JP4525754B2

JP4525754B2 - 代謝能力が低減した微生物を用いた生物活性食品成分の保護

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Description

本発明は、１種もしくは２種以上の生きた微生物と、少なくとも１種の選択された生物活性食品成分とを含有する食品であって、該生きた微生物と該選択した生物活性食品成分が、該微生物による該生物活性食品成分の代謝を低減させるように使用される食品に関する。

食品成分、特に生物活性または機能性のペプチド（すなわち、消費者に対する有益な活性を、消化管において局所的に、または循環系に到達した後の体内のどこかで遠位的に有するペプチド）の市場は長年にわたって成長してきた。

生物活性ペプチドとは、それが由来するタンパク質内では不活性であるが、酵素作用により放出（遊離）されると特有の特性を示すようになる、特定されたアミノ酸配列のことである。これらのペプチドは機能性ペプチドとも呼ばれる。このような生物活性ペプチドは、とりわけ、消化器系、生体防御系（例えば、抗菌もしくは免疫調節効果）、心臓血管系（特に抗血栓もしくは抗高血圧効果）、ならびに／または神経系（鎮静効果もしくはオピエート型の鎮痛効果など）に効果を発揮することができる（下記の表１および表２を参照）。

次の表１は人乳および牛乳からタンパク質の加水分解により放出される主要な機能性ペプチドを列挙する。

次の表２は、今日まで知られている乳から誘導された機能性ペプチドの主な生理学的活性をまとめたものである。

これらのペプチドは通常は植物タンパク質（例えば、大豆タンパク質）または動物タンパク質（例えば、カゼインまたは乳清タンパク質）の加水分解により得られる。この加水分解は酵素法および／または発酵法により行われ、目的とする「健康増進効果」を与えるのに一般に必要な工程である、活性分画の濃縮を通常は伴う。健康増進効果を提供するためのこれらのペプチドの製造および使用については、十分な数の文献の主題となっている（Danone World Newsletter No. 17, 1998年9月を参照）。

このような成分を受容することができる食物ベクターの中で、発酵乳製品は、発酵素や発酵産物（即ち、乳中に存在する基質の乳酸菌による変換により生ずる分子）の存在に起因する健康増進効果のために強い立場にある。従来、科学界では発酵素（ferment）の性質に特に注意を払ってきた。研究者は最近、発酵産物に関心を持ち始めており、その中でもある種のペプチドは、非常に多くの特異的な生物学的メッセンジャーであることから特別の地位を占めている。従って、発酵乳製品は例えば、カゼインまたは乳清タンパク質のような乳基質から得られた生物活性ペプチドの加水分解物に対するベクターとして特に好適であると思われる。

しかし、次の大きな問題がある：生の（新鮮）乳製品（ヨーグルト、発酵乳製品類、乳を主成分とする発酵飲料など）の製造に使用する微生物、特に乳酸菌は、それらの栄養要求量、より具体的にはそれらの窒素要求量を満たすために、一般にペプチドを消費することができる。以下では、これを「ペプチドの代謝」と称する。具体的には、乳酸菌は、それらがペプチドを代謝するのを可能にする下記のいくつかの分解系および／または輸送系を有し、それによりそれらのペプチドを培地から消失させてしまう。

１）タンパク質および大きなペプチドを開裂して、それらの吸収（同化）を促進するタンパク質分解系（細胞壁プロテアーゼ、ＰＲＴ）（「細胞外代謝系」）；
２）細胞内部に向かう輸送系、その一つはサイズが１０アミノ酸に近いオリゴペプチドに対して特異的にあり、もう一つはジペプチドおよびトリペプチドの輸送に適している（乳酸桿菌は別にトリペプチドペルミアーゼ系も有する）（「細胞内への輸送系」）；ならびに
３）ペプチドをアミノ酸に分解できる細胞内酵素系（約１５種のエンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼを含有）（「細胞内代謝系」）。

乳中に天然に存在するペプチドの量は乳酸菌の要求量に比べて一般に極めて少ないことを考慮して、ペプチドの補給を行うことによりそれらの増殖を加速するのが普通である。そうすると、発酵中にそれらペプチドは完全に消費される。

結局のところ、(ｉ) 乳中でペプチドがその主要供給源となる、乳酸菌の窒素要求量、(ii) 該乳酸菌がペプチドを効率的に消費するその能力、および(iii) 賞味期限まで乳系発酵製品中に乳酸菌のかなりの集団が生存、という理由により、発酵乳製品中の機能性ペプチドに基づく成分の使用は、発酵中または賞味期限までの製品の貯蔵中にこのような成分が一般に乳酸菌により消費されてしまうため、不可能であるか、そうでなくても困難である。

さらに、乳酸菌によるペプチドの「時期尚早の」代謝による分解というこの問題は、ある特定のペプチドに特異的なものではないばかりか、ある特定の発酵素（または発酵を生ずることができる微生物、好ましくは細菌）に特異的なものでもない。

この問題は普遍的であり、考慮するペプチドおよび微生物の種類に関係なく起こる。
１例として、生物活性αＳ１[91-100]ペプチドの場合を引用することができる（欧州特許ＥＰ０７１４９１０を参照；αＳ１[91-100]ペプチドは、特に、51-53, Avenue Fernand Lobbedez BP 946, 62033 ARRAS Cedex, フランス所在のアングルディア(Ingredia)社からラクティウム(R)(Lactium)なる名称で販売されている、乳タンパク質加水分解物に含まれる弛緩性を有するペプチドである）。かくして、出願人は、最終製品中の生存乳酸菌の集団がその最終製品の貯蔵中に生物活性ペプチドを代謝し続けるため、わずか１０日後（その賞味期限が２８日間である生製品について）にαＳ１[91-100]ペプチドの約３５〜５５％が消失したことを認めた。これは消費者に対して「健康」効果を提供するのには全く許容できないことである（データは示さず）。

