KR20080108247A

KR20080108247A - 락토스를 발효시키지 않는 락토바실러스 헬베티쿠스 균주

Info

Publication number: KR20080108247A
Application number: KR1020087023009A
Authority: KR
Inventors: 페기 가롤; 안느 드루에네; 장-미셀 포리; 클래르 끄기너; 드니스 티에리 상; 타마라 스모크비나
Original assignee: 꽁빠니 자베 다노느
Priority date: 2006-02-20
Filing date: 2007-02-19
Publication date: 2008-12-12
Also published as: EP1820851B9; JP5184378B2; RU2422509C2; CN101421390A; WO2007096510A2; BRPI0707985A2; RU2008137627A; ZA200807147B; CN101421390B; JP2009532018A; BRPI0707985B1; EP1991661B1; US8323951B2; PL1820851T3; EP1820851A1; CA2642891A1; AU2007217318A1; ES2380595T3; US20090088391A1; ES2384096T3

Abstract

본 발명은 락토바실러스 헬베티쿠스의 신규 균주에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 락토스 음성 표현형을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스 균주 및 농산품에서의 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 락토바실러스 헬베티쿠스 균주를 수득하기 위한 방법에 관한 것이기도 하다.

락토바실러스 헬베티쿠스, 락토스 음성, 락토스 오페론

Description

락토스를 발효시키지 않는 락토바실러스 헬베티쿠스 균주{STRAINS OF LACTOBACILLUS HELVETICUSWHICH DO NOT FERMENT LACTOSE}

본 발명은 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)의 신규 균주와 이의 농산품 분야에서의 용도에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 락토스 음성 표현형을 보유하는 락토바실러스 헬베티쿠스 균주를 제시한다. 본 발명은 이러한 락토바실러스 헬베티쿠스 균주를 수득하기 위한 방법에 관한 것이기도 하다.

고혈압은 상당히 많은 사람들이 앓고 있는 질환이다. 앤지오텐신(angiotensin) 전환 효소(ACE)의 억제에 의해 혈압을 감소시킬 수 있는 제제로서 펩타이드 VPP (Val Pro Pro) 및 서열 VPP를 함유하는 펩타이드의 용도는 이미 EP 0 583 074에 개시된 바 있다. 트리펩타이드 IPP (Ile Pro Pro)의 유사한 효과 또한 문헌에 설명되어 있다. 이들 펩타이드는 이의 활성 자리를 차단함으로써 ACE를 억제하고 그 결과 앤지오텐신이 활성화되는 것을 방지한다.

두 개의 서열 VPP 및 IPP는 소 베타 카제인에 존재하고, 이 카제인이 적당히 가수분해(또는 더욱 일반적으로는 이를 함유하는 유(乳)가 가수분해)되면 상기 트리펩타이드가 수득되는 것으로 알려져 있다. 여러 가지 동물 및 인간을 대상으로 한 연구를 통해서, 이들 트리펩타이드 단 몇 mg을 날마다 섭취하면 혈압, 구체적으로는 고혈압 대상자에서의 혈압을 효과적으로 감소시킬 수 있어서, 심혈관 사고의 위험을 더욱 감소시킬 수 있다는 것이 증명된 바 있다.

락토바실러스 헬베티쿠스에 의해 발효된 유로부터 유래하는 펩타이드는 생체내(in vivo)에서 ACE 억제(ACEI) 효과를 보였고, 이들 펩타이드는 연구에 참여한 래트의 대동맥에서 발견되었다(Masuda O. et al., 1996. J. Nutr. 126, 3063-8). 다른 연구는 엘. 헬베티쿠스에 의해 발효유로부터 유래한 펩타이드를 섭취한 후 고혈압 래트에서 혈압이 감소되었음을 더욱 구체적으로 보여주었다 (Yamamoto N. et al., 1994. Biosci. Biotech. Biochem. 58, 776-8).

인간에서, 상기와 동일한 발효유는 동맥의 수축 혈압을 감소시킬 수 있었다(Hata et al.; 1996. Am. J. Clin. Nutr., 64, 767-71). 더욱 최근의 연구에서는, CALPIS라는 회사가 판매하는 제품인 AMEALS^®에 존재하는 펩타이드는 정상 혈압보다 더 혈압이 높은 대상자에서의 혈압을 유의하게 감소시킨다는 것을 확인시켜 주었다(Mizuno et al., 2005. British Journal of Nutrition; vol 94, issue 1, 84-91).

또다른 최근의 연구(Jauhiainen et al.; 2005. Am. J. of Hypertension, 18: 1600-1605)에서는, 엘. 헬베티쿠스에 의해 발효유의 항고혈압 효과를 설명하기 위한 상기 언급된 작용 기전(ACE 억제)은 인간에서의 작용 기전을 결정할 수는 없을 것이라는 가설을 제시하였다.

거의 대부분의 락토바실러스 헬베티쿠스는 유의 발효를 통해서 트리펩타이드 IPP 및 VPP를 생산할 수 있지만, 이의 생산량은 가변적이다. EP 1 016 709는 락토바실러스 헬베티쿠스의 종에 속하는 젖산 박테리아의 특이적인 균주를 사용하여 유를 발효시킴으로써 트리펩타이드 VPP 및 IPP를 제조하는 수단을 기술하고 있다. 하지만, 이렇게 제조된 제품 (발효유)은 매우 다량의 젖산을 함유하여, 감각 및 미각의 관점에서 허용될 수 없는 산미를 갖는다는 것이 특징이다. 또한, 후산성화(post-acidification)의 문제점이 발생하는데, 감각적으로 허용되는 pH(pH > 4)에서 발효가 중단되더라도 (냉각이라는 표준 방식으로), 락토바실러스 헬베티쿠스의 본래 성질 때문에 저온에서 계속 산성화가 일어난다. 이렇게 되면 제품의 pH가 떨어지고, 이는 상업적으로 불리하다.

후산성화를 회피하기 위해서, 열처리 [저온 살균(pasteurization), 가온 처리(thermization)]에 의해 균주를 즉시 사멸시킴으로써 허용되는 pH에서 발효를 중단시키는 것이 가능하다. 그 후에 후산성화는 제로가 된다 (즉, 보관 중 더 이상 제품의 산성화가 발생하지 않는다). 공교롭게도, 트리펩타이드의 양은 발효의 조기 중단 때문에 감소된다. 그리하여 수득된 제품은, 낮은 IPP 및 VPP 함량만을 가지게 된다. 최대한의 트리펩타이드 농도가 얻어질 때까지 동일한 균주로 유를 발효시키는 것도 가능하다. 동시에 발생된 다량의 젖산은 복잡하고 비용이 높은 다단계 방법에 의해 제거되어야만 한다. 더구나, 그 과정은 별개의 단계를 수반하는 것이기 때문에 "자연친화적"("natural")이지 못하다. 그러므로 이러한 과정은 산업적 규모로는 적당하지 못하다.

