WO2007013426A1 - 発酵乳の製造方法及び発酵乳飲食品 - Google Patents

発酵乳の製造方法及び発酵乳飲食品 Download PDF

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protease
lactic acid
pro
casein
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Mariko Yasuda
Tadashi Shinoda
Naoyuki Yamamoto
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Calpis Co., Ltd.
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    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/147—Helveticus

Definitions

  • the present invention can efficiently produce peptides such as Val Pro Pro, lie Pro Pro, and Tyr Pro, which have been confirmed to have useful functions such as blood pressure lowering action, in fermented milk.
  • the present invention relates to a method for producing fermented milk that can be easily imparted with excellent flavor and the like that can be used as a food and drink, and a fermented milk food and drink that uses fermented milk obtained by the method. Background art
  • peptides that exhibit useful functions such as blood pressure lowering effects have been separated and reported from enzymatic degradation products of food proteins and fermented foods.
  • a peptide having a Pro residue at the carboxy terminus may exert a blood pressure lowering effect in vivo because there are many so-called angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory activities that regulate blood pressure in vivo. It is shown.
  • ACE angiotensin converting enzyme
  • Patent Document 1 describes a method in which a milk component is produced by fermentation with lactic acid bacteria such as Lactobacillus helveticus.
  • Patent Documents 2 to 4 propose methods for producing main milk protein casein by enzymatic degradation.
  • the functional peptide can be efficiently produced by appropriately setting the amount and conditions of the enzyme used.
  • a functional peptide obtained by such enzymatic degradation is to be used in a dairy product such as a fermented milk food having a good flavor and containing the peptide at a high concentration, it is purified, concentrated, and powdered after enzymatic digestion. It is inevitable that the manufacturing process will be complicated.
  • fermented milk that can be used as a food or drink or its raw material can be obtained directly, and a functional peptide is produced in the fermented milk. Therefore, the fermented milk obtained without necessarily purifying, concentrating, and pulverizing the functional peptide can be easily used for dairy products.
  • Patent Document 5 proposes a specific lactic acid bacterium that can improve the productivity of a functional peptide exhibiting a blood pressure lowering action and the like, and can efficiently decompose casein, and fermented milk using the lactic acid bacterium. .
  • Non-Patent Document 3 in order to obtain a blood pressure lowering effect using Val Pro Pro and lie Pro Pro as active ingredients, the effective daily dose for adults is 3.4 mg or more as a total converted value thereof. It has been reported to do.
  • the effective daily dose for adults is 3.4 mg or more as a total converted value thereof. It has been reported to do.
  • Patent Document 5 when producing a final product having a blood pressure lowering function containing the effective amount of peptide using fermented milk by lactic acid bacteria described in Patent Document 5, use 60 ml or more of the fermented milk. The final product needs to be manufactured.
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 2782142
  • Patent Document 2 JP-A-6_128287
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-136995
  • Patent Document 4 Pamphlet of WO2005Z012542
  • Patent Document 5 Japanese Patent No. 3028411
  • Non-Patent Document 1 Nakamura et al. J. Dairy Sci. 78: pl253-1257 (1995)
  • Non-Patent Document 2 Yamamoto et al. J. Dairy Sci. 82: pl388_1393 (1995)
  • Non-Patent Document 3 Hata et al. Am J. Clin. Nutr., P767-771 (1996) Disclosure of the invention
  • a problem of the present invention is that a specific peptide having a useful function such as a blood pressure lowering effect can be efficiently produced in fermented milk, and the fermented milk food and drink have excellent flavor and blood pressure lowering.
  • An object of the present invention is to provide a fermented milk production method capable of easily imparting functionalities such as action and the like, and a fermented milk food and drink that uses the fermented milk and has excellent flavor and functionality.
  • the step (A) of enzymatically degrading animal milk casein with a protease (1) comprising at least one protease belonging to superfamily that exhibits papain, bromelain and similar enzyme reactions, , Animal milk casein and / or the enzymatic degradation product of animal milk casein by the above-mentioned protease (1) in combination with the step (B) of fermenting lactic acid bacteria, Val Pro Pro (hereinafter sometimes abbreviated as VPP), lie Provided is a method for producing fermented milk, characterized by producing at least one of Pro Pro (hereinafter sometimes abbreviated as IPP) and Tyr Pro (hereinafter sometimes abbreviated as YP).
  • a protease (1) comprising at least one protease belonging to superfamily that exhibits papain, bromelain and similar enzyme reactions, , Animal milk casein and / or the enzymatic degradation product of animal milk casein by the above-mentioned protease (1) in combination with the step (B
  • animal milk casein animal milk having a casein concentration of about 10 to 10% by weight is used, and the addition amount of the protease (1) is 0.005 to the amount of casein.
  • Fermented milk food and drink containing fermented milk or its concentrate obtained at ⁇ 0.1% by weight, Val Pro Pro 1.2mgZl00ml or more, lie Pro Pro l.Omg / lOOml or more and Ding 1 ⁇ 1 "
  • a fermented milk food or drink characterized by containing 0.5113 ⁇ 4 / 1001111 or more of 0 .
  • the method for producing fermented milk of the present invention combines the steps (A) and (B), a specific peptide having a useful function such as a blood pressure lowering effect is efficiently contained in the fermented milk. It can be produced well. Moreover, it is possible to easily impart excellent flavor and functionality such as a blood pressure lowering effect to fermented milk foods and drinks. In particular, by simultaneously performing the steps (A) and (B), the production step can be simplified and the production efficiency of the specific peptide can be improved.
  • the fermented milk food and drink of the present invention has a useful function obtained by the production method of the present invention. Since fermented milk containing a large amount of the specific peptide to be used is used, it is possible to obtain a fermented milk food and drink that is easy to adjust in flavor, excellent in flavor, and capable of imparting functionality.
  • FIG. 1 is a graph showing the production amounts of VPP and IPP peptides according to the difference in the amount of bromelain added in Example 4.
  • the production method of the present invention includes a step (A) of enzymatic degradation of animal milk casein with a specific protease (1).
  • the specific protease (1) includes at least one of a protease belonging to a superfamily that exhibits nopain, bromelain, and similar enzyme reactions.
  • the protease (1) exhibits a specificity to ⁇ -casein having peptide sequences such as VPP, IPP, YP, etc., and is considered to be deficient in the initial degradation of animal milk casein in normal lactic acid bacteria fermentation. It includes proteases that can complement and enhance activity and increase the production rate of peptides with the desired functionality.
  • the protease belonging to the superfamily showing papain, bromelain and similar enzyme reaction is usually (Xaa) m Val Pro Pro (Xbb) n, (Xaa) mlie Pro Pro (Xb b) n or It includes a protease that cleaves at least one of the peptides represented by (Xaa) m Tyr Pro (Xbb) n at the carboxyl terminus of (Xaa) m.
  • Xaa and Xbb independently represent any amino acid.
