EP1809116A1 - Protection d'ingrédients alimentaires bioactifs par l'utilisation de microorganismes présentant une capacité de métabolisation réduite - Google Patents

Protection d'ingrédients alimentaires bioactifs par l'utilisation de microorganismes présentant une capacité de métabolisation réduite

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EP1809116A1
EP1809116A1 EP05808073A EP05808073A EP1809116A1 EP 1809116 A1 EP1809116 A1 EP 1809116A1 EP 05808073 A EP05808073 A EP 05808073A EP 05808073 A EP05808073 A EP 05808073A EP 1809116 A1 EP1809116 A1 EP 1809116A1
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EP
European Patent Office
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food product
food
bioactive
interest
product according
Prior art date
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EP05808073A
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English (en)
Inventor
Peggy Garault
Jean-Michel Faurie
Jérôme MENGAUD
Chloé BEAL
Thierry Saint-Denis
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Gervais Danone SA
Original Assignee
Gervais Danone SA
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Publication date
Application filed by Gervais Danone SA filed Critical Gervais Danone SA
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
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    • A23C9/1322—Inorganic compounds; Minerals, including organic salts thereof, oligo-elements; Amino-acids, peptides, protein-hydrolysates or derivatives; Nucleic acids or derivatives; Yeast extract or autolysate; Vitamins; Antibiotics; Bacteriocins
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    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/21—Streptococcus, lactococcus
    • A23V2400/249—Thermophilus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Definitions

  • the present invention relates to a food product containing one or more living microorganisms and at least one bioactive food ingredient of interest, wherein the living microorganism (s) and the bioactive food ingredient (s) of interest are used to reduce the metabolizing said bioactive ingredient (s) with said microorganism (s).
  • Bioactive peptides are defined sequences of amino acids that are inactive in their original protein, but which have particular properties once released by enzymatic action. They are also called functional peptides. These bioactive peptides are capable of exerting, inter alia, an effect on the digestive system, the defenses of the body (for example, an antimicrobial or immunomodulatory effect), the cardiovascular system (in particular an antithrombotic or antihypertensive effect), and or the nervous system (such as a sedative and analgesic effect of the opioid type) (see Tables 1 and 2 below).
  • Table 1 lists the main functional peptides released by the hydrolysis of the proteins of human milk and cow's milk.
  • Table 2 below lists the main physiological activities of functional peptides from milk known to date.
  • peptides are most often obtained by hydrolysis of plant proteins (for example soy proteins) or animal proteins (for example, caseins or serum proteins of milk), hydrolysis generated by enzymatic and / or fermentative processes, most often accompanied by a concentration of the active fraction, a step usually necessary to provide the targeted "health benefit".
  • plant proteins for example soy proteins
  • animal proteins for example, caseins or serum proteins of milk
  • hydrolysis generated by enzymatic and / or fermentative processes most often accompanied by a concentration of the active fraction, a step usually necessary to provide the targeted "health benefit”.
  • the manufacture and use of these peptides for a health benefit is subject to an extensive literature (see in particular Danone World Newsletter N 0 17 September 1998).
  • fermented milk products are in a good position because of their health benefits due to the presence of ferments and fermentation products (ie the molecules resulting from the transformation , by lactic acid bacteria, substrates present in the milk).
  • PRT wall proteases which cuts proteins and large peptides to facilitate their assimilation ("extracellular metabolism system")
  • intracellular enzymatic system capable of degrading the peptides into amino acids (comprising about fifteen endo- and exopeptidases) ("intracellular metabolization system").
  • the Applicant has thus observed that the population of living lactic acid bacteria in the finished product continues to metabolize the bioactive peptide during storage of the finished product, so that after only 10 days (for fresh products with a DLC of 28 days) about 35-55% of the bioactive peptide ⁇ Si [91-100] has disappeared, which is totally unacceptable to guarantee a "health" effect on the consumer (data not shown).
  • the thermisation of a fermented milk mass implies the use stabilizers added before the heat treatment (pectins, starches, carrageenans, etc.), which complicates the process and substantially increases the cost of the formula;
  • An object of the present invention is therefore a food product containing one or more live microorganisms and at least one bioactive food ingredient of interest, characterized in that the living microorganism (s) and the bioactive food ingredient (s) of interest are placed in to reduce metabolism of said bioactive ingredient (s) by said living microorganism (s).
  • the Applicant has been able to show that one or more bioactive food ingredients of interest could be effectively protected against metabolism by living microorganisms, provided that the conditions of implementation with each other are appropriate.
  • Such suitable conditions of implementation may involve a variety of means, including: a) the use of living microorganisms whose ability to metabolize bioactive ingredients is reduced; and / or (b) the use of lure food ingredients that are deliberately “fed” to living microorganisms; and / or c) the implementation of a physical protection of the bioactive ingredients, in particular by encapsulation of the latter.
  • metabolized or “metabolized” is intended to mean, according to the present invention, the transformation or degradation of a substance by one or more living microorganisms, aimed at its consumption as a source of nutrients, and having the final consequence of its disappearance, more or less complete, of the medium.
  • the metabolisation of an ingredient is “reduced” if it is less than the metabolism of the same ingredient when the latter ingredient is not protected by at least one of the means provided for in the context of this invention.
  • this reduced metabolism tends to, or is worth, zero, which amounts to little, almost no or no metabolism of said ingredient.
  • the residual amount of bioactive food ingredient (s) of interest in said food product is, 3 weeks after its preparation, between 50 and 100% approximately relative to the amount of ingredient (s) food (s) bioactive (s) of interest present in the product just after its preparation.
  • residual amount is between about 80 and 100%.
  • residual amount of bioactive food ingredient (s) of interest in said food product is meant according to the present invention the percentage of bioactive food ingredient (s) d interest present in said food product when the latter is maintained under suitable storage conditions (for example, of the order of 4 to 10 0 C for a fresh product) for 3 weeks, relative to the percentage of ingredient (s) ) bioactive food (s) of interest present at the start, that is to say right after manufacture of the product.
  • the one or more bioactive food ingredients of interest are chosen from: proteins,
  • the bioactive food ingredient of interest is chosen from: the bioactive peptide ⁇ Si [91-100] (see the European patent
  • caseinophosphopeptides caseinophosphopeptides, ⁇ -casomorphine, ⁇ -exorphin casein, casokinin, ⁇ -casomorphine, caseinomacropeptides
  • CMP glycomacropeptides
  • GMP glycomacropeptides
  • CGMP caseinoglycomacropeptides
  • the bioactive food ingredient of interest is chosen from: the bioactive peptide OcS 1 [91-100], fragments, analogs, derivatives thereof, proteins and / or peptides containing them, and their combinations.
  • Analogous is understood to mean any modified version of an initial compound, here a protein or a peptide, said modified version possibly being natural or synthetic, in which one or more atoms, such as carbon atoms, d Hydrogen, oxygen, or heteroatoms such as nitrogen, sulfur, or halogen, have been added or removed from the structure of the parent compound to obtain a new molecular compound.
  • a “derivative" within the meaning of the invention is any compound that has a resemblance or a structural unit in common with a reference compound (protein or peptide). Also included in this definition are compounds which, alone or with other compounds, may be precursors or intermediates in the synthesis of a reference compound, by one or more chemical reactions, and on the other hand compounds which can be formed from said reference compound, alone or with other compounds, via one or more chemical reactions.
  • the definition of “derivatives” above covers at least the hydrolyzates, in particular tryptic hydrolysates, of proteins and / or peptides, the hydrolyzate fractions, as well as the mixtures of hydrolysates and / or of hydrolysate fractions.
  • the terms “analogue” and “derivative of a peptide or protein” mentioned above for example, cover a peptide or a glycosylated or phosphorylated protein or which has undergone any group grafting. chemical.
  • the bioactive food ingredient of interest may be in particular a sugar or a fatty acid.
  • the living microorganism or microorganisms are characterized by a reduced or no capacity for metabolizing the bioactive food ingredients of interest.