生物活性ペプチドの消費が発酵素の代謝活性の結果であることから、この微生物の全部または一部を、例えば適当な熱処理（高温殺菌<thermization>または低温殺菌<Pasteurization>）を用いて殺すことにより、この現象を低減させることが有用であると考えられるかもしれない。この場合、生物活性αＳ１[91-100]ペプチドを保存することが可能となる（例えば、７５℃に約１分間の加熱後に）。

しかし、かかる解決策は下記の多くの難点を与える：
・発酵乳塊の高温殺菌は、熱処理前に添加する安定剤（ペクチン、デンプン、カラジーナン等）の使用を必要とするため、プロセスを複雑化させ、調合コストを著しく増大させる；
・工業用生産ラインがより複雑となり、より大きな比投資額を必要とする；
・製品は、もはや生きた発酵素を含有する製品に付随する称号（品質表示）から得られる利益を享受できず（ヨーグルトなどで）、その結果、乳酸発酵素の摂取に伴う利益を失うであろう；そして
・一般にマイナス方向の官能性（感覚刺激）衝撃が顕著である。
ＥＰ０７１４９１０ＵＳ６５１４９４１ＥＰ０５８３０７４ＥＰ０７３７６９０ＥＰ１３０２２０７ＥＰ０８２１９６８特開平６−１９７７８６号公報 Kayser et al., (1996) FEBS Letters 383, 18-20 Hata Y. et al., (1996) Am. J. Clin. Nutr. 64, 767-71 Nakamura Y. et al., (1995) J. Dairy Sci. 78, 1253-7 Migliore-Samour D. et al., (1988) Experimentia 44,188-93 Defilippi C. et al., (1995) Nutr. 11, 751-4 Tome D. et al., (1987) Am. J. Physiol. 253, G737-44 Tome D. et al.,(1988) Reprod. Nutri. Develop. 28, 909-18 Ben Mansour A. et al., (1988) Pediatr. Res. 24, 751-5 Mahe S. et al., (1989) Reprod. Nutri. Develop. 29, 725-32 Schusdziarra V. et al., (1983) Diabetologia 24, 113-6 Yvon M. et al., (1994) Reprod. Nutri. Develop. 34, 527-37 Zucht H.D. et al., (1995) FEBS Letters 372, 185-8 Tomita M. et al.,(1994) Acta Paed. Jap. 36, 585-91 Lahov E. et al., (1996) Food Chem. Toxic. 34, 131-145 Migliore-Samour D. et al., (1989) Int. Dairy Res. 56, 357-62 Jolles P. et al., (1986) Europ. J. Biochem, 158, 379-82 Raha S. et al., (1988) Blood 772, 172-8 Chabance B. et al., (1995) Brit. J. Nut. 73, 582-90 Kohmura M. et al., (1989) Agric. Biol. Chem. 53, 2107-14 Masuda O. et al.,(1996) J. Nutr. 126, 3063-8 Yamamoto N. et al.,(1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58, 776-8 Ermisch A. et al.,(1983) J. Neurochem. 41, 1229 Umbach M. et al.,(1985) Regul. Pept. 12, 223-30 Singh M. et al.,(1989) Pediatr. Res. 26, 34-8 Svedberg J.et al.,(1985) Peptides 6, 825-30 Teschemacher H. et al.,(1986) J. Dairy Res. 53, 135-8 Yoshikawa M. et al.,(1986) Agric. Biol. Chem. 50, 2419-21 Chiba H. et al.,(1989) J. Dairy Sci. 72, 363 Beucher S. et al., (1994) J. Nutr. Biochem, 5, 578-84 Parker F. et al,,(1984) Eur. J. Biochem, 45, 677-82 Otani H. et al., (1992) Milchwiss. 47, 512-5 Otani H. et al., (1995) J. Dairy Res. 62, 339-48 Drouet et al., (1990) Nouv. Rev. Fr. Hermatol, 32, 59-62 Mullaly M. et al., (1997) Int. Dairy J. 7, 299-303 Meisel H. et al., (1986) FEBS Letters 196, 223-7 Garault et al., (2002) J. Biol. Chem. 277: 32-39 Danone World Newsletter No. 17 (September 1998) Functional Food Science in Europe (1998) British Journal of Nutrition 80(1): S1-S193 Biswas et al., (1993) J. Bacteriol. 175 (11), 3628-3635 Sambrook & Russel (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual (第３版) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Peltoniemi et al., (2002) Arch. Microbiol. 177 (6), 457-67 Detmers et al., (1998) Biochemistry 37 (47): 16671-9

従って、生きた微生物と１種または２種以上の選択された生物活性食品成分との両方を含有する食品（例、ヨーグルト）であって、その食品の官能的品質を保持しながら、該選択した生物活性食品成分が該生きた微生物による代謝から保護されているような食品が求められている。

本発明により、出願人は、既存のニーズを満たすことができる解決策を提供する。
すなわち、本発明の１主題は、１種もしくは２種以上の生きた微生物と少なくとも１種の有益な選択した生物活性食品成分とを含有する食品であって、該生きた微生物と該選択した生物活性食品成分とが、該生きた微生物による該生物活性食品成分の代謝を低減させるように使用される食品に関する。