  • Xaa in one of the peptide sequences may be the same or different from Xaa in the other peptide sequence
  • Xbb in one of the peptide sequences may be the same or different from Xbb in the other peptide sequence.
  • m and n are integers, and when m is 2 or more, Xaa may be the same or different. When n is 2 or more, Xbb may be the same or different.
  • papain a papaya extract can be used, and as a bromelain, a pineapple paste can be used.
  • protease belonging to the superfamily examples include ananain, ananase, extranase, pinase, and pineapple.
  • Norre 'Enzaimu pineapple enzyme
  • Toraumana 1 - i toraumanase
  • Nono Haiyochin papayo tin
  • Sumetorin summetrin
  • Bae Funoredon velardon input Nono Hire' to Fuchidaze
  • papaya pe ptiaase liver Nononono down, chymopapain
  • ⁇ ⁇ ⁇ 7 ⁇ Floor Ina 1 to i papaya proteinase
  • PPIV potashin
  • protease 'omega proteinase omega
  • CI peptidase examples include ananain, ananase, extranase, pinase, and pineapple.
  • Norre 'Enzaimu pineapple enzyme
  • Plant cysteine peptidases having cysteine at the active center as mentioned above, and proteases belonging to the subfamily of papain are particularly preferred. Also included are cathep sin and the like, which have a very high homology between these enzymes and the active center and appear to have similar substrate specificity.
  • the protease (1) used in the step (A) may be a mixture of a plurality of enzymes, or may contain a specific protease other than those described above for the purpose of improving degradability.
  • protease (1) Commercially available products can also be used as protease (1).
  • trade name Papain F Al Enzyme
  • trade name VERON L10 Higuchi Shokai
  • trade name Bromelain Great Food Co., Ltd.
  • the product name Papain W_40 manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.
  • the refined food nopain manufactured by Nagase ChemteX Corporation
  • the animal milk casein used in step (A) or step (B) to be described later is a food material containing animal milk casein having VPP, IPP, and YP peptide sequences having functions such as blood pressure lowering action.
  • animal milk such as cow milk, skim milk powder, processed milk, and animal milk casein extract, as well as food materials added with lactic acid bacteria fermentation aids such as vitamins, nucleic acids, and yeast extract. .
  • the casein concentration is not particularly limited, but is usually about 3 to 15% by weight, preferably 3 in order to obtain the desired effect of the present invention more efficiently. ⁇ 10% by weight.
  • the amount of protease (1) to be used can be appropriately determined in consideration of the titer so as to have a desired effect, but it is combined with lactic acid bacteria fermentation in step (B) described later. Therefore, the objective can be achieved with a smaller amount of use than when enzymatically degrading animal milk casein with protease alone.
  • the protease (1) is preferably in a proportion of 0.005 to 0.1% by weight based on the amount of animal milk casein. Below 0.005% by weight, the desired of the present invention There is a possibility that the effect cannot be obtained, and when it exceeds 0.1% by weight, the amount of the peptide to be produced becomes excessive and there is a risk that the flavor will be lost.
  • the enzymatic degradation conditions can be carried out at the optimum temperature and pH of the protease (1), usually at 25 to 45 ° C. while maintaining the pH at a neutral level.
  • the enzyme degradation time can be appropriately selected according to the amount and titer of protease (1).
  • step (A) When the step (A) is performed prior to the step (B) described later, the protease (1) is deactivated at about 60-100 ° C after the enzymatic decomposition, and then the step (B) Can be used.
  • step (A) is carried out at the same time as step (B) described later, that is, in cases where animal milk casein is enzymatically degraded and lactic acid bacteria fermented in a medium containing both the protease (1) and lactic acid bacteria, 25 It is preferable to adjust to the optimal growth condition temperature of lactic acid bacteria at ⁇ 45 ° C., and the fermentation time of lactic acid bacteria is usually 5-30 hours. At this time, the fermentation time can be shortened by increasing the amount of enzyme added.
  • the production method of the present invention comprises animal milk casein and / or the above-mentioned proteaase of animal milk casein (
  • step (B) of fermenting the enzymatic degradation product according to 1) with lactic acid bacteria Including the step (B) of fermenting the enzymatic degradation product according to 1) with lactic acid bacteria.
  • step (B) The animal milk casein described above can be used as the animal milk casein used in the step (B).
  • the process (A) and the process (B) are simultaneously performed as described above.
  • step (B) can be performed after step (A) is completed.
  • lactic acid bacteria used in the step (B) include lactic acid bacteria belonging to the genus Streptococcus, Ratatococcus, Ratatobacillus, Bifidobacterium, etc., with the genus Lactobacillus being preferred.
  • Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus helveticus, Lactobacillus casei, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus acidophilus Lactobacillus fermentum, etc., especially ratatobatorenoles helveticas or lactobacillus acidophilus, lactobacillus bulgaricus, lactobacillus caseica VPP, IPP, YP more efficiently
  • two or more of these can be used.
  • the Lactobacillus helveticus strain includes an extracellular proteinase activity. A high one is preferred. For example, according to the method of Twinmoto et al. (Twining, S. Anal. Biochem. 143 3410 (1984), Yamamoto et al. (Yamamoto, Tsuji et al. J. Biochem. (1993) 114, 740)) A strain having a value of UOOD590 of OO or higher is preferred.
  • CM4 Lactobacillus' Helveticas CM4 strain (Incorporated administrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, Ibaraki Prefecture Tsukuba Rinto Central 6th Deposit Number: FERM BP_6060, Deposit Date 1997.8.15X or less, referred to as CM4) Is mentioned.
  • This CM4 is registered with the above deposit number in the Budapest Treaty concerning the international recognition of microbial deposits under patent procedures, and this strain has already been patented.
  • the lactic acid bacteria are preferably used as a starter having a sufficiently high activity and pre-cultured beforehand.
  • the initial bacterial count is preferably about 10 5 to 10 9 cells / ml.
  • the step (B) can be performed using yeast in combination with the lactic acid bacteria.
  • the strain of yeast is not particularly limited, and preferred examples include Saccharomyces yeasts such as Saccharomyces cerevisiae.
  • the content ratio of yeast can be appropriately selected depending on the purpose.
  • lactic acid bacteria fermentation adjuvants can be added.
  • the adjuvant include amino acids, vitamins, minerals, nucleic acids, salts, microbial sex, and detergent agents.
  • step (B) the fermentation conditions for lactic acid bacteria are usually 25 to 45 ° C, depending on the optimal growth temperature for lactic acid bacteria, whether it is performed simultaneously with step (A) or after step (A). Usually, it is preferable to carry out under conditions of 5 to 30 hours. In addition, neutralization culture is preferable for the purpose of promoting fermentation.
  • fermented milk containing more of any of VPP, IPP, and YP can be obtained than only ordinary lactic acid bacteria fermentation without performing step (A).
  • step (ii) since the step (ii) is included, a product containing a peptide such as VPP, IPP, or YP can be obtained directly as fermented milk.