  • a "reduced metabolic capacity" is such that the amount of bioactive ingredients of interest metabolized during fermentation (which therefore disappears from the medium) is less than or equal to 40% of the initial amount of ingredients ( before fermentation). This is mathematically translated as: Q r > 0.6 Q 0 (1) Where:
  • the amount of residual bioactive ingredients Q r can be measured by an HPLC liquid chromatography method coupled to an MS / MS type detector.
  • an example of an experimental procedure is given in the examples below.
  • said living microorganism (s) are wild-type strains and / or natural variants and / or mutants obtained by genetic engineering.
  • variant strain or “variant” is meant in the present application a strain obtained mainly by selective mutation from a reference strain, and having the property of of interest sought, namely the capacity, reduced or zero, to metabolize the bioactive food ingredient (s) of interest described above.
  • a “mutant” or “mutant strain” within the meaning of the invention is a strain obtained by means of directed mutagenesis techniques, from a reference strain. Such a mutant has, as the variants defined above, the desired property of interest.
  • the techniques for obtaining natural variants by selective mutation, or obtaining mutants by genetic engineering, in particular by genetic transformation using vectors are known to those skilled in the art. In this respect, reference may be made to Sambrook and Russel (2001).
  • the living microorganism or microorganisms are bacteria, preferably lactic acid bacteria, living.
  • a system for intracellular metabolisation of the peptides is reduced in said living bacteria.
  • the term "reduced capacity of a metabolizing and / or transport mechanism” is used to describe a metabolism and / or transport mechanism as mentioned above, whose capacity (or activity) does not allow it to metabolize and / or carry more than 40% of bioactive ingredients of interest during fermentation.
  • said mechanism (s) is (are) non-functional (s) in said living bacteria.
  • said mechanism, of reduced or non-functional capacity is a system for transporting the peptides into the interior of the cell. More particularly, said peptide transport system is the AMI system (see, for example, Garault et al., 2002) or the OPP system (in L. bulgaricus: Peltoniemi et al., 2002; in L. lactis: Detmers et al., 1998).
  • the living bacteria that may be used in the context of the invention may especially be chosen from:
  • Streptococcus spp preferably Streptococcus thermophilus
  • said living bacteria are chosen from: - Streptococcus thermophilus, deposited at the CNCM (Collection
  • said living bacteria are S. thermophilus bacteria deposited at the CNCM on 05/201704 under the number 1-3211.
  • the food product according to the present invention contains at least the living bacteria S. thermophilus and Lactobacillus spp.
  • said living bacteria Streptococcus thermophilus are chosen from S. thermophilus deposited at the CNCM on 24/01/02 under the number I-2774, S. thermophilus deposited at the CNCM on May 10, 2004 under the number 1-3211, S. thermophilus deposited at the CNCM on September 16, 2004 under the number 1-3301, and S. thermophilus deposited at the CNCM on September 16, 2004 under the number I-3302.
  • the content of the food product according to the invention in live microorganisms may vary and will be chosen by those skilled in the art in the light of his general knowledge in the field. In practice, a standard overall content, for example of the order of 10 7 to 10 9 bacteria per gram of food product, will preferably be sought.
  • the one or more bioactive food ingredients of interest are encapsulated.
  • encapsulated or “encapsulation” is meant to designate according to the present invention the implementation of a method of protecting an active ingredient in a microparticle type vehicle to allow controlled release of this active ingredient.
  • the active ingredient is constituted by one or more bioactive food ingredients of interest. This encapsulation provides a complementary solution to that according to the present invention, in that it allows said bioactive food ingredients of interest not to be metabolized by living microorganisms.
  • the food product further contains at least one decoy food ingredient.
  • lure food ingredient is intended to denote according to the present invention a food ingredient (preferably a peptide, a protein, an analogue or a derivative thereof, and combinations thereof) capable of serving as a source of nutrients (especially Nitrogen source) for living microorganisms, and intended to be preferentially metabolized by said microorganisms, so as to divert the latter from the bioactive ingredients of interest that are of course intended to be preserved as a priority.
  • the lure ingredient represents a nutrient source for microorganisms, which is sacrificed deliberately to save as much bioactive ingredients of interest as possible.
  • the lure food ingredient acts as a competitive inhibitor of the transport of the bioactive ingredients of interest.
  • the food product according to the present invention is a fermented product. More preferably, the fermented food product is a dairy or vegetable product.
  • dairy product in addition to milk, products derived from milk, such as cream, ice cream, butter, cheese, yogurt; secondary products, such as whey, casein; and any prepared food containing, as the main ingredient, milk or milk constituents.
  • Plant product means, inter alia, products obtained from a vegetable base such as, for example, fruit juices and vegetable juices, including soya juice, oat juice or the rice juice.
  • the above definitions of “dairy product” and “plant product” each cover any product made from a mixture of dairy and vegetable products, such as a mixture of milk and fruit juice, for example.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of a food product as described above, in which one or more living microorganisms and one or more bioactive food ingredient (s) (s) ( s) encapsulated interest are added in the mixture intended to constitute said food product.
  • the bioactive food ingredient (s) of interest are added to said mixture one after the other.
  • the one or more bioactive food ingredient (s) of interest are added simultaneously to said mixture.
  • the culture conditions of the microorganisms depend on said microorganisms and are known to those skilled in the art. By way of example, it will be specified that the optimum growth temperatures for S. thermophilus are generally between about 36 ° and 42 ° C. they are between 42 ° and 46 ° C for L. delbrueckii spp. bulgaricus (typically found in yoghurt).
  • the fermentation stoppage which depends on the desired pH, is obtained by rapid cooling, which slows down the metabolic activity of the microorganisms.
  • the one or more bioactive food ingredients of interest are prepared directly in the mixture intended to constitute said food product.
  • in situ synthesis it can be predicted that the living microorganism or microorganisms are added to the mixture intended for constituting said food product, before, during or after, the in situ synthesis of one or more bioactive food ingredients of interest.
  • the present invention further relates to the use of a food product as described above as a functional food.
  • “functional food” is meant a food product that advantageously affects one or more target functions of the body, regardless of its nutritional effects. This can result in an improvement of the state of health and / or well-being and / or a reduction of the risks of occurrence of diseases in a consumer who ingests normal amounts of said product.
  • activities of a “functional food” include anti-cancer activities, immunostimulatory, promoting bone health, anti-stress, opiates, antihypertensives, calcium bioavailability enhancers, or antimicrobial (Functional Food Science in Europe, 1998).
  • Such functional foods may be intended for humans and / or animals.
  • the present invention also relates to the use, in a food product, of a living microorganism having a reduced metabolic capacity of a bioactive food ingredient of interest, for protecting said bioactive food ingredient of interest against metabolism by said living microorganism.
  • FIG. 1 Chromatogram LC-MS illustrating the disappearance of the bioactive peptide ⁇ S1 [91-100] included in the ingredient Lactium® during lactic fermentation.
  • Figure 2 Identification and quantification of the main peptides of the Lactium® ingredient by LC-MS / MS before and after fermentation of the dairy "mix” with a ferment consisting of a mixture of strains I-2783 (deposited at the CNCM on 24 / 01/02), I-2774 (filed at the CNCM on 24/01/02), I-2835 (filed at the CNCM on 04/04/02) and 1-1968 (filed at the CNCM on 14/01 / 98). After fermentation, these peptides are only found in trace amounts and merge with the baseline. "? Means that the identification of the sequence was not possible or is not certain; only the mass of the peptide is then reported.
  • FIG. 4 Curves illustrating the evolution of the residual content of bioactive peptide ⁇ S1 [91-100] in a finished product constituted of 95% fermented mass by the ferment containing strains I-2783, I-2774, I-2835 and 1-1968, and 5% flavored sugar syrup containing the peptide ⁇ S1 [91-100], during storage at 10 ° C. The experiment was carried out at the rate of 4 independent tests E1, E2, E3 and E4 .
