgを pH7.2の 50mMリン酸緩衝液 5mlに溶解させたものを基質溶液として用い た。各画分 10 μ ΐ及び基質溶液 20 μ ΐをカ卩え、 55°Cで 10分間反応させた後、 5%トリク ロロ酢酸溶液 120 μ 1を加えて反応を停止させた。 1500rpmで遠心分離により上清 60 μ 1を回収し、 ρΗ8.5の 0.5Μトリス塩酸塩 3mlに加えて、蛍光測定器 (F_1300、 日立製 作所 (株)製)を用いて励起波長 485nm及び蛍光波長 525nmを測定した。
[0038] DEAE sephacelの各画分の 280nmの吸光度測定の結果から、約 73%程度のタンパ ク質が陰イオン交換樹脂に吸着していることが確認された。図 3に、 0から 0.6Mの直線 濃度勾配による結合タンパク質の溶出パターンとタンパク質分解活性を示す。
特に画分 21— 60に、多くのタンパク質が溶出された。また各画分に溶出された酵素 液を用いてカゼインを分解させた場合の ACE阻害成分の生成活性を評価した。その 結果、主な ACE阻害成分の生成活性は画分 20— 60に確認された。
一方、 FITC-カゼインを基質としたプロティナーゼ活性は主に画分 19一 27(NaClで 0.1M— 0.2M)に溶出されており、 ACE阻害成分の生成にプロティナーゼ活性が重要 な働きを持っていることが示された。以上の結果から、カゼイン力 ACE阻害成分を 精製する酵素活性にプロティナーゼ活性が重要な役割を果たしていることが判った。
[0039] (含有プロティナーゼの特定）
前記 DEAE s印 hacel溶出画分のうち、プロティナーゼ活性のあった画分 21 35を集 め、 pH7.2の 5mMリン酸緩衝液 5リットルに対して透析を行った。 S印 hacryl S- 300 HR( アマシャムバイオサイエンス (株)製)を、 200mMの NaClを含む pH7.2の 50mMリン酸緩 衝液に懸濁し、充分に脱気した後、直径 18cm X 100cmのガラスカラムに充填した。こ のカラムは 2ml/分の流速を保ち、 200mMの NaClを含む pH7.2の 50mMリン酸緩衝液 で十分に平衡ィ匕した。このカラムに透析後の試料を供し、 10mlずつ 100本の画分を回 収した。これらの画分は 280nmの吸収と FITC-カゼインを基質としたプロティナーゼ活 性測定を行なった。
[0040] (ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
各画分を 10 Ai l分取し、 ρΗ6·8の 0.125Mトリスバッファ、 3%SDS、 5% /3 _メルカプトェ タノ一ノレ、 10%グリセロール、 0.01%ブロモフエノールブルーからなる試料バッファー 10 μ ΐを加えて、 95°Cで 5分間加温し、室温で冷却した。この試料を Laemmliの方法 (Nature,227,680(1970》に従レ、、ミニスラブ (アト一社製)で指定濃度のポリアクリルアミ ドゲルに供して 30mAZ枚の条件で電気泳動を行った。泳動終了後のゲルは、 0.25 %クマッシーブリリアントブルー R-250、 50%メタノール及び 7.5%酢酸からなるクマッ シーブリリアントブルー染色液に 10分間浸し、 5%メタノール及び 7.5%酢酸からなる 脱色液で背景が完全に脱色するまで浸透した。分子量の推定には分子量マーカー ( アマシャムバイオサイエンス (株)製)を使用し、各タンパク質バンドの移動度から算出 した。
[0041] 陰イオン交換樹脂に吸着した ACE阻害成分の生成活性を示す画分を Sephacryl S-300樹脂でゲルろ過分離を行レ、分子量約 45kDaに相当する画分に活性が確認さ れ、この画分を 12.5%ゲルによる SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分析したと ころ、 44kDaと 40kDaにほぼ単一のバンドが得られ、このバンドを切り出して N末端配 列解析を行なったところ、 44kDaのバンドからは既知の麹菌の中性プロテアーゼ Iに 相同性が高い配列であった。また、 40kDaのバンドからは麹菌の中性プロテアーゼ II に相同'性が高レ、配列であった。
以上の結果から、陰イオン交換樹脂に吸着したカゼイン力 ACE阻害成分を生成 するプロティナーゼ活性には、少なくとも中性プロテアーゼ Iと中性プロテアーゼ IIの 2 種類のプロティナーゼが含まれていることが判った。
プロティナーゼによりカゼインから分解生産された成分をさらに分解するため、ぺプ チドに作用するぺプチダーゼについて以下のように分析した。
本発明の特徴である Xaa Pro及び Xaa Pro Proを多く含むペプチドを生産するため の酵素を特定するために、ここでは Val Pro Proの各種前駆ペプチドを合成し、 Val Pro Proへの加工活性を評価した。
[0042] (ァミノ末端加工酵素の精製）
