MX2008000944A - Procedimiento para la produccion de leche fermentada y bebida/alimento de leche fermentada. - Google Patents

Abstract

Se describen: un procedimiento para producir una leche fermentada que puede producir un peptido especifico que tiene funcionales utiles (v.gr., efecto anti-hipertensivo) en una leche fermentada con buena eficiencia y puede impartir excelente sabor y actividades funcionales (v.gr., actividad anti-hipertensiva) a una bebida/alimento de leche fermentada de una manera simple; y una bebida/alimento de leche fermentada que tiene excelente sabor y actividades funcionales que es producida al usar la leche fermentada. El procedimiento comprende la combinacion del paso (A) con el paso (B): el paso (A) en el cual caseina de leche de animal es enzimaticamente digerida con una proteasa (1) que incluye una proteasa especifica (v.gr., papaina); y el paso (B) en el cual caseina de leche de animal o similar es fermentada con bacteria de acido lactico para producir asi VPP, IPP y YP. La bebida/alimento de leche fermentada comprende leche fermentada producida por el procedimiento o un producto de condensacion de la misma y contiene VPP, IPP y YP en cantidades dadas o mas en termicos de las cantidades determinadas al beber.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE LECHE FERMENTADA Y BEBIDA/ALIMENTO DE LECHE FERMENTADA Campo de la Invención La presente invención se refiere a un método para producir una leche fermentada, que facilita la producción efectiva de péptidos que tienen funciones útiles confirmadas, v.gr., un efecto anti-hipertensivo, tales como Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro, y Tyr-Pro, en la leche fermentada resultante, y que convenientemente da excelente gusto y sabor a la leche fermentada resultante que es útil para producir alimento y bebidas de leche fermentada. La presente invención también se refiere a alimento y bebidas de leche fermentada que utilizan la leche fermentada obtenida por este método.

Antecedentes de la Invención Los péptidos que tienen funciones útiles, tales como un efecto anti-hipertensivo han sido aislados de productos de digestión enzimática de la proteína de alimento o alimento fermentado, y se han reportado. En particular, los péptidos que tienen un residuo Pro en su carboxilo terminal a menudo tienen la llamada actividad inhibidora de enzima convertidora de angiotensina (ACE) , que contribuye a la regulación de presión sanguínea en organismos vivos. Se ha demostrado in vivo que esos péptidos presentan un efecto Ref. 189209 anti-hipertensivo. Las publicaciones que no son patente 1 y 2 reportaron que, entre varios péptidos anti-hipertensivos, Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro, y Tyr-Pro, que son péptidos de hidrolizado de la proteína de la leche caseína, tuvieron actividad anti-hipertensiva particularmente fuerte en ratas espontáneamente hipertensas . Un método para producir esos péptidos funcionales se reportó, por ejemplo, en la publicación de patente 1, en donde los péptidos funcionales fueron producidos por componentes de la leche fermentadores con bacterias de ácido láctico, tales como Lactobacillus helveticus . La publicaciones de patente 2 a 4 propusieron métodos para producir los péptidos funcionales por digestión enzimática de caseína, la proteína de la leche primaria. Los métodos que utilizan la digestión enzimática descrita en las publicaciones de patente 2 a 4 permiten la producción efectiva de los péptidos funcionales bajo condiciones adecuadamente seleccionadas, tales como la cantidad de enzima que se ha de usar. Sin embargo, los péptidos funcionales obtenidos por esa digestión enzimática necesitan pasar por purificación, concentración, pulverización y otros procedimientos, antes de usarse en la producción de productos lácteos procesados que tienen un contenido de péptido funcional alto así como buen gusto y sabor, tales como alimento de leche fermentada. Esto inevitablemente complica el procedimiento de producción. Por otra parte, los métodos que utilizan la fermentación por bacterias de ácido láctico permiten la producción directa de una leche fermentada que se puede usar para alimentos, bebidas o materiales de partida de los mismos, y los péptidos funcionales son producidos en la leche fermentada. Por lo tanto, los péptidos funcionales no pasan necesariamente por purificación, concentración, pulverización y otros procedimientos y la leche fermentada obtenida se puede usar convenientemente en la producción de productos lácteos procesados. Sin embargo, la leche fermentada directamente obtenida por el método que utiliza la fermentación de bacterias de ácido láctico descrita en la publicación de patente 1, contenía una cantidad sustancial de caseína sin digerir, y el contenido de los péptidos funcionales en la misma fue bajo. Por lo tanto, se ha necesitado un método que pudiera mejorar adicionalmente la eficiencia de producción de los péptidos funcionales. La publicación de patente 5 propuso una bacteria de ácido láctico particular que mejora la productividad de los péptidos funcionales que tienen actividad anti-hipertensiva y otras propiedades, y que hidroliza la caseína de manera más efectiva, así como leche fermentada producida con esas bacterias de ácido láctico.

