ES2313067T3 - Hidrolizado de caseina, y su procedimiento de preparacion y uso. - Google Patents
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Abstract
Un hidrolizado de caseína que comprende aminoácidos libres y péptidos obtenidos por hidrólisis de caseína de leche animal con un grupo de enzimas que tiene una longitud media de cadena no mayor que 2,1 en términos del número de residuos de aminoácidos, en donde dicho grupo de enzimas comprende peptidasas capaces de escindir un enlace peptídico Pro-Xaa y leucinaamino-peptidasas, y comprende adicionalmente al menos una de proteasa neutra I y proteasa neutra II, todas las cuales son enzimas extracelulares derivadas de Aspergillus oryzae, en donde dichos péptidos comprenden péptidos indigeribles in vivo constituidos por dipéptidos que tienen una secuencia Xaa-Pro y tripéptidos que tienen una secuencia Xaa-Pro-Pro, y en donde el contenido de dichos dipéptidos que tienen una secuencia Xaa-Pro no es menor que 5% en peso de la cantidad total de aminoácidos libres y péptidos en el hidrolizado, y el contenido de dichos tripéptidos que tienen una secuencia Xaa-Pro no es menor que 1% en peso de la cantidad total de aminoácidos libres y péptidos en el hidrolizado.
Description
Hidrolizado de caseína, y su procedimiento de
preparación y uso.
La presente invención se refiere a hidrolizado
de caseína que se obtiene por hidrólisis de caseína de leche
animal, y se espera que exhiba diversas funciones que incluyen
actividad inhibidora de la enzima convertidora de las angiotensinas
y efecto hipotensor, y es útil para diversos alimentos y
medicamentos, así como a un método para preparar hidrolizado de
caseína, y uso del mismo.
Se han consignado una diversidad de péptidos que
tienen diversas funciones, tales como efecto hipotensor, actividad
antibacteriana, efecto de solubilización del calcio, y efecto
inmunomodulador, y estos péptidos se utilizan en alimentos y
medicamentos.
Por ejemplo, se han propuesto péptidos
hipotensores, muchos de los cuales tienen actividad inhibidora de la
enzima convertidora de las angiotensinas (abreviada en lo sucesivo
como ACE). La ACE convierte un precursor, la angiotensina I, en
angiotensina II que tiene actividad vasoconstrictora en el organismo
vivo, aumentando con ello la presión sanguínea. Así, se espera que
los péptidos que tienen actividad inhibidora de la ACE exhiban
efecto hipotensor por inhibir la ACE para suprimir la producción de
angiotensina II en el organismo vivo. En el desarrollo de péptidos
hipotensores, las investigaciones se dirigen usualmente en primer
lugar hacia péptidos que tengan actividad inhibidora de la ACE, con
lo que el efecto hipotensor de los péptidos propuestos se indica
principalmente por el efecto inhibidor de la ACE como índice de
referencia. Un gran número de agentes que tienen efecto hipotensor
evaluados por la actividad inhibidora de la ACE como índice de
referencia, han sido propuestos hasta la fecha, y se utilizan para
prevención y tratamiento de la hipertensión.
En la producción de péptidos funcionales, tales
como péptidos que tengan efecto hipotensor evaluado por el efecto
inhibidor de la ACE, en particular, en la producción de péptidos
funcionales por digestión de las proteínas alimentarias con
enzimas, se requieren usualmente pasos complicados después de la
digestión enzimática, tales como concentración, purificación, y
aislamiento de los productos digeridos, a fin de mejorar la
expresión de los efectos funcio-
nales.
nales.
Como péptidos que son absorbidos a través del
canal alimentario en la sangre para expresar sus funciones en el
organismo vivo, se espera que sean ventajosos péptidos indigeribles
in vivo que tienen susceptibilidad de absorción y
resistencia a la digestión altas contra diversas enzimas digestivas
en el organismo vivo. Sin embargo, no se conocen en detalle cuáles
son los péptidos que contribuyen al aumento de la resistencia a la
digestión in vivo. Así pues, se desean el desarrollo de
productos de digestión enzimática para alimentos y medicamentos,
así como métodos para obtener tales productos, productos que tienen
resistencia elevada a la digestión in vivo, y pueden
expresar eficazmente sus funciones deseadas sin someterse a procesos
complicados tales como concentración, purificación, o aislamiento
después de la digestión enzimática.
Por ejemplo, la Publicación de Patente 1
describe un método para producir una mezcla de péptidos de peso
molecular bajo compuesta principalmente de dipéptidos y
tripéptidos, que tiene una longitud media de cadena no mayor que 3,
y que tienen susceptibilidad de absorción intestinal excelente. La
mezcla de péptidos se prepara a partir de proteína de soja por
acción simultánea o secuencial de dos o más enzimas que tienen
actividad de endoproteasas pero que no tienen sustancialmente
actividad alguna de exoproteasa, sin que se genere más de 5% de
aminoácidos libres. La Publicación de Patente 2 describe un alimento
funcional que utiliza productos de digestión de proteína de soja y
un método para producir el mismo. Los productos de digestión
contienen como ingredientes activos un dipéptido y tripéptidos
constituidos por Ala-Tyr,
Gly-Tyr-Tyr,
Ala-Asp-Phe, y
Ser-Asp-Phe, preparados por
digestión de proteína de soja desnaturalizada por calentamiento con
enzimas tales como proteasas derivadas de Aspergillus
oryzae. Los productos de digestión tienen preferiblemente una
longitud media de cadena peptídica de 2 a 4, y contienen 20 a 30% en
peso de aminoácidos libres.
Sin embargo, estos productos de digestión
enzimáticos de proteína de soja tienen componentes que son muy
diferentes de los de los productos de digestión enzimática de la
caseína de leche animal. Por ello, las publicaciones de patente
anteriores no sugieren nada en cuanto a métodos de preparación, a
partir de caseína de leche animal como materia prima, productos de
digestión de caseína e hidrolizado de caseína que tengan una
concentración elevada de ingredientes activos y susceptibilidad de
absorción excelente en el organismo vivo, y pueden utilizarse sin
ser sometidos necesariamente a procesos complicados tales como
concentración, purificación y aislamiento.
Por otra parte, las Publicaciones de Patente 3 y
4 proponen métodos para preparar péptidos que tienen diversas
funciones por digestión de la caseína de leche animal con enzimas
tales como proteasas y peptidasas, así como péptidos funcionales
particulares obtenidos por los métodos.
Los productos de digestión enzimática descritos
en estas publicaciones están destinados, sin embargo, a la
obtención de péptidos particulares como ingredientes activos. Así
pues, no se contiene en estas publicaciones doctrina alguna en
cuanto a la hidrólisis de caseína de leche animal que tiene una
longitud de cadena media no mayor que 2,1, proceso específico de la
hidrólisis, y eficacia del hidrolizado de caseína que tiene la
longitud media de cadena particular.
\newpage
Publicación de Patente 1:
JP-5-252979-A
Publicación de Patente 2:
JP-2003-210138-A
Publicación de Patente 3:
JP-6-128287-A
Publicación de Patente 4:
JP-2001-136995-A
Es un objeto de la presente invención
proporcionar un hidrolizado de caseína que contiene péptidos
indigeribles in vivo y aminoácidos libres que tienen
digestibilidad enzimática in vivo minimizada, y se espera que
expresen funciones, tales como efecto hipotensor, en el organismo
vivo.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un método para preparar el hidrolizado de caseína
arriba mencionado, que permite una producción fácil y eficiente del
hidrolizado de caseína arriba indicado, sin implicar necesariamente
procesos complicados.
Es todavía otro objeto de la presente invención
proporcionar un agente que tiene actividad inhibidora de la ACE o
efecto hipotensor, que contiene péptidos indigeribles in vivo
y aminoácidos libres, se espera que tenga efecto hipotensor
excelente en el organismo vivo, y es útil para diversos alimentos o
medicamentos funcionales.