  • step (B) is performed after step (A) or steps (A) and (B) are performed simultaneously, at least one of VPP, IPP, and YP is produced more than lactic acid bacteria fermentation alone.
  • the fermented milk food / beverage product of the present invention may be used as the animal milk casein in the production method.
  • Fermented milk or concentrate thereof obtained by using animal milk with a concentration of zein of 3 ⁇ 4 to 10% by weight, and an amount of the added amount of protease (1) of 0.005 to 0.1% by weight based on the amount of casein Fermented milk foods and beverages containing VPP 1.2mgZl00ml or more, IPP l.OmgZlOOml or more and YP 0.5mg / l00ml or more.
  • the measurement of the amount of a specific peptide contained is one for easily evaluating more types of peptides than the power that can be measured by various HPLC methods.
  • the LCZMS method is used as the method.
  • the LCZMS analysis method the method already reported by Matsuura et al. (MilchBib, 2004, 60, 24-27) is used.
  • the fermented milk food and drink of the present invention uses the fermented milk obtained by the production method of the present invention or a concentrated product thereof.
  • yogurt, lactic acid bacteria drinks, dairy lactic acid bacteria drinks, and other various processed products It can be a milk food or drink, and can be in the form of a room temperature milk drink, a chilled milk drink, a general food, a dietary supplement, or the like.
  • supplemental additives can be added to the fermented milk food and drink according to the present invention from the viewpoint of improving nutritional balance and flavor according to the form.
  • carbohydrates, lipids, vitamins, minerals, nutritional additives, sweeteners, fragrances, pigments, texture improvers and the like can be mentioned.
  • the fermented milk food and drink of the present invention contains a specific peptide known to exhibit a blood pressure lowering effect such as VPP, IPP and YP, functional food and drink such as food for specified health use, It can also be set as the functional food-drinks which displayed the effect for blood pressure lowering effect.
  • the amount of each intake is usually O. lmlZkg body weight as the amount of fermented milk contained. -5.0 ml / kg body weight, particularly preferably 0.3 ml / kg body weight to 0.6 ml / kg body weight.
  • CM4 was sterilized at 100 ° C in a milk medium consisting of skim milk powder with a solid content of 9% by weight 37 Pre-culture at 20 ° C. for 20 hours to prepare a lactic acid bacteria starter. Next, to the newly prepared 30% skim milk powder of 9% by weight, the starter was added to 3% by weight.
  • Example 1 the product name Papain F (manufactured by Amano Enzym, Carica papaya L.), in Example 2, the trade name purified papain (manufactured by Nagase Seikagaku, Carica papaya), and in Example 3, trade name Bromelain F (Amano Enzym, Ananas comosus ⁇
  • Example 1 the trade name Protease ⁇ (Amano Enzyme, Aspergillus oryzae) is used.
  • Comparative Example 2 the trade name Protease A (Amano Enzyme, Aspergillus oryza e) is used.
  • the trade name Neulase F3G (manufactured by Amano Enzym Co., Rhizopus n iveus) is used. (New Japan Manabu Kogyo Co., Ltd., the Aspe rgillus oryzae-derived), were respectively 0.5mg added separately.
  • the fermented milk of Comparative Examples 1 to 5 combined with protease, which does not contain the specific protease used in the present invention is significantly more VPP and IPP than the fermented milk of Comparative Example 6 using only CM4 strain lactic acid bacteria.
  • the production amount of was low.
  • the fermented milks of Comparative Examples 1, 2 and 5 using aspergillus-derived proteases, which are known to have the ability to produce animal milk casein, VPP and IPP were also found in VPP and IPP.
  • the production amount of was extremely small.
  • VPP and IPP production was not observed.
  • Fermented milk was prepared in the same manner as in Example 3 except that the amount of bromelain in protease was changed to 0.1 mg, 0.25 mg, and l.Omg, and the amounts of VPP and IPP peptides were analyzed in the same manner as in Example 3. It was. The results are shown in Figure 1.
  • FIG. 1 also shows the result of Example 3 in which the amount of bromelain of protease was 0.5 mg and the result of Comparative Example 6 in which no protease was added.
  • Each left bar in Figure 1 shows the VPP content, and each right bar shows the IPP content.
  • the addition of 0.1, 0.25, 0.5, and 1 mg bromelain to 30 ml of fermented milk means that 0.008%, 0.021%, and 0.042% by weight of protease for the amount of casein in fermented milk, respectively. And 0.084% by weight.
  • Figure 1 confirms that the productivity of both peptides is improved when added compared to when bromelain is not added.
  • the amount of protease added was in the range of 0.25 to 1.0 mg, it was confirmed that the productivity of VPP and IPP peptides was about 1.5 times that of unadded force.
  • CM4 was pre-cultured at 37 ° C. for 24 hours in a milk medium consisting of skim milk powder having a solid content of 9% by weight sterilized at 95 ° C. to prepare a lactic acid bacteria starter.
  • the starter was added to 1 liter of a newly prepared milk medium consisting of skim milk powder having a solid content of 9% by weight so that the starter would be 3% by weight.
  • the trade name Bromelain F (Amano) 10 mg of Ananas comosus M. manufactured by Enzym Co.) was added.
  • skim milk powder to which only a lactic acid bacterium starter not supplemented with protease was added was prepared. Next, each was kept at 32 ° C. for 20 hours, and enzymatic fermentation and lactic acid bacteria fermentation or lactic acid bacteria fermentation alone were carried out to prepare each fermented milk.
  • the fermented milk beverage containing about 60% by weight of fermented milk of Example 5 fermented with bromelain contained 8.4 mg of tripeptide in 120 g when calculated in the same manner.
  • the fermented milk beverage with a blend of about 30% by weight of the fermented milk of Example 5 was the same, while 1.9 mg of tripeptide was contained in 120 g.
  • it contained 4.3 mg of tripeptide in 120 g.
  • the production of YP which has been confirmed to lower blood pressure in animal studies, was also confirmed.
  • Example 10 Even if it is about half of the 60% by weight product in Example 10, the effective minimum amount can be cleared with 120g product. Moreover, when the flavor evaluation of the fermented milk itself prepared in Example 5 and Comparative Example 10 was performed, there was no significant difference in flavor between the addition and non-addition of protease.
  • Val Pro Pro Phe Leu and lie Pro Pro Leu Thr lactic acid bacteria species different from Lactobacillus' Helveticus are found in Val Pro Pro and lie
  • the strains are Lactobacillus bulgaricus JCM1002 (RIKEN BioResource Center, Microbial Materials Development Office, 2-1) The same as above was used.
  • Val Pro Pro and lie Pro Pro were produced in all strains. Therefore, Val Pro Pro Phe Leu and lie Pro Pro Leu Thr were combined with a protease that produces casein.
  • the fermented milk of the lactic acid bacteria can be expected to contain Val Pro Pro and lie Pro Pro, and it can be seen that the lactic acid bacteria used are not limited to Lactobacillus helveticus.