La publicación que no es patente 3 reportó que la cantidad efectiva de Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro como los componentes efectivos para lograr el efecto anti-hipertensivo fue 3.4 mg o más por día en adultos en términos de la cantidad total de estos péptidos . A fin de producir un producto final anti-hipertensivo que contenga la cantidad efectiva de los péptidos de, por ejemplo, la leche fermentada preparada con las bacterias de ácido láctico descritas en la publicación de patente anterior 5, se requiere no menos de 60 ml de la leche fermentada. Por otra parte, recientemente se ha requerido el desarrollo técnico para una mejora adicional de gusto y sabor de alimento y bebidas de leche fermentada. A la luz de esto, se requiere un método para producir una leche fermentada que mejore adicionalmente el contenido de los péptidos funcionales producidos en la leche fermentada por bacterias de ácido láctico. Ese método se desea para facilitar el desarrollo de recetas para alimento y bebidas de leche fermentada, y para producir materiales alimenticios funcionales con un gusto y sabor aún mejores o alimento y bebidas de leche fermentada con una cantidad incrementada de los péptidos funcionales. Publicación de Patente 1: JP-2782142-B Publicación de Patente 2: JP-6-128287-A Publicación de Patente 3: JP-2001-136995-A Publicación de Patente 4: WO-2005-012542-A Publicación de Patente 5: JP-3028411-B Publicación que no es Patente 1 Nakamura et al., J. Dairy Sci. 78: pl253-1257 (1995) Publicación que no es Patente 2 Yamamoto et al., J. Dairy Sci. 82: pl388-1393 (1995) Publicación que no es Patente 3 Hata et al., Am. J. Clin. Nutr., p767-771 (1996) Sumario de la Invención Un objeto de la presente invención es proveer un método para producir una leche fermentada que convenientemente dé gusto y sabor o funcionalidades excelentes, tales como efecto anti-hipertensivo, a alimento y bebidas de leche fermentada, el método permite la producción efectiva de péptidos particulares que tiene funciones útiles, tales como efecto anti-hipertensivo en la leche fermentada resultante . Otro objeto de la presente invención es proveer un alimento y bebidas de leche fermentada que utilizan la leche fermentada anterior, que tienen excelente gusto y sabor e incluso funcionalidad. De conformidad con la presente invención, se provee un método para producir una leche fermentada que comprende los pasos de: (A) digestión enzimática de caseína de la leche de animal con proteasa (1) que comprende por lo menos uno de papaína, bromelaína y proteasas que pertenecen a una súperfamilia que muestra reacción enzimática similar a ésta, y (B) fermentación, con bacterias de ácido láctico, de caseína de leche de animal y/o producto de digestión de proteasa (1) de caseína de leche de animal, para producir así por lo menos uno de Val-Pro-Pro (algunas veces referido como VPP de aquí en adelante) , Ile-Pro-Pro (algunas veces referido como IPP de aquí en adelante) , y Tyr-Pro (algunas veces referido como YP de aquí en adelante) en una leche fermentada resultante. De conformidad con la presente invención, también se provee alimento y bebidas de leche fermentada que comprenden una leche fermentada obtenida por el método anterior o un concentrado de la misma, en donde una leche de animal que tiene un contenido de caseína de 3 a 10% en peso se usa como la caseína de leche de animal, y una cantidad de esa proteasa (1) añadida es 0.005 a 0.1% en peso de la cantidad de esa caseína, ese alimento y bebidas de leche fermentada contienen no menos de 1.2 mg/100 ml de Val-Pro-Pro, no menos de 1.0 mg/100 ml de Ile-Pro-Pro, y no menos de 0.5 mg/100 ml de Tyr-Pro.