Los autores de la presente invención han
realizado investigaciones intensivas para alcanzar los objetos
anteriores, para descubrir que, por hidrólisis de caseína de leche
animal que tiene una longitud media de cadena no mayor que 2,1 en
términos del número de residuos de aminoácidos, puede obtenerse un
hidrolizado de caseína que contiene aminoácidos libres y péptidos
de peso molecular bajo, tales como tripéptidos y dipéptidos,
formándose eficazmente aminoácidos libres y moléculas de péptidos
indigeribles in vivo que tienen un residuo Pro en el terminal
carboxilo.
Los autores de la presente invención han
descubierto también que los péptidos indigeribles in vivo que
tienen un residuo Pro en el terminal carboxilo se espera que tengan
alta resistencia a la digestión contra las peptidasas in
vivo, de tal modo que es bastante posible que tales péptidos
indigeribles exhiban plenamente sus funciones en el organismo vivo,
y que el hidrolizado de caseína tiene un contenido elevado de
péptidos que tienen una susceptibilidad de absorción satisfactoria
in vivo, tales como dipéptidos y tripéptidos, de tal manera
que el hidrolizado de caseína es capaz de exhibir plenamente
diversas funciones, tales como un efecto hipotensor, en el
organismo vivo, para completar de este modo la presente
invención.
Adicionalmente, los autores de la presente
invención han realizado investigaciones en busca de enzimas que
produzcan eficientemente el hidrolizado de caseína de la presente
invención a partir de diversas enzimas conocidas descubriendo que
una clase particular de enzimas es particularmente capaz de producir
eficientemente el hidrolizado de caseína de la presente
invención.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona un hidrolizado de caseína que comprende aminoácidos
libres y péptidos obtenidos por hidrólisis de caseína de leche
animal con un grupo de enzimas que tiene una longitud media de
cadena no mayor que 2,1 en términos del número de residuos de
aminoácidos, en donde dicho grupo de enzimas comprende peptidasas
capaces de escindir un enlace peptídico Pro-Xaa y
leucina-aminopeptidasas, y comprende adicionalmente
al menos una de proteasa I neutra y proteasa II neutra, todas las
cuales son enzimas extracelulares derivadas de Aspergillus
oryzae, en donde los péptidos comprenden péptidos indigeribles
in vivo constituidos por dipéptidos que tienen una secuencia
Xaa-Pro y tripéptidos que tienen una secuencia
Xaa-Pro-Pro, y en donde un contenido
de los dipéptidos que tienen una secuencia Xaa-Pro
no es inferior a 5% en peso de la cantidad total de los péptidos y
los aminoácidos libres en hidrolizado, y un contenido de los
tripéptidos que tienen una secuencia
Xaa-Pro-Pro no es inferior a 1% en
peso de la cantidad total de los péptidos y los aminoácidos libres
en el hidrolizado.
Tal como se utiliza en esta memoria, Xaa puede
ser cualquier aminoácido.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona también un método para preparar un hidrolizado de
caseína que comprende aminoácidos libres y péptidos obtenidos por
hidrólisis de caseína de leche animal que tiene una longitud media
de cadena no mayor que 2,1 en términos del número de residuos de
aminoácidos, en donde dicho método comprende el paso de (A)
hidrolizar caseína de leche animal que tiene una longitud media de
cadena no mayor que 2,1 con un grupo de enzimas capaces de digerir
caseína de leche animal en un hidrolizado de caseína que tiene una
longitud media de cadena no mayor que 2,1 en términos del número de
residuos de aminoácidos, en donde dicho grupo de enzimas comprende
peptidasas capaces de escindir un enlace peptídico
Pro-Xaa y
leucina-amino-peptidasas, y
comprende adicionalmente al menos una de proteasa neutra I y
proteasa neutra II, todas las cuales son enzimas extracelulares
derivadas de Aspergillus oryzae.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona también un agente que tiene actividad inhibidora de la
ACE o efecto hipotensor que comprende el hidrolizado de caseína
anterior como ingrediente activo.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona adicionalmente el uso del hidrolizado de caseína
anterior en la fabricación de un medicamento para la prevención o
el tratamiento de la hipertensión.
El hidrolizado de caseína de la presente
invención contiene aminoácidos libres y péptidos de peso molecular
bajo tales como péptidos indigeribles in vivo, obtenidos por
hidrólisis de caseína de leche animal que tiene una longitud media
de cadena no mayor que 2,1 en términos del número de residuos de
aminoácidos.
Así pues, se espera que el presente hidrolizado
de caseína exhiba, por administración oral, una susceptibilidad de
absorción excelente in vivo y diversas funciones en el
organismo vivo, y sea útil para diversos alimentos, medicamentos, y
aditivos alimentarios. Por ejemplo, se espera que el presente
hidrolizado de caseína sea utilizado en un agente que tiene
actividad inhibidora de la ACE o efecto hipotensor que contiene el
presente hidrolizado como ingrediente activo.
El presente método incluye el paso (A) de
hidrolizar caseína de leche animal para obtener una longitud media
de cadena no mayor que 2,1 con un grupo de enzimas capaces de
digerir la caseína de leche animal en un hidrolizado de caseína que
tiene una longitud media de cadena no mayor que 2,1 en términos del
número de residuos de aminoácidos. Así pues, el método permite una
producción fácil y eficiente del hidrolizado de caseína de la
presente invención. De acuerdo con ello, el presente método es
ventajoso en la producción industrial del hidrolizado de caseína de
la presente invención.
La Fig. 1 es un gráfico que muestra los
resultados de la evaluación de la susceptibilidad de absorción in
vivo y resistencia a la digestión de Xaa-Pro y
Xaa-Pro-Pro realizadas en el Ejemplo
1.
La Fig. 2 es un gráfico que muestra los
resultados de experimentos para determinación del efecto hipotensor
dependiente de la dosis de los polvos de hidrolizado de caseína
preparados en el Ejemplo 1.
La Fig. 3 es un gráfico que muestra la relación
entre el patrón de elución de proteína combinada con un gradiente
lineal de NaCl 0 a 0,6 M y la actividad proteolítica en el Ejemplo
de Análisis 1.
La Fig. 4 es un gráfico que muestra la relación
entre el tiempo de digestión de la caseína con el grupo de enzimas y
la actividad inhibidora de la ACE del hidrolizado de caseína
resultante del Ejemplo 3.
La Fig. 5 es un gráfico que muestra la relación
entre la longitud media de cadena y la actividad inhibidora de la
ACE del hidrolizado de caseína obtenido por hidrólisis de caseína
con el grupo de enzimas en el Ejemplo 3.
La presente invención se explicará a
continuación en detalle.
El hidrolizado de caseína de la presente
invención contiene aminoácidos libres y péptidos obtenidos por
hidrólisis de caseína de leche animal que tienen un intervalo
particular de longitud media de cadena en términos del número de
residuos de aminoácidos. La cantidad de los aminoácidos libres y los
péptidos es preferiblemente no inferior a 80% en peso, más
preferiblemente 80 a 90% en peso de la cantidad total del
hidrolizado de caseína. El hidrolizado tiene un contenido
particular de péptidos indigeribles in vivo como los
péptidos, compuestos de dipéptidos que tienen la secuencia
Xaa-Pro y tripéptidos que tienen la secuencia
Xaa-Pro-Pro. Los péptidos pueden ser
sales peptídicas.
Tal como se utiliza en esta memoria, la longitud
media de cadena puede expresarse como una relación del número total
de moles de los péptidos y los aminoácidos libres generados por
hidrólisis de caseína de leche animal con respecto al número de
moles de todos los aminoácidos contenidos en el hidrolizado ácido de
caseína del mismo peso. En este caso, el hidrolizado ácido de
caseína se obtiene por digestión de la proteína caseína en
aminoácidos simples.
La longitud media de cadena puede determinarse,
por ejemplo, por evaluación de las concentraciones molares de los
grupos amino en los hidrolizados por el método OPA utilizando un
reactivo OPA (aldehído o-ftálico), que se colorea
por reacción con grupos amino, y se expresa como:
Longitud media
de cadena = (número de moles de grupos amino en el hidrolizado ácido
de caseína)/(número de moles de grupos amino en el
hidrolizado enzimático de
caseína).