Abstract

血圧降下作用等の有用な機能を有する特定のペプチドを、発酵乳中に効率良く産生させることができ、しかも発酵乳飲食品に、優れた風味や血圧降下作用等の機能性を簡便に付与することができる発酵乳の製造方法及び該発酵乳を利用した、風味に優れ、機能性をも付与可能な発酵乳飲食品を提供する。本発明の製造方法は、パパイン等の特定のプロテアーゼを含むプロテアーゼ(1)により獣乳カゼインを酵素分解する工程(A)と、獣乳カゼイン等を、乳酸菌発酵する工程(B)とを組合せ、VPP、IPP、YPを生成させることを特徴とし、本発明の発酵乳飲食品は、本発明の製造方法で得られた発酵乳又はその濃縮物を含み、飲用時換算で、特定量以上のVPP、IPP及びYPを含むことを特徴とする。

Description

明 細 書
発酵乳の製造方法及び発酵乳飲食品
技術分野
[0001] 本発明は、血圧降下作用等の有用な機能が確認されている Val Pro Pro, lie Pro Pr o及び Tyr Pro等のペプチドを発酵乳中に効率良く産生させることができ、しかも発酵 乳飲食品として利用可能な、優れた風味等を簡便に付与することができる発酵乳の 製造方法及び該方法により得られた発酵乳を利用した発酵乳飲食品に関する。 背景技術
[0002] 従来、血圧降下作用等の有用機能を示すペプチドが、食品用蛋白質の酵素分解 物や発酵食品から分離、報告されている。特に、カルボキシ末端に Pro残基を有する ペプチドは、生体内で血圧調節を行う、いわゆるアンジォテンシン変換酵素 (ACE)阻 害活性を有する物が多ぐ生体内で血圧降下作用を発現することが示されている。血 圧降下作用を示すペプチドの中でも、特に、乳蛋白質カゼインの分解ペプチドであ る Val Pro Pro, lie Pro Proあるいは Tyr Proが、 自然発症高血圧ラットに対して強い血 圧抑制効果を示したことが非特許文献 1及び 2に報告されている。
[0003] 上記機能性ペプチドの製造方法としては、例えば、特許文献 1に、乳成分をラクト バチルス ·ヘルべティカス等の乳酸菌で発酵させて製造する方法が記載されてレ、る。 また、特許文献 2〜4には、主要乳蛋白質カゼインを酵素分解により製造する方法が 提案されている。
特許文献 2〜4に示される酵素分解による方法においては、酵素の使用量や条件 を適切に設定することにより、前記機能性ペプチドを効率良く生産することができる。 しかし、このような酵素分解により得られる機能性ペプチドを、該ペプチドが高濃度 で含まれる風味良好な発酵乳食品等の乳加工製品に利用しょうとする場合、酵素分 解後に純化、濃縮、粉化等を行う必要があり、製造工程が煩雑化することが避けられ なレ、。
一方、上記乳酸菌の発酵を利用する方法においては、飲食品又はその原料とする ことが可能な発酵乳を直接得ることができ、該発酵乳中に機能性ペプチドを産生させ ること力できるので、機能性ペプチドの純化、濃縮、粉化等を必ずしも行うことなぐ得 られる発酵乳を乳加工製品等へ容易に利用することが可能である。
しかし、特許文献 1に記載された乳酸菌による発酵を利用する方法では、発酵乳中 に未分解カゼインが多く含まれ、直接得られる発酵乳中における機能性ペプチドの 含有割合が低かったため、更に機能性ペプチドの生産効率を改善する方法の開発 が望まれていた。
そこで、特許文献 5において、血圧降下作用等を示す機能性ペプチドの生産性を 改善でき、カゼイン分解をより効率良く行うことができる特定の乳酸菌、並びに該乳酸 菌を用いた発酵乳が提案された。
ところで、非特許文献 3において、 Val Pro Pro及び lie Pro Proを有効成分として血 圧降下作用を得るためには、これらの合計換算値として、一日の成人への有効量を 3 . 4mg以上とすることが報告されている。例えば、上記特許文献 5に記載された乳酸 菌による発酵乳を用いて、前記有効量のペプチドを含む血圧降下機能を有する最 終製品を製造する場合には、該発酵乳を 60ml以上利用して最終製品を製造する必 要がある。
一方、近年、発酵乳飲食品においては、更なる風味改善効果を目指した技術開発 が求められている。そこで、発酵乳飲食品のレシピ開発をより容易とし、より風味の高 い機能性食品素材や機能性ペプチドの有効量を高めた発酵乳飲食品を得るために 、乳酸菌発酵乳内の機能性ペプチド濃度を更に高めることができる発酵乳の製造方 法等が望まれている。
特許文献 1：特許第 2782142号公報
特許文献 2：特開平 6 _ 128287号公報
特許文献 3：特開 2001 _ 136995号公報
特許文献 4 : WO2005Z012542号パンフレット
特許文献 5：特許第 3028411号公報
非特許文献 1： Nakamura et al. J. Dairy Sci. 78: pl253-1257(1995)
非特許文献 2 : Yamamoto et al. J. Dairy Sci. 82:pl388_1393(1995)
非特許文献 3 : Hata et al. Am J. Clin. Nutr., p767-771(1996) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の課題は、血圧降下作用等の有用な機能を有する特定のペプチドを、発酵 乳中に効率良く産生させることができ、しかも発酵乳飲食品に、優れた風味や血圧降 下作用等の機能性等を簡便に付与することができる発酵乳の製造方法及び該発酵 乳を利用した、風味に優れ、機能性をも付与可能な発酵乳飲食品を提供することに ある。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明によれば、パパイン、ブロメライン及びこれらと類似の酵素反応を示すスーパ 一ファミリーに属するプロテアーゼの少なくとも 1種を含むプロテアーゼ (1)により獣乳 カゼインを酵素分解する工程 (A)と、獣乳カゼイン及び/又は獣乳カゼインの前記プ 口テアーゼ (1)による酵素分解物を、乳酸菌発酵する工程 (B)とを組合せ、 Val Pro Pro (以下、 VPPと略す場合がある)、 lie Pro Pro (以下、 IPPと略す場合がある)及び Tyr Pro (以下、 YPと略す場合がある)の少なくとも 1種を生成させることを特徴とする発酵乳の 製造方法が提供される。
また本発明によれば、前記製造方法において、前記獣乳カゼインとして、カゼイン 濃度力 ¾〜10重量％の獣乳を用レ、、前記プロテアーゼ (1)の添加量を、カゼイン量に 対して 0.005〜0.1重量％にして得られた発酵乳又はその濃縮物を含む発酵乳飲食 品であって、 Val Pro Proを 1.2mgZl00ml以上、 lie Pro Proを l.Omg/lOOml以上及 び丁 1^1"0を0.511¾/1001111以上含むことを特徴とする発酵乳飲食品が提供される。 発明の効果
