CN101060786B - 使用代谢能力降低的微生物保护生物活性食物成分 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有活微生物和感兴趣的生物活性食物成分的食品,其中组织所述活微生物和所述感兴趣的生物活性食物成分,使得降低所述活微生物对所述生物活性成分的代谢。更具体而言,本发明涉及降低代谢生物活性成分能力的活微生物的用途。

Description

使用代谢能力降低的微生物保护生物活性食物成分
技术领域
本发明涉及含有一种或多种活微生物和至少一种感兴趣的生物活性食物成分的食品,其中使用所述活微生物和所述感兴趣的生物活性食物成分,使得所述微生物对所述生物活性成分的代谢降低。
背景技术
食物成分市场,尤其是生物活性肽或功能性肽的市场(即对消费者而言,局部地在消化道中或在进入循环系统后遥远地在体内具有有益活性的肽)许多年来已经全面成熟。
生物活性肽被定义为在它们的原始蛋白质中无活性,但是一旦通过酶作用释放,便具有特殊性能的氨基酸序列。它们还被称为功能性肽。这些生物活性肽尤其能对消化系统、身体的防御(例如抗微生物或免疫调节作用)、心血管系统(尤其是抗血栓形成或抗高血压作用)和/或神经系统(例如阿片型的镇静和止痛作用)产生作用(见下面的表1和2)。
下面的表1列举通过人乳和牛乳蛋白水解释放的主要功能性肽。
表1
 
原始蛋白质 功能肽 乳来源** 描述的活性
酪蛋白α α-酪吗啡肽酪蛋白α-外啡肽酪激肽 CCC 阿片活性阿片活性抗高血压活性
酪蛋白β β-酪吗啡肽酪激肽CPP HCHCHC 阿片活性免疫调节活性+抗高血压活性作用于矿物
酪蛋白κ CMP=GMPcasoxinecasoplatellins CHCC 胃肠动力调节和消化激素释放调节阿片拮抗剂抗血栓形成活性
α-乳白蛋白 片段50-53 HC 阿片活性
β-乳球蛋白 β-乳吗啡样肽 C 阿片活性+抗高血压活性
乳铁蛋白乳运铁蛋白 lactoferroxin CH 阿片拮抗剂
()氨基酸序列不完全相同
(**)H:人乳/C:牛乳
下面的表2比较了迄今已知的乳源功能性肽的主要生理活性。
Figure S05839975420070524D000031
通常通过植物蛋白(例如大豆蛋白)或动物蛋白(例如酪蛋白或乳清蛋白)的水解得到这些肽,该水解是通过酶和/或发酵方法产生的,通常伴随活性部分的浓缩,这个步骤通常对提供“健康益处”目标是必需的。健康益处的这些肽的生产和使用已经是大量文献的主题(尤其见Danone World Newsletter No.17,September1998)。
能接受这样的成分的食物载体中,由于发酵乳制品的健康益处归因于存在发酵剂和发酵产品(即来源于用乳酸菌转化存在于乳中的底物的分子),主要考虑发酵的乳制品。至今,科学界特别考虑发酵剂的特性。最近研究者开始对发酵产品产生兴趣,所述发酵产品中的某些肽占据特定的位置,因为它们是众多的并且是特定的生物信使。因此发酵的乳制品似乎特别适于用作水解例如从乳品底物,例如酪蛋白或乳清蛋白得到的生物活性肽的载体。
然后出现了主要的问题:用于生产新鲜乳制品(例如酸奶、发酵的乳特制品、发酵的基于乳的饮料等)的微生物,尤其是乳酸菌通常能消耗肽以满足它们的营养需求,更尤其是满足它们的氮需求。这在下文中称为“肽的代谢”。具体而言,乳酸菌具有几个降解和/或转运系统,所述降解和/或转运系统允许它们代谢肽,然后使它们从介质中消失:
1/蛋白水解系统(PRT壁蛋白酶),其切开蛋白质和巨肽以方便它们的同化作用(“细胞外代谢系统”)。
2/向细胞内转运的系统,其中之一对大小接近10个氨基酸的寡肽具有特异性,另外一个适用于转运二肽和三肽(乳杆菌具有另外的三肽透性酶系统)(“向细胞内转运的系统”),和
3/能将肽降解成氨基酸的细胞内酶系统(含有约15种内源性肽酶和外源性肽酶)(“细胞内代谢系统”)。
假如乳中自然存在的肽量相对于乳酸菌的需求量太小,通常通过提供肽的补充物来加速它们的生长。然后这些将在发酵期间被完全消耗掉。
总之,由于:(i)乳酸菌的氮需求,其中肽枸成乳中的主要来源,(ii)这些细菌有效消耗肽的能力,和(iii)发酵的基于乳的产品中大量乳酸菌的生存,最高到有效期限时,利用发酵的乳制品中基于功能性肽的成分是较困难的,或甚至不可能,因为这些成分通常在发酵期间,或甚至在到达有效期限的产品储藏期间被乳酸菌消耗。