  • FIG. 5 Curves illustrating the evolution of the residual content of bioactive peptide ⁇ S1 [91-100], added after fermentation in a fermented product then thermised at 75 ° C. for 1 minute, and stored at 10 ° C. until the date consumption limit (DLC).
  • DLC date consumption limit
  • Figure 6 Illustration of the evolution of the residual content of ⁇ S1 [91-100] bioactive peptide in a finished product consisting of 95% fermented mass by the ferment containing the strain I-2774 and the formate and of 5% flavored sugar syrup containing the peptide ⁇ S1 [91-100] (provided in the form of Lactium®, assayed at 1.5 g / kg of finished product), during storage at 100 ° C. until DLC.
  • Figure 7 Illustration of the evolution of the residual content of bioactive peptide ⁇ S1 [91-100], added before fermentation, in a finished product consisting of milk mass fermented by the ferment containing the I-2774 strain and the formate.
  • ingredients of the peptide or protein type are simpler when they are added during the step of preparation of the dairy "mix” (powdering of the milk), before the treatment thermal sanitation (Le., 95 0 C, 8 min) and, therefore, before fermentation.
  • the risk of metabolizing the active peptide is very high.
  • a functional ingredient such as Lactium® (Ingredia, France) containing a bioactive peptide (fragment 91-100 of casein ⁇ S1).
  • Protocol the medium was prepared by hydration of a skimmed milk powder at 120 g / L, supplemented with 1.5 g / L of Lactium® ingredient
  • the sample was prepared by dilution of the fermented medium in a mixture of water, methanol and trifluoroacetic acid (50/50 / 0.1%), in a ratio of 1 to about 6.
  • the supernatant after centrifugation constituted the representative sample of the peptide content of the fermented medium.
  • the detection was carried out using a specific MS / MS type detector, for example with an ion trap device such as Esquire3000 + (Bruker Daltonique, rue de l'Industrie, 67166
  • the Lactium® ingredient contains many other peptides, some of which potentially have biological activity (such as ⁇ S1 casein fragment 23-34, which is also commercially available in DMV International's C12 ingredient). It is interesting to note that almost all the peptides provided by the addition of Lactium® are widely consumed during fermentation. Whatever their origin (from different caseins ⁇ S1, ⁇ S2, K, ⁇ ) and their size (from 2 to 3 residues up to 12 residues and more), all Peptides are generally consumed during the fermentation process.
  • the C12 and CPP ingredients produced by DMV International are hydrolysates of milk proteins containing bioactive peptides targeting the control of hypertension and the assimilation of minerals respectively. On the whole of the experiments, it appeared that all the ferments tested have an important capacity of metabolizing peptides, whatever their nature and their size.
  • the active peptide As shown in FIG. 4, even added cold (4 ° C.) after fermentation, the active peptide (provided by the equivalent of 1.5 g of Lactium® per kg of finished product) is rapidly degraded during storage, so that leave only 30 to 40% of the initial quantity at the use-by date (DLC).
  • the population of living lactic acid bacteria in the finished product continues to metabolize the bioactive peptide during storage of the finished product, so that after only 10 days (for fresh products with a 28-day DLC), between 35 and 50% of the peptide ⁇ S1 [91-100] have disappeared, which remains unacceptable to obtain the desired effect in the consumer.

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Abstract

La présente invention concerne un produit alimentaire contenant des microorganismes vivants et des ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt, dans lequel les microorganismes vivants et les ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont mis en œuvre de manière à réduire la métabolisation desdits ingrédients bioactifs par lesdits microorganismes vivants. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation à cette fin de microorganismes vivants présentant une capacité réduite de métabolisation des ingrédients bioactifs.

Description

Protection d'ingrédients alimentaires bioactifs par l'utilisation de microorganismes présentant une capacité de métabolisation réduite
La présente invention concerne un produit alimentaire contenant un ou plusieurs microorganismes vivants et au moins un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt, dans lequel le ou lesdits microorganismes vivants et le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont mis en œuvre de manière à réduire la métabolisation du ou desdits ingrédients bioactifs par le ou lesdits microorganismes.
Le marché des ingrédients alimentaires, en particulier des peptides, bioactifs ou fonctionnels (Le., ayant une activité bénéfique pour le consommateur soit localement dans le tube digestif, soit à distance dans l'organisme, après être passés dans le système circulatoire) est, depuis quelques années, en plein essor.
Les peptides bioactifs sont des séquences définies d'acides aminés qui sont inactives au sein de leur protéine d'origine, mais qui présentent des propriétés particulières une fois libérées par action enzymatique. On les appelle aussi peptides fonctionnels. Ces peptides bioactifs sont capables d'exercer, entre autres, un effet sur le système digestif, les défenses de l'organisme (par exemple, un effet antimicrobien ou immunomodulateur), le système cardiovasculaire (notamment un effet antithrombotique ou antihypertenseur), et/ou le système nerveux (tel qu'un effet sédatif et analgésique de type opioïde) (voir tableaux 1 et 2 ci-après).
Le tableau 1 ci-après liste les principaux peptides fonctionnels libérés par l'hydrolyse des protéines du lait humain et du lait de vache.
(*) les séquences des acides aminés ne sont pas exactement les mêmes
(**) H lait humain / V lait de vache
Le tableau 2 ci-après recense les principales activités physiologiques des peptides fonctionnels issus du lait connus à ce jour.
Tableau 2
W
Tableau 2 (suite)
Tableau 2 (suite)
Tableau 2 (suite)
Ces peptides sont le plus souvent obtenus par hydrolyse de protéines végétales (par exemple des protéines de soja) ou animales (par exemple, les caséines ou les protéines sériques du lait), hydrolyse générée par des procédés enzymatiques et/ou fermentaires, le plus souvent accompagnée d'une concentration de la fraction active, étape généralement nécessaire pour apporter le « bénéfice santé » visé. La fabrication et l'utilisation de ces peptides pour un bénéfice santé font l'objet d'une littérature abondante (voir notamment la Danone World Newsletter N017 de Septembre 1998). Parmi les vecteurs alimentaires susceptibles d'accueillir de tels ingrédients, les produits laitiers fermentes figurent en bonne position de part leur bénéfice santé dû à la présence de ferments et de produits de fermentation (c'est-à-dire les molécules issues de la transformation, par les bactéries lactiques, des substrats présents dans le lait). Jusqu'à présent, la communauté scientifique prenait surtout en compte les propriétés des ferments. Les chercheurs commencent depuis peu à s'intéresser aux produits de fermentation, parmi lesquels certains peptides occupent une place particulière, car ce sont des messagers biologiques nombreux et spécifiques. Les produits laitiers fermentes paraissent donc particulièrement appropriés comme vecteurs d'hydrolysats de peptides bioactifs obtenus, par exemple, à partir de substrats laitiers comme les caséines ou les protéines sériques. Un problème majeur se pose alors : les microorganismes et, en particulier, les bactéries lactiques utilisées dans la fabrication des produits laitiers frais (type yoghourts, spécialités laitières fermentées, boissons fermentées à base de lait, etc.), sont généralement capables de consommer les peptides pour satisfaire leurs besoins nutritionnels et, plus particulièrement leurs besoins en azote. On parlera à cet effet dans ce qui suit de « métabolisation des peptides ». Les bactéries lactiques sont en effet dotées de plusieurs systèmes de dégradation et/ou transport leur permettant de métaboliser les peptides, les faisant alors disparaître du milieu :
1/ un système protéolytique (protéases de paroi PRT) qui découpe protéines et gros peptides pour faciliter leur assimilation (« système de métabolisation extracellulaire »),
2/ des systèmes de transport vers l'intérieur de la cellule, dont l'un est spécifique des oligo-peptides d'une taille proche de 10 acides aminés, l'autre étant adapté au transport de di- et tri-peptides (les lactobacilles possèdent un système supplémentaire de perméases à tri-peptides) (« système(s) de transport vers l'intérieur de la cellule »), et
3/ un système enzymatique intracellulaire capable de dégrader les peptides en acides aminés (comprenant une quinzaine d'endo- et exopeptidases) (« système de métabolisation intracellulaire »).