[0007] 本発明の発酵乳の製造方法は、前記工程 (A)及び工程 (B)を組合せているので、血 圧降下作用等の有用な機能を有する特定のペプチドを、発酵乳中に効率良く産生さ せることができる。しかも発酵乳飲食品に、優れた風味や血圧降下作用等の機能性 等を簡便に付与することができる。特に、工程 (A)及び (B)を同時に行うことにより、製 造工程が簡便になると共に、特定ペプチドの産生効率も向上させることができる。 本発明の発酵乳飲食品は、本発明の製造方法により得られた、有用な機能を有す る特定ペプチドを多く含む発酵乳を利用するので、風味調整が容易で、風味に優れ 、機能性をも付与可能な発酵乳飲食品とすることができる。
図面の簡単な説明
[0008] [図 1]実施例 4で行ったブロメライン添加量の相違による VPP及び IPPペプチドの産生 量を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の製造方法は、特定のプロテアーゼ (1)により獣乳カゼインを酵素分解する 工程 (A)を含む。
前記特定のプロテアーゼ (1)は、ノ パイン、ブロメライン及びこれらと類似の酵素反 応を示すスーパーファミリーに属するプロテアーゼの少なくとも 1種を含む。該プロテ ァーゼ (1)は、特に VPP、 IPP、 YP等のペプチド配列を有する β -カゼインに対する特 異性を示し、通常の乳酸菌発酵における獣乳カゼインの初期の分解加工で不足す ると思われるプロテアーゼ活性を補足及び強化し、所望の機能性を有するペプチド の生成率を高くすることが可能なプロテアーゼを含む。
[0010] 前記パパイン、ブロメライン及びこれらと類似の酵素反応を示すスーパーファミリー に属するプロテアーゼは、通常、（Xaa)m Val Pro Pro (Xbb)n、 (Xaa)m lie Pro Pro (Xb b)n又は (Xaa)m Tyr Pro (Xbb)nで示されるペプチドの少なくとも 1つを (Xaa)mのカルボ キシ末端で切断するプロテアーゼを含む。ここで、 Xaa及び Xbbは独立に任意のァミノ 酸を示す。前記ペプチド配列の 1つにおける Xaaは他のペプチド配列における Xaaと 同一若しくは異なってレ、ても良く、前記ペプチド配列の 1つにおける Xbbは他のぺプ チド配列における Xbbと同一若しくは異なっていても良い。 m及び nは整数であって、 mが 2以上の場合には、 Xaaは同一若しくは異なっていても良い。また nが 2以上の場 合には、 Xbbは同一若しくは異なっていても良い。
パパインとしては、パパイア抽出物を用いることができ、ブロメラインとしては、パイナ ップノレ抽出物を用いることができる。
[0011] 前記スーパーファミリーに属するプロテアーゼとしては、例えば、アナナイン (ananain )、アナナーゼ (ananase)、ェクストラナーセ (extranase)、ピナーセ (pinase)、パイナップ ノレ'ェンザィム (pineapple enzyme) ^トラウマナ1— i (traumanase)、 ノヽハイョチン (papayo tin)、スメトリン (summetrin)、ぺフノレドン (velardon入ノヽハイア'へフチダーゼ (papaya pe ptiaase)、キモノヽノヽ ン、 chymopapain)、 ノヽノヽ 7 ·フロアイナ1 ~ i (papaya proteinase )、 PPIV、カリ力イン (caricain)、プロテアーゼ 'オメガ (proteinase omega), CIぺプチダ ーゼ.ファミリー (p印 tidase family CI)に属する酵素等のパパインのように活性中心に システィンを有する植物性システィンぺプチダーゼ等が挙げられ、特に、パパインの サブファミリーに属するプロテアーゼが好ましく挙げられる。また、これらの酵素と活性 中心の相同性が極めて高く類似の基質特異性を有すると思われるカテブシン (cathep sin)等も含まれる。
[0012] 工程 (A)に用いるプロテアーゼ (1)は、複数の酵素の混合物であっても良いし、分解 性を高める目的で上記以外の特定のプロテアーゼを含んでいても良い。
プロテアーゼ (1)として市販品を用いることもでき、例えば、商品名パパイン F (天野ェ ンザィム社製)、商品名 VERON L10 (樋口商会製)、商品名ブロメライン (Great Food C o.， Ltd.製又はジヱネンコア協和製)、商品名パパイン W_40(天野ェンザィム社製)、食 品用精製ノ パイン (ナガセケムテックス社製)を用いることができる。
[0013] 工程 (A)又は後述する工程 (B)に用いる獣乳カゼインは、血圧降下作用等の機能性 を有する VPP、 IPP及び YPのペプチド配列を有する獣乳カゼインを含む食品素材で あれば特に限定されない。例えば、牛乳を初めとする獣乳、脱脂粉乳、加工乳、獣乳 カゼイン抽出物が挙げられ、これらに更に、ビタミン類、核酸、酵母エキス等の乳酸菌 発酵助剤を添加した食品素材が挙げられる。
本発明の製造方法により用いる獣乳カゼインにおいて、カゼイン濃度は特に限定さ れないが、本発明の所望の効果をより効率的に得るために、通常 3〜15重量％程度 であり、好ましくは 3〜10重量％である。
[0014] 工程 (A)において、プロテアーゼ (1)の使用量は、所望の効果を有するように力価を 考慮して適宜決定することができるが、後述する工程 (B)の乳酸菌発酵と組合せるた め、獣乳カゼインをプロテアーゼだけで酵素分解するよりも通常少ない使用量で目 的を達成することができる。例えば、プロテアーゼ (1)を、獣乳カゼイン量に対して 0.00 5〜0.1重量％の割合とすることが好ましい。 0.005重量％未満では、本発明の所望の 効果が得られない恐れがあり、 0.1重量％を超える場合には、生成するペプチド類が 過剰になり、風味の点において損なわれる恐れがある。
工程 (A)において、酵素分解条件は、プロテアーゼ (1)の至適温度及び pHで行うこと ができ、通常 25〜45°Cにおいて、 pHを中性程度に維持して行うことができる。酵素分 解時間は、プロテアーゼ (1)の量及び力価に応じて適宜選択することができる。
[0015] 工程 (A)を後述する工程 (B)に先立って行なう場合には、酵素分解後に、プロテア一 ゼ (1)を 60〜100°C程度で失活させ、次に工程 (B)に供することができる。また、工程 (A) を後述する工程 (B)と同時に、即ち、前記プロテアーゼ (1)と乳酸菌との両方を含む培 地で、獣乳カゼインを酵素分解及び乳酸菌発酵する場合には、通常 25〜45°Cにお いて乳酸菌の最適増殖条件温度に合わせ、また、乳酸菌発酵時間は、通常 5〜30時 間の条件で行うことが好ましい。この際、酵素添加量を増加することで発酵時間を短 縮することも可能である。
[0016] 本発明の製造方法は、獣乳カゼイン及び/又は獣乳カゼインの前記プロテア一ゼ(
