JP2782142B2 - アンジオテンシン変換酵素阻害剤及びその製造法 - Google Patents

アンジオテンシン変換酵素阻害剤及びその製造法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Val-Pro-Proを含有す
る特定のアミノ酸残基数を有するペプチドを有効成分と
するアンジオテンシン変換酵素阻害剤とその製造法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】アンジオテンシン変換酵素（以下ＡＣＥ
と称す）は、主に肺や血管内皮細胞に存在し、レニンに
より分解されたアンジオテンシンＩ(Asp-Arg-Val-Tyr-I
le-His-Pro-Phe-His-Leu)に作用してＣ末端よりジペプ
チド(His-Leu)を遊離させ、強力な血圧上昇作用を有す
るアンジオテンシンIIを生成させる。また、この酵素
は、降圧作用を有するブラジキニンを分解し、不活性化
する作用を合せもつ。このようにＡＣＥは、昇圧ペプチ
ド（アシジオチンシンII）を生じさせると共に、一方で
は降圧ペプチド（ブラジキニン）を分解、不活化するの
で、結果として血圧を上昇させる作用を示す。従って、
この酵素活性を阻害することにより、血圧上昇を抑制さ
せる物質が種々開発されている。
【０００３】ＡＣＥ阻害物質としては、蛇毒ペプチドを
はじめとして、天然物、合成物が多数報告されており、
カプトプリル（Ｄ−２−メチル−３−メルカプトプロパ
ノイル−Ｌ−プロリン）等の合成物質は既に経口降圧剤
として実用化されている。しかし、これら医薬品は、多
くの場合、副作用等を有し常に安全性の問題に注意を払
わなければならない。低毒性で安全性の高い降圧剤を期
待し、食品原料由来のＡＣＥ阻害物質が各方面で研究さ
れており、例えばカゼイン［Susumu MARUYAMAet al. A.
B.C., 51(9), 2557〜2561 (1987)］、魚肉蛋白質［受田
浩之，日本農芸化学会誌，66(1),25〜29(1992)］等の酵
素分解物から得られるＡＣＥ阻害ペプチド等が報告され
ている。
【０００４】しかし、経口投与により有効なデータを示
すものは少なく、安全で微量の経口投与（摂取）によっ
て、有効な降圧物質の開発が望まれている。
【０００５】これまで乳酸菌菌体成分には、ＡＣＥ阻害
能あるいは降圧作用があることが知られている［伊藤
整、医学と生物、116(3),159-161(1988)、特開平２−２
４７１２７号公報］。また発酵乳から菌体、カゼインを
除去して得られる分子量５０００以上の高分子物質が降
圧作用を有することが報告されている（特開昭６１−５
３２１６号公報）が、このような菌体成分以外について
の報告はほとんどなされていないのが現状である。
【０００６】一方トリペプチドVal-Pro-Proは、Ｒａｏ
らによってコラーゲンの部分構成物として合成され、ラ
セミ化現象解明の為の材料の一つとして報告されている
［RAO S. RAPAKA, R.S.BHATNAGAR, and D.E.NITECKI, B
IOPOLYMERS, 15, 317-324(1976)］が、ＡＣＥ阻害活性
を有することについては知られていない。また該トリペ
プチドVal-Pro-Proは、化学合成により製造するのが困
難であり、工業的にも容易に製造できる方法の開発が望
まれている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、安全
性が高く、微量の経口投与（摂取）で有効なＡＣＥ阻害
活性を有し、医薬品、機能性食品として使用できるＡＣ
Ｅ阻害剤及びその製造法を提供することにある。
【０００８】本発明の別の目的は、前記ＡＣＥ阻害剤を
安価に且つ容易に製造することができる方法を提供する
ことにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、Val-Pr
o-Proを含有し、アミノ酸残基数が３〜１０のペプチド
を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤であ
って、前記ペプチドが、Val-Pro-Pro、Val-Val-Pro-Pr
o、Val-Val-Val-Pro-Pro、Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro、L
eu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro、Leu-Val-Pr
o-Pro、Phe-Leu-Val-Pro-Pro、Pro-Val-Pro-Pro、及びA