본 발명은 당업계에 존재하는 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위한 해법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 하기와 같은 여러 가지 유리한 특성을 보유하는 식품류, 특히 발효된 유제품의 제조를 가능하게 하는 락토바실러스 헬베티쿠스의 균주를 제시한다:

- 본 발명에 따른 유제품은 완벽하게 제어된 산도를 가지는데, 발효의 종기 뿐만 아니라, 보관 중에서도 완벽하게 제어된 산도를 가진다. 특히, 본 발명의 제품들은 후산성화 현상을 일으키지 않는다. 그러므로, 본 발명에 따른 유제품은 감각적으로(organoleptically) 매우 만족스럽다.

- 본 발명에 따른 유제품은 프로바이오틱(probiotic)으로서 바로 소비될 수 있는데, 즉 이들은 미각의 품질에 미치는 영향 없이, 특히, 이들의 산도에 미치는 영향 없이, 유의한 양의 살아있는 박테리아를 함유하고 있다.

- 본 발명에 따른 제품의 제조는 가온 처리 단계나, 복잡한 정제 단계를 요하지 않는다. 그러므로 본 발명에 따른 공정은 설비를 변화시키지 않고, 표준 유제품 설비에서 간단히 수행할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 공정은 완전히 자연친화적이다.

- 본 발명에 따른 식품, 특히 유제품은 높은 (IPP+VPP)/(젖산) 비율로, 매우 높은 비율의 트리펩타이드 VPP 및 IPP를 함유할 수 있다. 이들 결과는 예비 정제 단계나 농축 단계를 거치지 아니하고서도 얻을 수 있다.

- 본 발명에 따른 식품, 특히 유제품은 유리하게도 유의적인 양의 바이오매스 (biomass) (즉, 유의적인 농도의 살아있는 미생물)을 함유한다.

본 발명에 사용된 용어 중에 균주는 단일 세포 또는 분리된 콜로니로부터 수득된 미생물의 임의의 배양체, 일반적으로는 순수한 배양체를 의미한다.

본 발명에 사용된 용어 중에 균주 X의 변이체 또는 돌연변이주는, 레퍼런스 균주 X로부터 얻어진 임의의 균주를 의미한다. 본 명세서에서, "변이체(variant)"라는 용어는 주로 레퍼런스 균주 X를 돌연변이시킨 다음에 선택함으로써 얻어지는 균주를 말할 때 사용되고, "돌연변이(mutant)"라는 용어는 특히 무작위 돌연변이 유발 기술 또는 부위 지정 돌연변이를 균주 X에 적용함으로써 얻어진 균주를 가리킬 때 사용된다.

본 발명에 따른 균주의 돌연변이주 또는 변이체도, 이들이 본 발명의 필수 구성요소, 특히 젖산 음성 표현형을 보유하는 경우 본 출원 발명의 보호 범위에 속한다.

"젖산 음성 표현형" 균주는 락토스를 젖산으로 전환시키는 능력이 없는 임의의 균주를 말한다.

"프럭토스 음성 표현형" 균주는 프럭토스를 대사시킬 능력이 없는 임의의 균주를 말한다.

유(乳)배지(dairy medium)란 유단백질을 함유하는 임의의 배지, 예를 들면 우유 분말(탈지된 것 또는 탈지되지 않은 것) 또는 농축유를 사용하여 4% 단백질 수준으로 표준화된 우유를 함유하는 임의의 배지를 말한다.

본 발명에 사용된 용어 중에서 유제품이란 유 외에도, 크림, 아이스크림, 버터, 치즈, 요구르트, 발효유와 같은 유에서 유래된 임의의 제품과, 락토 세럼 및 카제인과 같은 부산물 뿐만 아니라, 유 또는 유 성분을 주성분으로서 함유하는 각종 제조된 식품을 말하는 것이다. 유제품 중에서도, 발효된 유제품에는 특히 요구르트, 발효유, 코티지 치즈(cottage cheeses), 케프리스(kefirs), 치즈, 프로바이오틱 유제품(probiotic dairy products)이 포함되고, 더욱 일반적으로는 적어도 한 단계의 발효를 겪은 임의의 유제품이 포함된다. 상기 유제품은 일반적으로는 암소의 유를 말하지만, 다른 포유류, 예컨대 염소, 양, 말, 낙타 또는 버팔로로부터의 젖도 가능하다.

본 발명에 사용된 용어 중에서 식품이란, 인간 또는 동물 영양 보충을 위한 임의의 제품을 말한다. 특히, 식품에는 유아, 아동, 청소년 및 성인이 섭취하도록 하는 제품이 포함된다. 본 발명에 따른 식품의 전부 또는 일부는 본 발명에 따른 발효된 유제품 중 적어도 하나를 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 식품은 농산품 산업에 보통 사용되는 다른 성분, 예컨대 첨가제, 보존제, 과즙 또는 과일추출물, 향료, 착색제, 질감보충제(texturing agent), 씨리얼(cereal), 초콜렛 조각 등을 함유할 수도 있다.

본 발명에 사용된 용어 중에서 발효제란, 소정의 배지를 발효시킬 수 있는 적어도 하나의 살아있는 미생물 균주를 함유하는 임의의 조성물을 말한다. 발효제 중에서도 특히 젖산 발효제는 유배지를 발효시킬 수 있는 적어도 하나의 살아있는 미생물 균주를 함유하는 조성물이다.

하나의 구체예에 따르면, 본 발명은 락토스를 젖산으로 전환시키는 능력이 없는 락토바실러스 헬베티쿠스 균주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 락토스를 젖산으로 전환시키는 능력이 없고, 락토스 오페론 내의 적어도 하나의 돌연변이를 보유하는 락토바실러스 헬베티쿠스 균주에 관한 것이다.

하나의 구체예에 따르면, 상기의 락토스 오페론내의 돌연변이는 정지 코돈을 도입시키는 점 돌연변이이다. 더욱 더 바람직한 구체예에 따르면, 상기 정지 코돈을 도입시키는 점 돌연변이는 락토스 오페론의 lacL 유전자에 발생한다. 점 돌연변이란, 이른바 "야생형" 서열과 비교했을 때, 그 서열내에 포함된 임의의 뉴클레오타이드가 치환되었음을 의미한다. 당업자라면, mRNA 중에서의 트리플렛: UAA, UAG, UGA에 해당하는, 정지 코돈(또한 넌센스 코돈이라고도 부른다)을 어떻게 알아내는지 잘 알고 있을 것이다.

그러므로, 본 발명에 따른 락토바실러스 헬베티쿠스 균주는 락토스를 분해시키는 능력이 없다(즉, 락토스를 젖산으로 전환시킬 수 없다). 사실상, 본 발명에 따른 균주는 락토스 음성 표현형을 가진다. 반면에, 탄소 급원으로서 글루코스의 존재하에 성장할 수 있고(글루코스를 젖산으로 발효시킴), 유의 특정 성분, 특히 단백질을 대사시킬 수는 있다.