Como se utiliza en esta memoria, los péptidos
indigeribles in vivo significan dipéptidos
Xaa-Pro y tripéptidos
Xaa-Pro-Pro que tienen Pro en el
terminal carboxilo, que tienen resistencia elevada a la digestión
contra las peptidasas in vivo cuando se absorben
intestinalmente en el organismo vivo.
De acuerdo con la presente invención, la
longitud media de cadena del hidrolizado obtenido por hidrólisis de
la caseína de leche animal no es mayor que 2,1, siendo
preferiblemente 1,1 a 2,1, más preferiblemente 1,3 a 2,1, en
términos del número de residuos de aminoácidos. Con la longitud
media de cadena mayor que 2,1, los contenidos de los dipéptidos y
tripéptidos deseados así como los aminoácidos libres son bajos, y
por tanto el contenido de los péptidos absorbibles in vivo e
indigeribles in vivo deseados es bajo.
El contenido de los dipéptidos que tienen la
secuencia Xaa-Pro en el hidrolizado de caseína de la
presente invención es no inferior a 5% en peso, preferiblemente 5 a
25% en peso de la cantidad total de los péptidos y los aminoácidos
libres en el hidrolizado. Para proporción menor que 5% en peso, la
susceptibilidad de absorción deseada in vivo disminuye y la
expresión de las funciones es insuficiente.
El contenido de los tripéptidos que tienen la
secuencia Xaa-Pro-Pro en el
hidrolizado de caseína de la presente invención no es inferior a 1%
en peso, preferiblemente 1 a 5% en peso de la cantidad total de los
péptidos y los aminoácidos libres en el hidrolizado. Para contenido
inferior a 1% en peso, la susceptibilidad de absorción deseada
in vivo se reduce y la expresión de las funciones es
insuficiente.
En el hidrolizado de caseína de la presente
invención, Xaa en los dipéptidos que tienen la secuencia
Xaa-Pro y los tripéptidos que tienen la secuencia
Xaa-Pro-Pro puede ser cualquier
aminoácido.
El hidrolizado de caseína de la presente
invención puede contener preferiblemente Ile+Pro,
Glu-Pro, Arg-Pro,
Gln-Pro, Met-Pro y
Tyr-Pro como los dipéptidos que tienen la secuencia
Xaa-Pro, y
Ser-Pro-Pro,
Ile-Pro-Pro, y
Val-Pro-Pro como los tripéptidos que
tienen la secuencia Xaa-Pro-Pro.
El hidrolizado de caseína de la presente
invención, que contiene tales dipéptidos y tripéptidos, exhibe
eficazmente en particular actividad inhibidora de la ACE y efecto
hipotensor.
El hidrolizado de caseína de la presente
invención contiene aminoácidos libres además de los péptidos. El
contenido de los aminoácidos libres es usualmente 35 a 50% en peso,
preferiblemente 40 a 55% en peso de la cantidad total de los
péptidos y los aminoácidos libres en el hidrolizado.
El hidrolizado de caseína de la presente
invención puede contener opcionalmente, además de los péptidos y
los aminoácidos libres, por ejemplo, lípido, cenizas, carbohidrato,
fibras dietéticas y agua, que están contenidos usualmente en la
caseína de leche animal disponible comercialmente, en una cantidad
de aproximadamente 10 a 20% en peso. Algunos o la totalidad de
estos ingredientes pueden eliminarse en caso deseado.
El hidrolizado de caseína de la presente
invención, así como un hidrolizado de caseína que comprende
aminoácidos libres y péptidos obtenidos por hidrólisis de caseína
de leche animal que tienen una longitud media de cadena no mayor
que 2,1 en términos del número de residuos de aminoácidos, puede
prepararse por el método de la presente invención que incluye el
paso de (A) hidrolizar caseína de leche animal para tener una
longitud media de cadena no mayor que 2,1 con un grupo de enzimas
capaces de digerir caseína de leche animal en un hidrolizado que
tiene una longitud media de cadena no mayor que 2,1 en términos del
número de residuos de aminoácidos, en donde dicho grupo de enzimas
comprende peptidasas capaces de escindir un enlace peptídico
Pro-Xaa y
leucina-amino-peptidasas, y
comprende adicionalmente al menos una de proteasa neutra I y
proteasa neutra II, todas las cuales son enzimas extracelulares
derivadas de Aspergillus oryzae.
La caseína de leche animal es una proteína que
tiene un alto contenido de Pro y seguridad confirmada para uso en
alimentos y análogos, y puede ser, por ejemplo, caseína procedente
de leche de vaca, leche de caballo, leche de cabra, y leche de
oveja, siendo particularmente preferida la caseína de leche de
vaca.
La concentración de caseína en la hidrólisis de
la caseína de leche animal puede ser preferiblemente 3 a 19% en peso
para la producción eficiente del hidrolizado de la presente
invención.
El grupo de enzimas utilizado en el método de la
presente invención es un grupo de enzimas en el cual las enzimas
capaces de digerir caseína de leche animal en un hidrolizado que
tiene una longitud media de cadena no mayor que 2,1 en términos del
número de residuos de aminoácidos se seleccionan y combinan
convenientemente. Por ejemplo, puede utilizarse preferiblemente un
grupo de enzimas que contienen peptidasas capaces de escindir el
enlace peptídico Pro-Xaa en el terminal carboxilo de
Xaa-Pro-Xaa o
Xaa-Pro-Pro-Xaa.
El grupo de enzimas puede contener
preferiblemente serina-proteasas que tienen serina
en el centro activo.
El grupo de enzimas contienen metaloproteinasas
que tienen un metal en el centro activo.
Las metaloproteinasas son al menos una de
proteasa neutra I y proteasa neutra II; y
leucina-amino-peptidasa. Con estas
metaloproteinasas, el hidrolizado objetivo puede obtenerse
eficientemente en un tiempo breve, y e incluso en una reacción de
un solo paso, siendo preferido esto. Las peptidasas capaces de
escindir el enlace peptídico Pro-Xaa pueden ser
preferiblemente enzimas que tienen puntos isoeléctricos en la región
ácida.
El grupo de enzimas son un grupo de enzimas
extracelulares derivadas del moho koji tales como Aspergillus
oryzae. Dicho grupo de enzimas extracelulares pueden ser las
obtenidas por cultivo del cuerpo celular en un medio apropiado, y
extracción con agua de las enzimas producidas extracelularmente. Un
grupo de enzimas extracelulares derivadas de Aspergillus
oryzae que tienen puntos isoeléctricos en la región ácida son
particularmente preferidas.
El grupo de enzimas extracelulares derivadas de
Aspergillus oryzae puede ser un producto comercial, tal como
SUMIZYME FP, LP o MP (todas ellas marcas comerciales registradas,
fabricadas por SHIN NIHON CHEMICAL CO., LTD.), UMAMIZYME (marca
comercial registrada, fabricada por AMANO ENZYME, INC.), Sternzyme
B11024 y PROHIDROXY AMPL (ambos nombres comerciales, fabricados por
HIGUCHI INC.), ORIENTASE ONS (marca comercial registrada, fabricada
por HANKYU BIOINDUSTRY CO.), y DENAZYME AP (marca comercial
registrada, fabricada por NAGASE SEIKAGAKU), siendo particularmente
preferida SUMIZYME FP (marca comercial registrada, fabricada SHIN
NIHON CHEMICAL Co., LTD.).
Tales enzimas disponibles comercialmente tienen
por regla general condiciones óptimas específicas. Las condiciones,
tales como la cantidad de enzimas utilizadas y el tiempo de
reacción, pueden ajustarse convenientemente dependiendo del grupo
de enzimas utilizadas de tal manera que pueda obtenerse el
hidrolizado de caseína de la presente invención.