此外,由细菌引起肽的“不合时宜的”代谢引起的这种降解问题不仅对于给定的肽不是特异性的,而且对于特定的发酵剂(或可以发酵的微生物,优选细菌)也不是特异性的。
这是普遍的问题,不限于所考虑的肽和微生物。
例如提及生物活性肽αS1[91-100]的情况(见欧洲专利EP 0 714 910;尤其是Ingredia公司:51-53,Avenue Fernand Lobbedez BP 946 62033Arras Cedex,法国,以商品名
Figure S05839975420070524D00009140455QIETU
出售的乳蛋白水解产物中含有的具有松弛特性的肽)。因此,申请人观察到在成品储藏期间成品中乳酸菌群继续代谢生物活性肽,作用仅仅10天后(对于有效期限是28天的新鲜产品),约35%到55%的生物活性肽αS1[91-100]已经消失,这已经完全不能给消费者提供“健康”作用(数据未显示)。
因为生物活性肽的消耗是发酵剂代谢活性的结果,可以预想通过破坏所有的或部分微生物来减少这种现象,例如通过适当的热处理(热杀菌或巴氏杀菌)。在这种情况下,可能保留生物活性肽αS1[91-100](例如在75℃加热约1分钟后)。
然而,这样的溶液具有许多缺点:
-热杀菌发酵的乳品物质必须在加热之前添加使用稳定剂(果胶、淀粉、角叉菜胶等),使得过程复杂化并且实际上增加了配方的成本;
-工业生产线更复杂并且需要较大的特殊投资;
-产品不再受益于与含有活发酵剂(例如酸奶)的产品相关的名称,结果失去了与消耗乳酸发酵剂相关的利益;和
-通常负面的感官影响很显著。
因此,需要含有活微生物例如酸奶和一种或多种感兴趣的生物活性食物成分的食品,其中保护这些感兴趣的生物活性食物成分免于被所述活微生物代谢,而且同时保留食品的感官质量。
发明内容
通过本发明,申请人提供了可满足现有需求的解决方案。
因此,本发明的一个主题是含有一种或多种活微生物和至少一种感兴趣的生物活性食物成分的食品,其特征在于,使用所述活微生物和所述感兴趣的生物活性食物成分,使得所述活微生物对所述生物活性成分的代谢降低。
因此,申请人已经能展示能有效地保护一种或多种感兴趣的生物活性食物成分免于被活微生物代谢,只要一种和另一种使用条件适当。
这样的适当的使用条件可使用多种手段,包括:
a)使用代谢生物活性成分的能力已被降低的活微生物;和/或
b)向活微生物施用故意“在牧场传递”的诱饵(decoy)食物成分;和/或
c)使用生物活性成分的物理性保护,尤其是通过包封它们。
在此方面应当指出,一种或多种或甚至所有的这些手段可以在相同食品中有利地组合。
如前面的一般说明中简要指出的,根据本发明,术语“代谢的”或“代谢”旨在表示通过一种或多种活微生物转化或降解底物,目的是将其作为营养物源消耗,并且最后结果是其或多或少全部从介质中消失。
用于本发明的目的,如果与一种成分的代谢低于当所述成分没有被本发明中提供的至少一种手段保护时,该相同成分的代谢有所降低,则该成分的代谢被“降低”了。
有利地,并且理想地,这种降低了的代谢趋向于零,或甚至是零,相当于所述成分的代谢很少,近乎没有,或甚至没有。
根据本发明的一个具体实施方案,所述食品制备3周后,相对于刚刚制备后产品中存在的感兴趣的生物活性食物成分量,所述食品中感兴趣的生物活性食物成分的剩余量为约50%到100%。
优选地,所述剩余量为约80%到100%。
根据本发明,短语“所述食品中感兴趣的生物活性食物成分的剩余量”旨在表示当所述产品在适当储藏条件(例如,对于新鲜产品为约4℃到10℃)下保持3周时,相对于开始时,即产品刚刚生产后其中存在的感兴趣的生物活性食物成分的百分率,所述食品中存在的感兴趣的生物活性食物成分的百分率。
根据本发明的一个具体实施方案,所述感兴趣的生物活性食物成分选自:
-蛋白质,
-肽,
-它们的类似物或衍生物,和
-它们的组合。
优选地,所述感兴趣的生物活性食物成分选自:生物活性肽αS1[91-100](见欧洲专利EP 0 714 910)、肽C6-αS1194-199(见美国专利US 6 514 941)、肽C7-β177-183(见美国专利US 6 514 941)、肽C12-αS123-34(见美国专利US 6 514 941)、酪蛋白磷酸肽、α-酪吗啡肽、α-酪蛋白、外啡肽(exorphin)、酪激肽、β-酪吗啡肽、酪蛋白巨肽(CMP),还称为糖巨肽(GMP)或酪蛋白糖巨肽(CGMP)、casoxine、casoplatellins、片段50-53、β-乳吗啡样肽、lactoferroxin、肽Val-Pro-Pro(见欧洲专利EP 