かくして、出願人は、１種もしくは２種以上の選択した生物活性食品成分を生きた微生物と一緒に使用する時の使用条件が適切であるなら、この成分を該微生物による代謝から効率よく保護することができることを示した。

この適切な使用条件としては、下記を含む多様な手段を利用することができる：
ａ）該生物活性成分を代謝する能力が低減している、生きた微生物を使用する；
ｂ）生きた微生物に意図的に「餌として供される」デコイ食品成分を使用する；および／または
ｃ）該生物活性成分の特に封入（マイクロカプセル化、encapsulation）による、その物理的保護を使用する。

この点に関し、これらの手段の１または２以上、さらには全部を同じ食品に有利に組み合わせることができることに留意すべきである。
前述の背景技術に関して簡単に触れたように、本発明に関して「代謝する」または「代謝」とは、ある物質が栄養分の供給源として消費されるために、１種または２種以上の生きた微生物により変換または分解されることを意味し、最終結果は培地からのその物質のほぼ完全な消失となる。

本発明の目的にとって、ある成分の代謝が「低減する」とは、同じ成分が本発明の範囲内で提供された手段の少なくとも一つにより保護されていない時のその成分の代謝より低くなっている場合である。

有利には、そして理想的には、この低減した代謝はゼロに近づき、さらにはゼロに到達することであり、そうなるとその成分の代謝はほとんど、実質的に全く、さらには全く起こらなくなる。

本発明にある特定の態様によると、その食品中の選択した生物活性食品成分の残留量が、その製造直後の食品中に存在する選択した生物活性食品成分の量に対して、その製造から３週間後で、約５０〜１００％である。

好ましくは、この残留量は約８０〜１００％である。
本発明によると、「食品中の選択した生物活性食品成分の残留量」とは、選択した生物活性食品成分の最初の割合、すなわち、その食品の製造直後における割合に対する、その食品を適切な貯蔵条件下（例えば、生の食品については約４〜１０℃）で３週間保持した時の該食品中に存在する選択した生物活性食品成分の割合を意味する。

本発明のある特定の態様によると、前記選択した生物活性食品成分は下記の群から選ばれる：
・タンパク質、
・ペプチド、
・それらの類似物もしくは誘導体、ならびに
・それらの混合物。

好ましくは、選択した生物活性食品成分は下記の群から選ばれる：生物活性のαＳ１[91-100]ペプチド（欧州特許ＥＰ０７１４９１０を参照）、Ｃ６−α_S1[194-199]ペプチド（米国特許ＵＳ６５１４９４１を参照）、Ｃ７−β[177-183]ペプチド（米国特許ＵＳ６５１４９４１を参照）、Ｃ１２−α_S1[23-34]ペプチド（米国特許ＵＳ６５１４９４１を参照）、カゼイノホスホペプチド（ＣＰＰ）、α−カゾモルフィン、α-カゼインエキソルフィン、カゾキニン（casokinin）、β−カゾモルフィン、カゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）、これはグリコマクロペプチド（ＧＭＰ）もしくはカゼイノグリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）とも呼ばれる、カゾキシン（casoxin）、カゾプラテリン（casoplatelins）、フラグメント50-53、β−ラクトルフィン（β-lactorphins）、ラクトフェロキシン（lactoferroxin）、Val-Pro-Proペプチド（欧州特許ＥＰ０５８３０７４を参照）、Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Glnペプチド（欧州公開ＥＰ０７３７６９０を参照）、Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leuペプチド（欧州公開ＥＰ０７３７６９０を参照）、Tyr-Proペプチド（欧州公開ＥＰ１３０２２０７および欧州特許ＥＰ０８２１９６８を参照）、Ile-Pro-Proペプチド（Nakamura et al., 1995および特開平６−１９７７８６号を参照）、それらのフラグメント、類似物および誘導体、それらを含むタンパク質および／もしくはペプチド、ならびにそれらの混合物（概説については、Danone World Newsletter No. 17, 1998年9月を参照）。

より一層好ましくは、選択した生物活性食品成分は下記の群から選ばれる：生物活性αＳ１[91-100]ペプチド、そのフラグメント、類似物および誘導体、それを含むタンパク質および／もしくはペプチド、ならびにそれらの混合物。

「類似物」とは、初期化合物（この場合はタンパク質またはペプチド）の任意の改変物を意味し、この改変物は天然または合成物質であり、炭素、水素もしくは酸素原子のような１もしくは２以上の原子、または窒素、硫黄もしくはハロゲンのようなヘテロ原子が初期化合物の構造に付加またはこれから除去されることにより新たな分子化合物となったものである。

本発明の目的にとって、「誘導体」とは、参考化合物（タンパク質またはペプチド）との類似性またはこれと共通する構造ユニットを有する任意の化合物である。やはりこの定義に該当するものは、単独でもしくは他の化合物と共に、１もしくは２以上の化学反応により参考化合物の合成を生ずる前駆体もしくは中間体となることができる化合物、ならびに単独でもしくは他の化合物と共に、１もしくは２以上の化学反応を経て該参考化合物から形成されうる化合物である。

すなわち、上記「誘導体」の定義に包含される化合物として、少なくともタンパク質および／またはペプチドの加水分解物、特にトリプシンの作用で生じる加水分解物、加水分解物の画分ならびに加水分解物および／もしくは加水分解物画分の混合物が挙げられる。

さらに、上述した「類似物」ならびに「ペプチドもしくはタンパク質誘導体」は、例えば、グリコシル化（糖付加）もしくはリン酸化（ホスホリル化）されたペプチドもしくはタンパク質、または化学基の付加を受けたものも包含する。