Para la hidrólisis, el grupo de enzimas pueden
añadirse, por ejemplo, a una solución acuosa de caseína de leche
animal en un grupo de relación de enzimas/caseína de leche animal no
inferior a 1/1000, preferiblemente 1/10 a 1/1000, más
preferiblemente 1/10 a 1/100, muy preferiblemente 1/20 a 1/40, en
peso.
Las condiciones de reacción pueden seleccionarse
convenientemente dependiendo del grupo de enzimas utilizadas a fin
de que se obtenga el hidrolizado de caseína objetivo. La reacción
puede efectuarse usualmente a 25 hasta 60ºC, preferiblemente 45 a
55ºC, a un pH de 3 a 10, preferiblemente 5 a 9, más preferiblemente
5 a 8. El tiempo de reacción de la enzima es usualmente 2 a 48
horas, preferiblemente 7 a 15 horas.
La reacción enzimática puede terminarse por
desactivación de las enzimas. Usualmente, las enzimas se desactivan
a 60 hasta 110ºC para terminar la reacción.
Una vez terminada la reacción enzimática, el
precipitado resultante puede separarse preferiblemente por
centrifugación o a través de diversos filtros, en caso deseado.
Adicionalmente, el hidrolizado obtenido puede
someterse a eliminación de péptidos que tengan sabor amargo u olor,
lo que puede efectuarse utilizando carbono activado, una resina
hidrófoba o análogos. Por ejemplo, 1 a 20% en peso de carbono
activado con respecto a la cantidad de caseína utilizada puede
añadirse al hidrolizado, y hacerse reaccionar durante 1 a 10 horas
para eliminar tales componentes amargos y olorosos. El carbono
activado utilizado puede eliminarse por un método convencional, tal
como centrifugación o filtración con membrana.
El líquido de reacción que contiene el
hidrolizado de caseína obtenido por el paso (A) puede añadirse como
tal a productos líquidos tales como bebidas. Para la mejora de la
versatilidad del hidrolizado de caseína de la presente invención,
el líquido de reacción puede concentrarse y secarse preferiblemente
para obtener polvos.
Tales polvos pueden utilizarse como diversos
alimentos funcionales, aditivos para los mismos, medicamentos, y un
ingrediente activo para los mismos. Los polvos pueden mezclarse
opcionalmente con diversos aditivos adyuvantes para mejora del
equilibrio nutritivo o sabor. Ejemplos de tales aditivos auxiliares
pueden incluir diversos carbohidratos, lípidos, vitaminas,
minerales, edulcorantes, agentes saborizantes, pigmentos, y
mejoradores de la textura.
Los polvos que contienen el hidrolizado de
caseína de la presente invención pueden utilizarse por adición a,
por ejemplo, bebidas, yogur, alimento líquido, jalea, caramelos,
alimentos tratados en autoclave, caramelos en tabletas, galletas,
tortas esponjosas, pan, bizcochos, chocolate y análogos, o por
formulación en cápsulas, tabletas y análogos.
Dado que el hidrolizado de caseína de la
presente invención puede utilizarse de la manera arriba mencionada,
el presente hidrolizado puede utilizarse eficazmente en la
fabricación de alimentos funcionales tales como diversas bebidas
isotónicas, bebidas en general, alimentos en general, suplementos
dietéticos, alimento funcional nutritivo, incorporando en ellos
beneficios para la salud, o en la fabricación de medicamentos.
Se ha confirmado que el hidrolizado de caseína
de la presente invención tiene actividad inhibidora de la ACE y
efecto hipotensor en los ejemplos que se expondrán más adelante, por
lo que el presente hidrolizado puede utilizarse, por ejemplo, como
agente para la fabricación de alimentos funcionales que tienen dicha
actividad y efecto, o como agente para la fabricación de
medicamentos.
Cuando el hidrolizado de caseína de la presente
invención se utiliza como agente que tiene actividad inhibidora de
la ACE y efecto hipotensor, una dosis preferida del agente para
administración oral a humanos es usualmente aquélla que permite la
ingestión de 0,1 a 100 mg/kg, preferiblemente 1 a 20 mg/kg de los
péptidos y los aminoácidos libres en el hidrolizado de caseína por
cada administración. Así, la cantidad del hidrolizado de caseína de
la presente invención o del agente que tiene actividad inhibidora de
la ACE y efecto hipotensor, cuando se utiliza por adición a
diversas bebidas, alimentos o medicamentos, puede seleccionarse
convenientemente teniendo en cuenta la dosis arriba indicada.
De acuerdo con el método de la presente
invención, por hidrólisis de la caseína de leche animal en una
reacción de un solo paso con el grupo de enzimas arriba mencionado,
puede obtenerse Xaa-Pro-Pro
contenido en la caseína de leche animal, en particular
Ile-Pro-Pro y/o
Val-Pro-Pro, de los cuales se han
confirmado diversas funciones que incluyen efecto hipotensor y
efecto anti-estrés, con un rendimiento mayor y más
próximo a la recuperación teórica, por ejemplo no inferior a 60%,
preferiblemente no inferior a 70%, comparado con los métodos
convencionales. Así pues, este método no sólo es un método para
preparación de un hidrolizado de caseína, preferiblemente el
hidrolizado de caseína de la presente invención, sino que es también
un método eficaz para producir productos digeridos que contienen
una cantidad considerable del
Xaa-Pro-Pro objetivo, o productos
purificados del mismo, a partir de caseína de leche animal o
proteína alimentaria que tiene un contenido elevado de
Xaa-Pro-Pro.
\newpage
La presente invención se explicará a
continuación con mayor detalle con referencia a Ejemplos, Ejemplo de
Análisis y Ejemplos Comparativos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1 y Ejemplos Comparativos 1
a
8
Se añadió 1 g de caseína derivada de leche de
vaca (fabricada por NIPPON NZMP) a 99 g de agua destilada a
aproximadamente 80ºC y se mezcló concienzudamente. Se añadió a la
mezcla hidróxido de sodio 1 N (fabricado por WAKO PURE CHEMICAL
INDUSTRIES, LTD.) para ajustar el pH a 7,0. La temperatura se ajustó
a 20ºC, a fin de preparar una solución sustrato.
A la solución sustrato así obtenida, se añadió
cada una de las diversas enzimas que se muestran en la Tabla 1, de
tal modo que la relación enzima/caseína era 1/25 en peso. La mezcla
se hizo reaccionar a 50ºC durante 14 horas, y se sometió después a
tratamiento en autoclave a 110ºC durante 10 minutos para desactivar
las enzimas, a fin de obtener de este modo una solución de
productos de digestión enzimáticos de caseína. La solución obtenida
de los productos de digestión enzimáticos se secó por pulverización
para preparar polvos.
Los polvos así obtenidos se sometieron a
análisis de ingredientes. La proteína se determinó por el método de
Kjeldahl, y los aminoácidos con un analizador de aminoácidos. La
cantidad obtenida por sustracción de la cantidad de aminoácidos de
la cantidad de proteína se tomó como la cantidad de péptidos.
Adicionalmente, la cantidad de lípidos se determinó por el método
de hidrólisis ácida, las cenizas por ignición directa, y el agua
por el método del horno de aire. La cantidad de cada ingrediente se
sustrajo de 100, tomándose el resto como la cantidad de
carbohidrato. Como resultado, se determinó que los polvos contenían
35,8% en peso de aminoácidos, 45,7% en peso de péptidos, 6,6% en
peso de agua, 0,2% en peso de lípidos, 4,1% en peso de cenizas, y
7,6% en peso de carbohidrato.
\vskip1.000000\baselineskip
La longitud media de cadena de los aminoácidos y
los péptidos contenidos en los polvos obtenidos se determinó por
medida del número de moles utilizando un reactivo OPA, que reacciona
con los grupos amino de los aminoácidos libres y los péptidos en el
polvo, midiendo análogamente el número de moles de un hidrolizado
ácido de caseína, y evaluando la relación de estos dos. Los
resultados se muestran en la Tabla 1.