0 583 074)、Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln(见专利申请EP 0 737 690)、Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leu(见专利申请EP 0 737 690)、Tyr-Pro(见专利申请EP 1 302 207和专利EP 0 821 968)、Ile-Pro-Pro(见Nakamuraet al.,1995;和日本专利JP 6 197 786),它们的片段、类似物和衍生物,含有它们的蛋白质和/或肽以及它们的组合(回顾,尤其见Danone World Newsletter No.17,September1998)。
甚至更优选,所述感兴趣的生物活性食物成分选自:生物活性肽αS1[91-100],其片段、类似物或衍生物,含有它们的蛋白质和/或肽以及它们的组合。
术语“类似物”指初始化合物(在此情况下指蛋白质或肽)的任何经修饰形式,所述经修饰形式可能是天然的或合成的,其中一个或多个原子(例如碳、氢或氧原子)或杂原子(例如氮、硫或卤素)已被添加到初始化合物的结构中或从初始化合物的结构中除去,从而得到新分子化合物。
用于本发明的目的,“衍生物”是具有相似性或含有与参照化合物(蛋白质或肽)共同的结构单元的任何化合物。一方面,该定义还包括某些化合物,其单独或与其它化合物一起可作为通过一个或多个化学反应合成参照化合物的前体或中间产物,另一方面,该定义还包括可从所述参照化合物单独或与其它化合物一起通过一个或多个化学反应形成的化合物。
因此,“衍生物”的上述定义至少包含蛋白质和/或肽的水解产物,尤其是胰蛋白酶水解产物、水解产物级分以及水解产物和/或水解产物级分的混合物。
此外,上面提及的术语“类似物”和“肽或蛋白质的衍生物”包括,例如糖基化或磷酸化的肽或蛋白质,或者经过任何化学基团接枝的肽或蛋白质。
根据本发明的另一个实施方案,所述感兴趣的生物活性食物成分尤其可以是糖或脂肪酸。
有利地,所述活微生物的特征在于代谢感兴趣的生物活性食物成分的能力有所降低或甚至是零。
根据本发明,“代谢的能力降低”是使得发酵期间代谢的感兴趣的生物活性成分量(因此从介质中消失)小于或等于成分起始量(发酵之前)的40%。
这在数学上通过下式来反映:
Qr≥0.6Qo(1)
其中:
Qr:剩余的生物活性成分的量(存在于发酵后的介质中)
Qo:生物活性成分的初始量。
可通过与MS/MS型检测器偶联的HPLC液相色谱来测量生物活性成分的剩余量Qr。下面的实施例中给出实验程序的实例。
优选地,所述活微生物是野生株和/或天然变体和/或通过基因工程得到的突变体。
在本专利申请中,术语“变异株”和“变体”旨在表示主要通过选择性突变从参照株得到的具有感兴趣的期望性能,即上述的代谢所述感兴趣的生物活性食物成分的能力降低或为零的菌株。
用于本发明的目的,“突变体”或“突变株”是由参照株通过定点诱变技术得到的菌株。与上述定义的变体相似,这样的突变体具有感兴趣的期望性能。
通过选择性突变得到天然变体的技术,或通过基因工程,尤其是使用载体通过基因转化得到突变体的技术是本领域技术人员公知的。在此方面,尤其可参考出版物Sambrook和Russel(2001)。具体而言,本领域技术人员可从Biswas et al.(1993)描述的试验操作中得到选择性突变方案的启示。
根据本发明的一个具体实施方案,所述活微生物是活的细菌,优选活的乳酸菌。
优选地,所述活细菌中选自下述的至少一种机制的能力降低了:
-蛋白质和肽的细胞外代谢系统,
-将肽转运到细胞内的系统,或
-肽的细胞内代谢系统。
短语“代谢和/或转运机制的能力降低”在此表示上述的代谢和/或转运机制的能力(或活性)不允许其在发酵期间代谢和/或转运约40%以上的感兴趣的生物活性成分。
甚至更优选地,所述机制在所述活菌中是非功能性的。
具体而言,所述降低或非功能性能力的机制是将肽转运到细胞内的系统。
更具体而言,所述肽转运系统是AMI系统(例如见Garault et al.,2002)或OPP系统(在保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)中:Peltoniemiet al.,2002;在乳杆菌(L.lactis)中:Detmerset al.,1998)。