la-Pro-Val-Pro-Proからなる群より選択される１種又は
２種以上のペプチドであるアンジオテンシン変換酵素阻
害剤が提供される。また本発明によれば、Val-Pro-Pro
を構成成分とするペプチドを含む食品素材を、乳酸菌に
より発酵処理して、前記ペプチドを得ることを特徴とす
る前記アンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造法が提供
される。
【００１０】また本発明によれば、前記アンジオテンシ
ン変換酵素阻害剤を含む機能性食品が提供される。
【００１１】以下本発明を更に詳細に説明する。
【００１２】本発明のＡＣＥ阻害剤において、有効成分
として用いるペプチドは、Val-Pro-Proを含有し、且つ
アミノ酸残基数が３〜１０のペプチドであれば良く、通
常塩酸塩、硫酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩
等の製薬工業上許容される塩を付加したペプチド等であ
っても良い。この際Val-Pro-Proに結合する他のアミノ
酸残基は、Ｎ末端側に結合するのが好ましく、また他の
アミノ酸残基数は、少ない方が好ましい。具体的には例
えば、後述する配列表に示されるVal-Pro-Pro、Val-Val
-Pro-Pro、Val-Val-Val-Pro-Pro、Pro-Val-Val-Val-Pro
-Pro、Leu-Thr- Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro、Le
u-Val-Pro-Pro、Phe-Leu-Val-Pro-Pro、 Pro-Val-Pro-P
ro、Ala-Pro-Val-Pro-Pro等のアミノ酸配列で表される
ペプチド又はこれらの塩付加物等を好ましく挙げること
ができ、使用に際しては単独若しくは混合物として用い
ることができる。
【００１３】本発明のＡＣＥ阻害剤に使用する前記Val-
Pro-Proを含有し、且つアミノ酸残基数が３〜１０のペ
プチドを調製するには、後述する本発明の製造法により
得ることができる他、獣乳の全乳、脱脂乳、カゼイン等
の乳タンパク質成分；とうもろこし、コーンタンパク、
小麦、小麦タンパク、大豆、脱脂大豆、大豆タンパク等
を酵素加水分解処理する方法或いは通常の有機化学的合
成法等によっても製造することができる。
【００１４】本発明のＡＣＥ阻害剤は、前記特定のペプ
チドを含んでおれば良く、例えば医薬上許容される他の
添加物又は飲食品等を添加して用いることができ、その
剤型は、固形状、液状等として、経口投与等により摂取
することができる。またその投与量は、予防あるいは、
治療目的により異り、また症状の進行課程によっても変
化するが、成人の治療又は予防のために投与する場合に
は、有効成分である前記特定のペプチド量換算で、一日
当り、好ましくは０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは
１〜３０ｍｇの範囲である。
【００１５】本発明のＡＣＥ阻害剤の製造法では、Val-
Pro-Proを構成成分とするペプチドを含む食品素材（以
下食品素材Ａと称す）を、乳酸菌により発酵処理するこ
とにより得ることができる。
【００１６】前記食品素材Ａとしては、例えば獣乳の全
乳、脱脂乳、カゼイン等の乳タンパク質成分；とうもろ
こし、コーンタンパク、小麦、小麦タンパク、大豆、脱
脂大豆、大豆タンパク等を好ましく挙げることができ
る。また前記乳酸菌としては、例えばラクトバチルス・
ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクト
バチルス・デルブルィキィ・サブスペシィーズ・ブルガ
リカス（Lactobacillusdelbruekii subsp. bulgaricus)
等のラクトバチルス属に属する乳酸菌；ラクトコッカス
・ラクティス(Lactococcus lactis)等のラクトコッカス
属に属する乳酸菌；ストレプトコッカス・サリバリウス
・サブスペシィーズ・サーモフィラス(Streptococcus s
alivarius subsp. thermophilus)等のストレプトコッカ
ス属に属する乳酸菌；ロイコノストック・ラクテス(Leu
conostoc lactis)等のロイコノストック属に属する乳酸
菌；ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium
longum)、ビフィドバクテリウム・ブレベ(Bifidobacte
rium breve)等のビフィドバクテリウム属に属する乳酸
菌等を好ましく挙げることができ、使用に際しては、酵