本発明の別の態様によると、選択した生物活性食品成分は特に糖または脂肪酸であってもよい。
有利には、前記生きた微生物は、選択した生物活性食品成分の低減した、さらにはゼロの代謝能力を特徴とする。

本発明によると「低下した代謝能力」とは、発酵中に代謝された（すなわち、こうして培地から消失した）選択した生物活性食品成分の量が、その成分の初期（発酵前）の量の４０％以下であるものである。

これは下記の数式により表される：
Ｑ_r ≧ ０.６Ｑ₀ (１)
式中、
Ｑ_r：生物活性成分の残留量(発酵後の培地中に存在する量)、
Ｑ₀：生物活性成分の初期の量。

生物活性成分の残留量（Ｑ_r）は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）をＭＳ／ＭＳ型検出器と連結した方法により測定することができる。実験手順の１例は、後で実施例中に示される。

好ましくは、前記生きた微生物は、野生型の菌株および／または天然変異株および／または遺伝子工学により得られた突然変異物である。
本発明出願において、「変異株」および「変異体」とは、参考天然菌株から主に選択的突然変異により得られた菌株であって、選択した所望特性、すなわち、上述した選択した生物活性食品成分の代謝能力が低減またはゼロである、を有するものを意味する。

本発明の目的にとって「突然変異物」または「突然変異株」とは、参考菌株から特定部位の突然変異誘発技術によって得られた菌株のことである。このような突然変異物は、上記変異体と同様に、選択した所望特性を有する。

選択的突然変異により天然変異体を得るため、または遺伝子工学を利用して、特にベクターを用いた遺伝子の形質転換により突然変異物を得るための方法は、当業者には知られている。この点について、特にSambrookおよびRussel (2001)の刊行物を参考文献として挙げることができる。特に、当業者はBiswas et al., (1993)に記載された実験手順から選択的突然変異プロトコルについて情報を得ることができよう。

本発明のある特定の態様によると、前記生きた微生物は、生きた細菌、好ましくは生きた乳酸菌である。
好ましくは、前記生きた微生物において、下記から選ばれた少なくとも一つのメカニズムの能力が低減している：
・タンパク質およびペプチドの細胞外代謝系、
・細胞内へのペプチド輸送系、または
・ペプチドの細胞内代謝系。

「代謝および／または輸送メカニズムの低減した能力」とは、上述した代謝および／または輸送メカニズムの能力（または活性）が、発酵中に選択した生物活性成分の約４０％以上の代謝および／または輸送を不可能にするものであることをここでは意味する。

さらにより好ましくは、前記メカニズムは前記生きた微生物において非機能性である。
特に、能力が低減または機能しなくなった前記メカニズムは、細胞内へのペプチド輸送系である。

さらにより具体的には、前記ペプチド輸送系は、ＡＭＩ系（例えば、Garault at al., 2002を参照）またはＯＰＰ系（ラクトバシラス・ブルガリカス(L. bulgaricus)中: Peltoniemi et al., 2002; ラクトバシラス・ラクティス(L. lactis)中: Detmers et al, 1998）である。

本発明において使用しうる生きた細菌は、特に下記の群から選ぶことができる：
・ストレプトコッカス属（Streptococcus）の種、好ましくはストレプトコッカス・テルモフィラス（Streptococcus thermophilus）、
・ラクトバシラス属（Lactobacillus）の種、
・ラクトコッカス属（Lactococcus）の種、および
・ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）の種。

好ましくは、生きた細菌は下記の群から選ばれる：
・2002年1月24日にＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [パスツール研究所、フランス、パリ]）に寄託された番号I-2774のストレプトコッカス・テルモフィラス；
・2004年5月10日にＣＮＣＭに寄託された番号I-3211のストレプトコッカス・テルモフィラス；
・2004年9月16日にＣＮＣＭに寄託された番号I-3301のストレプトコッカス・テルモフィラス；および
・2004年9月16日にＣＮＣＭに寄託された番号I-3302のストレプトコッカス・テルモフィラス。

さらにより好ましくは、この生きた細菌は、2004年5月10日にＣＮＣＭに寄託された番号I-3211のストレプトコッカス・テルモフィラスである。
有利には、本発明の食品は、生きたストレプトコッカス・テルモフィラスおよびラクトバシラス属の種の細菌を少なくとも含有する。

好ましくは、この生きたストレプトコッカス・テルモフィラス細菌は、下記の群から選ばれる：2002年1月24日にＣＮＣＭに寄託された番号I-2774のストレプトコッカス・テルモフィラス；2004年5月10日にＣＮＣＭに寄託された番号I-3211のストレプトコッカス・テルモフィラス；2004年9月16日にＣＮＣＭに寄託された番号I-3301のストレプトコッカス・テルモフィラス；および2004年9月16日にＣＮＣＭに寄託された番号I-3302のストレプトコッカス・テルモフィラス。

本発明に係る食品中の生きた微生物の含有量は変動してもよく、その分野の一般常識に照らして当業者により選択されよう。実際には、好ましくは、例えば、食品１グラムあたりの細菌数が約１０⁷〜１０⁹のオーダーとなるような標準的な総含有量が追求されよう。

本発明のある特定の態様によると、前記選択された生物活性食品成分は封入（マイクロカプセル化）されている。
本発明によれば、「封入された」または「封入」とは、活性成分を微粒子型のビヒクル中にこの活性成分の制御された放出が可能となるように保護する方法の使用を意味する。本発明の場合、活性成分は１種または２種以上の選択された生物活性食品成分からなる。