En el método para producir una leche fermentada de conformidad con la presente invención, puesto que los pasos (A) y (B) descritos anteriormente se realizan en combinación, los péptidos particulares que tienen funciones útiles, tales como efecto anti-hipertensivo pueden ser producidos de manera eficiente en la leche fermentada resultante. Además, buen gusto y sabor así como funcionalidades, tales como efecto anti-hipertensivo, se pueden dar convenientemente a la leche y bebidas de leche fermentada. En particular, al llevar a cabo los pasos (A) y (B) de manera simultánea, el procedimiento de producción se puede simplificar y la eficiencia de producción de los péptidos particulares se puede mejorar. Puesto que el alimento y bebidas de leche fermentada de conformidad con la presente invención utilizan la leche fermentada obtenida por el presente método, que contiene una cantidad sustancial de los péptidos particulares que tienen funciones útiles, su gusto y sabor pueden ser controlados fácilmente, y un excelente gusto y sabor así como funcionalidad se pueden dar a los productos.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1 es una gráfica que muestra las cantidades de péptidos VPP y IPP producidos a diferentes cantidades de bromelaína añadida en el ejemplo 4.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se explicará ahora con detalle. El método de conformidad con la presente invención incluye el paso (A) de digestión enzimática de caseína de leche de animal con proteasa particular (1) . La proteasa particular (1) contiene por lo menos uno de papaína, bromelaína y proteasa que pertenecen a una súperfamilia que muestra reacción enzimática similar a éstas. La proteasa (1) contiene proteasas que tienen especificidad a ß-caseína, que tiene una secuencia de péptidos VPP, IPP, YP o similar, y actividad de proteasa de complemento y refuerzo que de otra manera parece ser insuficiente en el proceso de digestión inicial de la caseína de leche animal en fermentación por bacterias de ácido láctico ordinarias, para mejorar así la productividad de los péptidos con funcionalidad deseada. La papaína, bromelaína y proteasas que pertenecen a una súperfamilia que muestra reacción enzimática similar a éstas usualmente incluyen una proteasa que digiere por lo menos un péptido representado por (Xaa)m-Val-Pro-Pro- (Xbb)n, (Xaa)m-Ile-Pro-Pro- (Xbb)n, o (Xaa)m-Tyr-Pro- (Xbb)n en el lado de carboxilo terminal de (Xaa)m, en donde Xaa y Xbb representan cada uno independientemente un aminoácido arbitrario; Xaa en una secuencia de péptido puede ser el mismo que o diferente de Xaa en las otras secuencias de péptido; Xbb en una secuencia de péptido puede ser el mismo que o diferente de Xbb en las otras secuencias de péptido; m y n son enteros; cuando m es 2 o más, Xaa's pueden ser los mismos o diferentes; y cuando n es 2 o más, Xbb's pueden ser los mismos o diferentes. La papaína puede ser un extracto de papaya, y la bromelaína puede ser un extracto de piña. Ejemplos de las proteasas que pertenecen a la súperfamilia antes mencionada pueden incluir cisteína peptidasas vegetales que tienen un residuo de cisteína en el centro activo como papaína, tales como ananaína, ananasa, extranasa, pinasa, enzima de la piña, traumanasa, papayotina, sumetrina, velardón, peptidasa de la papaya, quimopapaína, proteinasa de la papaya, PPIV, caricaína, proteinasa omega y enzimas que pertenecen a la familia de peptidasa Cl, en donde las proteasas que pertenecen a una súperfamilia de papaína son preferidas. Además, también se puede incluir catepsina, de la cual el centro activo es extremadamente homólogo al de estas enzimas, por lo que se cree que tienen especificidad de sustratos similar al de estas enzimas. La proteasa (1) que se ha de usar en el paso (A) puede ser una mezcla de una pluralidad de enzimas, o puede contener .opcionalmente una proteasa particular distinta a la anterior para mejorar la capacidad de digestión.