따라서, 본 발명에 따른 균주는 유리하게도 완전히 제어된 pH에서 발효될 수 있도록 해주는데, 발효 후 최종 pH는 발효 배지 내에 최초 함유된 글루코스의 양에 따라 완벽하게 제어된다. 이러한 결과는 소정의 글루코스 양은, 실질적으로 화학량론적 방식으로, 동일한 양의 젖산을 만들어내기 때문이다. 또한, 본 발명에 따른 균주를 사용하면 임의의 후산성화 현상을 피하게 해 준다. 그러므로, 본 발명에 따른 균주의 혜택을 받아, 특히 감각적으로 만족스러운 식품을 얻을 수 있게 된 것이다.

유리하게는, 일 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 락토바실러스 헬베티쿠스 균주를 이용하여 글루코스 1.0 %(w/w)를 함유하고 총 단백질이 4.0%인 유배지를 최대 30시간의 발효 기간 동안, 30 내지 45℃의 온도에서 발효시킬 경우, 유배지의 pH가 4.0 이상, 바람직하게는 4.1 이상, 바람직하게는 4.2 이상, 바람직하게는 4.3 이상, 바람직하게는 4.5 이상이 되도록 해 준다.

이러한 장점은 트리펩타이드 IPP 및/또는 VPP를 대량생산하는(hyperproducers) 락토바실러스 헬베티쿠스의 균주의 경우에 특히 현저하며:

- 발효 중 트리펩타이드의 대량 생산(발효 시간이 가능한 한 길 것을 요구)과,

- 감각적으로 허용가능한 특성 (제한된 산성화를 요구하므로, 이에 따라 발효에 의한 젖산의 생성을 제한하기 위해서 가능한 한 발효 시간이 짧을 것을 요구할 뿐만 아니라, 후산성화 현상을 방지하기 위해서 저온 처리/가온 처리를 요구한다)

중 어느 하나를 희생시킬 필요가 전혀 없다.

사실상, 유리하게는 본 발명에 따르면, 트리펩타이드 VPP 및/또는 IPP의 생산, 및 젖산의 생산은 부분적으로 관련되어 있지 않다. 젖산의 생산은 오로지 발효 배지 중에 최초로 존재하는 글루코스의 양의 함수에만 의하고, 발효 시간의 함수에는 의하지 않는다.

트리펩타이드의 농도를 간단히 표현하는 수단은, VPP 등가물(VPP equivalent)의 농도인 [VPPeq]로 표현된다. 이는 mg/kg 단위로 표현된다: [VPPeq] = [VPP] + (9/5 x [IPP]).

그러므로, 일 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 락토바실러스 헬베티쿠스 균주는 유리하게도 발효에 의해, 발효된 생성물 1 kg당, 적어도 25 mg, 바람직하게는 적어도 30 mg, 바람직하게는 적어도 35 mg, 바람직하게는 적어도 40 mg, 바람직하게는 적어도 45 mg, 바람직하게는 적어도 50 mg, 바람직하게는 적어도 55 mg, 바람직하게는 적어도 60 mg, 바람직하게는 적어도 65 mg, 바람직하게는 적어도 70 mg, 바람직하게는 적어도 75 mg, 더욱 바람직하게는 적어도 80 mg의 VPPeq의 양으로, 서열 IPP 및/또는 VPP의 트리펩타이드를 생성할 수 있다. 이러한 VPP 및/또는 IPP의 양은 일반적으로는 30 내지 45℃, 바람직하게는 31 내지 44℃, 바람직하게는 32 내지 43℃, 바람직하게는 33 내지 42℃, 바람직하게는 34 내지 41℃, 바람직하게는 35 내지 40℃, 더욱 바람직하게는 37℃에서, 3%(w/w) 이상의 글루코스를 함유하고, 총단백질 함량이 2%(w/w) 이상, 바람직하게는 2 내지 10% (w/w), 더욱 바람직하게는 2.5 내지 6% (w/w), 더욱 더 바람직하게는 4% (w/w)인 유배지를 본 발명에 따른 균주로 발효시킴으로써 얻어진다.

일 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 락토바실러스 헬베티쿠스 균주는 또한 프럭토스 음성 표현형을 보유한다. 락토스 음성 및 프럭토스 음성 표현형의 조합이 특히 유리하다. 사실상, 프럭토스는 감미력이 강하여, 식품 중의 성분으로 유용하다. 그러므로, 프럭토스가 락토바실러스 헬베티쿠스 균주에 의해 분해될 수 없는 경우, 식품은 탁월한 감각적 특성을 보유하게 된다. 뿐만 아니라, 락토스 음성 및 프럭토스 음성 모두에 해당하는 균주는 글루코스를 함유하는 배지에서만 생장할 수 있다. 그러므로, 최종 pH는 과일 제조물, 특히 과일 조각 및/또는 쥬스를 함유하는 식품의 경우에 더욱 유리하게 제어된다.

하나의 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 균주는 하기의 균주, 및 이들 균주로부터 유래한 변이체 또는 돌연변이 균주로부터 선택된다:

I-3504 CNCM에 2005년 10월 14일에 기탁;

I-3505 CNCM에 2005년 10월 14일에 기탁;

I-3508 CNCM에 2005년 10월 14일에 기탁.

다른 구체예에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 락토바실러스 헬베티쿠스 균주의, 식품 또는 약학적 제품, 특히 발효된 유제품의 제조용 용도에 관한 것이다.

유리하게는, 본 발명의 구체예에 따르면, 상기 식품 또는 약학적 제품은 항고혈압 특성을 보유한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 락토바실러스 헬베티쿠스 균주 1종 이상을 포함하는 식품, 특히 발효된 유제품에 관한 것이다.

유리하게는, 일 구체예에 따르면, 상기 식품은 적어도 10⁶, 바람직하게는 적어도 10⁷, 바람직하게는 적어도 10⁸ CFU/㎖의 살아있는 락토바실러스 헬베티쿠스 박테리아를 함유한다. 그러므로, 본 발명에 따른 식품은 상당한 바이오매스를 함유한다.

일 구체예에 따르면, 상기 식품은 식품 1 kg당, 적어도 25 mg, 바람직하게는 적어도 30 mg, 바람직하게는 적어도 35 mg, 바람직하게는 적어도 40 mg, 바람직하게는 적어도 45 mg, 바람직하게는 적어도 50 mg, 바람직하게는 적어도 55 mg, 바람직하게는 적어도 60 mg, 바람직하게는 적어도 65 mg, 바람직하게는 적어도 70 mg, 바람직하게는 적어도 75 mg, 더욱 바람직하게는 적어도 80 mg의 VPPeq.를 함유한다.

일 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 식품은 또한 과일 제조물, 특히 과일 조각 및/또는 쥬스를 포함한다.