Etant donné que la quantité de peptides naturellement présents dans le lait est généralement trop faible par rapport aux besoins des bactéries lactiques, il est commun d'accélérer leur croissance en fournissant un supplément de peptides. Ceux-ci sont alors totalement consommés pendant la fermentation.
En définitive, du fait : (i) du besoin en azote des bactéries lactiques, dont les peptides constituent la principale source dans le lait, (ii) de la capacité de ces bactéries à consommer efficacement les peptides, et (iii) de la survie d'une population importante de bactéries lactiques dans les produits fermentes à base de lait, jusqu'à la date limite de consommation (DLC), la mise en œuvre d'ingrédients à base de peptides fonctionnels dans les produits laitiers fermentes est difficile, voire impossible, car ces ingrédients sont le plus souvent consommés par les bactéries lactiques, pendant la fermentation, voire pendant le stockage des produits jusqu'à DLC.
En outre, non seulement ce problème de dégradation par métabolisation « intempestive » des peptides par les bactéries n'est pas spécifique à un peptide donné, mais il n'est pas non plus spécifique à un ferment (ou microorganisme, de préférence bactérie, capable de fermenter) particulier.
Il s'agit là d'un problème général, qui se pose quels que soient le ou les peptides et le ou les microorganismes considérés. On citera, à titre d'exemple, le cas du peptide bioactif αSi [91-100] (voir le brevet européen EP 0 714 910 ; peptide aux propriétés relaxantes contenu dans l'hydrolysat de protéines de lait commercialisé notamment par la société Ingredia : 51-53, Avenue Femand Lobbedez BP 946 62033 ARRAS Cedex, France, sous le nom Lactium®). La Demanderesse a ainsi observé que la population de bactéries lactiques vivantes dans le produit fini continue de métaboliser le peptide bioactif pendant le stockage du produit fini, si bien qu'après seulement 10 jours (pour des produits frais dont la DLC est de 28 jours), entre 35 et 55% environ du peptide bioactif αSi [91-100] ont disparu, ce qui est tout à fait inacceptable pour garantir un effet « santé » chez le consommateur (données non montrées).
Puisque la consommation du peptide bioactif est le fait de l'activité métabolique des ferments, on pourrait envisager de réduire ce phénomène en détruisant tout ou partie des microorganismes, par exemple à l'aide d'un traitement thermique approprié (thermisation ou pasteurisation). En ce cas, il est possible de préserver le peptide bioactif αS-i [91-100] (par exemple après chauffage à 750C pendant environ 1 min). Toutefois, une telle solution présente de nombreux inconvénients :
- la thermisation d'une masse laitière fermentée implique l'usage de stabilisants ajoutés avant le traitement thermique (pectines, amidons, carraghénanes, etc.), ce qui complique le procédé et augmente sensiblement le coût de la formule ;
- la ligne de fabrication industrielle est plus complexe et demande un investissement spécifique plus important ;
- le produit ne bénéficie plus d'appellations liées aux produits contenant des ferments vivants (type yoghourt) et perd de fait les bénéfices associés à la consommation de ferments lactiques ; et
- l'impact organoleptique, généralement négatif, est significatif.
II existe dès lors un besoin pour un produit alimentaire contenant à la fois des microorganismes vivants, par exemple un yoghourt, et un ou plusieurs ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt, dans lequel ces ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt seraient protégés contre la métabolisation par lesdits microorganismes vivants, et ce, tout en préservant les qualités organoleptiques du produit alimentaire.
Par la présente invention, la Demanderesse apporte une solution qui permet de satisfaire le besoin existant. Un objet de la présente invention est donc un produit alimentaire contenant un ou plusieurs microorganismes vivants et au moins un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants et le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont mis en œuvre de manière à réduire la métabolisation du ou desdits ingrédients bioactifs par le ou lesdits microorganismes vivants. Ainsi, la Demanderesse a pu montrer qu'un ou plusieurs ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt pouvaient être efficacement protégés contre la métabolisation par des microorganismes vivants, dès lors que les conditions de mise en œuvre des uns avec les autres sont appropriées. De telles conditions de mise en œuvre appropriées peuvent faire appel à divers moyens, parmi lesquels : a) l'utilisation de microorganismes vivants dont la capacité à métaboliser les ingrédients bioactifs est réduite ; et/ou b) l'utilisation d'ingrédients alimentaires leurres qui sont délibérément « livrés en pâture » aux microorganismes vivants ; et/ou c) la mise en œuvre d'une protection physique des ingrédients bioactifs, notamment par encapsulation de ces derniers.
On notera à cet égard qu'un ou plusieurs de, voire tous, ces moyens peuvent être avantageusement combinés au sein d'un même produit alimentaire.
Comme indiqué brièvement dans la description générale qui précède, par « métabolisé » ou « métabolisation », on entend désigner selon la présente invention la transformation ou dégradation d'une substance par un ou plusieurs microorganismes vivants, visant à sa consommation à titre de source de nutriments, et ayant pour conséquence finale sa disparition, plus ou moins complète, du milieu. Au sens de l'invention, la métabolisation d'un ingrédient est « réduite » si elle est inférieure à la métabolisation du même ingrédient lorsque ce dernier n'est pas protégé par au moins l'un des moyens prévus dans le cadre de la présente invention.
Avantageusement, et idéalement, cette métabolisation réduite tend vers, voire vaut, zéro, ce qui revient à peu, quasiment pas, voire pas, de métabolisation dudit ingrédient.
Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, la quantité résiduelle d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt dans ledit produit alimentaire est, 3 semaines après sa préparation, comprise entre 50 et 100 % environ par rapport à la quantité d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt présente dans le produit juste après sa préparation.
Préférentiellement, ladite quantité résiduelle est comprise entre 80 et 100% environ. Par « quantité résiduelle en ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt dans ledit produit alimentaire », on entend désigner selon la présente invention le pourcentage d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt présent dans ledit produit alimentaire lorsque ce dernier est maintenu dans des conditions de stockage adaptées (par exemple, de l'ordre de 4 à 100C pour un produit frais) pendant 3 semaines, par rapport au pourcentage d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt présent au départ, c'est-à-dire juste après fabrication du produit. Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont choisis parmi : - des protéines,
- des peptides,
- des analogues ou dérivés de ceux-ci, et leurs combinaisons.
Préférentiellement, l'ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt est choisi parmi : le peptide bioactif αSi [91-100] (voir le brevet européen
EP 0 714 910), le peptide C6-αsi 194-199 (voir le brevet américain US
6 514 941 ), le peptide C7-β177-183 (voir le brevet américain US
6 514 941 ), le peptide C12-αsi23-34 (voir le brevet US américain
6 514 941 ), les caséinophosphopeptides, l'α-casomorphine, la caséine α exorphine, la casokinine, la β-casomorphine, les caséinomacropeptides
(CMP) aussi appelés glycomacropeptides (GMP) ou caséinoglycomacropeptides (CGMP), la casoxine, les casopiatellines, les fragments 50-53, les β-lactorphines, la lactoferroxine, les peptides VaI-
Pro-Pro (voir le brevet européen EP 0 583 074), Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro- GIn (voir la demande EP 0 737 690), Tyr-Lys-Val-Pro-GIn-Leu (voir la demande EP 0 737 690), Tyr-Pro (voir la demande EP 1 302 207 et le brevet EP 0 821 968), ile-Pro-Pro (voir Nakamura et al., 1995 ; et brevet japonais JP 6 197 786), des fragments, analogues, dérivés de ceux-ci, des protéines et/ou peptides les contenant, et leurs combinaisons (pour une revue, voir notamment la Danone World Newsletter N°17 de septembre 1998).
De manière encore plus préférée, l'ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt est choisi parmi : le peptide bioactif OcS1 [91-100], des fragments, analogues, dérivés de celui-ci, des protéines et/ou peptides les contenant, et leurs combinaisons.