Los productos comerciales se pueden usar como proteasa (1) , tales como Papain F (nombre comercial, fabricado por AMANO ENZYME INC.), VERON LlO (nombre comercial, fabricado por HIGUCHI, INC.), Bromelain (nombre comercial, fabricado por GREAT FOOD CO., LTD. O GENENCOR KYOWA CO., LTD.), Papain W-40 (nombre comercial, fabricado por AMANO ENZYME INC.) y papaína purificada de grado alimenticio (fabricada por NAGASE CHEMTEX CORPORATION) . La caseína de leche de animal que se ha de usar en el paso (A) o (B) que se ha de describir particularmente no está particularmente limitada, siempre que esté en forma de cualesquiera materiales alimenticios que contengan caseína de leche de animal que tenga secuencias de péptido VPP, IPP y YP, con funcionalidad, tal como actividad anti-hipertensiva. Ejemplos de ese material alimenticio pueden incluir leche de animal, tales como leche de vaca, leche descremada, leche procesada y extractos de caseína de leche de animal, opcionalmente mezclada con agentes auxiliares para fermentación por bacterias de ácido láctico, tales como vitaminas, ácidos nucleicos o extractos de levadura. En la caseína de leche de animal que se ha de usar en el método de la presente invención, el contenido de caseína no está particularmente limitado, y usualmente es de 3 a 15% en peso, preferiblemente 3 a 10% en peso, para lograr de manera eficiente los efectos deseados de la presente invención. En el paso (A) , la cantidad de proteasa (1) que se ha de usar se puede decidir adecuadamente para lograr los efectos deseados, según su título. Cabe notar, puesto que el paso (A) de digestión enzimática se realiza en combinación con el paso (B) de fermentación por bacterias de ácido láctico que se ha de discutir más adelante, la cantidad de proteasa (1) para lograr el propósito usualmente puede ser menor que el que se requiere para la digestión enzimática de caseína de leche de animal sólo con proteasas. Por ejemplo, la cantidad de proteasa (1) puede ser preferiblemente de 0.005 a 0.1% en peso de la cantidad de caseína de leche de animal. A menos de 0.005% en peso, los efectos deseados de la presente invención pueden no lograrse, mientras que por arriba de 0.1% en peso, se producen péptidos en exceso, que pueden alterar el gusto y sabor del producto resultante. En el paso (A) , la digestión enzimática se puede levar a cabo a la temperatura y pH óptimos de la proteasa (1), usualmente a 25 a 45°C a alrededor de pH neutro. El tiempo para la digestión enzmática se puede decidir adecuadamente según la cantidad de título de la proteasa (1) . Cuando el paso (A) se ha de realizar antes del paso (B) que se ha de discutir más adelante, después de la digestión enzimática, la proteasa (1) puede ser inactivada a 60 a 100°C, antes del paso (B) . Alternativamente, cuando los pasos (A) y (B) se han de realizar de manera simultánea, es decir, cuando la caseína de leche de animal ha de ser enzimáticamente digerida y fermentada con bacterias de ácido láctico al mismo tiempo en un solo medio que contiene tanto proteasa (1) como bacterias de ácido láctico, se prefiere que se fije la temperatura usualmente de 25 a 45°C, que es la temperatura de crecimiento óptima para bacterias de ácido láctico, y el tiempo de fermentación de aproximadamente 5 a 30 horas. El tiempo de fermentación puede ser acortado al añadir una cantidad más grande de la enzima. El método de la presente invención incluye el paso (B) de fermentación, con bacterias de ácido láctico, de caseína de leche de animal y/o el producto de digestión de proteasa (1) de caseína de leche de animal. La caseína de leche de animal que se ha de usar en el paso (B) pueden ser aquellas mencionadas anteriormente. Cuando la caseína de leche de animal se ha de usar en el paso (B) , los pasos (A) y (B) se deben llevar a cabo simultáneamente, como se mencionó antes. Alternativamente, cuando el producto de digestión de proteasa (1) ha de ser sometido a la fermentación con bacterias de ácido láctico en el paso (B) , el paso (B) se debe llevar a cabo después del paso (A) . Las bacterias de ácido láctico que se han de usar en el paso (B) pueden ser bacterias de ácido láctico de los géneros Streptococcus , Lactococcus, Lactobacillus , Bifidobacterium, o similares, donde se prefiere Lactobacillus . Ejemplos más específicos pueden incluir Lactojbacillus bulgaricus, Lactobacill us helveticus, Lactobacillus casei , Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus fermentum, en donde Lactobacill us helveticus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus y Lactobacillus casei son preferidos por su capacidad para producir VPP, IPP y YP de manera más efectiva. Uno o más tipos de estas bacterias de ácido láctico se pueden usar. La cepa de Lactobacillus helveticus puede ser preferiblemente aquellas que tengan una actividad de proteinasa extracelular alta. Por ejemplo, cepas que tienen un valor de U/OD590 no menor que 400 son preferidas, como se mide dé conformidad con el método de Yamamoto et al. (Yamamoto N. , et al., J. Biochem. (1993) 114, 749) basado en el método de T ining et al. (Twining, S., Anal. Biochem. 143 3410 (1984) . Un ejemplo de las cepas preferidas de Lactobacill us helveticus puede ser Lactobacillus helveticus CM4 (depositado en International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki , Japón, bajo el número de acceso FERM BP-6060 el 15 de agosto de 1997) (referido como CM4 de aquí en adelante) . CM4 ha sido depositado bajo el número de acceso antes mencionado bajo el Tratado de Budapest del International Recognition of the Deposit of Microorganisms para los propósitos de procedimiento de patentes, y ya se ha patentado. Las bacterias de ácido láctico están preferiblemente en forma de un iniciador de pre-cultivo que tiene actividad suficientemente alta. El conteo de células inicial preferiblemente puede ser de aproximadamente 105-109 células/ml . El paso (B) se puede realizar como co-fermentación con las bacterias de ácido láctico y una levadura para dar el gusto, sabor y similares mejorados de la leche fermentada resultante. La cepa de la levadura no está particularmente limitada, y preferiblemente puede ser, por ejemplo, levadura del género Saccharomyces, tal como Saccharomyces cerevisiae. El contenido de la levadura puede ser adecuadamente seleccionado para ese propósito. En la fermentación por bacterias de ácido láctico, varios agentes auxiliares para fermentación por bacterias de ácido láctico se pueden usar adicionalmente. Ejemplos de esos agentes auxiliares pueden incluir aminoácidos, vitaminas, minerales, ácidos nucleicos, sales extractos microbianos y detergentes . En el paso (B) , la fermentación por bacterias de ácido láctico preferiblemente se puede llevar a cabo de manera usual a 25 a 45°C, que es la temperatura de crecimiento óptima de las bacterias de ácido láctico, durante 5 a 30 horas, ya sea cuando el paso (B) se lleva a cabo simultáneamente con el paso (A) o después del paso (A) . La neutralización de la fermentación es preferida para promover la fermentación. De conformidad con el método de la presente invención, se puede obtener una leche fermentada que contenga cualquiera de VPP, IPP, y YP en una cantidad mayor que aquella en la leche fermentada obtenida por fermentación con bacterias de ácido láctico ordinarias sin el paso (A) . Más aún, puesto que el presente método incluye el paso (B) , un producto que contiene péptidos tales como VPP, IPP, YP o similares, se puede obtener directamente en forma de una leche fermentada. Además, independientemente de si el paso (B) se lleva a cabo después del paso (A) , o los pasos (A) y (B) se llevan a cabo simultáneamente, por lo menos uno de VPP, IPP y YP se espera que sean producidos en una cantidad mayor que aquella producida simplemente por la fermentación por bacterias de ácido láctico. El alimento y bebidas de leche fermentada de conformidad con la presente invención contienen la leche fermentada o un concentrado de la misma, obtenido por el método anterior de la presente invención en donde una leche de animal que tiene un contenido de caseína de 3 a 10% en peso se usa como la caseína de leche de animal, y la cantidad de proteasa (1) es 0.005 a 0.1% en peso de la cantidad de caseína, y contiene no menos que 1.2 mg/100 ml de VPP, no menos que 1.0 mg/100 ml de IPP y no menos que 0.5 mg/100 ml de YP. Los contenidos de los péptidos particulares en el alimento y bebidas de leche fermentada de la presente invención se pueden medir por varias CLAR. En particular, se puede utilizar el método de CL/EM, que es uno de los métodos que facilitan la evaluación conveniente de varios péptidos. El método de CL/EM reportado por Matsuura et al (Milchwissenschaft , 2004, 60, 24-27) se puede usar. El alimento y bebidas de leche fermentada de conformidad con la presente invención son producidos con la leche fermentada obtenida por el presente método o un concentrado de la misma, y puede estar en forma de, por ejemplo, yogurt, bebidas de bacterias de ácido láctico, bebidas de bacterias de ácido láctico hechas a partir de productos lácteos, o algunos otros alimentos y bebidas lácteos procesados . El alimento y bebidas de leche fermentada de la presente invención también pueden estar en forma de bebidas lácteas para distribución a temperatura ordinaria o en estado enfriado, artículos alimenticios generales, complementos dietéticos o similares. El alimento y bebidas de leche fermentada de la presente invención opcionalmente pueden contener varios aditivos opcionales para mejorar el equilibrio nutricional o gusto y sabor, según su forma. Ejemplos de esos aditivos auxiliares pueden incluir carbohidratos, lípidos, vitaminas, minerales, aditivos nutricionales, edulcorantes, agentes saborizantes, pigmentos y mejoradores de textura. El alimento y bebidas de leche fermentada de conformidad con la presente invención pueden ser provistos como alimentos y bebidas funcionales, tales como alimentos para usos de salud especificados, o como alimento y bebidas funcionales que tienen efecto anti-hipertensivo, ya que los péptidos particulares, VPP, IPP, YP y similares, que se sabe que producen efecto anti-hipertensivo, están contenidos. Cuando el alimento y bebidas de leche fermentada de la presente invención se han de proveer como alimento y bebidas funcionales que tienen efecto anti-hipertensivo, una sola ingesta preferida es usualmente 0.1 ml/kg de peso corporal a 5.0 ml/kg de peso corporal, particularmente 0.3 ml/kg de peso corporal a 0.6 ml/kg de peso corporal en términos de la leche fermentada contenida en los mismos.