일 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 식품의 pH는 3.85 이상, 바람직하게는 3.90 이상; 바람직하게는 3.95 이상; 바람직하게는 4.00 이상; 바람직하게는 4.05 이상; 바람직하게는 4.10 이상; 바람직하게는 4.15 이상; 더욱 바람직하게는 4.20 이상이다.

유리하게도 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 식품은 항고혈압 특성을 보유한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 식품의 제조 방법에 관한 것이다.

구체예에 따르면, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:

■ 유단백질, 특히 펩타이드 서열 IPP 및/또는 VPP를 함유하는 단백질을 함유하는 원료 물질을 선택하는 단계. 이는 예를 들어, 총 단백질 2 내지 10%(w/w)을 함유하는 우유를 들 수 있다.

■ 본 발명에 따른 적어도 하나의 락토바실러스 헬베티쿠스 균주를 선택하는 단계.

■ 상기 균주를 원료 물질에 접종(seeding)하는 단계.

■ 12 내지 30시간 동안 30 내지 45℃에서, 상기 균주 및 글루코스 1 내지 3%(w/w) 존재하에 원료 물질을 발효시키는 단계.

구체예에 따르면, 본 발명에 따른 방법에는 유리하게도 발효 후의 가온 처리 단계가 없다. 이는 (프로바이오틱) 식품에서 살아있는 박테리아를 보유할 수 있도록 해 준다.

하나의 구체예에 따르면, 본 발명은 락토스 음성 표현형을 보유하는 락토바실러스 헬베티쿠스 균주를 수득하기 위한 스트렙토조토신(streptozotocin)의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 락토바실러스 헬베티쿠스 균주를 수득하기 위한 방법에 관한 것이다.

하나의 구체예에 따르면, 상기 락토스 음성 표현형을 보유하는 락토바실러스 헬베티쿠스 균주를 수득하기 위한 방법은 하기의 단계를 포함한다:

■ 적어도 하나의 락토바실러스 헬베티쿠스 균주를 제공하는 단계;

■ 락토스의 존재하에 스트렙토조토신의 유효량을 상기 적어도 하나의 균주와 접촉시키는 단계;

■ 락토스 음성 표현형의 콜로니를 분리하는 단계.

스트렙토조토신의 존재하에 생존할 수 있는 락토바실러스 헬베티쿠스의 세포의 집단은, 유리하게도 락토스 음성 세포가 극히 풍부하다.

일 구체예에서, β-갈락토사이드 결합에 의해 갈락토스에 결합하여 있고, 미생물에 의해 이 결합이 파괴된 후 태깅될(tagged) 수 있는, Xgal 및/또는 Sgal 및/또는 임의의 다른 화합물을 함유하는 배지에 대한 색상 시험을 포함하는 단계를, 본 발명에 따른 균주를 수득하기 위한 방법에 추가할 수 있다. IPTG 또한 미생물에 의한 락토스의 사용의 인듀서(inducer)로서 또는 락토스 수송자의 인듀서로서 이 화합물이 작용하기 때문에 이 시험을 수행하기 위해 첨가될 수 있다.

예를 들자면, 상기 방법은 아래와 같이 수행할 수 있다:

- 중성 MRS (Man Rogosa Sharp) 브로쓰(broth) 상에서 35 내지 40℃에서 밤새 출발 락토바실러스 헬베티쿠스 균주(모균주)의 제1 계대 배양

- 중성 MRS에서 제2 계대 배양

- 충분한 바이오매스가 얻어질 때까지, 예를 들면, 10 내지 30시간 동안 35 내지 40℃에서 인큐베이션

- 충분한 바이오매스를 얻을 수 있도록 하는 락토스 농도, 예를 들면, 2 내지 7%(w/w)를 함유하는 MRS를 접종(seeding); 580 nm에서의 OD를 모니터링하면서 인큐베이션

- 대상 균주를 살균할 수 있는 최종 농도를 가질 수 있도록, 스트렙토토조토신을 즉석 제조하고, 발효 동안에 첨가. 이 농도는 균주에 따라 달라진다.

- 35 내지 40℃에서 인큐베이션한 후, 배양체를 트립톤 염으로 2회 세척

- 펠렛을 트립톤 염 중에서 추출하여, 중성 MRS 브로쓰를 재배양

- 균주가 성장할 때까지 35 내지 40℃에서 인큐베이션

- 중성 MRS + Xgal + IPTG 상에서 분리를 수행한 다음에, 35 내지 40 ℃에서 CO₂ 하에서 인큐베이션. 이 단계는 박테리아 균주가 락토스 양성인지 음성인지를 결정하게 해주는 색상 시험이다. 만약 균주가 탄소 급원으로서 락토스를 이용할 수 있다면, 청색 물질이 생성될 것이고, 그에 따라 콜로니는 청색을 띠고 반대의 경우 (즉 락토스 음성 균주인 경우) 이는 흰색을 띨 것이다.

- 흰색 콜로니를 중성 MRS 상에서 계대배양 후, 35 내지 40 ℃에서 인큐베이션.

본 발명은 하기의 실시예를 통해 더욱 자세히 설명될 것이며, 이는 본 발명을 제한하는 것이 아니다.

실시예 1: 락토스 음성 표현형을 보유하는 균주의 수득

물질 및 방법

출발 균주(이른바, " 모균주 ")

I-3431 CNCM에 2005년 5월 25일 기탁

I-3434 CNCM에 2005년 5월 25일 기탁

I-3435 CNCM에 2005년 5월 25일 기탁

스트렙토조토신에 대한 민감성 시험

제1기에서, 모균주는 사용된 항생제인 스트렙토조토신에 대해 민감성인 것으 로 확인되었다. 580 nm에서의 광학밀도(OD)를 중성 MRS(Man Rogosa Sharp) 브로쓰중에서 42℃에서 배양체 상에서 관찰하였다. 후자가 0.1에 이르렀을 때, 스트렙토조토신을 튜브에 첨가하여, 최종 50 ㎍/㎖ (예를 들어, 배지 10 ㎖에 대해 5 mg/㎖ 용액 100㎕)으로 만들었다.

락토스 음성 균주의 선택

하기의 단계는 락토스 음성 락토바실러스 헬베티쿠스 균주를 수득하기 위하여 수행하였다:

- 중성 MRS 배지에서, 밤새 37℃에서 워킹 스톡(working stock)의 웰로부터 출발 락토바실러스 헬베티쿠스 균주(모균주)를 제1 계대 배양

- 중성 MRS 1%에서 제2 계대 배양

- 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션

- 5% (w/w) 락토스, 1% 락토스로 MRS 10 ㎖를 접종한 후 580 nm에서의 OD를 관찰하면서 40℃에서 인큐베이션

- 스트렙토조토신을 즉석에서 제조하여, 최종 농도 50 ㎍/㎖을 가질 수 있도록 2시간 15분 동안 또는 4시간 동안 발효시킨 뒤, 첨가

- 7시간 30분 동안 40℃에서 인큐베이션한 다음에, 배양체를 트립톤 염으로 2회 세척

- 펠렛을 트립톤 염 2 ㎖에서 건져낸 다음, 중성 MRS 배지를 10%로 접종

- 균주가 성장될 때 까지 37℃에서 인큐베이션

- 중성 MRS + Xgal + IPTG 상에서 분리한 다음에, 37℃에서 CO₂에서 인큐베이션. 이 단계는 박테리아 균주가 락토스 양성인지 음성인지를 결정하게 해 주는 색상 시험이다. 만약 균주가 탄소 급원으로서 락토스를 사용할 수 있는 경우라면, 청색 물질이 생성될 것이고, 그에 따라 콜로니는 청색을 띨 것이며, 반대(락토스 음성 균주)의 경우, 흰색을 띨 것이다.