この封入は、選択した生物活性食品成分が生きた微生物により代謝されるのを回避するのを可能にする点で、本発明にかかるものの補完的な解決手段を与える。
また、そして全く有利には、封入により、例えば、一部の生物活性成分、特に一部のペプチドの強い苦みをいくらかマスキングすることにより、官能的により許容しうる最終製品を得ることが可能となる。

最後に、封入により、選択した生物活性食品成分が分解せずに腸内に達して、それらが腸内でそれらの効果を生ずることができるように損傷せずに腸障壁を通過することが可能となる。

本発明の別の特定の態様によると、食品は、少なくとも１種のデコイ食品成分も含有する。
本発明によると、「デコイ食品成分」なる用語は、生きた微生物に対して栄養分の供給源（特に窒素の供給源）として作用することができる食品成分（好ましくはペプチド、タンパク質、それらの類似物もしくは誘導体、またはそれらの混合物）であって、その生きた微生物を、選択した生物活性食品成分（もちろん、これが優先的に保存しようとする成分である）からそらすように、該微生物によって優先的に代謝されることを意図したものである。すなわち、デコイ成分は微生物に対する栄養分の供給源であって、選択した生物活性成分をできるだけ保持するように意図的に犠牲となるものを意味する。この点に関し、デコイ食品成分は、選択した生物活性成分の輸送の競合的阻害剤として作用する。

上記の２種類の特定の態様を有利に組合わせてもよいことは認められよう。
好ましくは、本発明に係る食品は発酵食品である。
さらにより好ましくは、発酵食品は乳製品または植物性製品である。

本発明によれば、「乳製品」とは、乳（ミルク）に加えて、クリーム、アイスクリーム、バター、チーズおよびヨーグルトといった乳を主成分とする製品；乳清（ホエー）およびカゼインのような二次製品；ならびに主成分として乳または乳の成分を含む任意の加工食品を意味する。

「植物性製品」とは、とりわけ、例えば、豆乳、オート麦乳および米乳を包含する果汁および野菜汁といった、植物ベースから得られた製品を意味する。
さらに、上記の「乳製品」および「植物性製品」の定義のそれぞれは、例えば、乳と果汁との混合物といった乳製品と植物性製品との混合物を含有する任意の製品も包含する。

本発明はまた、上述したような食品の製造方法にも関する。この製造方法では、１種または２種以上の生きた微生物と１種または２種以上の封入された選択した生物活性食品成分とを、前記食品を構成するための混合物に添加する。

１態様によると、前記選択した生物活性食品成を前記混合物に逐次的に順に添加する。
別の有利な態様では、前記選択した生物活性食品成分を前記混合物に同時に添加する。
微生物の培養条件はその微生物に依存し、当業者には知られている。１例として、ストレプトコッカス・テルモフィラスの最適増殖温度は一般にほぼ３６℃〜４２℃の範囲内であり、ラクトバシラス・デルブリュッキイ・スピーシーズ・ブルガリカス（L. delbrueckii spp. bulgaricus）(ヨーグルト中に普通に存在)の場合のこの温度範囲はほぼ４２℃〜４６℃であると特定することができる。

通常、発酵の停止（これは所望の到達ｐＨに依存する）は急冷により行われ、それにより微生物の代謝活性を低下させる。
本発明のある特定の態様によると、該選択した生物活性食品成分を、該食品を構成するための混合物中で直接調製する。これを、選択した生物活性成分の「その場合成」と称する。

その場合成の場合、該生きた微生物を、該選択した生物活性成分のその場での合成前、合成中、または合成後に、該食品を構成するための混合物に添加することが、優先順位をつけずに想定される。

本発明はまた、上述したような食品の機能性食品としての使用にも関する。
「機能性食品」なる用語は、その栄養効果とは別に、生体の１または２以上の目標機能に有利に影響する食品を意味する。従って、機能性食品は、その食品の通常量を摂取した消費者に健康状態の改善および／または安寧および／または疾病発症の危険性の低減を生ずることができる。「機能性食品」の活性（作用）の例として、抗がん活性、免疫促進（増強）活性、骨健康増進活性、抗ストレス活性、オピエート（阿片様の抑制）活性、抗高血圧活性、カルシウムの生物学的利用能向上活性、および抗菌活性を挙げることができる（Functional Food Science in Europe, 1998）。

かかる機能性食品は、人間用および／または動物用のものとすることができる。
本発明はまた、選択した生物活性食品成分の代謝能力が低減した生きた微生物を、該選択した生物活性食品成分を該生きた微生物による代謝から防護するために食品中に使用することにも関する。

本発明を添付図面により説明するが、それらは制限を意図したものではない。
本発明の他の特徴および利点は、以下の実施例を読むと明らかとなろう。実施例は例示のみを目的として示すものである。

実施例１：本発明を適用しない選択した生物活性成分の使用
１.１）ラクティウム(R)加水分解物中に含有される生物活性αＳ１[91-100]ペプチドによる例
しばしば粉末形態で供給されるペプチドまたはタンパク質型の成分の使用は、この成分を、調合乳 (diary "mix")を製造（ミルクを粉末化）する時に、衛生用熱処理（すなわち、９５℃、８分間）の前、従って発酵前に添加すると、より簡単となる。この場合、活性ペプチドが代謝される危険性は非常に高い。これは、例えば、生物活性ペプチド（カゼインαＳ１のフラグメント91-100）を含有するラクティウム(R)（アングルディア社、フランス）のような機能性成分を使用する場合にそうである。