可用于本发明中的活细菌尤其可选自:
-链球菌属(Streptococcus spp),优选嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus);
-乳杆菌属(Lactobacillus spp);
-乳球菌属(Lactococcus spp);和
-双歧杆菌属(Bifidobacterium spp)。
优选地,所述活细菌选自:
-嗜热链球菌,其于2002年1月24日以I-2774号保藏在CNCM(国家微生物菌种保藏中心(Collection nationale de cultures desmicroorganisms)(法国巴黎巴斯德研究所);
-嗜热链球菌,其于2004年5月10日以I-3211号保藏在CNCM;
-嗜热链球菌,其于2004年9月16日以I-3301号保藏在CNCM;
-嗜热链球菌,其于2004年9月16日以I-3302号保藏在CNCM;
甚至更优选地,所述活细菌是2004年5月10日以I-3211号保藏在CNCM的嗜热链球菌。
有利地,本发明的食品至少包含活的嗜热链球菌和乳杆菌属细菌。
优选地,所述活的嗜热链球菌选自2002年1月24日以I-2774号保藏在CNCM的嗜热链球菌、2004年5月10日以I-3211号保藏在CNCM的嗜热链球菌、2004年9月16日以I-3301号保藏在CNCM的嗜热链球菌、2004年9月16日以I-3302号保藏在CNCM的嗜热链球菌。
本发明的食品中活微生物含量可以变化,并且将由本领域技术人员根据他在本领域中的一般知识进行选择。实际上,优选寻找标准总含量,例如以每克食品中107~109个细菌的数量级。
根据本发明的一个具体实施方案,所述感兴趣的生物活性食物成分被包封起来。
根据本发明,术语“包封的”和“包封”旨在表示在微粒型的赋形剂中使用保护活性成分的方法以使得允许控制释放这个活性成分。在这种情况下,所述有效成分由一种或多种感兴趣的生物活性食物成分组成。
这种包封提供了对本发明的补充解决方案,因为其允许所述感兴趣的生物活性食物成分避免被所述活微生物代谢。
此外,非常有利地,包封允许得到感官上更可接受的成品,例如通过掩盖某些生物活性成分,尤其是某些肽的或多或少的强烈苦味。
最后,包封允许感兴趣的生物活性食物成分到达小肠而不被降解,并且不受伤害地穿过小肠屏障,以便在那里发挥它们的作用。
根据本发明的另一个具体实施方案,所述食品还包含至少一种诱饵食物成分。
根据本发明,术语“诱饵食物成分”用于表示能用作活微生物的营养源(尤其是氮源)的食物成分(优选地,肽、蛋白质、它们的类似物或衍生物以及它们的组合),并且旨在优先被所述微生物代谢,以便使所述微生物转为显然旨在优先保存的感兴趣生物活性成分。因此,诱饵成分表示微生物的营养源,其被故意消耗,以便尽可能多地保留所述感兴趣的生物活性成分。在此方面,所述诱饵食物成分起到该感兴趣的生物活性成分转运的竞争性抑制剂作用。
应当指出,可有利地组合上述的具体实施方案。
优选地,本发明的食品是发酵产品。
更优选地,所述发酵的食品是乳制品或植物性产品。
根据本发明,术语“乳制品”用于表示乳,以及基于乳的产品,例如奶油、冰淇淋、黄油、乳酪或酸奶;二级产品例如乳清或酪蛋白;还包括含有乳或乳组分作为主要成分的任何制备的食物。
术语“植物性产品”特别用于表示从例如水果汁和植物汁,包括大豆汁、燕麦汁或水稻汁的植物基本成分(plant base)中得到的产品。
此外,“乳制品”和“植物性产品”的上述定义各自包含基于乳制品和植物性产品的混合物的任何产品,例如乳和水果汁的混合物。
本发明的一个主题还包括制备上述食品的方法,其中将一种或多种活微生物和一种或多种被包封的感兴趣生物活性食物成分添加到意图构成所述食品的混合物中。
根据一个实施方案,相继地将所述感兴趣的生物活性食物成分添加到所述混合物中。
可替代地并且优选地,同时将所述感兴趣的生物活性食物成分添加到所述混合物中。
微生物生长条件取决于所述微生物,并且是本领域技术人员公知的。作为实例,应当指出,嗜热链球菌的最适宜生长温度通常为约36℃到42℃;德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckii spp.Bulgaricus)(典型地存在于酸奶中)的最适宜生长温度通常为约42℃到46℃。
作为一般规则,通过快速冷却可实现发酵停止,这可使得微生物的代谢活性降低,这种发酵停止取决于达到的pH。