DEAE s印 hacel溶出画分のうち、 ACE阻害成分の生成活性のあった画分 21— 37を 集め、 pH7.2の 5mMリン酸緩衝液 5リットルに対して透析を行った。ヒドロキシアパタイト (和光純薬 (株)製)を PH7.2の 5mMリン酸緩衝液に懸濁し、よく脱気した後、直径 1.5cm X 12cmのプラスチックカラムに充填し、 pH7.2の 5mMリン酸緩衝液を 10倍量以上流し て洗浄した。このヒドロキシアパタイトカラムに、透析した ACE阻害成分の生成活性画 分を供し、素通りした画分を全て回収した。
[0043] (アミノぺプチダーゼ活性の測定）
アミノぺプチダーゼ活性の測定は次のように行なった。合成したペプチド Val Val Val Pro Proを 50 μ gZmlとなるように、 pH7.2の 50mMリン酸緩衝液に溶解し、基質溶 液とした。この基質溶液 45 β 1と酵素画分 5 β 1とを混ぜて、 55°Cのインキュベータで 30 分間反応させ、 98°Cで 5分間熱して反応を停止させた。この反応液から適量を分取し 、質量分析装置付高速液体クロマトグラフ装置 ((株)島津製作所製)に供して生成する Val Pro Pro量を評価した。
[0044] 陰イオン交換樹脂に吸着した ACE阻害成分の生成活性画分に含まれる 32kDaの主 要タンパク質を、 10%ゲルを用いた SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を行い、 該当するバンドを切り出してタンパク質を抽出し、 32kDaのほぼ単一タンパク質を精製 し、 N末端配列解析を行なったところ、既知の麹菌のロイシンアミノぺプチダーゼと 10 残基にわたって相同性を保持していたことから、 ACE阻害成分の生成活性の確認さ れた画分には、ロイシンアミノぺプチダーゼが含まれると結論付けることができた。 以上の結果から、陰イオン交換樹脂に吸着する ACE阻害成分の生成活性を示す 画分には、 ACE阻害成分の生成活性に重要な役割を果たしているアミノぺプチダー ゼ活性を示す、ロイシンアミノぺプチダーゼが少なくとも含まれていることが判った。
[0045] (カルボキシ末端カ卩ェ酵素活性の測定）
合成ペプチド Val Pro Pro Phe Leuを 45 μ gZmlとなるように、 pH7.2の 50mMリン酸緩 衝液に溶解したものを基質溶液とした。この基質溶液 50 μ 1と酵素を含む溶液 5 μ 1と を混ぜて、 55°Cのインキュベータで 30分間反応させ、 98°Cで 5分間熱して反応を停止 させた。この反応液から適量を分取し、質量分析装置付高速液体クロマトグラフ装置 ((株)島津製作所製)に供して生成する Val Pro Pro濃度を定量した。
各 DEAE s印 hacel溶液画分のカルボキシ末端加工活性の評価を行なったところ、 画分 30— 50に Val Pro Pro Phe Leuを Val Pro Proに変換する酵素活性が含まれること が明らかとなった。
[0046] 実施例 2
(精製酵素の組合わせによるカゼイン加水分解物の ACE阻害活性の確認） 分析例 1からァスペルギルス ·オリゼー由来の菌体外酵素 (スミチーム FP (登録商標 、新日本化学工業社製))の陰イオン交換樹脂に吸着した ACE阻害成分の生成活性 には、少なくとも中性プロテアーゼ I及び IIを含むプロティナーゼ活性と、ロイシンアミ ノぺプチダーゼを含むアミノぺプチダーゼ活性と、カルボキシ末端をプロリン直後ま で分解する活性の 4つの酵素活性が含まれていることが判った。
前記吸着した画分 (図 3参照)のうち、プロティナーゼ活性を多く含む画分 1(図 3の画 分 1一 35)と、カルボキシ末端をプロリン直後まで分解する活性を多く含む画分 11(図 3 の画分番号 36— 55)と、それ以降の画分 III (図 3の画分番号 56— 100)と、プロティナ一 ゼ活性を示した未吸着画分をそれぞれ用意した。
用意したそれぞれの画分を、表 6に示すように、単独又は組合せて、 1%牛乳由来 カゼイン溶液 lmlに加えて 55°Cで 13時間反応させてカゼイン加水分解物を調製した。 反応終了後、得られた各カゼイン加水分解物について、実施例 1と同様の測定方法 に準じて ACE阻害活性及び平均鎖長を測定した。また、対象として粗酵素溶液を精 製に用いた量の 1Z10000量を分取して同様な測定を行なった。これらの結果を表 6 に示す。
[0047] [表 6] 用いた画分 ACE阻害率 分解物の
(%) 平均鎖長
粗酵素画分 79 1.8
未吸着画分 45 3.7
画分 I 46 2.3
画分 II 27 2.75
面分 m 0 ―
未吸着画分 +面分 II 70 2.1 面分 I +画分 II 56 1.8
未吸着画分 +画分 I +面分 Π 77 1.7
未吸着画分 +画分 I +面分 11+画分 III 78 1.6
未吸着面分 +面分 III 52 ―