1)による酵素分解物を、乳酸菌発酵する工程 (B)を含む。
工程 (B)に用いる獣乳カゼインとしては、上述の獣乳カゼインを用いることができ、該 獣乳カゼインを用いる場合には、上述のとおり、工程 (A)と工程 (B)とを同時に実施す る。一方、前記プロテアーゼ (1)による酵素分解物を工程 (B)により乳酸菌発酵する場 合には、工程 (A)終了後に工程 (B)を実施することができる。
[0017] 工程 (B)に用いる乳酸菌としては、ストレプトコッカス属、ラタトコッカス属、ラタトバチ ルス属、ビフイドバタテリゥム属等に属する乳酸菌が挙げられるが、ラクトバチルス属 が好ましレ、。具体的には、例えば、ラクトバチルス ·ブルガリカス (Lactobacillus bulgari cus)、ラクトノくチノレス'へノレべティカス (Lactobacillus helveticus)、ラタトバチノレス'カゼ ィ (Lactobacillus casei)、ラクトノ チノレス -ァシドフィラス (Lactobacillus acidophilus),ラク トバチルス.フアーメンタム (Lactobacillus fermentum)等が挙げられ、特に、ラタトバチ ノレス .ヘルべティカス又はラクトバチルス .ァシドフィラス、ラクトバチルス .ブルガリカス 、ラクトバチルス ·カゼイカ VPP、 IPP、 YPをより効率的に産生させることができる点で 好適である。使用に際しては、これらは 2種以上用いることもできる。
[0018] 前記ラクトバチルス 'ヘルべティカスの菌株としては、菌体外プロティナーゼ活性の 高いものが好ましい。例えば、 Twiningらの方法 (Twining, S. Anal. Biochem. 143 3410 (1984》をもとにした Yamamotoらの方法 (Yamamoto, Ν·ら J.Biochem. (1993) 114, 740 )に準じて測定した UZOD590の値力 OO以上を示す菌株が好ましい。
例えば、ラクトバチルス 'ヘルべティカス CM4株 (独立行政法人産業技術総合研究 所特許生物寄託センター 日本国茨城県つくば巿東 中央第 6寄託番号: FERM BP_6060、寄託日 1997.8.15X以下、 CM4と称す)が挙げられる。この CM4は、特許手 続上の微生物寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に上記寄託番号で登録さ れており、この株は既に特許されている。
[0019] 前記乳酸菌は、あらかじめ前培養しておいた十分に活性の高レ、スターターとして用 レ、ることが好ましい。初発菌数は、好ましくは 105〜109個/ ml程度である。
得られる発酵乳の風味等をより良好にするために、前記乳酸菌に酵母を併用して 工程 (B)を行うこともできる。酵母の菌種は特に限定されないが、例えば、サッカロマイ セス 'セレビシェ等のサッカロマイセス属酵母が好ましく挙げられる。酵母の含有割合 は、その目的に応じて適宜選択することができる。
また乳酸菌発酵においては、種々の乳酸菌発酵補助剤を添加することも可能であ る。該補助剤としては、例えば、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、核酸、塩類、微生物ェキ ス、デタージェント剤が挙げられる。
工程 (B)において、乳酸菌発酵条件は、工程 (A)と同時に行う場合も、又は工程 (A) の後に行う場合も、乳酸菌の最適増殖条件温度に合わせて、通常 25〜45°Cにおい て、通常 5〜30時間の条件で行うことが好ましい。また、発酵を促進する目的で中和 培養することが好適である。
[0020] 本発明の製造方法では、工程 (A)を行わない通常の乳酸菌発酵のみよりも、 VPP、 I PP、 YPのいずれかを多く含む発酵乳を得ることができる。しかも、工程 (Β)を含むので 、 VPP、 IPP、 YP等のペプチドを含む生成物を直接に発酵乳として得ることができる。 更に、工程 (B)を工程 (A)の後に行っても、工程 (A)と工程 (B)とを同時に行っても、 VPP 、 IPP、 YPの少なくとも 1つが、乳酸菌発酵のみよりも多く生成されることが期待される
[0021] 本発明の発酵乳飲食品は、前記製造方法において、前記獣乳カゼインとして、力 ゼイン濃度力 ¾〜10重量％の獣乳を用レ、、前記プロテアーゼ (1)の添カ卩量を、カゼィ ン量に対して 0.005〜0.1重量％にして得られた発酵乳又はその濃縮物を含む発酵 乳飲食品であって、 VPPを 1.2mgZl00ml以上、 IPPを l.OmgZlOOml以上及び YPを 0. 5mg/l00ml以上含む。
尚、本発明の発酵乳飲食品において、含有される特定のペプチド量の測定は、種 々の HPLC法を用いた方法により測定できる力 より多くの種類のペプチドを簡易的 に評価するためのひとつの方法として LCZMS法が用いられる。 LCZMS分析法とし ては既に報告されている Matsuuraらによる方法 (Milchwissenschaft、 2004、 60， 24-27) が用いられる。
[0022] 本発明の発酵乳飲食品は、本発明の製造方法で得られた前記発酵乳又はその濃 縮物をもちいて、例えば、ヨーグルト、乳酸菌飲料、乳製品乳酸菌飲料、その他さま ざまな加工乳飲食品とすることができ、常温乳飲料、チルド乳飲料、一般食品、栄養 補助食品等の形態とすることができる。
本発明の発酵乳飲食品には、その形態に応じて、栄養的バランスや風味の改善の 観点から様々な補助添加物を添加することができる。例えば、炭水化物、脂質、ビタ ミン類、ミネラル類、栄養性添加物、甘味料、香料、色素、テクスチユア改善剤等が挙 げられる。
[0023] 本発明の発酵乳飲食品は、前記 VPP、 IPP、 YP等の血圧降下作用を示すことが知ら れた特定のペプチドを含有するので、特定保健用食品等の機能性飲食品や、血圧 降下作用のための効能を表示した機能性飲食品とすることもできる。
本発明の発酵乳飲食品を血圧降下作用のための効能を表示した機能性飲食品と する場合には、 1回の摂取量は、含有される発酵乳換算量として、通常 O. lmlZkg体 重〜 5.0ml/kg体重、特に 0.3ml/kg体重〜 0.6ml/kg体重であることが好ましい。 実施例
[0024] 以下、本発明を実施例および比較例によりさらに具体的に説明するが、本発明の 範囲はこれに限定されない。
実施例 1〜 3及び比較例：!〜 6