手順
脱脂粉乳を１２０ｇ／Ｌに水和し、１.５ｇ／Ｌのラクティウム(R)（約３０ｍｇ／Ｌの生物活性αＳ１[91-100]ペプチドに対応）を添加し、次いで９５℃で８分間の低温殺菌処理（パスチャリゼーション）を行うことにより培地を調製した。

乳酸発酵素を０.０２％の割合で添加し、使用発酵素に最適の温度（３７〜４２℃）でｐＨが４.７０になるまで発酵を行った。
残留ペプチドの分析、特に生物活性αＳ１[91-100]ペプチドの分析は、ＭＳ／ＭＳ型の検出器と連結させた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法により、次のように実施した。

・水、メタノールおよびトリフルオロ酢酸（５０／５０／０.１％）の混合液中に発酵させた培地を約１：６の比率で希釈することによりサンプルを調製した。遠心分離後の上清が発酵培地のペプチド含有量の表示サンプルとなった。

・このサンプルを、ペプチド分析に適したウォーターズ・シメトリー(R) (Waters Symetry) のカラム（５μｍ、２.１×１５０ｍｍ、WAT056975、Waters France社、5 rue Jacques Monod, 78280 Guyancourt）を装着したアギレント (Agilent) 1100 型ＨＰＬＣシステム (Agilent Technologies France社、1 rue Galvani, 91745 Massy Cedex, フランス)に、４０℃の温度および０.２５ｍＬ／分の流量で注入した。ペプチドの溶離は、常法により、溶媒Ａ（水＋ギ酸０.１０６％）中の溶媒Ｂ（アセトニトリル＋ギ酸０.１００％）の増大する濃度勾配で、所望の解像度に応じて４０分間から２時間の時間にわたって行った。

・検出は、ペプチド含有量の全体分析(ＭＳ−ＭＳモード)用、またはその固有フラグメントからあるペプチドの正確かつ特異的な定量用にセットされた、例えば、エスクァイア（Esquire）3000+ (Bruker Daltonique社、rue de l'Industrie, 67166 Wissembourg Cedex)のようなイオントラップ装置と共に、ＭＳ／ＭＳ型の特異的検出器を用いて行った。例えば、αＳ１[91-100]ペプチドを、その質量から単離し（質量６３４.５Ｄａの二重荷電イオン）、フラグメンテーション後のその固有娘イオン（ｍ／ｚ＝９９１.５Ｄａ、７７１.５Ｄａおよび６５８.３Ｄａのイオン）の強度からそれを定量した。より一層特異的なやり方では、同じ二重に重水素化された合成ペプチド（９９３.５Ｄａの固有フラグメント）からなる内部標準により、マトリックスに関係する可能な干渉を考慮し、それを排除することが可能であった。

結果を図１に示す。
この段階、すなわち、菌株I-2783（2002年1月24日にＣＮＣＭに寄託）、I-2774（2002年1月24日にＣＮＣＭに寄託）、I-2835（2002年4月4日にＣＮＣＭに寄託）およびI-1968（1998年1月14日にＣＮＣＭに寄託）の混合物からなる発酵素、またはＹＣ−３８０（Chr. Hansen SA社、Le Moulin d'Aulnay, BP64, 91292 ARPAJON Cedex フランス）のような発酵素による発酵の前の段階でペプチドを使用すると、生物活性αＳ１[91-100]ペプチドの９５％以上が発酵後には消費されたことが実証された。

これらの知見は、上記の例に従った生物活性ペプチドの配合は、消費者が望む効果を認めることができるよう経時的に十分に安定した量の生物活性ペプチドおよび／またはタンパク質を添加した食品、特に乳製品、を得るのには、そのままでは適用できないことを示している。

１.２）別の選択した生物活性ペプチドによる例
結果を図２および３に示す。
ラクティウム(R)成分は多くの他のペプチドを含有しており、その一部は潜在的な生物学的活性を有する（例えば、DMV International社からＣ１２成分としても販売されているαS1カゼインのフラグメント23-24）。ラクティウム(R)の添加により供給されたペプチドの実質的に全ての種類が発酵中にかなり消費されてしまうことは留意点として興味深い。

それらの出所（多様なαＳ１−、αＳ２−、κ−およびβ−カゼインから生ずる）およびそれらのサイズ（２〜３残基から１２残基およびそれ以上まで）に関係なく、全てのペプチドが発酵プロセス中に全体的に消費されてしまう。

１.３）生物活性αS1[91-100]ペプチド（ラクティウム(R)）の他の発酵素との併用
この現象が上記１.１）節で使用した２種類の発酵素に特異的ではないことを証明するために、主要な工業用発酵素ならびにこれらの発酵素の組成中に含まれる各種の純菌株を同じ試験法に基づいて試験した：粉乳から戻した還元乳にラクティウム(R)を１.５ｇ／Ｌの量で添加したものを標準的条件下で発酵させた（３７〜４２℃の範囲内の発酵素に最適の温度、発酵はｐＨ４.７で停止、２回反復）。生物活性αＳ１[91-100]ペプチドの含有量の分析を発酵の前後のサンプルについて行った。

純菌株について得られた結果を次の表３に示す。

上記表３において、使用した純菌株はそれらのＣＮＣＭ（パスツール研究所、フランス、パリ）での寄託番号と寄託日とで表示されており、この表は、１.５ｇ／Ｌのラクティウム(R)を含有する調合乳の発酵中の各種の工業用菌株および発酵素による生物活性αＳ１[91-100]ペプチドの消費を示している。