母等との混合物として用いることもできる。この際前記
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシェ
(Saccharomyces cerevisiae)等のサッカロマイセス属に
属する酵母菌；カンディダ・ウチリス(Candida utilis)
等のカンディダ属に属する酵母菌；クルイベロマイセス
・マルキサナス・バー・ラクティス(Kluyveromyces mar
xianus var lactis)等のクルイベロマイセス属に属する
酵母菌又はこれらの混合物等を好ましく挙げることがで
きる。
【００１７】本発明の製造法において、前記食品素材Ａ
を、乳酸菌により発酵処理する際の条件は、乳酸菌の種
類又はその組合わせ等により異なるが、好ましくは、前
記食品素材Ａを、例えば水等により溶液状とした後、乳
酸菌を添加して培養することにより発酵処理することが
できる。この際培養温度は２５〜４５℃、培養時間は３
〜７２時間の範囲で行うのが好ましく、特に乳酸菌を効
果的に作用させるために、培養開始時のｐＨを６〜７に
調整するのが望ましい。培養の終了点は、例えば乳酸菌
数が、１０7個／ｍｌ以上またはＰＨ５．５以下になっ
た時点で判断することができる。また該培養を行う際の
乳酸菌の配合割合は、食品素材Ａ溶液に対して、菌数で
約５×１０6個／ｍｌとするのが好ましい。更に前記培
養は、複数回に分けて行うこともできる。
【００１８】本発明の製造法により得られる発酵乳は、
そのままＡＣＥ阻害剤の有効成分として用いることがで
きるが、有効成分以外の例えば苦み成分等を除去するた
めに、種々の生化学的方法、カラムクロマトグラフィー
等により精製して用いることも可能である。この際得ら
れる発酵乳中に含まれる前記有効成分として用いるVal-
Pro-Proを含有するペプチドの含有量は、発酵乳１００
ｍｌあたり、１〜４ｍｇであるので、該発酵乳をそのま
ま本発明のＡＣＥ阻害剤として用いる場合には、その投
与量は、成人一日当り好ましくは１０ｍｌ〜１０００ｍ
ｌ、特に好ましくは５０〜３００ｍｌの範囲である。
【００１９】
【発明の効果】本発明のＡＣＥ阻害剤は、特定のペプチ
ドを有効成分とするので、微量の経口投与により優れた
ＡＣＥ阻害活性を示す。また本発明の製造法では、該Ａ
ＣＥ阻害剤を、安価に且つ容易に製造することができ、
工業的にも極めて有効である。
【００２０】
【実施例】以下本発明を実施例により更に詳細に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２１】
【実施例１】発酵乳ａの調製 脱脂粉乳９ｇを水１００ｇに溶解し、１１５℃、２０分
間殺菌した後、室温まで冷却してラクトバチルス・ヘル
ベティカス（Lactobacillus helveticus）を一白金耳接
種し、３７℃で２４時間培養を行なって、１次スタータ
ー（乳酸菌数５×１０8個／ｍｌ，ｐＨ３．５）を調製
した。次いで脱脂粉乳１８０ｇを水２Ｋｇに溶解し、９
０℃達温殺菌した後室温まで冷却して、前記１次スター
ターを接種した。更に、３７℃で２４時間培養を行な
い、これを２次スターターとした。次に、脱脂粉乳４．
５Ｋｇを水５０Ｋｇに溶解し、９０℃達温殺菌した後室
温まで冷却して、前記２次スターターを接種し、３７℃
で２４時間培養を行ない、発酵乳ａ約５６Ｋｇを得た。
【００２２】発酵乳中に含有されるペプチドｂの定量 前記得られた発酵乳ａ１ｍｌを１０，０００ｒｐｍ、５
分間遠心し、得られた上清を商品名「セントリコン−３
０」（分画分子量３０，０００、アミコン社製）にて遠
心濾過した。次いで濾液を逆相カラム(商品名「TSK-gel
Octadecyl-4PW」、東ソー株式会社製）を使用したＨＰＬ
Ｃに供し、０．１重量％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）水
溶液にて溶出される非吸着画分を収集し凍結乾燥した。
次に０．１重量％ＴＦＡ水溶液の少量に溶解した後、下
記条件により定量分析を行なった。その結果得られたペ
プチドをスタンダードとして用い濾液中に含まれるペプ
チドｂの重量を算出したところ発酵乳ａ５６Ｋｇ中にペ
プチドｂ１．６５ｇが含まれていた。
【００２３】カラム：ウオーターズ社製、マイクロボン
ダスフェアー５μＣ１８ 溶出条件：Ａ液：０．１重量％ＴＦＡ水溶液 Ｂ液：０．１重量％ＴＦＡ入りアセトニトリル （Ｂ／Ａ＋Ｂ）×１００（％）：０％→０％（５分）→
４０％（６５分） 流速 ：１ｍｌ／分、 検出 ：２１５ｎｍの紫外
部吸収
【００２４】ペプチドｂの調製 次いで得られた発酵乳ａ中に含まれるペプチドを精製す
るために以下に示す精製工程を行った。
【００２５】得られた発酵乳ａ６リットルを１０Ｎ Ｎ