画分 I +画分 ΠΙ 40 ―
画分 11+面分 ΙΠ 12 ―
未吸着画分 +面分 Π+面分 ΙΠ 68 ―
面分 I +画分 11+面分 III 43 ―
[0048] 表 6より、未吸着画分、プロティナーゼ活性を多く含む画分、カルボキシ末端をプロ リン直後まで分解する活性を多く含む画分までに ACE阻害活性が強い成分が得られ ること力 S半 IJる。また、約 300mM NaClにて溶出される酵素群により ACE阻害成分が生 成されることが明らかとなり、画分 IIIは不用であることが分かった。
更に、強レ、ACE阻害成分の生成活性を示した各画分で分解したカゼイン加水分解 物の平均鎖長を比較すると、未吸着画分、画分 I、画分 Πでは平均鎖長が 2.1を超え ていたが、それぞれを組合せることにより平均鎖長 2.1以下のカゼイン加水分解物が 得られることが判った。
[0049] 実施例 3
牛乳由来カゼイン（日本 NZMP社製) 15gを約 80°Cに調整した蒸留水 85gに加えて充 分に撹拌した後、 1N水酸化ナトリウム溶液を添加して pH7.0とし、また温度を 20°Cに 調整して基質溶液を調製した。
得られた基質溶液に酵素群としてァスペルギルス 'ォリゼ一由来の菌体外酵素であ るスミチーム FP (登録商標、新日本化学工業社製)を、酵素/カゼインの重量比が 1/ 25となるように添加して、 50°Cで 20時間反応させ、経時的に反応液をサンプリングし、 経時的な ACE阻害活性及び平均鎖長を実施例 1と同様な方法で評価した。結果を 図 4及び図 5に示す。また、 ACE活性が最大値を示した反応時間 12時間の酵素分解 液をスプレードライヤーにて乾燥し、ペプチド渡合物の粉末を得た。
図 4及び図 5より、反応時間の増加に伴い ACE阻害活性は増加し、反応 12時間以 降に減少した。また、ペプチド量の評価から平均鎖長が約 1.3— 2.1において ACE阻 害活性が増加することが確認された。

Claims

請求の範囲
[I] 獣乳カゼインを平均鎖長がアミノ酸残基数として 2.1以下に加水分解して得た、遊 離アミノ酸及びペプチドを含むカゼインカ卩水分解物。
[2] ペプチドとして、 Xaa Pro配列を有するジペプチド及び Xaa Pro Pro配列を有するトリ ペプチドからなる生体内非分解性ペプチドを含み、且つ Xaa Pro配列を有するジぺプ チドの含有割合が分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計に対して 5重量％以 上であり、 Xaa Pro Pro配列を有するトリペプチドの含有割合が分解物中のペプチド 及び遊離アミノ酸の合計に対して 1重量％以上である請求項 1記載のカゼイン加水分 解物。
[3] 食品添加用又は医薬用である請求項 1記載のカゼイン加水分解物。
[4] Xaa Pro配列を有するジペプチドとして、 lie Pro, Glu Pro, Arg Pro, Gin Pro, Met
Pro及び Tyr Proを含み、 Xaa Pro Pro配列を有するトリペプチドとして、 Ser Pro Pro, lie Pro Pro及び Val Pro Proを含む請求項 2記載のカゼイン加水分解物。
[5] 請求項 1記載のカゼイン加水分解物の製造法であって、カゼイン加水分解物の平 均鎖長がアミノ酸残基数として 2.1以下に分解しうる酵素群を用いて、獣乳カゼインを 、該平均鎖長 2.1以下に加水分解する工程 (A)を含むカゼイン加水分解物の製造法。
[6] 前記酵素群が、ァスペルギルス'オリゼー由来の菌体外酵素である請求項 5記載の 製造法。
[7] 前記加水分解を、前記酵素群により 1段階反応により行なう請求項 5記載の製造法
[8] 前記酵素群が、 Pro Xaaを切断可能なぺプチダーゼを含む酵素群 (X)である請求項
5記載の製造法。
[9] 前記酵素群 (X)が、金属プロテアーゼ及びセリンプロテアーゼの少なくとも 1種を更 に含む請求項 8記載の製造法。
[10] 前記酵素群 (X)が、中性プロテアーゼ I、中性プロテアーゼ II及びロイシンアミノぺプ チダーゼの少なくとも 1種を更に含む請求項 8記載の製造法。
[I I] 前記酵素群 (X)が、ァスペルギルス *ォリゼ一由来の菌体外酵素である請求項 8記 載の製造法。
[12] 前記 Pro Xaaを切断可能なぺプチダーゼが、等電点が酸性域を示す酵素群である 請求項 8記載の製造法。
[13] 工程 (A)において、獣乳カゼインの加水分解時のカゼイン濃度力 ¾一 19重量％であ り、且つ酵素群/獣乳カゼインの割合が質量比で 1Z100以上である請求項 5記載の 製造法。
[14] 請求項 1記載のカゼイン加水分解物を有効成分として含む、アンジォテンシン変換 酵素阻害活性又は血圧降下作用を有する剤。
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