Ejemplos La presente invención se explicará ahora con más detalle con referencia a los ejemplos y ejemplos comparativos, que son ilustrativos únicamente y no pretenden limitar la presente invención.

Ejemplos 1-3 y Ejemplos Comparativos 1-6 CM4 se precultivó a 37°C durante 20 horas en un medio de leche compuesto de leche descremada con un contenido de sólidos de 9% en peso que había sido pasteurizado a 100°C, para preparar un iniciador de bacterias de ácido láctico. Después 30 ml de un medio de leche recién preparado compuesto de leche descremada con un contenido de sólidos de 9% en peso se inoculó con este iniciador a 3% en peso, y 0.5 mg de Papain F (nombre comercial, fabricado por AMANO ENZYME INC., derivada de Carica papaya L.) para el ejemplo 1, Purified Papain (nombre comercial, fabricada por NAGASE BIOCHEMICALS, LTD., derivada de Carica papaya L.) para el ejemplo 2, Bromelain F (nombre comercial, fabricado por AMANO ENZYME INC. derivada de Ananas comosus M.) para el ejemplo 3, Portease P (nombre comercial, fabricada por AMANO ENZYME INC. derivada de Aspergillus oryzae) para el ejemplo comparativo 1, Protease A (nombre comercial, fabricada por AMANO ENZYME INC., derivada de Aspergill us oryzae) para el ejemplo comparativo 2, Ne rase F3G (nombre comercial, fabricado por AMANO ENZYME INC., derivada de Rhizopus niveus) para el ejemplo comparativo 3, Neutrase (nombre comercial, fabricada por NOVOZYMES, derivada de Bacillus amyloliquefaciens) para el ejemplo comparativo 4, o Sumizyme FP (nombre comercial, fabricada por SHIN NIHON CHEMICAL CO., LTD., derivada de Aspergillus oryzae) para el ejemplo comparativo 5, se añadió a la misma. Para el ejemplo comparativo 6, un medio de leche compuesto de leche descremada e inoculado únicamente con el iniciador de bacterias de ácido láctico sin una proteasa se preparó. Cada medio se incubó a 32 °C durante 24 horas para digestión enzimática y fermentación con bacterias de ácido láctico, o fermentación con bacterias de ácido láctico únicamente, para preparar una leche fermentada. Cada leche fermentada resultante se centrífugo a 10000 g durante 10 minutos, y los contenidos de péptidos VPP y IPP en 1 ml del sobrenadante del cultivo se determinó por CL/EM (fabricado por SHIMADZU CORPORATION, modelo LCMS2010A) . Los resultados se muestran en la tabla 1.