表３は、試験した発酵素および菌株の全てが、標準的な調合乳の発酵中に生物活性αＳ１[91-100]ペプチドの９４％から１００％を代謝してしまうことを示している。従って、この成分を使用しても、消費者にある効果を生じさせるのに経時的に十分に安定した量の生物活性ペプチドおよび／またはタンパク質を含有する食品、特に乳製品を製造することは標準的条件下では不可能である。

また、この現象がラクティウム(R)成分に固有なものではないことを証明するために、発酵素と生物活性ペプチドを含有する他の成分とのいくつかの組み合わせについて、同じ試験（粉乳からの還元乳＋１.５ｇ／Ｌの量の試験成分、標準的条件下で発酵、発酵はｐＨ４.７で停止、２回反復）を用いて検討した。試験した各種組み合わせを次の表４に示す。

DMV International社製の成分Ｃ１２およびＣＰＰは、それぞれ高血圧のコントロールおよびミネラルの吸収を目的とする生物活性ペプチドを含有する乳タンパク質の加水分解物である。

全ての実験において、試験した全ての発酵素が、ペプチドの種類やサイズに関係なく、ペプチドを代謝する大きな能力を有することがわかる。
１.４）発酵後の添加
上で検討した手順に対する論理的な別法は、発酵後に機能性成分を、例えば、発酵塊に風味づけするのに用いるシロップと共に導入することである（「遅延差別化」型手法）。このプロトコルに従って同じ量のラクティウム(R)を使用すると、図４に示した結果になった。

図４に示したように、発酵後に低温（４℃）で添加した場合でも、活性ペプチド（最終製品１ｋｇあたりラクティウム(R)１.５ｇに等しい量で供給）は貯蔵中にすぐに分解され、賞味期限（ＢＢＤ）までに初期量の３０〜４０％しか残らない。

従って、最終製品中の生きた乳酸菌の集団が最終製品の貯蔵中に生物活性ペプチドを代謝し続けるので、わずか１０日後には（その賞味期限が２８日である生製品について）、αＳ１[91-100]ペプチドの３５〜５０％が消失しており、これは消費者が求める効果を得るにはやはり許容できない。

１.５）選択した生物活性成分を含有する発酵乳製品の加熱処理
この場合、αＳ１[91-100]ペプチドの安定性を確保することができる（図５）が、最終製品の総合品質が犠牲となる。この解決策は次のような多くの難点を生ずる：
・発酵乳塊の高温殺菌は熱処理前に添加される安定剤（ペクチン、デンプン、カラジーナン等）の使用を伴い、従ってプロセスを複雑にすると共に、調合コストを著しく増大させる；
・工業用生産ラインがより複雑となり、より大きな比投資額を必要とする；
・製品は、もはや生きた発酵素を含有する製品に関係する称号（品質標準）から得られる利益を享受できず（ヨーグルト）、結果として乳酸発酵素の摂取に伴う利益を失うであろう；
・官能性（感覚刺激）衝撃（一般にマイナス方向）が顕著である。

実施例２：本発明を適用した選択した生物活性成分の使用
工業用発酵素について、ペプチドαＳ１[91-100]を消費しないその能力に基づいてスクリーニングを行った。試験した３０種の発酵素のうち、一つを除いて全部が発酵中にペプチドαＳ１[91-100]の実質的に全部を消費する。その例外であった発酵素は、菌株I-２７７４だけとギ酸エステルとを含有する発酵素であり、菌株Ｉ−２７７４は微生物学的に異例である。

別の菌株を試験した：それは1995年10月24日にＣＮＣＭに寄託された菌株I−１６３０（それ自体はペプチドを消費する）の天然変異株である。この変異株I−３２１１（2004年5月10日にＣＮＣＭに寄託）は、ペプチド輸送系（ＡＭＩ系）を有していない天然突然変異物の発生により得られた。この変異株がペプチドαＳ１[91-100]を消費せず、また他のペプチドの大部分も消費しないことが効果的にわかってきている。パイロットレベル、さらには工業的レベルで試験した適用例として、成分ラクティウム（Lactium）(R)(アングレディア<Ingredia>社)の形態で供給された生物活性ペプチドαＳ１[91-100]の利用が、菌株I−２７７４およびギ酸エステルを含有する発酵素を用いることにより成功裏に実施することができたことがある。図６は、得られた安定性の結果を示す。

さらにより目覚ましいことに、このペプチドは、図７に示すように、発酵前に導入することが有利に可能であった（それにより工業的実施が単純化される）。
すなわち、上記発酵素では、選択したペプチドの発酵（約４１℃で１２時間）中の消失は初期量の３〜４％を超えないのに対し、他の発酵素ではペプチドの実質的に全量を消費する。表４に記載したのと同一の条件下で、菌株Ｉ−２７７４およびＩ−３２１１は、発酵後に８５％より大きなαＳ１[91-100]の生存レベルを効果的に生ずる。

菌株Ｉ−２７７４およびＩ−３２１１が示すペプチド代謝能力の著しい低減により、とりわけ確証試験の課題となってきた多くの商業用加水分解物を包含する任意の種類の生物活性ペプチドの使用がより広範囲に可能となる。従って、表４に記載した実験は発酵素／菌株Ｉ−２７７４およびＩ−３２１１の使用に成功裏に拡張された。