根据本发明的一个具体实施方案,直接在意图构成所述食品的混合物中制备所述感兴趣的生物活性食物成分。这被称为原位合成所述感兴趣的生物活性食物成分。
在原位合成的情况中,可预想在原位合成所述感兴趣的生物活性食物成分之前、期间或之后,将所述活微生物添加到意图构成所述食品的混合物中,其中没有偏好性。
本发明的一个主题还包括将上述食品用作功能性食物。
术语“功能性食物”意指不依赖其营养作用,有利地影响身体的一个或多个靶功能的食品。因此,它可导致食用正常量所述产品的消费者健康和/或舒适状况的改善和/或降低发病的风险。可特别提及的“功能性食物”的活性实例包括抗癌、免疫刺激、促进骨骼健康、抗应激、阿片、抗高血压、增强钙利用度或抗微生物活性(Functional Food Sciencein Europe,1998)。
可将这样的功能性食物用于人和/或动物。
本发明的一个主题还包括在食品中使用对感兴趣的生物活性食物成分的代谢能力降低的活微生物,以保护所述感兴趣的生物活性食物成分免于被所述活微生物代谢。
附图说明
通过下面附图举例说明本发明,所述附图不以任何方式限制本发明。
图1:LC-MS色谱图举例说明乳酸发酵期间包含在成分
Figure S05839975420070524D000171
中的生物活性肽αS1[91-100]的消失。调节MS/MS检测器,使得仅仅显示m/z离子=634.5Da(双带电肽αS1[91-100]的质量)的信号,它在片段化后产生m/z=991.5Da;771.5Da;658.3Da(肽αS1[91-100]的特征性片段)的子离子。
图2:乳品“混合物”用由菌株I-2783(2002年1月24日保藏在CNCM)、I-2774(2002年1月14日保藏在CNCM)、I-2835(2002年4月4日保藏在CNCM)和I-1968(1998年1月14日保藏在CNCM)的混合物组成的发酵剂进行发酵前和发酵后,通过LC-MS/MS鉴定和量化成分
Figure S05839975420070524D000172
中的主要肽。发酵后,发现这些肽仅仅是痕量的并且合并到基线中。“?”表示序列的鉴定是不可能的或不确定的;因而仅仅报道了该肽的质量。
图3:在用乳酸发酵剂Hansen YC380发酵达到pH4.7之前(1)和之后(2),含有1.5g/L DMV
Figure S05839975420070524D000181
水解产物的乳品“混合物”的比较性肽图谱(LC-MS/MS色谱图)。实际上水解产物的所有肽,包括生物活性肽C12(片段αS1[23-34])在使用发酵剂的菌株代谢后消失。
图4:举例说明在10℃储藏期间,成品中生物活性肽αS1[91-100]剩余量变化的曲线,所述成品由95%的用含有菌株I-2783、I-2774、I-2835和I-1968的发酵剂发酵的物质和5%的含有肽αS1[91-100]的已调味糖浆组成。以4个独立试验E1、E2、E3和E4的形式进行该实验。
图5:举例说明发酵后添加到发酵产品中,然后在75℃加热1分钟并且在10℃储藏到有效期限的生物活性肽αS1[91-100]剩余量变化的曲线。
图6:举例说明在10℃储藏到有效期限期间,成品中生物活性肽αS1[91-100]剩余量的变化,所述成品由95%的用含有菌株I-2774和甲酸盐的发酵剂发酵的物质和5%的含有肽αS1[91-100]的已调味糖浆组成(以
Figure S05839975420070524D000182
的形式提供,1.5g/kg成品)。
图7:举例说明在发酵之前添加到成品中的生物活性肽αS1[91-100]剩余量的变化,所述成品由使用含有菌株I-2774和甲酸盐的发酵剂发酵的乳品物质组成。
具体实施方式
阅读下面的仅仅为了举例说明目的给出的实施例,本发明的其它特征和优点将更明显。
实施例
实施例1:不施用要求保护的发明,利用感兴趣的生物活性成分1.1)包含在水解产物
Figure S05839975420070524D000183
中的生物活性肽αS1[91-100]的实施例当在制备乳品“混合物”(将乳粉末化)步骤中、卫生热处理(即95℃、8分钟)之前以及因此在发酵之前添加肽或蛋白质型的成分时,使用通常以粉末形式提供的这些成分更简单方便。在此情况下,代谢活性肽的风险很高。例如,使用含有生物活性肽(酪蛋白αS1的片段91-100)的功能性成分例如(Ingredia,法国)的情形就是如此。
程序:通过水解120g/L脱脂奶粉制备介质,补充1.5g/L