Ejemplos Comparativos 7-9 A 30 ml de un medio de leche compuesto de leche descremada con un contenido de sólidos de 8% en peso que había sido pasteurizada a 100°C, se añadió 0.5 mg de Papain F (nombre comercial, fabricada por AMANO ENZYME INC., derivada de Carica papaya L.) para ejemplo comparativo 7, esa enzima se usó en el ejemplo 1, Purified Papain (nombre comercial, fabricado por NAGASE BIOCHEMICALS, LTD., derivada de Carica papaya L.) para el ejemplo comparativo 8, la enzima se usó en el ejemplo 2, o Bromelain F (nombre comercial, fabricada por AMANO E?ZYME INC., derivada de Ananas comosus M. ) para el ejemplo comparativo 9, la enzima se usó en el ejemplo 3. Cada medio se incubó a 32 °C durante 24 horas para digestión enzimática para preparar un producto de digestión enzimática. Los contenidos de los péptidos VPP y IPP en cada producto de digestión enzimática se determinaron de la misma manera que en el ejemplo 1. Los resultados se muestran en la tabla 1. La presencia de péptidos que incluían una secuencia de Val-Pro-Pro o Ile-Pro-Pro se detectó en los productos de digestión enzimática preparados en los ejemplos comparativos 7-9, y las secuencias de los péptidos se analizaron para identificar Val-Pro-Pro-Phe-Leu y Ile-Pro-Pro-Leu-Thr en los ejemplos comparativos 7 y 8, en donde las proteasas idénticas con aquellas usadas en los ejemplos 1 y 2 se usaron, y Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met y Ile-Pro-Pro-Leu-Thr en el ejemplo comparativo 9, en donde se usó la proteasa idéntica con aquella usada en el ejemplo 3. A partir de estos resultados, se supone que la digestión enzimática por las proteasas en los ejemplos 1 a 3 dio por resultado la digestión de los péptidos representados por Xaa-Val-Pro-Pro- (Xbb)n y Xaa-Ile-Pro-Pro- (Xbb) n en el lado amino terminal del residuo de aminoácido Xaa, mientras que la fermentación con bacterias de ácido láctico en los ejemplos 1 a 3 dio por resultado la digestión de los mismos péptidos en el lado de carboxilo terminal del residuo de aminoácido (Xbb)n, por lo que Val-pro-Pro y Ile-Pro-pro fueron producidos de manera eficiente en la leche fermentada resultante.

Tabla 1 Como se muestra en la tabla 1, en la leche fermentada del ejemplo comparativo 6 preparada únicamente por la fermentación con bacterias de ácido láctico CM4 , se confirmó alta productividad de VPP y IPP. En las leches fermentadas de los ejemplos 1 a 3 en donde la fermentación se combinó con el uso de las proteasa particulares incluyendo papaína o bromelaína, se confirmó la producción de VPP y IPP en las cantidades 1.7 a 1.9 veces la cantidad del ejemplo comparativo 1. Por otra parte, en las leches fermentadas de los ejemplos comparativos 1 a 5 en donde la fermentación se combinó con el uso de proteasas sin incluir las proteasas particulares usadas en la presente invención, las cantidades de VPP y IPP producidos fueron remarcablemente más bajas que aquellas en la leche fermentada del ejemplo comparativo 6 preparada únicamente por la fermentación con bacterias de ácido láctico CM4. De manera específica, las cantidades de VPP y IPP producidos fueron remarcablemente menores incluso en las leches fermentadas de los ejemplos comparativos 1, 2 y 5, en donde se usaron las proteasas derivadas de Aspergi l l us , que se sabe que tienen la capacidad para producir VPP y IPP de caseína de leche de animal. En los productos de digestión enzimática de ejemplos comparativos 7 a 9, en donde sólo se usaron las proteasas idénticas con aquellas usadas en los ejemplos 1 a 3, no se observó producción de VPP y IPP. Por lo tanto, se confirmó el efecto sinergístico de la combinación de la digestión enzimática por las proteasas particulares y la fermentación con bacterias de ácido láctico.

Ejemplo 4 Se prepararon leches fermentadas de la misma manera que en el ejemplo 3, excepto que la cantidad de la proteasa, bromelaína, se cambió a 0.1 mg, 0.25 mg y 1.0 mg, respectivamente, y los contenidos de los péptidos VPP y IPP en cada leche fermentada se determinaron de la misma manera que en el ejemplo 3. Los resultados se muestran en la figura 1, que también muestra el resultado del ejemplo 3 en donde se usó 0.5 mg de la proteasa, bromelaína, y el ejemplo comparativo 6 en donde no se usó proteasa. En la figura 1, la columna de la izquierda representa el contenido de VPP y las columnas de la derecha representan el contenido de IPP. Aquí, 0.1 mg, 0.25 mg, 0.5 mg, y 1 mg de bromelaína en 30 ml de la leche fermentada corresponden a los contenidos de proteasa de 0.008% en peso, 0.021% en peso, 0.042% en peso, y 0.084% en peso, respectivamente, del contenido de caseína en la leche fermentada. A partir de la figura 1, se confirmó que la adición de bromelaína mejoró la productividad de los dos péptidos, comparado con el caso en donde no se añadió bromelaína. En particular, se confirmó que la adición de la proteasa en el intervalo de 0.25 a 1.0 mg dio por resultado productividad de péptido VPP- y IPP mejorada, que fue aproximadamente 1.5 veces la cantidad producida cuando no se añadió la proteasa.