乳酸発酵中のラクティウム(R)成分に含有される生物活性αＳ１[91-100]ペプチドの消失を示すＬＣ−ＭＳクロマトグラム。ＭＳ／ＭＳ検出器は、ｍ／ｚ＝６３４.５Ｄａ（二重荷電αＳ１[91-100]ペプチドの質量）のイオンシグナルだけを検出するように調整。これは、フラグメンテーション後に、ｍ／ｚ＝９９１.５Ｄａ、７７１.５Ｄａおよび６５８.３Ｄａの娘イオン（αＳ１[91-100]ペプチドに固有のフラグメント）を生ずる。菌株I-2783（2002年1月24日にＣＮＣＭに寄託）、I-2774（2002年1月14日にＣＮＣＭに寄託）、I-2835（2002年4月4日にＣＮＣＭに寄託）およびI-1968（1998年1月14日にＣＮＣＭに寄託）の混合物からなる発酵素による調合乳(diary mix)の発酵前および発酵後のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるラクティウム(R)成分の主成分ペプチドの同定および定量。発酵後、該ペプチドは痕跡量で見出されるだけであり、基線と見分けがつかない。記号？は、配列の同定が可能ではなかったか不確実であることを意味し、その場合はペプチドの質量だけを報告する。ハンセン（Hansen）ＹＣ−３８０乳酸発酵素でｐＨ４.７まで発酵する前(1)と発酵後(2)の、ＤＭＶＣ１２ (R)加水分解物１.５ｇ／Ｌを含有する調合乳のペプチドプロファイル（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラム）の比較。生物活性のＣ１２ペプチド（αＳ１[23-34]フラグメント）を含む、加水分解物ペプチドの実質的に全てが該発酵素菌株による代謝後に消失した。菌株I-2783、I-2774、I-2835およびI-1968を含有する発酵素により発酵させた発酵生成物９５％と、αＳ１[91-100]ペプチドを含有する香味づけ砂糖シロップ５％とからなる最終製品における１０℃での貯蔵中の生物活性αＳ１[91-100]ペプチドの残留含有量の変化を示す曲線。本実験は４つの独立した試験:Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４の形態で実施された。生物活性αＳ１[91-100]ペプチドを発酵後の発酵生成物に添加し、それを次いで７５℃で１分間熱処理した後、賞味期限まで１０℃で貯蔵した時の該ペプチドの残留含有量の変化を示す曲線。菌株I-2774とギ酸エステルとを含有する発酵素とにより発酵させた発酵生成物９５％と、αＳ１[91-100]ペプチドを含有する香味砂糖シロップ５％とからなる最終製品（該ペプチドは最終製品中１.５ｇ／ｋｇの量のラクティウム(R)の形態で供給）における１０℃で賞味期限まで貯蔵中の生物活性αＳ１[91-100]ペプチドの残留含有量の変化を示す曲線。菌株I-2774とギ酸エステルとを含有する発酵素により発酵させた乳塊からなる最終製品中の、発酵前に添加された生物活性αＳ１[91-100]ペプチドの残留含有量の変化を示す。

Claims

以下から選ばれる１種もしくは２種以上の生きた微生物と、
・2002年1 月24日にＣＮＣＭ[Collection Nationale de Cultures des Microorganismes ( パスツール研究所、フランス、パリ)]に寄託された番号I-2774のストレプトコッカス・テルモフィラス；
・2004年5 月10日にＣＮＣＭに寄託された番号I-3211のストレプトコッカス・テルモフィラス；
以下から選ばれる少なくとも１種の選択した生物活性食品成分とを含有する食品であって：
・タンパク質、
・ペプチド、
・それらの類似物もしくは誘導体、ならびに
・それらの混合物、
該生きた微生物が、該選択した生物活性食品成分の低減した代謝能力を有することを特徴とする食品。
前記選択した生物活性食品成分が下記から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の食品：αＳ１[91-100]ペプチド、Ｃ６−α_S1[194-199] ペプチド、Ｃ７−β[177-183] ペプチド、Ｃ12−α_S1[23 −34] ペプチド、カゼインホスホペプチド類、α−カゾモルフィン、α- カゼインエキソルフィン、カゾキニン、β−カゾモルフィン、カゼインマクロペプチド、グリコマクロペプチド、カゾキシン、カゾプラテリン、フラグメント50-53 、β−ラクトルフィン、ラクトフェロキシン、Val-Pro-Pro ペプチド、Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln ペプチド、Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leu ペプチド、Tyr-Pro ペプチド、Ile-Pro-Pro ペプチド、それらのフラグメント、類似物および誘導体、それらを含むタンパク質および／もしくはペプチド、ならびにそれらの混合物。
前記生きた微生物が野生型菌株および／または天然変異株および／または遺伝子工学により得られた突然変異物であることを特徴とする、請求項１または２に記載の食品。
前記生きた微生物において、下記から選ばれた少なくとも一つのメカニズムの能力が低減していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかの項記載の食品：
・タンパク質およびペプチドの細胞外代謝系、
・細胞内へのペプチド輸送系、または
・ペプチドの細胞内代謝系。
前記メカニズムが前記生きた微生物において非機能性であることを特徴とする、請求項４に記載の食品。
前記メカニズムが細胞内へのペプチド輸送系であることを特徴とする、請求項４または５に記載の食品。
前記ペプチド輸送系がＡＭＩ系またはＯＰＰ系であることを特徴とする、請求項６に記載の食品。
前記選択した生物活性食品成分が封入されていることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の食品。
発酵食品であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の食品。
乳製品または植物性製品であることを特徴とする、請求項９に記載の食品。
前記生きた微生物および前記選択した生物活性食品成分を、前記食品を構成するための混合物に逐次的な順序で添加することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の食品の製造方法。
前記生きた微生物および前記選択した生物活性食品成分を、前記食品を構成するための混合物に同時に添加することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の食品の製造方法。
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の食品の機能性食品としての使用。