Figure S05839975420070524D000192
成分(相当于约30mg/L生物活性肽αS1[91-100]),然后在95℃巴氏灭菌8分钟。
添加乳酸发酵剂至比例为0.02%,并且在所选发酵剂的最适宜温度进行发酵(37到42℃)直到pH达到4.70。
如下所述通过与MS/MS型检测器偶联的HPLC液相色谱法分析剩余的肽,尤其是生物活性肽αS1[91-100]:
-用水、甲醇和三氟乙酸(50/50/0.1%)的混合物,以约1比6的比率稀释发酵的介质来制备样品。离心后的上清液组成发酵介质中肽内容物的代表性样品。
-将该样品注入装备适于肽分析的Waters
Figure S05839975420070524D000193
型柱(5μm2.1×150mm,WAT056975,Waters France,5,Rue Jacques Monod,78280Guyancourt)的Agilent1100型HPLC色谱系统(来自AgilentTechnologies France公司,1rue Galvani,91745Massy Cedex,France)中,温度为40℃和流速为0.25ml/分钟。常规地用溶剂A(水+0.106%甲酸)中溶剂B(乙腈+0.100%甲酸)的增加梯度洗脱肽,时间在40分钟到2小时,作为所需拆分的函数。
-使用特殊的MS/MS型检测器进行检测,例如用离子阱仪器如Esquire3000+(Bruker Daltonique,rue de l’Industrie,67166Wissembourg Cedex),其或者已被调节用于全面分析肽含量(MS-MS模式),或者被调节用于有肽的特征片段对该肽进行精确和具体定量。例如,从其质量(质量为634.5Da的双带电离子)分离肽αS1[91-100]并且从其片段化后特征子离子(m/z为991.5Da、771.5Da和658.3Da的离子)强度来定量。甚至更具体而言,由氘化两次的相同合成肽组成的内标(993.5Da的特征片段)使得有可能考虑上述肽和放弃任何与基质相关的干扰。
图1举例说明了结果。
在此阶段(由菌株1-2783(2002年1月24日保藏在CNCM)、I-2774(2002年1月14日保藏在CNCM)、I-2835(2002年4月4日保藏在CNCM)和I-1968(1998年1月14日保藏在CNCM)的混合物组成的发酵剂,或例如发酵剂YC380(Chr.Hansen SA,Le Moulin d’Aulnay,BP64,91292 ARPAJON Cedex France)的发酵剂发酵之前),证实了发酵后95%以上的生物活性肽αS1[91-100]被消耗。
这些观察显示,前述生物活性肽的掺入本身不适于生产这样的食品,尤其是乳制品,其中补充一定量的能随时间而保持足够稳定,从而可在消费者中观察到期望效果的生物活性肽和/或蛋白质。
1.2)利用其它感兴趣的生物活性肽的实施例
图2和3举例说明了结果。
成分
Figure S05839975420070524D000201
含有许多其它肽,其中一些潜在地有生物活性(例如酪蛋白αS1的片段23-34,其还由DMV International公司以成分C12销售)。值得一提的是,实际上通过添加
Figure S05839975420070524D000202
提供的所有肽在发酵期间大部分被消耗掉。
不管它们的来源(来源于多种酪蛋白αS1、αS2、κ或β)和它们的大小(从2~3个残基到高达12个残基和更多),所有的肽在发酵过程全部被消耗掉。
1.3)使用其它发酵剂利用生物活性肽αS1[91-100](
Figure S05839975420070524D000203
)
为了核对这种现象不是上述段落1.1)中使用的两种发酵剂所特有的,以相同的试验为基础,测试了主要的工业发酵剂、还有多种包括在这些发酵剂组成中的纯菌株:由奶粉重构成乳,向其中加入1.5g/L剂量的
Figure S05839975420070524D000204
,将其在标准条件(发酵剂的最适宜温度为37到42℃,在pH4.7时终止发酵,重复两次)下发酵。然后分析发酵前和发酵后样品中生物活性肽αS1[91-100]的量。
下面表3给出由纯菌株得到的结果:
表3
 
纯菌株(嗜热链球菌) 发酵后剩余的肽αs1[91-100]的%
I-1630(10/24/95) 0.3
I-1477(09/22/94) 0.3
纯菌株(乳杆菌)