Ejemplo 5 y Ejemplo Comparativo 10 CM4 se precultivó a 37°C durante 24 horas en un medio de leche compuesto de leche descremada con un contenido de sólidos de 9% en peso que había sido pasteurizado a 95°C, para preparar un iniciador de bacterias de ácido láctico. Después, 1 litro del medio de leche recién preparado compuesto de leche descremada con un contenido de sólidos de 9% en peso se inoculó con este iniciador a 3% en peso, y 10 mg de Bromelain F (nombre comercial, fabricada por AMANO ENZYME INC., derivado de Ananas comos us M.) se añadió para el ejemplo 5. Para el ejemplo comparativo 10, se preparó un medio de leche compuesto de la leche descremada e inoculado sólo con el iniciador de bacterias de ácido láctico sin una proteasa. Cada medio se incubó a 32°C durante 20 horas para digestión enzimática y fermentación con bacterias de ácido láctico, o fermentación con bacterias de ácido láctico únicamente, para preparar una leche fermentada . A cada leche fermentada resultante, un estabilizador y agentes saborizantes se añadieron, y finalmente se preparó 120 g de cada una de las bebidas de leche fermentada que tenían un contenido de leche fermentada de aproximadamente 60% en peso y 30% en peso. Los contenidos de VPP, IPP, y YP en cada bebida de leche fermentada se determinaron de la misma manera que en el ejemplo 1. La acidez de cada leche fermentada también se midió. Los resultados se muestran en la tabla 2.

Tabla 2 A partir de la tabla 2, se entiende que en la bebida de leche fermentada con aproximadamente 60% en peso de le del ejemplo comparativo 10, que se preparó únicamente por fermentación con bacterias de ácido láctico CM4, el contenido total de los péptidos anti-hipertensivos, VPP y IPP, fue 31 µg/ml, por lo que 120 g de la bebida contenían un total de 3.7 mg de dos tripéptidos Por otra parte, también se entiende que, en la bebida de leche fermentada con aproximadamente 60% en peso de leche fermentada del ejemplo 5, que se fermentó con bromelaína añadida, 8.4 mg de los tripéptidos estaban contenidos en 120 g de la bebida, de conformidad con el mismo cálculo . Además, de conformidad con el mismo cálculo, en la bebida de leche fermentada con aproximadamente 30% en peso de leche fermentada del ejemplo comparativo 10, 1.9 mg de los tripéptidos estaban contenidos en 120 g de la bebida, mientras que la bebida de leche fermentada con aproximadamente 30% en peso de leche fermentada del ejemplo 5, 4.3 mg de los tripéptidos estaban contenidos en 120 g de la bebida. La producción de YP también se observó, que tenía actividad anti-hipertensiva confirmada en pruebas con animales . Se sabe que la dosis efectiva mínima por ingesta de péptidos VPP y IPP juntos para lograr el efecto anti-hipertensivo en un humano es no menor que 3.4 mg en términos de VPP (VPP + 1.7 x IPP) . Por lo tanto, para proveer la bebida de leche fermentada con aproximadamente 60% en peso de leche fermentada del ejemplo comparativo 10 como alimento funcional que tiene el efecto anti-hipertensivo, la bebida se debe hacer en un producto de 120 g. Por el contrario, la bebida de leche fermentada con aproximadamente 60% en peso de leche fermentada del ejemplo 5 satisface la dosis efectiva mínima incluso en aproximadamente 60 g de producto, y la bebida de leche fermentada con aproximadamente 30% en peso de leche fermentada del ejemplo 5, cuando se hace en un producto de 120 g, satisface la dosis efectiva mínima anterior aun cuando el contenido de leche fermentada del mismo sea la mitad de la cantidad de la bebida de 60% en peso del ejemplo comparativo 10. Además, como resultado de la evaluación de gusto y sabor de las leches fermentadas como tales preparadas en el ejemplo 5 y ejemplo comparativo 10, no se observó diferencia remarcable en gusto y sabor entre las leches fermentadas con y sin la proteasa. A partir de los resultados anteriormente descritos, cabe entender que la bebida de leche fermentada que contiene la leche fermentada obtenida por el método de la presente invención se puede proveer como alimento funcional que tiene el efecto anti-hipertensivo, incluso a un contenido menor de la leche fermentada, comparado con la cantidad de la leche fermentada con CM4 convencional requerida. Por lo tanto, la libertad en mezclado para diseñar el gusto y sabor del producto final se incrementa, lo que permite la fabricación de productos que tengan alta calidad de gusto y sabor.