CM4を、 100°Cで達温殺菌した固形分 9重量％の脱脂粉乳からなる乳培地にて 37 °C、 20時間の前培養を行い、乳酸菌スターターを調製した。次に、新たに準備した同 じく 9重量％の脱脂粉乳 30mlに、前記スターターを 3重量％となるように添加し、更に 、実施例 1では、商品名パパイン F (天野ェンザィム社製、 Carica papaya L.由来)を、 実施例 2では、商品名精製パパイン (ナガセ生化学社製、 Carica papayaし由来)を、 実施例 3では、商品名ブロメライン F (天野ェンザィム社製、 Ananas comosus Μ·由来） を、比較例 1では、商品名プロテアーゼ Ρ (天野ェンザィム社製、 Aspergillus oryzae由 来)を、比較例 2では、商品名プロテアーゼ A (天野ェンザィム社製、 Aspergillus oryza e由来)を、比較例 3では、商品名ニューラーゼ F3G (天野ェンザィム社製、 Rhizopus n iveus由来)を、比較例 4では、商品名ニュートラーゼ (ノボザィム社製、 Bacillus amyloli quefaciens由来)を、比較例 5では、商品名スミチーム FP (新日本化学工業社製、 Aspe rgillus oryzae由来)を、それぞれ別に 0.5mg添加した。また、比較例 6として、プロテア ーゼを添加しない乳酸菌スターターのみを添加した脱脂粉乳を用意した。次に、そ れぞれを 32°Cで 24時間保持し、酵素分解及び乳酸菌発酵、若しくは乳酸菌発酵の みを行なって各発酵乳を調製した。
得られた各発酵乳を、 10000gで 10分間遠心分離し、培養上清 lml中の VPP及び IP Pペプチド量を、 LC/MS (島津製作所製、型番 LCMS2010A)で分析した。結果を表 1 に示す。
比較例 7〜9
100°Cで達温殺菌した固形分 8重量％の脱脂粉乳からなる乳培地 30mlに、比較例 7 では、実施例 1で用いた、商品名パパイン F (天野ェンザィム社製、 Carica papaya L. 由来)を、比較例 8では、実施例 2で用いた、商品名精製パパイン (ナガセ生化学社製 、 Carica papayaし由来)を、比較例 9では、実施例 3で用いた、商品名ブロメライン F( 天野ェンザィム社製、 Ananas comosus M.由来)をそれぞれ別に 0.5mg添加した。次 に、それぞれを 32°Cで 24時間保持し、酵素分解を行なって各酵素分解物を調製した 。得られた酵素分解物について、実施例 1と同様に VPP及び IPPペプチド量の分析を 行った。結果を表 1に示す。
尚、比較例 7〜9で得られた酵素分解物中における、 Val Pro Pro又は lie Pro Pro配 列を含むペプチドの存在を検出し、そのペプチド配列を分析したところ、実施例 1及 び 2と同様なプロテアーゼを用いた比較例 7及び 8では、 Val Pro Pro Phe Leu及び lie Pro Pro Leu Thrが検出され、実施例 3と同様なプロテアーゼを用いた、比較例 9で は、 Val Pro Pro Phe Leu Gin Pro Glu Val Met及び He Pro Pro Leu Thrが検出された この結果より、実施例 1〜3におけるプロテアーゼによる酵素分解では、 Xaa Val Pro Pro (Xbb)n、 Xaa lie Pro Pro (Xbb)nで示されるペプチドのァミノ末端側のアミノ酸残 基 (Xaa)が切断され、実施例:!〜 3の乳酸菌発酵では、同ペプチドのカルボキシ末端 側のアミノ酸残基 ((Xbb)n)が切断され、効率的に Val Pro Pro及び lie Pro Proが発酵 乳中に産生されたものと推測できる。
[表 1]
Figure imgf000011_0001
表 1より、 CM4の乳酸菌のみによる比較例 6の発酵乳では、 VPP及び IPPの高生産 性が確認された。これに対し、パパイン又はプロメラインを含む特定のプロテアーゼと 組合せた実施例 1〜 3の発酵乳は、比較例 1の 1.7〜 1.9倍の VPP及び IPPの産生が確 認できた。
一方、本発明に用いる特定のプロテアーゼを含まなレ、、プロテアーゼと組合せた比 較例 1〜5の発酵乳は、 CM4株の乳酸菌のみによる比較例 6の発酵乳よりも、極端に VPP及び IPPの産生量が少なかった。特に、獣乳カゼイン力 VPP及び IPPの生産活 性があることが知られてレ、る Aspergillus由来のプロテア一ゼを用 、た比較例 1、 2及 び 5の発酵乳においても、 VPP及び IPPの産生量が極端に少なかった。更に、実施例 ：!〜 3で用いたプロテアーゼのみを用いた比較例 7〜9の酵素分解物では、 VPP及び IPPの産生が認められなかった。
従って、特定のプロテアーゼによる酵素分解と乳酸菌発酵とを組合せることにより、 これらの併用による相乗効果が確認できた。
[0028] 実施例 4
プロテア一ゼのブロメライン量を 0.1mg、 0.25mg及び l.Omgに代えた以外は、実施例 3と同様に発酵乳を調製し、実施例 3と同様に VPP及び IPPペプチド量の分析を行つ た。結果を図 1に示す。尚、図 1には、プロテア一ゼのブロメライン量 0.5mgの実施例 3 の結果と、プロテアーゼを添カ卩しなかった比較例 6の結果も示す。図 1の各左側の棒 が VPP含有量、各右側の棒が IPP含有量を示す。
ここで、発酵乳 30mlに対して、ブロメラインを 0.1、 0.25, 0.5及び lmg添加したというこ とは、発酵乳中のカゼイン量に対して、プロテアーゼをそれぞれ 0.008重量％、 0.021 重量％、 0.042重量％及び 0.084重量％添加したことになる。
図 1より、ブロメライン未添加の時に比べて、添加時に両ペプチドの生産性が向上 することが確認できる。特に、プロテアーゼ添加量が 0.25〜1.0mgの範囲において、 未添力卩の約 1.5倍程度の VPP及び IPPペプチド生産性の増加が確認できた。
[0029] 実施例 5及び比較例 10
CM4を、 95°Cで達温殺菌した固形分 9重量％の脱脂粉乳からなる乳培地にて 37°C 、 24時間の前培養を行い、乳酸菌スターターを調製した。次に、新たに準備した同じ く固形分 9重量％の脱脂粉乳からなる乳培地 1リットルに、前記スターターを 3重量％ となるように添加し、更に、実施例 5では商品名ブロメライン F (天野ェンザィム社製、 A nanas comosus M.由来)を 10mg添加した。また、比較例 10として、プロテア一ゼを添 カロしない乳酸菌スターターのみを添加した脱脂粉乳も用意した。次に、それぞれを 32 °Cで 20時間保持し、酵素分解及び乳酸菌発酵、若しくは乳酸菌発酵のみを行なって 各発酵乳を調製した。
得られた各発酵乳に、安定剤及び香料を添加して、最終的に発酵乳含有割合が 約 60重量％及び 30重量％を含む発酵乳飲料 120gをそれぞれ調製した。得られた各 発酵乳飲料中の VPP、 IPP及び YP量を実施例 1に準じて分析した。また、各発酵乳の 酸度も測定した。結果を表 2に示す。 [0030] [表 2]
Figure imgf000013_0001