- 흰색 콜로니를 중성 MRS 상에서 계대 배양하고, 37℃에서 인큐베이션

결과

부다페스트 조약에 의거하여, CNCM [(Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, France)]에 기탁해 둔, 락토스 음성 표현형을 갖는 하기 균주를 얻게 해 주었다.

I-3504 CNCM에 2005년 10월 14일 기탁; 모균주 I-3431로부터 유래.

I-3505 CNCM에 2005년 10월 14일 기탁; 모균주 I-3434로부터 유래.

I-3508 CNCM에 2005년 10월 14일 기탁; 모균주 I-3435로부터 유래.

수득된 균주의 락토스 음성 표현형은 MRS + Xgal + IPTG 중성 겔로스 배지 (소위 "청색/백색" 염색 시험)로 재차 확인하였다.

실시예 2: 락토스 음성 표현형을 갖는 균주

부다페스트 조약에 의거하여, CNCM [(Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, France]에 기탁된 균주 I-3504는 하기의 특성을 보유한 락토바실러스 헬베티쿠스 균주이다:

- 락토스 음성: 프럭토스 음성

- IPP 및 VPP의 생산: 도 4 및 5 참조

- 산성화 특성 : 도 1 참조

- ACE 억제: 도 6 참조

부다페스트 조약에 의거하여, CNCM [(Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, France]에 2005년 10월 14일에 기탁된 균주 I-3505는 하기의 특성을 보유한 락토바실러스 헬베티쿠스 균주이다:

- 락토스 음성; 프럭토스 음성

- IPP 및 VPP의 생산: 도 5 참조

- 산성화 특성: 도 2 참조

부다페스트 조약에 의거하여, CNCM [(Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, France]에 2005년 10월 14일에 기탁된 균주 I- 3508는 하기의 특성을 보유한 락토바실러스 헬베티쿠스 균주이다:

- 락토스 음성; 프럭토스 음성

- IPP 및 VPP의 생산: 도 5 참조

- 산성화 특성; 도 3 참조

1. 여러가지 변이체 균주의 산성화 특성의 측정

산성화 특성은 다음과 같이 평가되었다:

물 930 ㎖중에 스킴 밀크 분말(SMP) 120 g을 함유하는 배지를 10분 동안 95℃에서 저온 살균하였다. 이 배지를 0.5%로 접종한 다음에, 글루코스 농도를 달리하여 37℃에서 발효시켰다 (Gx라는 약자는 발효 전 배지 중의 글루코스의 농도가 x% (w/w)라는 것을 가리킨다). 이어서, pH를 상이한 균주에 대해서 시간의 함수로서 관찰한다. 발효 30시간 째에 취해진 발효된 배지 샘플을 트리펩타이드 IPP 및 VPP의 생산 측정을 위해서, 그리고 ACEI 활성의 측정을 위해서 사용하였고, 그 결과는 아래에 제시한다.

I-3504에 대해서, 모균주의 결과도 나타내었다 (I-3431, 락토스 양성 균주), (도 1 참조)

I-3505에 대해서, 모균주의 결과도 나타내었다 (I-3434, 락토스 양성 균주), (도 2 참조)

I-3508에 대해서, 모균주의 결과도 나타내었다 (I-3435, 락토스 양성 균주), (도 3 참조)

도 1 내지 3에 제시된 결과는, 본 발명에 따른 균주가 유리하게도, 배지 중에 최초 존재하는 글루코스의 양에 따라 발효의 말기에 pH를 정교하게 제어할 수 있다는 것을 보여준다. 더구나, 락토스 음성 균주에 의한 발효는 유리하게도 높은 pH값을 초래하였고, 이는 미각적으로 허용가능한 식품을 만들게 할 것이다.

2. 트리펩타이드 IPP 및 VPP 의 생산의 측정

물질 및 방법

상기 1번 항목에서 기술한 바와 같이 발효 30시간 째에 취해진 유배지 샘플을 본 측정을 수행하기 위하여 사용하였다.

펩타이드 함량, 특히 트리펩타이드 IPP 및 VPP의 함량의 분석은, 하기에 기술하는 바와 같이 MS/MS 유형의 검출기와 함께 HPLC 액체 크로마토그래피법을 사용하여 수행한다:

- 복합 샘플의 분석에서 본래 존재하는 간섭 때문에, 공지된 양으로, 샘플 제조시 제어된 시간에 첨가된 중수소화 내부 표준(deuterated internal standard)을 사용할 것을 강력 권장한다.

- 샘플의 제조는, 중수소화 VPP 내부 표준 25 ppm (앞으로 VPPd라 명명, 화학식 H-VaI [D8]- Pro-Pro-OH, MM = 319.45 g/mol, Bachem Chemicals, France로부터 입수가능) 및 중수소화 IPP 내부 표준 10 ppm (앞으로 IPPd라 명명, 화학식 H-IIe [D10 N15]-Pro-Pro-OH, MM = 336.2 g/mol, NEOMPS, Group SNPE, 7 rue de Boulogne, 67100 Strasbourg, France로부터 입수가능)를 1대3의 비율로 함유하는, 물, 메탄올 및 트리플루오로아세트산(50/50/0.1%)의 혼합물 중에서 발효된 배지를 희석시킴으로써(예를 들어, 내부 표준을 함유하는 물-메탄올-TEA 혼합물 1200 mg 중에, 샘플 600 mg이 있는 에펜도르프를 정확하게 질량 측정) 수행한다.

- 이 희석된 샘플은 이어서 15분간 14000 g로 원심분리한다. 발효 중에 생성된 펩타이드를 함유하는, 수득된 투명한 상청액을 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 물-메탄올 (50/50, v/v) 혼합물 중에 정확히 1/50으로 희석한다.