ａＯＨ溶液でｐＨ７．３付近に調整した後、商品名「Am
berlite XAD-2」（オルガノ社製）樹脂約１リットルを
加え、更に蒸留水を加えて全量を約２０リットルとし
た。９０分間撹拌後、晒し布でろ過して樹脂を回収し
た。蒸留水２０リットルにて該樹脂を洗浄後、メタノー
ル１リットルに添加し、３０分間撹拌した。次にナイロ
ンウール（２００メッシュ）を用いて濾過し、更に硬質
濾紙で吸引ろ過後、濾液をエバポレータにて５５℃、減
圧濃縮し２００ｍｌを得た。この濃縮液に商品名「Ambe
rlite IRA-400」（ＯＨ形）（オルガノ社製）２５０ｍ
ｌを加えスパテールで撹拌し、液の黄色味を除去した。
次いで硬質濾紙にて吸引濾過し濾液を１Ｎ塩酸溶液にて
ｐＨ７に調整後、凍結乾燥した。得られた乾燥物を少量
の蒸留水に溶解し、カラム（商品名「Sephadex G-2
5」、ファルマシア社製)に供した。その後蒸留水にて溶
出し、活性フランクションを収集し凍結乾燥して粉末５
０ｍｇを得た。この乾燥粉末を０．０５酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ４．５）に溶解した後、同緩衝液で平衡化したカラム
（商品名「Sephadex G-25」、ファルマシア社製)にかけ
同緩衝液にて溶出し、活性フラクションを集め凍結乾燥
を行なった。次に得られた凍結乾燥物を、０．１重量％
ＴＦＡ水溶液の少量に溶解した後、高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）による分離を行なった。ＨＰＬＣ
は逆相カラム（商品名「Ｍ＆ＳパックＣ１８」、エムエ
ス機器社製）を使用し、０．１重量％ＴＦＡ入り２−プ
ロパノール／アセトニトリル（７：３）を溶媒とし、０
〜４０％（６０分）の直線勾配にて分離し、ＡＣＥ阻害
活性を有し、単一なピークを示すペプチドｂを１ｍｇ得
た。
【００２６】次いで得られたペプチドｂについて、下記
に示す各方法に従って分析を行った。
【００２７】アミノ酸組成 定沸点６Ｎ塩酸に得られたペプチドｂ１μｇを溶解し、
真空下１１０℃にて２４時間加水分解し、商品名「日立
Ｌ−８５００型アミノ酸分析計」（日立製作所株式会社
製）によるニンヒドリン発色法にて組成分析を行なった
ところ、Val:Pro（モル比）は１．００：２．０８であ
った。
【００２８】アミノ酸配列 商品名「島津プロテインシークエンサー ＰＳＱ−１
型」（島津製作所株式会社製）によるＮ末端アミノ酸配
列分析を測定した結果、Ｎ末端：Val-Pro-Proであっ
た。
【００２９】ＡＣＥ阻害活性の測定 CheungとCushmanの方法［D. W. Cushman and H. S.Cheu
ng, Biochem. Pharmacol., 20 1637(1971)］に準じて行
なった。
【００３０】即ち、前記調製したペプチドｂを０．１Ｍ
ホウ酸緩衝液（０．３Ｍ ＮａＣｌを含む、ｐＨ８．
３）を用いて濃度１２．５、２５．０、５０．０、１０
０、２００μｇ／ｍｌに調整した後、夫々を試験管に
０．０８ｍｌ入れ、これに基質として０．１Ｍホウ酸緩
衝液（０．３Ｍ Ｎａｃｌを含む、ｐＨ８．３）で５ｍ
Ｍに調整したヒプリルヒスチジルロイシン（Hip-His-Le
u、シグマ社製）０．２ｍｌを添加し、更に酵素水溶液
（０．１ｕ／ｍｌ，シグマ社製）０．０２ｍｌを添加
し、３７℃、３０分間反応させた。その後、１Ｎ塩酸
０．２５ｍｌを添加して反応を停止させた後、１．７ｍ
ｌの酢酸エチルを加え２０秒間撹拌した。次いで３００
０ｒｐｍで１０分間遠心して酢酸エチル層１．４ｍｌを
採取した後、１２０℃、４０分間加熱し、溶媒を除去し
た。溶媒除去後、蒸留水１ｍｌを加え、抽出されたヒプ
リル酸の吸収２２８ｎｍ値を測定し、これをＡＣＥ阻害
活性とした。阻害率は下記式より算出した。その結果阻
害率５０％の時の阻害剤濃度ＩＣ50を求めたところ、得
られたペプチドｂは１４μＭであった。
【００３１】 阻害率＝［（Ａ−Ｂ）／（Ａ−Ｃ）］×１００（％） Ａ：試料（ペプチドｂ）を含まない場合の２２８ｎｍの
吸光度 Ｂ：試料（ペプチドｂ）を添加した場合の２２８ｎｍの
吸光度 Ｃ：酵素及び試料（ペプチドｂ）を添加しない場合の２
２８ｎｍの吸光度
【００３２】ラット経口投与時の降圧作用の測定 次に得られた発酵乳ａ及びペプチドｂについて下記に示
す方法に従って降圧作用を測定した。
【００３３】２０週令・雄の自然発症高血圧（ＳＨＲ）
ラット（日本チャールスリバー社，１群４匹）を温度２
３±２℃、湿度５５±５％の動物室中、水及び飼料（日
本クレア製、商品名「ＣＥ−２」）は、自由摂取とし
て、馴化飼育したものを被験動物として用いた。試験前