Se disolvieron 40 mg de aldehído
o-ftálico (reactivo garantizado para análisis de
fluorescencia, fabricado por NACALAI TESQUE, INC.) en 1 ml de
metanol, y se añadieron 100 \mul de
\beta-mercaptoetanol. La solución de aldehído
o-ftálico se diluyó a 25 ml con 25 ml de una
solución de tetraborato de sodio 100 mM mezclada previamente con
2,5 ml de dodecilsulfato de sodio al 20%, y adicionalmente a 50 ml
con agua destilada, para preparar un reactivo OPA.
Cada muestra de polvo de hidrolizado enzimático
de caseína al 1% obtenida por reacción con cada enzima (Tabla 1) se
disolvió en un disolvente apropiado a una concentración apropiada, y
se centrifugó a 15.000 rpm durante 10 minutos. Se retiraron 50
\mul del sobrenadante. A continuación se añadió 1 ml del reactivo
OPA arriba preparado, se agitó concienzudamente, y se dejó a la
temperatura ambiente durante 5 minutos. Se midió la absorbancia a
340 nm utilizando un absorciómetro (nombre comercial
Ubest-35, fabricado por JASKO CORPORATION).
Se preparó un hidrolizado ácido de caseína al
1%, se diluyó adecuadamente, y se sometió a la misma medida para
obtener una curva de calibración, a partir de la cual se determinó
la relación entre absorbancia y concentración molar. La longitud
media de la cadena se calculó de acuerdo con la fórmula
siguiente:
Longitud media
de cadena = (concentración molar de hidrolizado ácido de caseína al
1%)/(concentración molar de cada muestra de hidrolizado
enzimático de caseína al
1%)
\vskip1.000000\baselineskip
Los polvos preparados en el Ejemplo 1 se
disolvieron en una cantidad adecuada de agua destilada, y se
analizaron utilizando un analizador de péptidos automático (nombre
comercial PPSQ-10, fabricado por SHIMADZU
CORPORATION) para determinar los residuos de aminoácidos desde el
terminal N en los polvos. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Incidentalmente, el analizador de péptidos automático no detecta
aminoácidos libres.
La cantidad total de los residuos del quinto
aminoácido era 120 pmol, y la cantidad total de los residuos del
sexto aminoácido era 100 pmol. A partir de estos resultados se
encontró que la mayoría de los péptidos contenidos en los polvos
eran dipéptidos y tripéptidos. Se encontró también que el porcentaje
de péptidos que tenían Pro en el segundo residuo era 49,5%, lo cual
era notablemente alto, y el porcentaje de péptidos que tenían Pro en
el tercer residuo era 29,8%, lo que era también alto.
Así pues, se espera que los polvos contengan una
cantidad considerable de Xaa-Pro y
Xaa-Pro-Pro, que son altamente
resistentes contra la digestión enzimática con las proteasas in
vivo, por lo que estos péptidos son óptimos para uso como
péptidos funcionales.
\vskip1.000000\baselineskip
Con objeto de evaluar la susceptibilidad de
absorción y resistencia a la digestión en el organismo vivo de los
péptidos que tienen la secuencia Xaa-Pro o
Xaa-Pro-Pro contenido en los polvos
del hidrolizado enzimático de caseína preparado en el Ejemplo 1 e
indicado en la Tabla 1, se testó la absorción de los péptidos en la
sangre después de administración oral en ratas, como sigue.
A dos ratas SD (Sprague Dawley) de 6 semanas se
administraron por vía oral 500 mg/animal de cada uno de
Val-Pro-Pro como ejemplo de
Xaa-Pro-Pro y
Gly-Gly como un dipéptido que no contenía cantidad
alguna de Pro. Se tomaron muestras de sangre de la vena porta a
intervalos, y se determinó la absorción de cada péptido en la
sangre. Los resultados se muestran en la Fig. 1.
A partir de la Fig. 1, se confirmó que
Gly-Gly era digerido fácilmente in vivo, por
lo que se detectaba Gly, mientras que
Val-Pro-Pro era absorbido en la
sangre de modo relativamente estable. A partir de estos resultados,
se espera que los dipéptidos y los tripéptidos que tienen las
secuencias Xaa-Pro y
Xaa-Pro-Pro, respectivamente,
exhiban alta susceptibilidad de absorción y resistencia a la
digestión en el organismo vivo.
Cada uno de los polvos de hidrolizado de caseína
preparados en el Ejemplo y los Ejemplos Comparativos que se
muestran en la Tabla 1 se administraron por vía oral a cinco ratas
espontáneamente hipertensas (SHR) de 27 semanas (machos) a una
dosis de 32 mg/kg de peso corporal. Se midió la presión sanguínea
antes de la administración y 5 horas después de la administración
por el método del manguito en la cola con Tail-Cuff
PB-98 (fabricado por Softtron) para evaluar el
cambio en la presión sanguínea. Como control, se administró caseína
en lugar de los polvos, y se realizó la misma evaluación. Antes de
la medida de la presión sanguínea, se calentaron las ratas en una
jaula de precalentamiento (fabricada por CSI-Japan)
a 45ºC durante 8 minutos. Los resultados se muestran en la Tabla
3.
Por la Tabla 3, se encuentra que no se observaba
cambio alguno en la presión sanguínea con caseína como control,
mientras que se observaba un efecto hipotensor con la administración
de los polvos del Ejemplo 1. Por otra parte, no se observaba cambio
alguno en la presión sanguínea con ninguno de los polvos de los
Ejemplos Comparativos. Se demuestra así que el hidrolizado de
caseína del Ejemplo 1 que contenía una cantidad particular de
Xaa-Pro y
Xaa-Pro-Pro y que tenía una longitud
media de cadena no mayor que 2,1, tenía un efecto hipotensor
excelente.
Adicionalmente, de acuerdo con el método
anterior, se testó un efecto hipotensor dependiente de la dosis
utilizando los polvos de hidrolizado de caseína preparados en el
Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 4 y en la Fig.
2.
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Se disolvió ACE derivada de pulmón de bovino
(fabricada por WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) en un tampón
de borato 0,1 M a pH 8,3 en una cantidad de 0,1 U, para obtener una
solución de ACE. Se introdujeron en un tubo 80 \mul de una
solución diluida de hidrolizado enzimático preparada por dilución de
polvos de cada hidrolizado enzimático mostrado en la Tabla 1 50
veces con agua destilada, 200 \mul de una solución de
hipuril-histidil-leucina 5 mM
(fabricada por SIGMA), y 20 \mul de la solución de ACE arriba
preparada, y se dejaron reaccionar a 37ºC durante 30 minutos.
Subsiguientemente, se terminó la reacción por adición de 250 \mul
de ácido clorhídrico 1 N. Se añadieron luego 1,7 ml de acetato de
etilo, y se agitó. Se tomaron 1,4 ml de la capa de acetato de
etilo, se pusieron en otro tubo, y se evaporaron a 120ºC durante
aproximadamente 60 minutos para obtener un producto seco. El
producto seco se disolvió en 1 ml de agua destilada, y se midió la
absorbancia a 228 nm del ácido hipúrico extraído con acetato de
etilo. Como controles, se midió la absorbancia de una solución sin
la solución diluida de hidrolizado enzimático y una solución sin la
solución de hidrolizado enzimático diluido, y la solución de ACE. A
partir de la absorbancia obtenida, se calculó la actividad
inhibidora de la ACE de acuerdo con la fórmula siguiente. Los
resultados se muestran en la Tabla 3.