- 이렇게 수득된 희석된 용액을 Waters Biosuite^®타입 (3 mm 2.1 x 150 mm, C18 PA-A, WAT186002427, Waters France, 5, Rue Jacques Monod, 78280 Guyancourt)의 펩타이드 분석에 적합한 컬럼이 장착된 Agilent 1100 타입 (company Agilent Technologies France, 1 rue Galvani 91745 Massy Cedex, France)의 HPLC 크로마토그래피 시스템으로, 50℃ 온도, 0.25 ㎖/분 유속으로 분석하였다. 펩타이드는 용매 A(물 + 0.106% 포름산) 중의 용매 B (아세토니트릴 + 0.100% 포름산)가 증가 구배되는 표준 방식으로, 소기의 크로마토그래피 해상도에 따라 35분에서 2시간 동안 용리한다. 펩타이드 IPP 및 VPP의 분석에 적합한 방법은 하기의 구배를 사용한다:

시간	% 완충액 A	% 완충액 B
0	100	0
3	96	4
6	89	11
15	60	40
18	0	100
21	100	0
24	0	100
27.5	100	0
35	100	0

- 검출은 특이적인 MS/MS 타입 검출기, 예를 들면, 펩타이드 전체 함량 분석을 위한(MS-MS 모드), 또는 특징적인 단편으로부터의 펩타이드의 정확하고 특이적인 정량을 위한(MRM 모드), Esquire 3000+ (Bruker Daltonique, rue de l'Industrie, 67166 Wissembourg Cedex), 양성 모드 전기방사 이온화 매개변수와 같은 이온 트랩을 가진 장치를 사용하여 수행한다. 펩타이드 IPP 및 VPP의 분석의 경우 뿐 아니라, 내부 표준 IPPd 및 VPPd의 경우에도, 이들 펩타이드는 이들의 특 이적인 질량(VPP에 대해 단일 충전된 이온 312.2 Da, IPP에 대해 326.2 Da, VPPd에 대해 320.2 Da, IPPd에 대해 337.3 Da)에서 분리되어, 발효 후 이의 특이적인 이온 강도를 정량한다(단편 >= 85 Da)

- 각 펩타이드 IPP, VPP의 크로마토그래피 피크의 합과, 공지된 IPPd 및 VPPd 농도의 내부 표준의 피크 표면 비교를 하면, 단순한 선형 회귀를 통해서, 샘플의 초기 VPP 및 IPP 함량 (일반적으로는 mg/kg 또는 ppm으로 표현)을 계산할 수 있게 해 준다.

결과:

	VPPeq. (발효된 배지 mg/kg )
Calpis CM4	51
CNRZ 244	57

I-3504 (2% (w/w) 글루코스 함유)	80

도 4는 균주 I-3504 (글루코스 2% (w/w)가 배지에 첨가됨)의 트리펩타이드 IPP 및 VPP의 생산량을 선행 기술의 두 균주와 비교한 도면이다.

CALPIS사(社) 균주 CM4는 특허 EP 1 016 709에 개시되어 있고, 균주 CRNZ 244는 특허 출원 WO 2004/060073에 개시되어 있다.

이 도면에서 분명한 것은, 균주 I-3504 (본 발명에 따른 균주)는 동일한 조건 하에서 이들 종래의 두 균주보다 훨씬 더 많이 트리펩타이드 IPP 및 VPP를 생성하였다는 것이다.

도 5는 본 발명에 따른 균주의 트리펩타이드 IPP 및 VPP의 생산율을 서로 비 교한 것을 보여준다.

3. ACEI (앤지오텐신 전환 효소 억제) 활성의 측정

물질 및 방법

상기 1번 항목에서 기술한 바와 같이 발효 30시간 째에 채취된 유배지의 샘플을 이 측정을 수행하기 위해서 사용하였다. 본 방법은 Cushman 및 Cheng (Cushman et al. Biochem. Pharmacol. 1971. 20: 1637)의 방법에 기초한 것으로, 발효된 유제품 유형의 샘플에 맞게 변형시켜 사용하였다.

1. 반응물질 및 용액 제조

1.1 NaCl 0.3M이 보충된 소듐 보레이트 완충액 0.1M pH 8.3

H₃BO₃ (Carlo Erba ref: 402 766) 6.1843 g을 칭량하였다. 이를 대략 탈이온수 800 ㎖에 용해시키고, NaOH 용액을 사용하여 pH를 8.3으로 조정한 다음에, NaCl(최종 농도 0.3 M) 12.0 g을 첨가한 다음에, 탈이온수 1 리터를 첨가하였다.

1.2 HHL 기질의 제조: NaCl 0.3M을 함유한 소듐 보레이트 완충액 0.1M pH 8.3중 Hip - His - Leu 5 mM 용액

무수 HHL 펩타이드 (N-히푸릴-히스티딜-루신 테트라하이드레이트, mol. wt.: 501.5 g, Sigma-Aldrich ref: 53285-250 mg) 42.95 mg을 정확히 칭량하여, 0.3M NaCl을 함유한 pH 8.3의 0.1M 소듐 보레이트 완충액 약 15 ㎖에 용해시킨 다음에, 20 ㎖가 될 때까지 동일한 완충액을 첨가하였다.

1.3 0.1 U/㎖의 ACE 용액의 제조

동결건조된 분말 형태의 앤지오텐신 전환 효소(출처: 토끼 폐, Sigma-Aldrich ref A6778, 0.25 유니트)를 0.1M pH 8.3 소듐 보레이트 완충액 2.5 ㎖에 용해시켜서, 0.1 U/㎖ 용액으로 만들었다. 이렇게 제조된 용액은 4℃에서 보관, 사용하여야 하고, 충분한 효소 활성을 보존시키기 위해서는 2주 내에 사용하여야 한다.

2. 발효유 샘플의 제조

ACE의 최적 pH에 근접하도록 하기 위하여 8.0과 8.5 사이에 포함되는 pH에서 샘플을 컨디셔닝할 필요가 있다. 발효유를 먼저 원심분리하고, 상청액의 pH는 8.0 내지 8.5 사이로 맞춘 다음에(이상적으로는 pH 8.3), 컷오프 역치가 10,000 달톤인 Vivaspin 여과 유니트(Vivascience, France)를 사용하여 한외여과시켜서, 간섭 성분(전단백, 칼슘염)을 제거시키도록 한다.

완전한 프로토콜은 다음과 같다:

- 빈 튜브를 정확히 칭량한 다음에, 15 ㎖ 들이 팔콘 튜브내에 대략 6 ㎖의 발효유를 채워넣는다. 튜브에 담긴 발효유의 양을 칭량한다.

- 10℃에서 10분간 14,000 g로 원심분리한다.

- 상청액을 회수한다.

- 펠렛/상청액의 비율을 정량한다. 필요한 경우, 이 비율로 상청액 단독에 대해서가 아니라 본래의 생성물에 상당하는 IC50을 측정할 수 있다.

- 시험관내에 상청액 샘플 2.0 ㎖를 담고, pH를 측정한다.

- 보레이트 완충액을 첨가한 다음에 8.0 내지 8.5 사이에 포함된 pH(목표: 8.3)를 얻기 위해서 필요한 용량만큼 NaOH 2M을 첨가한 다음에 교반한다.