日より１晩絶食させたＳＨＲに、生理食塩水（２ｍｌ／
ラット）、発酵乳ａ（２ｍｌ／ラット）及び生理食塩水
２ｍｌに溶解したペプチドｂ（１５０μｇ／ラット）を
胃ゾンデにより強制経口投与した。投与直前、投与４時
間後、投与８時間後に、それぞれ血圧を測定した。血圧
の測定には、無加温、非観血値的ラット血圧計（シーエ
スアイ社製、商品名「ＰＥ−３００型」）を用いtail-c
uff法にて測定した。投与直前の血圧と４時間後及び８
時間後の血圧との差（血圧降下）の結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【実施例２】実施例１で得られた発酵乳ａ５５Ｋｇに、
商品名「Amberlite XAD-2」（オルガノ社製）５Ｋｇを
添加し、室温で９０分間撹拌後、晒し布で濾過して樹脂
を回収した。水１０リットルにて樹脂を洗浄後エタノー
ル２．５リットルに添加し、３０分間撹拌した。さらに
ナイロンウール（２００メッシュ）を用いてろ過し、更
に硬質濾紙で吸引ろ過後、濾液をエバポレーターにて５
５℃減圧濃縮し、更に凍結乾燥し、粉末約３．１ｇを得
た。実施例１の発酵乳中に含有されるペプチドの定量と
同様な方法によって定量を行なったところ、ペプチドｂ
０．４ｇが含まれていた。
【００３６】次に乳糖４０．０重量部、ショ糖３４．８
重量部、トウガント末５．０重量部、ペパーミント油
０．２重量部を混合した後、前記ペプチド粉末２０．０
重量部を蒸留水２０．０重量部に溶解した溶液を添加し
十分に練合した。次いで得られた練合物を、デンプンを
散布したガラス板上にて展延し、シート状とした後型で
打ち抜き乾燥しトローチ剤を得た（１ｇ／個）。
【００３７】
【配列表】
【００３８】配列番号：１ 配列の長さ：３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００３９】配列番号：２ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４０】配列番号：３ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４１】配列番号：４ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４２】配列番号：５ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４３】配列番号：６ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４４】配列番号：７ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４５】配列番号：８ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４６】配列番号：９ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:225） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 38/55 A61K 38/04 - 38/10 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Val-Pro-Proを含有し、アミノ酸残基数
    が３〜１０のペプチドを有効成分とするアンジオテンシ
    ン変換酵素阻害剤であって、前記ペプチドが、Val-Pro-
    Pro、Val-Val-Pro-Pro、Val-Val-Val-Pro-Pro、Pro-Val
    -Val-Val-Pro-Pro、Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-
    Pro-Pro、Leu-Val-Pro-Pro、Phe-Leu-Val-Pro-Pro、Pro
    -Val-Pro-Pro、及びAla-Pro-Val-Pro-Proからなる群よ
    り選択される１種又は２種以上のペプチドであるアンジ
    オテンシン変換酵素阻害剤。
  2. 【請求項２】 Val-Pro-Proを構成成分とするペプチド
    を含む食品素材を、乳酸菌により発酵処理して、請求項
    １記載のペプチドを得ることを特徴とする請求項１記載
    のアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造法。
  3. 【請求項３】 請求項１記載のアンジオテンシン変換酵
    素阻害剤を含む機能性食品。
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