[0031] 表 2より、 CM4のみで乳酸菌発酵した比較例 10の発酵乳約 60重量％配合による発 酵乳飲料では、血圧降下作用を有するペプチドである VPP及び IPPの合計量が 31 μ g/mlであることから 120g中には 3.7mgの 2種のトリペプチドを含んでいた。
一方、ブロメラインを添加して発酵した実施例 5の発酵乳約 60重量％配合による発 酵乳飲料では、同様に計算した場合、 120g中に 8.4mgのトリペプチドを含んでいた。 また、比較例 10の発酵乳約 30重量。 /。配合による発酵乳飲料では、同様に計算し た場合、 120g中に 1.9mgのトリペプチドが含まれていたのに対し、実施例 5の発酵乳 約 30重量％配合による発酵乳飲料では、同様に計算した場合、 120g中に 4.3mgのトリ ペプチドが含まれていた。また、動物試験において血圧降下作用が確認されている Y Pの産生も確認された。
[0032] ところで、 VPP及び IPPの両ペプチドでのヒトに対する血圧降下作用を得るための 1 回投与の有効最小量は、 VPP換算値 =VPP+ 1.7 X IPPとして 3.4mg以上であることが 知られているので、例えば、比較例 10の発酵乳約 60重量％配合による発酵乳飲料 を、血圧降下作用を表示した機能性食品とする場合には、 120g製品とする必要があ る。一方、実施例 5の発酵乳約 60重量。/。配合による発酵乳飲料では、 60g程度であつ ても充分に前記有効最少量をクリア一でき、また、実施例 5の発酵乳約 30重量％配 合による発酵乳飲料では、発酵乳含有量を比較例 10の約 60重量％製品の半分にし ても、 120g製品で前記有効最少量をクリア一できる。また、実施例 5及び比較例 10に ぉレ、て調製した発酵乳自体の風味評価を行ったところ、プロテアーゼ添加と未添加 で風味の大きな差異はなかった。
以上の結果より、本発明の製造方法により得られる発酵乳を用いた発酵乳飲料で は、従来の CM4による発酵乳よりも少ない量の使用で血圧降下作用を表示した機能 性食品を製造することができるので、最終製品製造における風味設計の配合上の制 限幅が大きく拡大することで、風味上の品質の高い製品を製造することが可能になつ た。
[0033] 参考例 1
前述の実施例 1及び 2、比較例 7及び 8で検出されたペプチド、 Val Pro Pro Phe Le u及び lie Pro Pro Leu Thrからラクトバチルス 'ヘルべティカスとは異なる乳酸菌種が V al Pro Pro及び lie Pro Proを生成しうるか否かを確認する目的で、乳酸菌培地に両ぺ ンタペプチドを添加して培養したときの Val Pro Proと lie Pro Proの生成量を検討した 。菌株は Lactobacillus bulgaricus JCM1002株 (独立行政法人理化学研究所バイオリ ソースセンター微生物材料開発室 日本国埼玉県和光巿広沢 2-1)、 Lactobacillus ac idophilus JCM 1132株 (同上)、 Lactobacillus casei ssp. casei JCM1136株 (同上)をそ れぞれ用いた。
化学合成した He Pro Pro Leu Thrと Val Pro Pro Phe Leuをそれぞれ 10 μ g/mlとな るように乳酸菌用培地である MRS培地に加えて、 4日間 37°Cで菌と共に培養した後の 上清画分の Val Pro Proと lie Pro Proの濃度を LC/MSにて測定した。結果を表 3に示 す。
[0034] [表 3]
Figure imgf000014_0001
[0035] 参考例 1の結果を鑑みると、全ての菌株において、 Val Pro Proと lie Pro Proが生成 していたため、 Val Pro Pro Phe Leu及び lie Pro Pro Leu Thrをカゼインより生成する プロテアーゼと組み合わせた上記乳酸菌の発酵乳は、 Val Pro Pro及び lie Pro Proを 含んでいることが期待でき、使用する乳酸菌はラクトバチルス 'ヘルべティカスに限ら ないことが判る。

Claims

請求の範囲
[1] ノ パイン、ブロメライン及びこれらと類似の酵素反応を示すスーパーファミリーに属 するプロテアーゼの少なくとも 1種を含むプロテアーゼ (1)により獣乳カゼインを酵素 分解する工程 (A)と、獣乳カゼイン及び/又は獣乳カゼインの前記プロテアーゼ (1)に よる酵素分解物を、乳酸菌発酵する工程 (B)とを組合せ、 Val Pro Pro, lie Pro Pro及 び Tyr Proの少なくとも 1種を生成させることを特徴とする発酵乳の製造方法。
[2] 前記プロテアーゼ (1)と乳酸菌との両方を含む培地で、獣乳カゼインを酵素分解及 び乳酸菌発酵し、前記工程 (A)及び (B)を行なう請求項 1の製造方法。
[3] 前記プロテアーゼ (1)が、 (Xaa)m Val Pro Pro (Xbb)n、 (Xaa)m lie Pro Pro (Xbb)n又 は (Xaa)m Tyr Pro (Xbb)n (ここで、 Xaa及び Xbbは独立に任意のアミノ酸を示す。前記 ペプチド配列の 1つにおける Xaaは他のペプチド配列における Xaaと同一若しくは異 なってレ、ても良く、前記ペプチド配列の 1つにおける Xbbは他のペプチド配列におけ る Xbbと同一若しくは異なっていても良レ、。 m及び nは整数であって、 mが 2以上の場 合には、 Xaaは同一若しくは異なっていても良レ、。また nが 2以上の場合には、 Xbbは 同一若しくは異なってレ、ても良レ、)で示されるペプチドの少なくとも 1つを (Xaa)mの力 ルポキシ末端を切断するプロテアーゼを含む請求項 1の製造方法。
[4] 前記プロテアーゼ (1)が、パパインのサブファミリーに属するプロテアーゼを含む請 求項 1の製造方法。
[5] 前記プロテアーゼ (1)が、パイナップル抽出物及び Z又はパパイア抽出物に含まれ るプロテアーゼを含む請求項 1の製造方法。
[6] 前記乳酸菌が、ラクトバチルス 'ヘルべティカス、ラクトバチルス'ァシドフィラス、ラタ トバチルス ·ブルガリタス、ラクトバチルス ·力ゼィの少なくとも 1種である請求項 1の製 造方法。
[7] 前記工程 (A)及び工程 (B)における酵素分解及び乳酸菌発酵を、温度 25〜45°Cで 実施する請求項 1の製造方法。
[8] 前記獣乳カゼインとして、カゼイン濃度力 ¾〜10重量％の獣乳を用レ、、前記プロテ ァーゼ (1)の添加量を、カゼイン量に対して 0.005〜0.1重量％にする請求項1の製造 方法。 請求項 8記載の製造方法により得られた発酵乳又はその濃縮物を含む発酵乳飲食 品であって、 Val Pro Proを 1.2mgZl00ml以上、 lie Pro Proを l.Omg/lOOml以上及び Tyr Proを 0.5mg/l00ml以上含む発酵乳飲食品。
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