- 첨가된 NaOH의 정확한 부피를 감안하여, 출발 상청액을 1/2까지 희석시키는데 필요한 부피로 보레이트 완충액을 첨가한다(예를 들면, 상청액 시험 샘플 = 2 ㎖ + 250 ㎕ NaOH + 1.75 ㎖ 보레이트 완충액).

- 최종 pH는 8.0 내지 8.5 사이가 되도록 한다. 그 범위 밖에 있다면, NaOH를 더 많이 또는 더 적게 첨가하여 다시 시작한다. 침전물이 생기는데, 이는 칼슘 염 때문이다.

- 투명한 샘플을 얻기 위하여, 10,000 달톤 Vivaspin 여과 유니트(용량 4 내지 6 ㎖)를 사용하여 10℃에서 15분간 12,000 g로 샘플을 초원심분리한다.

3. 발효유 샘플에 의한 ACE 억제의 측정

각 분석 시리즈에 대해서, 대조군 (0 및 100% ACE 활성)을 제조하여야만 한다. 각 샘플에 대해서 두 개의 독립적인 시험 샘플 및 블랭크 샘플을 각 희석액에 대해 제조한다. 이는 사실, 가능한 한 ACE의 활성을 (희석에 의해) 50%까지 감소시키기 위해 필요한 샘플의 양을 조정하기 위해 필요한 것이다.

이러한 목적을 위해:

- 블랭크 튜브 및 시험 튜브내에 pH 8.3으로 컨디셔닝된 샘플 80 ㎕를 넣는다.

- 대조군 튜브 0 및 100%에서 탈이온수 80㎕를 넣는다.

- 모든 튜브에 5mM HHL 기질 용액 200㎕를 넣고 교반한다.

- 열역학적으로 제어되는 수조에 37℃에서 튜브를 넣고, 온도 평형에 도달하 게 한다.

- 각 튜브에 0.1 U/㎖로 ACE 용액 20 ㎕을 첨가함으로써 효소 반응을 시작하게 한다. 단, 블랭크 샘플과 0% 대조군에는 pH 8.3 보레이트 완층액 20 ㎕를 넣는다.

- 정확히 1시간 후에 37℃에서 가수분해시킨다.

- HCl 1M 용액 250㎕을 각 튜브에 첨가함으로써 반응을 중단시킨다.

여러 가지 반응 배지의 조성의 요약 표는 다음과 같다:

	시험 부분	기질의 첨가	가수분해 시작
100% 대조군	탈이온수 80 ㎕	HHL 200 ㎕	ACE 20㎕
0% 대조군	탈이온수 80 ㎕	HHL 200 ㎕	보레이트 완충액 20 ㎕
(시험) 샘플	샘플 80 ㎕	HHL 200 ㎕	ACE 20 ㎕
블랭크 샘플	샘플 80 ㎕	HHL 200 ㎕	보레이트 완충액 20 ㎕

하기의 프로토콜을 사용하여, 가수분해된 기질(히푸르산)을 추출하고, 이를 분광기로 정량분석한 후 판독하였다:

각 튜브에 에틸 아세테이트 1.7 ㎖를 첨가하고 교반한다.

5분간 10℃에서 2000 g로 원심분리한다.

에펜도르프 마이크로튜브내에 상청액을 정확히 1 ㎖ 넣는다.

열 블록(heating block)내에서 10분간 120℃에서 에틸 아세테이트를 증발시킨다.

탈이온수를 정확히 1 ㎖ 첨가한 다음에, 10초간 교반하여 히푸르산을 추출하도록 한다.

UV 판독에 적합한 셀내에서 228 nm에서의 흡광도를 판독한다.

결과 표현:

ACE 억제의 %는 다음과 같이 계산한다:

( Abs 100% ctl - Abs 0% ctl ) - ( Abs sam . - Abs 블랭크 sam .) x 100

(Abs 100% ctl - Abs 0% ctl)

상기 식 중,

Abs = 히푸르산의 추출 후 228 nm에서의 흡광도

ctl = 대조군

sam. = 샘플

발효유에 대해서, IC50은 반응 배지내의 ACE의 효소 활성의 50%를 억제하는 발효유의 상청액의 양으로서 정의되는데, 즉 반응 배지 1 밀리리터당 발효유 상청액의 마이크로리터 단위로 표현된다.

결과

도 6은 본 발명에 따른 여러 균주와 종래 기술의 균주들의, 앤지오텐신 전환 효소에 대한 억제 활성을 비교 도시한 도면이다.

앤지오텐신 전환 효소의 활성을 50% 억제하는데 필요한 반응 배지 1 ㎖당 발효유의 상당하는 농도(IC50)를 y 축에 표시하였다. 이 농도가 더 높을 수록, 균주의 앤지오텐신 전환 효소를 억제하기 위한 능력은 더 낮아진다.

실시예 3: 본 발명에 따른 ( 프로바이오틱 ) 유제품의 제조

발효된 유제품은 하기에 나타낸 바와 같이 수득한다.

미리 탈지하고, 예비 저온 살균 처리하여, 4℃로 냉각된 벌크유(bulked milk)를 스킴 밀크 분말로 단백질(4.0%)에 관해 표준화하고, 글루코스를 이의 양이 1.8%(w/w)가 되도록 첨가한다. 이렇게 제조된 유배지를 저온 살균처리한다(95℃-8분). 37℃까지 식힌 다음에, 유배지에 본 발명에 따른 균주를 10⁷ CFU/㎖ 의 양으로 접종하고, 발효 기간 동안 동에 37℃로 유지한다. pH가 3.8에 이르면, 스무딩(smoothing) 반응을 겪도록 하기 위해서 (필터를 통과시킴으로써) 커드(curd)를 발효 탱크로부터 제거하고, 플레이트 열교환기에서 10℃로 냉각시킨다. 그 다음 부드러워졌고 냉각된 커드(curd)에 과일 제조물(4 내지 4.1 범위의 pH)을 최종 제품의 15%에 이르도록 첨가한 후 110 ㎖ 들이 병에 포장한 다음에, 4℃에서 28일 동안 보관하였다.

이렇게 제조된 제품은 VPP 등가물 65 mg/kg에 상당하는 서열 IPP/VPP의 트리펩타이드를 함유한다. 제품의 펩타이드 함량은 유리하게도 제품이 소비되는 동안에 안정하다. 냉장 보관 중의 pH 감소는 유리하게도 무시할만하고 (0.1 유니트 미만) 본 발명에 따른 균주 집단은 유리하게도 10⁷ 내지 10⁸ CFU/㎖ 범위내로 남아있다.