Actividad
inhibidora de ACE (%) = [(A-B)/A] x
100
- A:
- (Absorbancia de la solución sin solución diluida de hidrolizado enzimático pero con solución de ACE) - (Absorbancia de la solución diluida sin solución de hidrolizado enzimático y solución de ACE)
- B:
- (Absorbancia de la solución con solución diluida de hidrolizado enzimático y solución de ACE) - (Absorbancia de la solución con solución diluida de hidrolizado enzimático pero sin solución de ACE)
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Los polvos del hidrolizado enzimático del
Ejemplo 1 que se muestran en la Tabla 1 se disolvieron en agua
destilada a una concentración de 10 mg/ml. Por otra parte, se
prepararon soluciones de 25 \mug/ml, 50 \mug/ml y 100 \mug/ml
de cada péptido estándar sintetizado químicamente que tenía la
secuencia que se muestra en la Tabla 5. Estas soluciones se
analizaron por LC/MS en las condiciones indicadas más adelante.
Entre los picos indicados en el análisis de la solución de polvo,
se identificaron picos correspondientes a los pesos moleculares y
los tiempos de retención idénticos a los de péptidos estándar, como
representativos de las mismas secuencias que los péptidos estándar.
Los picos de la solución de polvo se compararon con los de los
péptidos estándar, para determinar el contenido de cada péptido
mostrado en la Tabla 4 en la solución de polvo. Los resultados se
muestran en la Tabla 5.
Se encontró que la cantidad de los péptidos y
los aminoácidos libres en la solución preparada por disolución de
los polvos con agua destilada era 8,15 mg/ml, la cantidad de
péptidos era 4,57 mg/ml y la cantidad de Xaa-Pro en
los péptidos era 514,5 \mug, por lo que el porcentaje de
Xaa-Pro con respecto a la cantidad total de los
péptidos y los aminoácidos libres en los polvos era 6,3% en peso.
Adicionalmente, la cantidad de
Xaa-Pro-Pro en los péptidos era
116,5 \mug, por lo que el porcentaje de
Xaa-Pro-Pro respecto a la cantidad
total de los péptidos y los aminoácidos libres en los polvos era
1,4% en peso.
Cromatógrafo líquido de alta
resolución-espectrómetro de masas:
LCMS-2010; controlador del
sistema: SCL-10Advp; inyector automático:
SIL-10Advp; bomba de suministro de disolvente:
NC-10Advp x 2; horno de la columna:
CT0-10Avp; detector del sistema de fotodiodos:
SPD-M10AVP; desgasificador en línea:
DGU-14A (todos ellos nombres comerciales, fabricados
por SHIMADZU CORPORATION); columna: Develosil
C30-UG-3 (2,0 mm D.I. x 150 mm l)
(fabricada por NOMURA CHEMICAL CO., LTD.)
Fase móvil A: solución acuosa de ácido fórmico
al 0,1% en peso;
Fase móvil B: solución de acetonitrilo al 100%;
programa de tiempos: 0% B (0 minutos) -7,5% B (30 minutos) - 80% B
(30,01 minutos) - 100% B (35 minutos) - 0% B (35,1 minutos) - PARADA
(45 minutos); cantidad de muestra para inyección: 5 \mul;
temperatura de columna: 50ºC; longitud de onda de detección: 200 a
300 nm; modo de ionización: ESI (+); caudal de gas atomizado: 4,5
l/min; voltaje aplicado: +4,5 kV; temperatura de CDL: 250ºC;
temperatura del calentador de bloque: 200ºC; voltaje CDL: 0,0 V;
voltaje de la red Q: SCAN; modo de análisis: medida de SIM;
intervalo analizado: EP (m/z = 245,2), IP (m/z = 229,3), MP (m/z =
247,3), QP (m/z = 244,2), RP (m/z = 272,3), SPP (m/z = 300,3); VPP
(m/z = 312,1), IPP (m/z = 326,1); tiempo de toma: 0,5 s/Ch.
Ejemplo de Análisis
1
Entre las enzimas extracelulares derivadas de
Aspergillus oryzae utilizadas en el Ejemplo 1, las enzimas
necesarias para obtener el hidrolizado de caseína de la presente
invención se analizaron por el método siguiente. Incidentalmente,
todas las operaciones que siguen se realizaron a 4ºC a no ser que se
especifique otra cosa. Los reactivos utilizados eran todos ellos
reactivos garantizados fabricados por WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES,
LTD. a no ser que se especifique otra cosa.
Se disolvieron 2000 mg de SUMIZYME FP (marca
comercial registrada, fabricada por SHIN NIHON CHEMICAL CO., LTD.)
en 10 ml de un tampón de fosfato 50 mM a pH 7,2, y se filtraron a
través de una membrana de acetato de celulosa
(DISMIC-25cs, diámetro de poro 0,45 \mum,
fabricada por ADVANTEC), para obtener una solución de enzima
bruta.
Esta solución de enzima bruta se hizo reaccionar
con 1% de caseína del mismo modo que en el Ejemplo 1. Cuando se
añadió al sistema de reacción un inhibidor de metaloproteasa, EDTA
(ácido etilenodiaminatetraacético), o un inhibidor de
serina-proteasa, PMSF (fluoruro de
fenilmetanosulfonilo), la longitud media de cadena era más larga, y
no pudo obtenerse el hidrolizado objetivo. Esto sugiere que la
metaloproteasa o serina-proteasa juega un papel
importante en la producción del hidrolizado de caseína de la
presente invención.
Se activaron 20 ml de una resina cambiadora de
aniones, DEAE Sephacel (fabricada por AMERSHAM BIOSCIENCES K.K.),
se equilibraron con un tampón de fosfato 50 mM a pH 7,2, y se
compactaron en una columna de vidrio de 1,5 cm de diámetro x 12 cm.
Mientras que todo el efluente se recogía como muestra no adsorbida,
la solución de enzima bruta se sometió a adsorción a un caudal de
1,0 ml/min. A continuación se lavó concienzudamente la columna con
un tampón de fosfato 50 mM a pH 7,2 en una cantidad 10 veces el
volumen del gel, y se eluyó con 200 ml de un tampón de fosfato 50
mM a pH 7,2 que contenía un gradiente lineal de NaCl (0 a 600 mM).
El material eluido se fraccionó en 100 fracciones de 5 ml cada
una. Se midieron para cada fracción la absorbancia a 280 nm, la
actividad de proteinasa, y la actividad inhibidora de la ACE.
Se disolvieron 25 mg de un material
fluorescente, caseína marcada con (isotiocianato de fluoresceína)
(FITC-caseína, fabricada por SIGMA) en 5 ml de un
tampón de fosfato 50 mM a pH 7,2 para preparar una solución
sustrato. Se mezclaron 10 \mul de cada fracción con 20 \mul de
la solución sustrato, y se dejaron reaccionar a 55ºC durante 10
minutos. La reacción se terminó por adición de 120 \mul de una
solución de tricloroacetato al 5%, y el líquido de reacción
resultante se centrifugó a 1500 rpm. Se tomaron 60 \mul del
sobrenadante, se mezclaron con 3 ml de un hidrocloruro de Tris 0,5M
a pH 8,5, y se sometieron a la medición utilizando un fluorómetro
(F-1300, fabricado por HITACHI, LTD.) para
determinar la longitud de onda de excitación a 485 nm, y la longitud
de onda de la fluorescencia a 525 nm.
A partir de los resultados de la medida de la
absorbancia a 280 mm de cada fracción de material eluido de
DEAE-Sephacel, se confirmó que aproximadamente el
73% de la proteína se adsorbía en la resina cambiadora de iones
aniónica. La Fig. 3 muestra el patrón de elución de la proteína
combinada con un gradiente lineal de NaCl 0 a 0,6 M y la actividad
proteolítica.
Las fracciones 21 a 60 contenían una cantidad
particularmente grande de proteínas eluidas en ellas.
Adicionalmente, la solución de enzima eluida de cada fracción se
evaluó respecto a la actividad para generar componentes inhibidores
de la ACE en la hidrólisis de la caseína. Como resultado, se
confirmó que principalmente las fracciones 20 a 60 tenían actividad
para generar componentes inhibidores de la ACE.
Por otra parte, la actividad de proteinasa
medida con la FITC-caseína como sustrato se observó
principalmente en las fracciones 19 a 27 (para NaCl 0,1 M a 0,2 M),
lo que indica que la actividad de proteinasa tiene una función
importante en la generación de los componentes inhibidores de la
ACE. A partir de estos resultados, se encontró que la actividad de
proteinasa juega un papel importante en la actividad enzimática para
la purificación de los componentes inhibidores de la ACE respecto a
la caseína.