I-1632(10/24/95) 0.2
I-1519(12/30/94) 0.1
I-1968(01/14/98) 1.6
I-2809(02/19/02) 0.4
上述表3反映了在含有1.5g/L
Figure S05839975420070524D000211
的乳品混合物发酵期间,多种工业株和发酵剂对生物活性肽αS1[91-100]的消耗,通过它们各自的在CNCM(法国巴黎巴斯德研究所)保藏的号码和日期确定纯菌株。
表3显示在标准乳品混合物发酵期间,所有试验发酵剂和菌株代谢94%到100%的生物活性肽αS1[91-100]。因此使用这种成分在标准条件下生产的含有随时间保持足够稳定,从而在消费者中产生作用之量的生物活性肽和/或蛋白质的食品,尤其是乳制品是不可能的。
另外,为了核对这种现象不是成分
Figure S05839975420070524D000212
所特有的,使用相同的试验研究了发酵剂与其它基于生物活性肽的成分的各种组合(重构的乳+1.5g/L剂量的试验成分,在标准条件下发酵,在pH4.7终止发酵,重复两次)。下面表4叙述了多种试验组合。
表4
表4
由DMV International公司生产的成分C12和CPP是含有生物活性肽的乳蛋白水解产物,所述生物活性肽分别靶向高血压的控制和矿物的同化。
在所有试验中可看到,不管其性质和大小如何,所有实验发酵剂均具有较大的代谢所述肽的能力。
1.4)发酵后添加
上述研究步骤的合理替代是在发酵后引入功能性成分(“延迟分化型”工艺),例如用于发酵物质调味的糖浆。根据这个程序使用相同量的
Figure S05839975420070524D000222
成分得到图4举例说明的结果。
如图4所示,甚至在发酵后在较冷的条件(4℃)下添加时,在储藏期间,活性肽(以每kg成品中1.5g
Figure S05839975420070524D000223
的相当量提供)被迅速降解,到有效期限时仅仅留下初始量的30%到40%。
因此,在成品的储藏期间,成品中活乳酸菌群继续代谢生物活性肽,使得仅仅10天后(对于有效期限是28天的新鲜产品),35%到50%的肽αS1[91-100]已消失,这对消费者得到期望的效果是无法接受的。
1.5)包含感兴趣的生物活性成分的发酵乳制品的热处理
在此情况下,可能保证肽αS1[91-100]的稳定性(图5),但是牺牲了成品的全面质量。特别是,该解决方案具有许多缺点:
-对发酵的乳品物质进行的热杀菌必需使用在热处理之前添加的稳定剂(果胶、淀粉、角叉菜胶等),其使过程复杂化并且实际上增加了配方的成本;
-工业生产线更复杂并且需要较大的具体投资;
-产品不再受益于与含有活发酵剂的产品(例如酸奶)相关的名称,结果失去了与消耗乳酸发酵剂相关的益处;和
-感官影响(通常负面的)很显著。
实施例2:通过施用要求保护的发明,利用感兴趣的生物活性成分
基于工业发酵剂不消耗肽αS1[91-100]的能力,对工业发酵剂进行筛选。在测试的30种发酵剂中,除了一种发酵剂(含有唯一的菌株I-2774和甲酸盐的发酵剂,其中所述株I-2774是微生物学上非典型的)以外,所有发酵剂在发酵期间基本上消耗所有肽αS1[91-100]。
测试了另外一种菌株:这是1995年10月24日保藏在CNCM的菌株I-1630的天然变体(其自身消耗肽)。通过形成不具有肽转运系统(AMI-系统)的天然突变体得到这种变体I-3211(2004年5月4日保藏在CNCM)。已有效证明了这种变体既不消耗肽αS1[91-100],又不消耗大多数的其它肽。在中试水平和甚至在工业水平测试的应用中,通过利用包含菌株I-2774和甲酸盐的发酵剂能成功地利用以成分
Figure S05839975420070524D000231
(Ingredia)形式供应的生物活性肽αS1[91-100]。图6显示得到的稳定性结果。
甚至更特别是,在发酵之前,可有利地引入所述的肽(这简化工业化了实施),如图7所示。
因此,发酵期间(在~41℃12小时期间)感兴趣的肽的消失不超过初始量的3%到4%,而其它发酵剂实际上消耗所有的肽。在表4中描述的那些试验的等同条件下,发酵后菌株I-2774和I-3211有效地达到大于85%的肽αS1[91-100]残存水平。
菌株I-2774和I-3211大大降低的代谢肽的能力更广泛地允许使用任何类型的生物活性肽,其中包括许多已经是确证试验的主题的商业化水解产物。因此表4中描述的试验成功地扩展至发酵剂/菌株I-2774和I-3211的用途。