실시예 4: 본 발명에 따른 균주의 락토스 오페론 내의 넌센스 점 돌연변이의 동정

GenBank로부터 시판되는 균주 DPC4571 및 ATCC15009의 락토스 오페론의 서열로 시작하여, 유전자로부터 가장 잘 보존된 것으로 나타난 올리고뉴클레오타이드 (프라이머)를 선택하였다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 "긴 범위(long range)" PCR을 생성하도록 해 주었고, 이어서, 본 발명에 따른 균주의 락토스 오페론의 서열을 시작하게 해 주었다. 서열분석을 단계 별로, 즉 수득된 서열에 따라 수행하였는데, 다른 프라이머가 새로운 서열 반응을 위해 기여한다.

모균주 I-3431에 관하여 균주 I-3504에서 넌센스 돌연변이를 동정하였다: 5'-3' 방향에서, 시토신 염기는 티민으로 대체되고, 이로 인해 β-갈락토시다아제를 코딩하는 lacL 유전자 (이는 대략 1900 bps를 만든다)의 개시 코돈의 1320번째 염기쌍에서 정지 코돈이 출현되었다.

이 돌연변이 이외에, 두 개의 균주 I-3431와 I-3504의 락토스 오페론은 동일하다.

I-3431 균주의 락토스 오페론의 서열 (프레임 돌연변이)

마찬가지로, 서열분석 결과, 본 발명에 따른 균주의 락토스 오페론 내에서 하기의 돌연변이가 발견되었다:

- 균주 I-3434와 비교하여 균주 I-3505

균주 I-3505에서, 아데노신 염기가 구아닌 염기를 대체하였고, 이로 인해 베타갈락토시다아제를 코딩하는 lacL 유전자의 출발점으로부터 1713번째 염기쌍에서 정지 코돈이 출현되었다.

- 균주 I-3435와 비교하여 균주 I-3508

균주 I-3508에서, 아데노신 염기가 구아닌 염기를 대체하였고, 이로 인해 베타갈락토시다아제를 코딩하는 lacL 유전자의 출발점으로부터 183번째 염기쌍에서 정지 코돈이 출현되었다.

Claims

락토스를 젖산으로 전환시키는 능력이 없는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 균주.
제1항에 있어서, 락토스 오페론 중에 하나 이상의 돌연변이를 보유하는 것인 락토바실러스 헬베티쿠스 균주.
제2항에 있어서, 락토스 오페론 중에 정지 코돈을 도입하는 하나 이상의 점 돌연변이를 보유하는 것인 락토바실러스 헬베티쿠스 균주.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1.0% (w/w) 글루코스를 함유하고 4.0% 총 단백질을 함유하는 유배지를, 최대 발효 시간 30 시간, 30 내지 45℃ 온도에서 상기 락토바실러스 헬베티쿠스 균주로 발효시킬 경우, 상기 배지의 pH가 4.0 이상, 바람직하게는 4.1 이상이 되도록 하는 것인 락토바실러스 헬베티쿠스 균주.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 30 내지 45℃의 온도에서, 더욱 바람직하게는 32 내지 43℃의 온도에서, 더욱 더 바람직하게는 37℃의 온도에서, 3% (w/w) 이상의 글루코스 양을 함유하고, 2% (w/w) 이상, 바람직하게는 2 내 지 10% (w/w), 더욱 바람직하게는 2.5 내지 6%, 더욱 더 바람직하게는 4%의 총 단백질 함량을 갖는 유배지를 발효시키는 것에 의해, 발효된 생성물 1 kg당 적어도 25 mg, 바람직하게는 적어도 50 mg, 더욱 바람직하게는 적어도 75 mg의 VPPeq 양으로 서열 IPP 및/또는 VPP의 트리펩타이드를 생성할 수 있는 것인 락토바실러스 헬베티쿠스 균주.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 프럭토스 음성 표현형을 추가로 보유하는 것인 락토바실러스 헬베티쿠스 균주.
제1항에 있어서, 하기 균주 및 이들 균주로부터 유래되는 변이체 또는 돌연변이 균주로부터 선택되는 락토바실러스 헬베티쿠스 균주:

2005년 10월 14일 CNCM에 기탁된 I-3504;

2005년 10월 14일 CNCM에 기탁된 I-3505;

2005년 10월 14일 CNCM에 기탁된 I-3508.
식품 또는 약학적 제품의 제조, 특히 발효된 유제품의 제조를 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 락토바실러스 헬베티쿠스 균주의 용도.
제8항에 있어서, 상기 식품 또는 약학적 제품은 항고혈압 특성을 갖는 것인 용도.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 락토바실러스 헬베티쿠스 균주 를 하나 이상 포함하는 식품으로서, 더욱 구체적으로는 발효된 유제품인 식품.
제10항에 있어서, 적어도 10⁶, 바람직하게는 적어도 10⁷, 바람직하게는 적어도 10⁸ CFU/㎖의 살아있는 락토바실러스 헬베티쿠스 박테리아를 함유하는 것인 식품.
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 식품 1kg당, 적어도 25 mg, 바람직하게는 적어도 50 mg, 더욱 바람직하게는 적어도 75 mg의 VPPeq를 함유하는 것인 식품.
제10항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 과일 제조물, 구체적으로는 과일 조각 및/또는 쥬스를 더욱 포함하는 것인 식품.
제10항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, pH가 3.85 이상, 바람직하게는 4.00 이상, 더욱 바람직하게는 4.20 이상인 것인 식품.
제10항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항고혈압 특성을 갖는 것인 식품.
하기의 단계를 포함하는 식품의 제조 방법:

- 유단백질, 특히 펩타이드 서열 IPP 및/또는 VPP를 함유하는 단백질을 함유하는 원료 물질을 선택하는 단계

- 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 락토바실러스 헬베티쿠스 균주를 하나 이상 선택하는 단계

- 상기 균주를 원료 물질에 접종하는 단계

- 1 내지 3 %(w/w) 글루코스 및 상기 균주의 존재 하에, 12 내지 30시간 동안 30 내지 45 ℃에서, 원료 물질을 발효시키는 단계.
제16항에 있어서, 발효 후에 가온 처리 단계를 거치지 않는 것인 방법.
락토스 음성 표현형을 보유하는 락토바실러스 헬베티쿠스 균주를 수득하기 위한 스트렙토조토신의 용도.
하기의 단계들을 포함하는, 락토스 음성 표현형을 보유하는 락토바실러스 헬베티쿠스 균주를 수득하기 위한 방법:

- 락토바실러스 헬베티쿠스 균주 1개 이상을 제공하는 단계;

- 락토스의 존재하에, 스트렙토조토신의 유효량과 상기 균주 하나 이상을 접촉시키는 단계;

- 락토스 음성 표현형의 콜로니를 분리하는 단계.
제19항에 있어서, β-갈락토사이드 결합에 의해 갈락토스에 연결되어 있고, 상기 락토바실러스 헬베티쿠스 균주에 의해 이 결합이 파괴된 후에 태깅될 수 있는, Xgal 및/또는 Sgal 및/또는 임의의 다른 화합물을 함유하는 배지 상에서 색상 시험을 하는 단계를 포함하는 것인 방법.