On entend par « analogue », n'importe quelle version modifiée d'un composé initial, ici une protéine ou un peptide, ladite version modifiée pouvant être naturelle ou synthétique, dans laquelle un ou plusieurs atomes, tels que des atomes de carbone, d'hydrogène, d'oxygène, ou des hétéroatomes tels que l'azote, le soufre ou un halogène, ont été ajoutés ou supprimés de la structure du composé initial, de manière à obtenir un nouveau composé moléculaire.
Un « dérivé » au sens de l'invention est n'importe quel composé qui présente une ressemblance ou un motif structurel en commun avec un composé de référence (protéine ou peptide). Entrent également dans cette définition, d'une part les composés qui, seuls ou avec d'autres composés, peuvent être des précurseurs ou des produits intermédiaires dans la synthèse d'un composé de référence, moyennant une ou plusieurs réactions chimiques, et d'autre part les composés qui peuvent être formés à partir dudit composé de référence, seul ou avec d'autres composés, via une ou plusieurs réactions chimiques.
Sont ainsi couverts par la définition de « dérivés » ci-dessus au moins les hydrolysats, notamment trypsiques, de protéines et/ou peptides, les fractions d'hydrolysats, ainsi que les mélanges d'hydrolysats et/ou de fractions d'hydrolysats. De plus, les termes « analogue » et « dérivé d'un peptide ou d'une protéine » susmentionnés couvrent par exemple un peptide ou une protéine glycosylé(e) ou phosphorylé(e) ou encore ayant subi n'importe quel greffage de groupement chimique. Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, l'ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt peut être notamment un sucre ou un acide gras.
Avantageusement, le ou lesdits microorganismes vivants se caractérisent par une capacité réduite, voire nulle, de métabolisation des ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt.
Selon la présente invention, une « capacité réduite de métabolisation » est telle que la quantité d'ingrédients bioactifs d'intérêt métabolisée pendant la fermentation (qui disparaît donc du milieu) est inférieure ou égale à 40% de la quantité d'ingrédients initiale (avant fermentation). Ceci se traduit mathématiquement par : Qr > 0,6 Q0 (1 ) Où :
Qr : quantité d'ingrédients bioactifs résiduelle (présente dans le milieu après fermentation) Q0 : quantité d'ingrédients bioactifs initiale
La quantité d'ingrédients bioactifs résiduelle Qr peut être mesurée par une méthode de chromatographie liquide CLHP couplée à un détecteur de type MS/MS. Un exemple de procédure expérimentale est donné dans les exemples ci-dessous. Préférentiellement, le ou lesdits microorganismes vivants sont des souches sauvages et/ou des variants naturels et/ou des mutants obtenus par génie génétique.
Par « souche variante » ou « variant », on entend désigner dans la présente demande une souche obtenue principalement par mutation sélective à partir d'une souche de référence, et présentant la propriété d'intérêt recherchée, à savoir la capacité, réduite ou nulle, à métaboliser le ou lesdits ingrédient(s) alimentaire(s) bioactifs d'intérêt décrite ci-avant. Un « mutant » ou une « souche mutante » au sens de l'invention est une souche obtenue grâce à des techniques de mutagénèse dirigée, à partir d'une souche de référence. Un tel mutant présente, comme les variants définis ci-dessus, la propriété d'intérêt recherchée. Les techniques d'obtention de variants naturels par mutation sélective, ou d'obtention de mutants par génie génétique, notamment par transformation génétique à l'aide de vecteurs, sont connues de l'homme du métier. A cet égard, l'on pourra notamment se référer à l'ouvrage Sambrook et Russel (2001 ). En particulier, l'homme du métier pourra inspirer le protocole de mutation sélective de la procédure expérimentale décrite par Biswas et al. (1993). Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, le ou lesdits microorganismes vivants sont des bactéries, de préférence des bactéries lactiques, vivantes. De préférence, la capacité d'au moins un mécanisme choisi parmi :
- un système de métabolisation extracellulaire des protéines et des peptides, - un système de transport des peptides vers l'intérieur de la cellule, ou
- un système de métabolisation intracellulaire des peptides, est réduite chez lesdites bactéries vivantes.
On désigne ici par « capacité réduite d'un mécanisme de métabolisation et/ou transport », un mécanisme de métabolisation et/ou transport tel que mentionné supra, dont la capacité (ou l'activité) ne lui permet pas de métaboliser et/ou transporter plus de 40% environ d'ingrédients bioactifs d'intérêt pendant la fermentation.
De manière encore préférée, le ou lesdits mécanisme(s) est (sont) non fonctionnel(s) chez lesdites bactéries vivantes. En particulier, ledit mécanisme, de capacité réduite ou non fonctionnel, est un système de transport des peptides vers l'intérieur de la cellule. Plus particulièrement encore, ledit système de transport de peptides est le système AMI (voir, par exemple, Garault et al., 2002) ou le système OPP (chez L. bulgaricus : Peltoniemi et al., 2002 ; chez L. lactis : Detmers et al., 1998).
Les bactéries vivantes susceptibles d'être utilisées dans le cadre de l'invention peuvent notamment être choisies parmi :
- Streptococcus spp, de préférence Streptococcus thermophilus ;
- Lactobacillus spp ;
- Lactococcus spp ; et
- Bifidobactehum spp.
De préférence, lesdites bactéries vivantes sont choisies parmi : - Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM (Collection
Nationale de Cultures des Microorganismes (Institut Pasteur, Paris, France)) le 24/01/02 sous le numéro I-2774 ;
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 10/05/04 sous le numéro 1-3211 ; - Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro 1-3301 ; et
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro I-3302.
De manière encore préférée, lesdites bactéries vivantes sont des bactéries S. thermophilus déposées à la CNCM le 10/05/04 sous le numéro 1-3211.
Avantageusement, le produit alimentaire selon la présente invention contient au moins les bactéries vivantes S. thermophilus et Lactobacillus spp. Préférentiellement, lesdites bactéries vivantes Streptococcus thermophilus sont choisies parmi S. thermophilus déposée à la CNCM le 24/01/02 sous le numéro I-2774, S. thermophilus déposée à la CNCM le 10/05/04 sous le numéro 1-3211 , S. thermophilus déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro 1-3301 , et S. thermophilus déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro I-3302.
La teneur du produit alimentaire selon l'invention en microorganismes vivants peut varier et sera choisie par l'homme du métier à la lumière de ses connaissances générales dans le domaine. En pratique, on recherchera de préférence une teneur globale standard, par exemple de l'ordre de 107 à 109 bactéries par gramme de produit alimentaire. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont encapsulés. Par « encapsulé » ou « encapsulation », on entend désigner selon la présente invention la mise en œuvre d'un procédé de protection d'un principe actif dans un véhicule de type microparticule afin de permettre un relarguarge contrôlé de ce principe actif. En l'espèce, le principe actif est constitué par un ou plusieurs ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt. Cette encapsulation apporte une solution complémentaire à celle selon la présente invention, en ce qu'elle permet auxdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt de ne pas être métabolisés par les microorganismes vivants.
En outre, et de manière tout à fait avantageuse, l'encapsulation permet d'obtenir un produit final organoleptiquement plus acceptable, par exemple en masquant l'amertume plus ou moins forte de certains ingrédients bioactifs, en particulier de certains peptides. Enfin, l'encapsulation permet aux ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt de parvenir jusqu'au niveau de l'intestin, sans être dégradés, et de traverser la barrière intestinale sans dommages afin d'y déployer leurs effets. Selon un autre mode de réalisation particulier de la présente invention, le produit alimentaire contient en outre au moins un ingrédient alimentaire leurre.
Par « ingrédient alimentaire leurre », on entend désigner selon la présente invention un ingrédient alimentaire (de préférence un peptide, une protéine, un analogue ou un dérivé de ceux-ci, et leurs combinaisons) capable de servir de source de nutriments (notamment de source d'azote) pour des microorganismes vivants, et destiné à être préférentiellement métaboiisé par lesdits microorganismes, de manière à détourner ces derniers des ingrédients bioactifs d'intérêt que l'on entend bien entendu préserver en priorité. Ainsi, l'ingrédient leurre représente une source nutritive pour les microorganismes, que l'on sacrifie délibérément afin de sauvegarder le plus possible les ingrédients bioactifs d'intérêt. L'ingrédient alimentaire leurre agit à cet égard comme un inhibiteur compétitif du transport des ingrédients bioactifs d'intérêt.