Ejemplo de Referencia 1 A fin de determinar si bacterias de ácido láctico distintas a Lactobacill us helveticus podrían producir Val-Pro-Pro y Ile-Pro-Pro a partir de los péptidos, Val-Pro-Pro-Phe-Leu y Ile-Pro-Pro-Leu-Thr, que se detectaron en los ejemplos 1 y 2 y ejemplos comparativos 7 y 8, las cantidades de Val-Pro-Pro y Ile-Pro-Pro producidas por el cultivo de medio de bacterias de ácido láctico que contenían los dos pentapéptidos, se midieron. Como la bacteria de ácido láctico, se usaron las cepas JCM1002 de Lactobacillus bulgaricus, la cepa JCM1132 de Lactobacillus acidophil us, y la cepa JCM1136 de Lactobacillus casei ssp . caeei (todas en Microbe División, Japan Collection of Microorganisms, RIKEN BioResource Center, 2-1 Hirosawa, Wako, Saitama, Japón) . 10 µg/ml de cada uno de Ile-Pro-Pro-Leu-Thr y Val-Pro-Pro-Phe-Leu químicamente sintetizados se añadieron al medio de MRS, que es un medio de bacterias de ácido láctico, y se incubaron con cada cepa a 37°C durante 4 días. Las concentraciones de Val-Pro-pro y Ile-Pro-Pro en la fracción de sobrenadante se midieron por CL/EM. Los resultados se muestran en la tabla 3.

Tabla 3 Los resultados del ejemplo de referencia 1 muestran que todas las cepas bacterianas produjeron Val-Pro-Pro y Ile-Pro-Pro. Se espera que VPP y IPP estuvieron contenidos en las leches fermentadas preparadas anteriormente por fermentación con bacterias de ácido láctico en combinación con las proteasas que producen Val-Pro-Pro-Phe-Leu y Ile-Pro-Pro-Leu-Thr de la caseína. Por lo tanto, se entiende que no sólo Lactobacillus helveticus sino otras bacterias de ácido láctico se pueden usar. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (12)

Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para producir una leche fermentada, caracterizado porque comprende los pasos de: (A) digestión enzimática de caseína de la leche de animal con proteasa (1) que comprende por lo menos uno de papaína, bromelaína y proteasas que pertenecen a una súperfamilia que muestra reacción enzimática similar a ésta, y (B) fermentación, con bacterias de ácido láctico, de caseína de leche de animal y/o producto de digestión de proteasa (1) de caseína de leche de animal, para producir así por lo menos uno de Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro, y Tyr-Pro en una leche fermentada resultante.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los pasos (A) y (B) se llevan a cabo en un medio que contiene tanto la proteasa (1) como las bacterias de ácido láctico para digerir enzimáticamente y fermentar la caseína de leche de animal.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteasa (1) comprende una proteasa que digiere por lo menos un péptido representado por (Xaa) -Val-Pro-Pro- (Xbb)n, (Xaa)m-Ile-Pro-Pro- (Xbb)n, o (Xaa)m-Tyr-Pro- (Xbb)n en el lado de carboxilo terminal de (Xaa)m, en donde Xaa y Xbb representan cada uno independientemente un aminoácido arbitrario; Xaa en una secuencia de péptido puede ser el mismo que o diferente de Xaa en las otras secuencias de péptido; Xbb en una secuencia de péptido puede ser el mismo que o diferente de Xbb en las otras secuencias de péptido; m y n son enteros; cuando m es 2 o más, Xaa's pueden ser los mismos o diferentes; y cuando n es 2 o más, Xbb's pueden ser los mismos o diferentes.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteasa (1) comprende una proteasa que pertenece a una subfamilia de papaína.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteasa (1) comprende una proteasa contenida en un extracto de piña y/o extracto de papaya .

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las bacterias de ácido láctico comprenden por lo menos uno de Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus y Lactobacillus casei .

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la digestión enzimática y la fermentación con bacterias de ácido láctico en los pasos (A) y (B) se llevan a cabo a 25 a 45°C.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque una leche de animal que tiene un contenido de caseína de 3 a 10% en peso se usa como la caseína de leche de animal, y una cantidad de esa proteasa (1) añadida es 0.005 a 0.1% en peso de la cantidad de esa caseína.

9. Alimento y bebidas de leche fermentada, caracterizados porque comprenden una leche fermentada obtenida por el método de la reivindicación 8 o un concentrado de la misma y que contiene no menos de 1.2 ng/100 ml de Val-Pro-Pro, no menos de 1.0 mg/100 ml de Ile-Pro-Pro, y no menos de 0.5 mg/100 ml de Tyr-Pro.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las bacterias de ácido láctico comprenden por lo menos uno de la cepa CM4 de Lactobacill us helveticus, la Cepa JCM1002 de Lactobacillus bulgaricus, la Cepa JCM1132 de Lactobacillus acidophilus y la Cepa JCM1136 de Lactobacillus casei .

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las bacterias de ácido láctico comprenden la cepa CM4 de Lactobacillus helveticus .

12. El método de conformidad con la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque la proteasa (1) comprende bromelaína .