A partir de las fracciones eluidas de
DEAE-Sephacel, se recogieron las fracciones 21 a 35
que tenían actividad de proteinasa, y se dializaron contra 5 litros
de un tampón de fosfato 5 mM a pH 7,2. Se suspendió Sephacryl
S-300 HR (fabricado por AMERSHAM BIOSCIENCES K.K.)
en un tampón de fosfato 50 mM a pH 7,2 que contenía NaCl 200 mM, se
desgasificó concienzudamente, y se compactó en una columna de vidrio
de 18 cm de diámetro x 100 cm. Esta columna se equilibró
concienzudamente con un tampón de fosfato 50 mM a pH 7,2 que
contenía NaCl 200 mM a un caudal constante de 2 ml/min. La muestra
dializada se aplicó a esta columna, y se recuperaron 100 fracciones
de 10 ml cada una. Se midieron para cada fracción la absorbancia a
200 nm y la actividad de proteinasa utilizando
FITC-caseína como sustrato.
Se tomaron 10 \mul de cada fracción, se
mezclaron con 10 \mul de un tampón de muestra compuesto de un
tampón Tris 0,125M a pH 6,8, 3% SDS, 5%
\beta-mercaptoetanol, 10% glicerol, y 0,01% azul
de bromofenol, se calentaron a 95ºC durante 5 minutos, y se
enfriaron a la temperatura ambiente.
La muestra resultante se sometió a
electroforesis de acuerdo con el método de Laemmli (Nature, 227, 680
(1970)), utilizando una mini-placa (fabricada por
ATTO CORPORATION) y un gel de poliacrilamida a una concentración
designada en las condiciones de 30 mA por gel. Una vez completada la
electroforesis, se impregnó el gel en una solución de tinción de
Azul Coomassie Brillante compuesta de 0,25% de Azul Coomassie
Brillante R-250, 50% de metanol, y 7,5% de ácido
acético durante 10 minutos, y se infiltró en un decolorante
compuesto de 5% de metanol y 7,5% de ácido acético hasta que el
sustrato se decoloró por completo. El peso molecular se obtuvo por
cálculo a partir de la movilidad de cada banda de proteína,
utilizando marcadores de peso molecular (fabricados por AMERSHAM
BIOSCIENCES K.K.).
Las fracciones adsorbidas en la resina de
intercammbio aniónico que tenían actividad para generar componentes
inhibidores de la ACE, se sometieron a filtración con gel a través
de resina Sephacryl S-300, y se observó la
actividad en fracciones correspondientes al peso molecular de
aproximadamente 45 kDa. Estas fracciones se analizaron por
electroforesis en SDS-gel de
poli-acrilamida en un gel al 12,5% para observar una
banda sustancialmente simple a 44 kDa y 40 kDa. Estas bandas se
separaron por corte y se sometieron a análisis de las secuencias
N-terminales. Se reveló que la banda de 44 kDa tenía
una secuencia que era sumamente homóloga a una proteasa I neutra
conocida del moho koji (Aspergillus) y la banda de 40 kDa
tenía una secuencia que era sumamente homóloga a una proteasa II
neutra conocida del moho koji (Aspergillus).
A partir de estos resultados se determinó que
las proteinasas adsorbidas en la resina de intercammbio aniónico
que generaban componentes inhibidores de la ACE para caseína,
contenían al menos dos proteinasas, proteinasa neutra I y proteinasa
neutra II.
Para hidrolizar ulteriormente los componentes
generados por hidrólisis de caseína con proteinasas, se analizaron
por el método siguiente las peptidasas que actúan sobre los
péptidos.
Con objeto de identificar las enzimas para
producir péptidos que tenían contenidos más altos de
Xaa-Pro y
Xaa-Pro-Pro, que son el rasgo
característico de la presente invención, se sintetizaron diversos
péptidos precursores para
Val-Pro-Pro, y se evaluó su
transformabilidad en
Val-Pro-Pro.
A partir de las fracciones eluidas de
DEAE-Sephacel, se recogieron las fracciones 21 a 37
que tenían actividad para generar componentes inhibidores de la
ACE, y se dializaron contra 5 litros de un tampón de fosfato 5 mM a
pH 7,2. Se suspendió hidroxiapatito (fabricado por WAKO PURE
CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) en un tampón de fosfato 5 mM a pH 7,2,
se desgasificó completamente, y se compactó en una columna de
plástico de 1,5 cm de diámetro x 12 cm. Esta columna se lavó con un
tampón de fosfato 5 mM a pH 7,2 en una cantidad no menor que 10
veces la cantidad del hidroxiapatito. Las fracciones dializadas que
tenían actividad para generar componentes inhibidores de la ACE se
aplicaron a esta columna de hidroxiapatito, y se recogieron todas
las fracciones que pasaban a través de la columna.
Se midió la actividad de aminopeptidasa por el
método siguiente. El péptido sintetizado
Val-Val-Val-Pro-Pro
se disolvió en un tampón de fosfato 50 mM a pH 7,2 en una
concentración de 50 \mug/ml para preparar una solución sustrato.
Se mezclaron 45 \mul de esta solución sustrato con 5 \mul de la
fracción enzimática, y se hicieron reaccionar en una incubadora a
55ºC durante 30 minutos. La reacción se terminó por calentamiento a
98ºC durante 5 minutos. Se tomó una cantidad apropiada de este
líquido de reacción, y se sometió a análisis en un cromatógrafo
líquido de alta resolución-espectrómetro de masas
(fabricado por SHIMADZU CORPORATION) para evaluar la cantidad de
Val-Pro-Pro generada.
Las fracciones adsorbidas en la resina
cambiadora de aniones que tenían actividad para generar componentes
inhibidores de la ACE se sometieron a electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida en un gel al 10%, y se separó
por corte la banda de 32 kDa. Se extrajo la proteína principal, y se
purificó para dar una proteína sustancialmente simple de 32 kDa. La
secuencia en el terminal N de la proteína se analizó para revelar
que la secuencia hasta el décimo residuo desde el terminal N era
homóloga a la secuencia de la leucina-aminopeptidasa
conocida del moho koji (Aspergillus). Se llegó a la
conclusión de que las fracciones que tenían actividad confirmada
para generar componentes inhibidores de la ACE contenían
leucina-aminopeptidasa.
A partir de estos resultados, se entiende que
las fracciones adsorbidas en la resina cambiadora de aniones que
tenían actividad para generar componentes inhibidores de la ACE
contenían al menos leucina-aminopeptidasa que tenía
actividad de aminopeptidasa, que jugaba un papel importante en la
actividad para generar componentes inhibidores de la ACE.
Se disolvió el péptido
Val-Pro-Pro-Phe-Leu
sintetizado en un tampón de fosfato 50 mM a pH 7,2 en una
concentración de 45 \mug/ml a fin de preparar una solución
sustrato. Se mezclaron 50 \mul de esta solución sustrato con 5
\mul de cada solución enzimática, y se dejaron reaccionar en una
incubadora a 55ºC durante 30 minutos. La reacción se terminó por
calentamiento a 98ºC durante 5 minutos. Se tomó una cantidad
apropiada de este líquido de reacción, y se sometió a análisis en
un cromatógrafo líquido de alta
resolución-espectrómetro de masas (fabricado por
SHIMADZU CORPORATION) para evaluar la concentración de
Val-Pro-Pro generada.
La transformabilidad del terminal carboxilo de
cada fracción eluida de DEAE-Sephacel se evaluó para
encontrar que las fracciones 30 a 50 tenían actividad enzimática
para convertir
Val-Pro-Pro-Phe-Leu
en Val-Pro-Pro.