On notera que les modes de réalisation particuliers susdécrits peuvent avantageusement être combinés.
Préférentiellement, le produit alimentaire selon la présente invention est un produit fermenté. De manière encore préférée, le produit alimentaire fermenté est un produit laitier ou végétal.
Par « produit laitier », on entend désigner selon la présente invention, en plus du lait, les produits dérivés du lait, tels la crème, la crème glacée, le beurre, le fromage, le yoghourt ; les produits secondaires, comme le lactosérum, la caséine ; ainsi que n'importe quel aliment préparé contenant, comme ingrédient principal, du lait ou des constituants du lait. Par « produit végétal », on entend désigner, entre autres, des produits obtenus à partir d'une base végétale telle que, par exemple, les jus de fruits et les jus végétaux parmi lesquels le jus de soja, le jus d'avoine ou le jus de riz. En outre, les définitions ci-dessus de « produit laitier » et « produit végétal » couvrent chacune n'importe quel produit à base d'un mélange de produits laitiers et végétaux, tels qu'un mélange de lait et de jus de fruits, par exemple. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un produit alimentaire tel que décrit ci-dessus, dans lequel un ou plusieurs microorganisme(s) vivant(s) et un ou plusieurs ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt encapsulés sont ajoutés dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire. Selon un mode de réalisation, le ou lesdits ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt sont ajoutés audit mélange les uns après les autres. Alternativement et préférentiellement, le ou lesdits ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt sont ajoutés simultanément dans ledit mélange. Les conditions de culture des microorganismes dépendent desdits microorganismes et sont connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, on précisera que les températures optimales de croissance pour S. thermophilus se situent généralement entre 36 et 420C environ ; elles se situent entre 42° et 46°C environ pour L. delbrueckii spp. bulgaricus (que l'on trouve typiquement dans les yoghourts).
En règle générale, l'arrêt de la fermentation, qui dépend du pH que l'on souhaite atteindre, est obtenu par refroidissement rapide, ce qui permet de ralentir l'activité métabolique des microorganismes. Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont préparés directement dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire. On parlera à cet égard de synthèse in situ du ou desdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt. En cas de synthèse in situ, on peut indifféremment prévoir que le ou lesdits microorganismes vivants sont ajoutés dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire, avant, pendant ou après, la synthèse in situ du ou desdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt. La présente invention a en outre pour objet l'utilisation d'un produit alimentaire tel que décrit supra comme aliment fonctionnel. Par « aliment fonctionnel », on entend désigner un produit alimentaire qui affecte avantageusement une ou plusieurs fonctions cibles de l'organisme, indépendamment de ses effets nutritionnels. Il peut ainsi en résulter une amélioration de l'état de santé et/ou du bien-être et/ou une réduction des risques d'apparition de maladies chez un consommateur qui ingère des quantités normales dudit produit. A titre d'exemples d'activités d'un « aliment fonctionnel », on citera notamment des activités anti¬ cancéreuses, immunostimulatrices, promotrices de la santé osseuse, anti¬ stress, opiacées, anti-hypertension, amélioratrices de la biodisponibilité du calcium, ou encore anti-microbiennes (Functional Food Science in Europe, 1998).
De tels aliments fonctionnels peuvent être destinés à l'homme et/ou aux animaux.
La présente invention a également pour objet l'utilisation, dans un produit alimentaire, d'un microorganisme vivant ayant une capacité réduite de métabolisation d'un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt, pour protéger ledit ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt contre la métabolisation par ledit microorganisme vivant.
La présente invention est illustrée par les figures suivantes, qui ne sont en aucun cas limitatives.
Figure 1 : Chromatogramme LC-MS illustrant la disparition du peptide bioactif αS1 [91-100] inclus dans l'ingrédient Lactium® pendant la fermentation lactique. Le détecteur MS/MS est réglé de façon à ne faire apparaître que le signal des ions de m/z = 634.5 Da (masse du peptide αS1 [91-100] doublement chargé) qui présentent, après fragmentation, des ions fils de m/z = 991.5 Da ; 771.5 Da ; 658.3 Da (fragments caractéristiques du peptide αS1 [91-100]).
Figure 2 : Identification et quantification des principaux peptides de l'ingrédient Lactium® par LC-MS/MS avant et après fermentation du « mix » laitier par un ferment consistant en un mélange des souches I- 2783 (déposée à la CNCM le 24/01/02), I-2774 (déposée à la CNCM le 24/01/02), I-2835 (déposée à la CNCM le 04/04/02) et le 1-1968 (déposée à la CNCM le 14/01/98). Après fermentation, ces peptides ne sont plus retrouvés qu'à l'état de traces et se confondent avec la ligne de base. « ? » signifie que l'identification de la séquence n'a pas été possible ou n'est pas certaine ; seule la masse du peptide est alors rapportée. Figure 3 : Profils peptidiques comparés (chromatogrammes LC-MS/MS) d'un « mix » laitier contenant 1.5 g/L d'hydrolysat DMV C 12®, avant (1 ) et après fermentation (2) jusqu'à pH 4.7 par le ferment lactique Hansen YC380. La quasi-totalité des peptides de l'hydrolysat, dont le peptide bioactif C12 (fragment αS1 [23-34]), a disparu suite à la métabolisation par les souches du ferment.
Figure 4 : Courbes illustrant l'évolution de la teneur résiduelle en peptide bioactif αS1 [91-100] dans un produit fini constitué de 95% de masse fermentée par le ferment contenant les souches I-2783, I-2774, I-2835 et 1-1968, et de 5% de sirop de sucre aromatisé contenant le peptide αS1 [91-100], pendant le stockage à 10 0C. L'expérience a été réalisée à raison de 4 essais indépendants E1 , E2, E3 et E4. Figure 5 : Courbes illustrant l'évolution de la teneur résiduelle en peptide bioactif αS1 [91-100], ajouté après fermentation dans un produit fermenté puis thermisé à 75°C pendant 1 minute, et stocké à 10 0C jusqu'à la date limite de consommation (DLC).
Figure 6 : Illustration de l'évolution de la teneur résiduelle en peptide bioactif αS1 [91-100] dans un produit fini constitué de 95% de masse fermentée par le ferment contenant la souche I-2774 et du formiate et de 5% de sirop de sucre aromatisé contenant le peptide αS1 [91-100] (apporté sous la forme de Lactium®, dosé à 1.5 g/Kg de produit fini), pendant le stockage à 10 0C jusqu'à DLC.
Figure 7 : Illustration de l'évolution de la teneur résiduelle en peptide bioactif αS1 [91-100], ajouté avant fermentation, dans un produit fini constitué de masse laitière fermentée par le ferment contenant la souche I-2774 et du formiate.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples suivants, donnés à titre purement illustratif.
Exemples
Exemple 1 : Mise en œuvre d'ingrédients bioactifs d'intérêt sans mettre en application l'invention revendiquée
1.1) Exemple avec le peptide bioactif αS1 [91-100] contenu dans l'hydrolysat Lactium®
La mise en œuvre d'ingrédients du type peptide ou protéine, souvent apportés sous forme de poudres, est plus simple lorsque ceux-ci sont ajoutés lors de l'étape de préparation du « mix » laitier (poudrage du lait), avant le traitement thermique de sanitation (Le., 950C, 8 min) et, donc, avant la fermentation. En ce cas, le risque de métabolisation du peptide actif est très élevé. C'est, pour l'exemple, le cas lors de l'utilisation d'un ingrédient fonctionnel comme le Lactium ® (Ingredia, France) contenant un peptide bio-actif (fragment 91-100 de la caséine αS1 ).