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Figure S05839975420070524D000271
Figure S05839975420070524D000281
受理局保留
Figure S05839975420070524D000291
国际局保留
Figure S05839975420070524D000292

Claims (18)

1.一种食品,其含有活嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和至少一种生物活性食物成分,其特征在于,所述活嗜热链球菌中用于将肽转运到细胞中的AMI或OPP转运系统不在发酵期间转运40%以上的生物活性食物成分,使得所述活嗜热链球菌对所述食物成分的代谢降低,并且其中所述生物活性食物成分是肽。
2.权利要求1的食品,其特征在于,所述食品制备3周后,相对于刚刚制备后产品中存在的生物活性食物成分量,所述食品中生物活性食物成分的剩余量为50%到100%。
3.权利要求2的食品,其特征在于,相对于刚刚制备后产品中存在的生物活性食物成分量,所述剩余量为80%到100%。
4.权利要求1的食品,其特征在于,所述生物活性食物成分选自:肽αS1[91-100]、肽C6-αS1194-199、肽C7-β177-183、肽C12-αS123-34、酪蛋白磷酸肽、α-酪吗啡肽、α-酪蛋白源外啡肽、酪激肽、β-酪吗啡肽、酪蛋白巨肽、糖巨肽、casoxine、β-乳吗啡样肽、lactoferroxin、肽Val-Pro-Pro、Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln、Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leu、Tyr-Pro、Ile-Pro-Pro,含有它们的蛋白质和/或肽以及它们的组合。
5.权利要求1-3中任一项的食品,其特征在于,所述活嗜热链球菌是野生株和/或天然变体。
6.权利要求1-3中任一项的食品,其特征在于,所述AMI或OPP系统在所述活嗜热链球菌中是非功能性的。
7.权利要求1-3中任一项的食品,其特征在于,所述活嗜热链球菌选自:
-嗜热链球菌,2002年1月24日以I-2774号保藏在CNCM(国家微生物菌种保藏中心(Collection nationale de cultures desmicroorganisms)(法国巴黎巴斯德研究所);
-嗜热链球菌,2004年5月10日以I-3211号保藏在CNCM;
-嗜热链球菌,2004年9月16日以I-3301号保藏在CNCM;
-嗜热链球菌,2004年9月16日以I-3302号保藏在CNCM。
8.权利要求7的食品,其特征在于,所述活嗜热链球菌是2004年5月10日以I-3211号保藏在CNCM的嗜热链球菌。
9.权利要求1-3中任一项的食品,其特征在于,所述生物活性食物成分被包封起来。
10.权利要求1-3中任一项的食品,其特征在于,其是发酵的产品。
11.权利要求10的食品,其特征在于,其是乳制品或植物性产品。
12.制备权利要求1-11中任一项的食品的方法,其特征在于,相继地将所述活嗜热链球菌和所述生物活性食物成分添加到意图构成所述食品的混合物中。
13.制备权利要求1-11中任一项的食品的方法,其特征在于,同时将所述活嗜热链球菌和所述生物活性食物成分添加到意图构成所述食品的混合物中。
14.制备权利要求1-11中任一项的食品的方法,其特征在于,直接在意图构成所述食品的混合物中制备所述生物活性食物成分。
15.制备权利要求1-11中任一项的食品的方法,其特征在于,在原位合成所述生物活性食物成分之前,将所述活嗜热链球菌添加到意图构成所述食品的混合物中。
16.制备权利要求1-11中任一项的食品的方法,其特征在于,在原位合成所述生物活性食物成分期间,将所述活嗜热链球菌添加到意图构成所述食品的混合物中。
17.制备权利要求1-11中任一项的食品的方法,其特征在于,在原位合成所述生物活性食物成分之后,将所述活嗜热链球菌添加到意图构成所述食品的混合物中。
18.权利要求1-11中任一项的食品用作功能性食物的用途。
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