Por el Ejemplo de Análisis 1, se confirmó que la
actividad para generar componentes inhibidores de la ACE de las
fracciones adsorbidas en la resina cambiadora de aniones de la
enzima extracelular derivada de Aspergillus oryzae (SUMIZYME
FP (marca comercial registrada, fabricada por SHIN NIHON CHEMICAL
CO., LTD.)) incluían cuatro actividades enzimáticas, a saber, las
actividades de proteinasa que incluían las de al menos las proteasas
neutras I y II, la actividad de aminopeptidasa que incluía la de
leucina-aminopeptidasa, y la actividad para escindir
el terminal carboxilo inmediatamente después de la prolina.
A partir de las fracciones adsorbidas (véase la
Fig. 3), se proporcionaron la Fracción I que tenía actividad alta
de proteinasa (fracciones 1 a 35 en la Fig. 3), la Fracción II que
tenía actividad alta para escindir el terminal carboxilo
inmediatamente después de la prolina (fracciones 36 a 55 en la Fig.
3), la Fracción III posterior (fracciones 56 a 100 en la Fig. 3), y
las fracciones no adsorbidas que tenían actividad de proteinasa.
Se añadió cada fracción, sola o en combinación
como se muestra en la Tabla 6 a 1 ml de una solución al 1% de
caseína derivada de leche de vaca, y se dejó reaccionar a 55ºC
durante 13 horas para preparar un hidrolizado de caseína.. Una vez
completada la reacción, se midió cada uno de los hidrolizados de
caseína obtenidos respecto a actividad inhibidora de la ACE, y la
longitud media de cadena de acuerdo con el método descrito en el
Ejemplo 1. Como control, se sometió a las mismas medidas la
solución de enzima bruta en 1/10000 la cantidad sometida a la
purificación. Los resultados se muestran en la Tabla 6.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Por la Tabla 6, se descubrió que los componentes
que tenían actividad inhibidora fuerte de la ACE estaban contenidos
en las fracciones no adsorbidas, las fracciones que tenían actividad
alta de proteinasa, y hasta las fracciones que tenían actividad
para escindir el terminal carboxilo inmediatamente después de la
prolina. Se descubrió también que el grupo de enzimas eluidas en
NaCl aproximadamente 300 mM generaban los componentes inhibidores de
la ACE, por lo que la Fracción III era innecesaria.
Se midió y se comparó la longitud media de
cadena del hidrolizado de caseína obtenido por hidrólisis con cada
fracción que exhibía actividad fuerte para generar componentes
inhibidores de la ACE. Se encontró que las longitudes medias de
cadena para las fracciones no adsorbidas, Fracción I y Fracción II
eran superiores a 2,1, pero por combinación de estas fracciones se
obtuvo un hidrolizado de caseína que tenía la longitud media de
cadena no mayor que 2,1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 15 g de caseína derivada de leche
de vaca (fabricada por NIPPON NZMP) a 85 g de agua destilada a
aproximadamente 80ºC y se mezclaron concienzudamente. Se añadió
solución 1 N de hidróxido de sodio a la mezcla para ajustar el pH a
7,0. Se ajustó la temperatura a 20ºC para preparar una solución
sustrato.
A la solución sustrato así obtenida, se añadió
SUMIZYME FP (marca comercial registrada, fabricada por SHIN NIHON
CHEMICAL CO., LTD.), que son enzimas extracelulares derivadas de
Aspergillus oryzae, como el grupo de enzimas de tal modo que
la relación enzima/caseína era 1/25 en peso. La mezcla se dejó
reaccionar a 50ºC durante 20 horas, muestreando el líquido de
reacción a intervalos para evaluar la actividad inhibidora de la
ACE y la longitud media de cadena en función del tiempo del mismo
modo que en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en las Figs. 4
y 5. La solución digerida con enzimas tomada después de 12 horas de
reacción, que exhibía la actividad inhibidora máxima de ACE, se
secó por pulverización para obtener polvos de mezcla peptídica.
Por las Figs. 4 y 5, se confirmó que la
actividad inhibidora de la ACE aumentaba con el aumento del tiempo
de reacción, y disminuía después de 12 horas de reacción. Se
confirmó también, por la evaluación de la cantidad de péptido, que
la actividad inhibidora de la ACE aumentaba para la longitud media
de cadena de aproximadamente 1,3 a 2,1.
<110> CALPIS CO., LTD.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> HIDROLIZADO DE CASEÍNA, MÉTODO DE
PREPARACIÓN DEL MISMO, Y USO DEL MISMO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P042742EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 04771088.4
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2044-07-04
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2003-285007
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-08-01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Val Val Pro Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Pro Pro Phe Leu}
Claims (8)
1. Un hidrolizado de caseína que comprende
aminoácidos libres y péptidos obtenidos por hidrólisis de caseína de
leche animal con un grupo de enzimas que tiene una longitud media de
cadena no mayor que 2,1 en términos del número de residuos de
aminoácidos,
en donde dicho grupo de enzimas comprende
peptidasas capaces de escindir un enlace peptídico
Pro-Xaa y
leucina-amino-peptidasas, y
comprende adicionalmente al menos una de proteasa neutra I y
proteasa neutra II, todas las cuales son enzimas extracelulares
derivadas de Aspergillus oryzae,
en donde dichos péptidos comprenden péptidos
indigeribles in vivo constituidos por dipéptidos que tienen
una secuencia Xaa-Pro y tripéptidos que tienen una
secuencia Xaa-Pro-Pro, y en donde el
contenido de dichos dipéptidos que tienen una secuencia
Xaa-Pro no es menor que 5% en peso de la cantidad
total de aminoácidos libres y péptidos en el hidrolizado, y el
contenido de dichos tripéptidos que tienen una secuencia
Xaa-Pro no es menor que 1% en peso de la cantidad
total de aminoácidos libres y péptidos en el hidrolizado.
2. El hidrolizado de caseína de la
reivindicación 1 para uso como aditivo alimentario o en
medicina.
3. El hidrolizado de caseína de la
reivindicación 1, en donde dichos dipéptidos que tienen una
secuencia Xaa-Pro comprenden
Ile-Pro, Glu-Pro,
Arg-Pro, Gln-Pro,
Met-Pro, y Tyr-Pro, y dichos
tripéptidos que tienen una secuencia
Xaa-Pro-Pro comprenden
Ser-Pro-Pro,
Ile-Pro-Pro, y
Val-Pro-Pro.
4. Un método para preparar un hidrolizado de
caseína que comprende aminoácidos libres y péptidos obtenidos por
hidrólisis de caseína de leche animal que tienen una longitud media
de cadena no mayor que 2,1 en términos del número de residuos de
aminoácidos, en donde dicho método comprende el paso de (A)
hidrolizar caseína de leche animal para tener una longitud media de
cadena no mayor que 2,1 con un grupo de enzimas capaces de digerir
caseína de leche animal en un hidrolizado de caseína que tiene una
longitud media de cadena no mayor que 2,1 en términos del número de
residuos de aminoácidos, en donde dicho grupo de enzimas comprende
peptidasas capaces de escindir un enlace peptídico
Pro-Xaa y
leucina-amino-peptidasas, y
comprende adicionalmente al menos una de proteasa neutra I y
proteasa neutra II, todas las cuales son enzimas extracelulares
derivadas de Aspergillus oryzae.
5. El método de la reivindicación 4, en donde
dicha hidrólisis se realiza en una reacción de un solo paso con
dicho grupo de enzimas.
6, El método de la reivindicación 4, en donde
dicho grupo de enzimas comprende adicionalmente al menos una de
metaloproteasas y serina-proteasas.
7. El método de la reivindicación 4, en donde
dichas peptidasas capaces de escindir un enlace peptídico
Pro-Xaa son un grupo de enzimas que tienen puntos
isoeléctricos en una región ácida.
8. El método de la reivindicación 4, en donde en
dicho paso (A), la relación de dicho grupo de enzimas a caseína de
leche animal no es menor que 1/100 en peso.
9. Uso de un hidrolizado de caseína de la
reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para la
prevención o el tratamiento de la hipertensión.
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