Protocole : le milieu a été préparé par hydratation d'une poudre de lait écrémé à 120 g/L, additionné de 1.5 g/L d'ingrédient Lactium®
(correspondant à environ 30 mg/L de peptide bioactif αS1 [91-100]), puis pasteurisé à 950C pendant 8 minutes. Le ferment lactique a été ajouté à un taux de 0.02%, et la fermentation a été conduite à la température optimale du ferment sélectionné (entre 37 et 42°C), jusqu'à atteindre un pH de 4.70.
L'analyse des peptides résiduels, et notamment celle du peptide bioactif αS1 [91-100], a été conduite avec une méthode de chromatographie liquide CLHP couplée à un détecteur de type MS/MS comme décrit ci- après :
- l'échantillon a été préparé par dilution du milieu fermenté dans un mélange d'eau, de méthanol et d'acide trifluoroacétique (50/50/0.1%), dans un rapport de 1 à 6 environ. Le surnageant après centrifugation constituait l'échantillon représentatif du contenu peptidique du milieu fermenté.
Cet échantillon a été injecté dans un système chromatographique CLHP de type Agilent 1100 (société Agilent Technologies France, 1 rue Galvani 91745 Massy cedex, France), équipé d'une colonne adaptée à l'analyse des peptides, de type Waters Symetry® (5μm 2.1 x 150 mm, WAT056975, Waters France, 5, Rue Jacques Monod, 78280 Guyancourt) à la température de 400C, débit de 0.25 ml/min. Les peptides ont été élues de façon classique avec un gradient croissant de solvant B (Acétonitrile + 0.100% d'acide formique) dans le solvant A (Eau + 0.106% acide formique), sur une durée de 40 min à 2 heures en fonction de la résolution souhaitée.
- La détection a été effectuée à l'aide d'un détecteur spécifique de type MS/MS, par exemple avec un appareil à trappe ionique comme l'Esquire3000+ (Bruker Daltonique, rue de l'Industrie, 67166
Wissembourg Cedex), réglé soit pour l'analyse globale du contenu peptidique (mode MS-MS), soit pour la quantification précise et spécifique d'un peptide à partir de ses fragments caractéristiques. Par exemple, le peptide αS1 [91-100]) a été isolé à partir de sa masse (ion doublement chargé de masse 634.5 Da) et quantifié à partir de l'intensité de ses ions fils caractéristiques après fragmentation (ions de m/z de 991.5 Da, 771.5 Da et 658.3 Da). De façon encore plus précise, un étalon interne constitué du même peptide de synthèse deutéré deux fois (fragment caractéristique de 993.5 Da) a permis de prendre en compte et de s'affranchir d'éventuelles interférences liées à la matrice.
Les résultats sont illustrés par la figure 1.
Lors de sa mise en œuvre à ce stade (avant fermentation par un ferment consistant en un mélange des souches I-2783 (déposée à la CNCM le 24/01/02), I-2774 (déposée à la CNCM le 24/01/02), I-2835 (déposée à la CNCM le 04/04/02) et 1-1968 (déposée à la CNCM le 14/01/98), ou un ferment tel que YC380 (Chr. Hansen SA, Le Moulin d'Aulnay, BP64, 91292 ARPAJON Cedex France), on a mis en évidence que plus de 95% du peptide bioactif αS1 [91-100] étaient consommés après fermentation. Ces observations montrent que l'incorporation de peptides bioactifs conformément à ce qui précède n'est pas applicable telle quelle à l'obtention de produits alimentaires, notamment laitiers, supplémentés avec des quantités de peptides et/ou protéines bioactifs suffisamment stables dans le temps pour observer l'effet recherché chez le consommateur.
1. 2) Exemples avec d'autres peptides bioactifs d'intérêt
Les résultats sont illustrés par les figures 2 et 3.
L'ingrédient Lactium® contient de nombreux autres peptides, dont certains présentent potentiellement une activité biologique (comme le fragment 23-34 de la caséine αS1 , que l'on retrouve aussi commercialisé dans l'ingrédient C12 de la société DMV International). Il est intéressant de constater que la quasi-totalité des peptides apportés par l'ajout du Lactium® sont largement consommés pendant la fermentation. Quelle que soit leur origine (provenant des différentes caséines αS1 , αS2, K, β) et leur taille (de 2 à 3 résidus jusqu'à 12 résidus et plus), tous les peptides sont globalement consommés pendant le processus de fermentation.
1.3) Mise en œuvre du peptide bioactif αS1 [91-100] (Lactium®) avec d'autres ferments
Afin de vérifier que ce phénomène n'était pas particulier aux deux ferments utilisés dans le paragraphe 1.1 ) ci-dessus, les principaux ferments industriels, ainsi que différentes souches pures rentrant dans la composition de ces ferments, ont été testés sur la base du même test : du lait reconstitué à partir de poudre de lait, auquel a été ajouté le Lactium® à une dose de 1 ,5 g/L, a été fermenté dans des conditions standard (température optimale du ferment entre 37 et 42°C, arrêt de la fermentation à pH 4.7, 2 répétitions). L'analyse du taux de peptide bioactif αS1 [91-100] a ensuite été réalisée sur l'échantillon avant et après fermentation.
Les résultats obtenus sur les souches pures sont présentés dans le Tableau 3 ci-dessous :
Tableau 3
Dans le tableau 3 ci-dessus, qui reflète la consommation du peptide bioactif αS1 [91-100] par différents ferments et souches industrielles lors de la fermentation d'un mix laitier contenant 1.5 g/L de Lactium®, les souches pures ont été identifiées par leurs numéro et date de dépôt respectifs auprès de la CNCM (Institut Pasteur, Paris, France). Le Tableau 3 montre que la totalité des ferments et souches testés métabolisent de 94 à 100% du peptide bioactif αS1 [91-100] pendant la fermentation d'un mix laitier standard. La mise en oeuvre de cet ingrédient est donc impossible dans des conditions classiques pour produire des produits alimentaires, notamment laitiers, contenant des peptides et/ou protéines bioactifs en quantités suffisamment stables au cours du temps pour produire un effet chez le consommateur.
En outre, afin de vérifier que ce phénomène n'était pas particulier à l'ingrédient Lactium®, plusieurs combinaisons de ferments et d'autres ingrédients à base de peptides bioactifs ont été étudiées en mettant en œuvre le même test (lait reconstitué + ingrédient à tester à une dose de 1 ,5 g/L, fermenté dans des conditions standard, arrêt de la fermentation à pH 4.7, 2 répétitions). Les diverses combinaisons testées sont rapportées dans le Tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4
Les ingrédients C12 et CPP produits par la société DMV International sont des hydrolysats de protéines de lait contenant des peptides bioactifs ciblant respectivement le contrôle de l'hypertension et l'assimilation des minéraux. Sur l'ensemble des expérimentations, il est apparu que tous les ferments testés ont une importante capacité de métabolisation des peptides, quelles que soient leur nature et leur taille.
1.4) Ajout après fermentation
Une alternative logique à la procédure étudiée ci-dessus est d'introduire l'ingrédient fonctionnel après la fermentation (procédé de type « différentiation retardée »), par exemple avec le sirop permettant d'aromatiser la masse fermentée. La mise en œuvre de la même quantité d'ingrédient Lactium ® selon ce protocole conduit aux résultats illustrés par la figure 4.
Comme le montre la figure 4, même ajouté à froid (4°C) après fermentation, le peptide actif (apporté par l'équivalent de 1.5 g de Lactium® par kg de produit fini) est rapidement dégradé au cours du stockage, pour ne laisser que 30 à 40% de la quantité initiale à la date limite de consommation (DLC).
Ainsi, la population de bactéries lactiques vivantes dans le produit fini continue de métaboliser le peptide bioactif pendant le stockage du produit fini, si bien qu'après seulement 10 jours (pour des produits frais dont la DLC est de 28 jours), entre 35 et 50% du peptide αS1 [91-100] ont disparu, ce qui reste inacceptable pour obtenir l'effet recherché chez le consommateur.
1.5) Traitement thermique du produit laitier fermenté contenant l'ingrédient bioactif d'intérêt
En ce cas, il est possible d'assurer la stabilité du peptide αS1 [91-100] (Figure 5), mais au détriment de la qualité globale du produit fini. Cette solution présente en effet de nombreux inconvénients : - la thermisation d'une masse laitière fermentée implique l'usage de stabilisants ajoutés avant le traitement thermique (pectines, amidons, carraghenanes, etc .). ce qui complique le procédé et augmente sensiblement le coût de la formule ; - la ligne de fabrication industrielle est plus complexe et demande un investissement spécifique plus important ; le produit ne bénéficie plus d'appellations liées aux produits contenant des ferments vivants (type yoghourt) et perd de fait les bénéfices associés à la consommation de ferments lactiques ; - l'impact organoleptique (généralement négatif) est significatif.
Exemple 2 : Mise en œuvre d'ingrédients bioactifs d'intérêt en mettant en application l'invention revendiquée
Un criblage a été réalisé sur des ferments industriels, sur la base de leur capacité à ne pas consommer le peptide αS1 [91-100]. Sur les 30 ferments testés, tous consomment l'essentiel du peptide αS1 [91-100] pendant la fermentation, sauf un, le ferment contenant la seule souche I- 2774 et du formiate, la souche I-2774 étant microbiologiquement atypique. Une autre souche a été testée : il s'agit d'un variant naturel de la souche 1-1630 déposée à la CNCM le 24/10/95 (qui, elle, consomme le peptide). Ce variant 1-3211 (déposé à la CNCM le 10/05/04) a été obtenu par génération de mutants naturels ne disposant pas de système de transport de peptide (système AMI-). Il s'avère effectivement que ce variant ne consomme pas le peptide αS1 [91-100], ni la plupart des autres peptides. Parmi les applications testées au niveau pilote et même industriel, la mise en œuvre du peptide bioactif αs1 [91-100] apporté sous la forme d'ingrédient Lactium ® (Ingrédia) a pu être effectuée avec succès grâce à l'utilisation du ferment contenant la souche I-2774 et du formiate. La figure 6 présente les résultats de stabilité obtenus. De façon encore plus spectaculaire, le peptide en question a pu être avantageusement introduit avant fermentation (ce qui simplifie la mise en œuvre industrielle), comme le montre la figure 7.
Ainsi, la disparition du peptide d'intérêt pendant la fermentation (d'une durée de 12 heures à ~ 41 0C) ne dépasse pas 3 à 4% de la quantité initiale, là où les autres ferments consomment la quasi-totalité des peptides. Dans des conditions identiques aux expérimentations décrites dans le Tableau 4, les souches I-2774 et 1-3211 donnent en effet des taux de survie du peptide αS1 [91-100] après fermentation supérieurs à 85%. La capacité, fortement réduite, de métabolisation des peptides par les souches 1-2774 et 1-3211 permet plus largement la mise en œuvre de tout type de peptide bioactif, dont entre autres, de nombreux hydrolysats commerciaux qui ont fait l'objet de tests concluants. Les expérimentations décrites dans le Tableau 4 ont ainsi été étendues avec succès à l'utilisation des ferments/souches 1-2774 et 1-3211.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Produit alimentaire contenant un ou plusieurs microorganismes vivants et au moins un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants et le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont mis en œuvre de manière à réduire la métabolisation du ou desdits ingrédients alimentaires d'intérêt par le ou lesdits microorganismes vivants.
2. Produit alimentaire selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la quantité résiduelle d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt dans ledit produit alimentaire est, 3 semaines après sa préparation, comprise entre 50 et 100 % environ par rapport à la quantité d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt présente dans le produit juste après sa préparation.
3. Produit alimentaire selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite quantité résiduelle est comprise entre 80 et 100% environ par rapport à ladite quantité d'ingrédient(s) aiimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt présente dans le produit juste après sa préparation.
4. Produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont choisis parmi :
- des protéines,
- des peptides,
- des analogues ou dérivés de ceux-ci, et - leurs combinaisons.
5. Produit alimentaire selon la revendication 4, caractérisé en ce que le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont choisis parmi : le peptide αS1 [91-100], le peptide C6-αsi 194-199, le peptide C7-β177- 183, le peptide C12-αsi23-34, les caséinophosphopeptides, l'α- casomorphine, la caséine α exorphine, la casokinine, la β-casomorphine, les caséinomacropeptides et les glycomacropeptides, la casoxine, les casoplatellines, les fragments 50-53, les β-lactorphines, la lactoferroxine, les peptides Val-Pro-Pro, Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-GIn, Tyr-Lys-Val-Pro- Gln-Leu, Tyr-Pro, Ile-Pro-Pro, des fragments, analogues, dérivés de ceux- ci, des protéines et/ou peptides les contenant, et leurs combinaisons.
6. Produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants ont une capacité réduite de métabolisation du ou desdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt.
7. Produit alimentaire selon la revendication 6, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants sont des souches sauvages et/ou des variants naturels et/ou des mutants obtenus par génie génétique.
8. Produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants sont des bactéries, de préférence des bactéries lactiques, vivantes.
9. Produit alimentaire selon la revendication 8, caractérisé en ce que la capacité d'au moins un mécanisme choisi parmi :
- un système de métaboiisation extracellulaire des protéines et des peptides,
- un système de transport des peptides vers l'intérieur de la cellule, ou
- un système de métabolisation intracellulaire des peptides, est réduite chez lesdites bactéries vivantes.
10. Produit alimentaire selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit mécanisme est non fonctionnel chez lesdites bactéries vivantes.
11. Produit alimentaire selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que ledit mécanisme est un système de transport des peptides vers l'intérieur de la cellule.
12. Produit alimentaire selon la revendication 11 , caractérisé en ce que ledit système de transport des peptides est le système AMI ou le système OPP.
13. Produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, caractérisé en ce que lesdites bactéries vivantes sont choisies parmi :
Streptococcus spp, de préférence
Streptococcus thermophilus ;
- Lactobacillus spp ;
- Lactococcus spp ; - Bifidobacterium ssp.
14. Produit alimentaire selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il contient au moins les bactéries vivantes S. thermophilus et Lactobacillus spp.
15. Produit alimentaire selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que lesdites bactéries vivantes S. thermophilus sont choisies parmi :
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 24/01/02 sous le numéro I-2774 ; - Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 10/05/04 sous le numéro 1-3211 ; - Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro 1-3301 ;
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro I-3302.
16. Produit alimentaire selon la revendication 15, caractérisé en ce que lesdites bactéries vivantes sont des bactéries S. thermophilus déposées à la CNCM le 10/05/04 sous le numéro 1-3211.
17. Produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont encapsulés.
18. Produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé en ce qu'il contient en outre au moins un ingrédient alimentaire leurre.
19. Produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce qu'il est un produit fermenté.
20. Produit alimentaire selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il est un produit laitier ou végétal.
21. Procédé de préparation d'un produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants et le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont ajoutés les uns après les autres dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire.
22. Procédé de préparation d'un produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants et le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont ajoutés simultanément dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire.
23. Procédé de préparation d'un produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont préparés directement dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire.
24. Procédé de préparation d'un produit alimentaire selon la revendication 23, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants sont ajoutés, dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire, avant la synthèse in situ du ou desdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt.
25. Procédé de préparation d'un produit alimentaire selon la revendication 23, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants sont ajoutés, dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire, pendant la synthèse in situ du ou desdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt.
26. Procédé de préparation d'un produit alimentaire selon la revendication 23, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants sont ajoutés, dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire, après la synthèse in situ du ou desdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt.
27. Utilisation d'un produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 comme aliment fonctionnel.
28. Utilisation, dans un produit alimentaire, d'un microorganisme vivant ayant une capacité réduite de métabolisation d'un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt, pour protéger ledit ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt contre la métabolisation par ledit microorganisme vivant.
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