BRPI0707985A2

BRPI0707985A2 - novas cepas de lactobacillus helveticus

Info

Publication number: BRPI0707985A2
Application number: BRPI0707985-0A
Authority: BR
Inventors: Peggy Garault; Anne Druesne; Jean-Michel Faurie; Claire Queguiner; Denis Thierry Saint; Tamara Smokvina
Original assignee: Gervais Danone Sa
Priority date: 2006-02-20
Filing date: 2007-02-19
Publication date: 2011-05-17
Also published as: EP1820851B9; JP5184378B2; RU2422509C2; CN101421390A; KR20080108247A; WO2007096510A2; RU2008137627A; ZA200807147B; CN101421390B; JP2009532018A; BRPI0707985B1; EP1991661B1; US8323951B2; PL1820851T3; EP1820851A1; CA2642891A1; AU2007217318A1; ES2380595T3; US20090088391A1; ES2384096T3

Abstract

NOVAS CEPAS DE LACTOBACILLUS HELVETICUS. A presente invenção refere-se a novas cepas de Lactobacilius helveticus. Mais particularmente, a presente invenção propõe cepas de Lactobacillus helveticus possuindo um fenótipo lactose negativa, e suas aplicações na indústria agro-alimentar. A presente invenção refere-se igualmente a um processo de obtenção de tais cepas de Lactobacilius helveticus.

Description

"NOVAS CEPAS DE LACTOBACILLUS HELVETICUS"

A presente invenção refere-se a novas cepas deLactobacillus helveticus, assim' como a suas aplicações nocampo agro-alimentar. Mais particularmente, a presentenvenção propõe cepas de Lactobacillus helveticus possuindoum fenótipo lactose negativa. A presente invenção refere-se, igualmente, a um processo de obtenção de tais cepas de

Lactobacillus helveticus.

A hipertensão atinge uma grande parte dapopulação. A utilização do peptideo VPP (Vai Pro Pro) e depeptideos contendo a seqüência VPP como agentes capazes dereduzir a pressão arterial por inibição da enzima deconversão da angiotensina (ACE) foi descrita na EP 0 583074. Um efeito similar do tripeptideo IPP (He Pro Pro) foiigualmente descrito na literatura. Esses peptideos inibem aACE bloqueando seu sitio ativo e impedindo, assim, tornarativa a angiotensina.

É sabido que as duas seqüências VPP e IPP estãopresentes na caseina Beta bovina e que a hidrólise adequadadesta caseina (ou, mais geralmente, do leite que a contém)permite obter os referidos tripeptideos. Numerosos estudosno animal e no homem mostraram que a ingestão diária dealguns miligramas destes tripeptideos permite reduzireficazmente a pressão arterial, em particular nos sujeitoshipertensos, reduzindo, desta forma, o risco de acidentecardiovascular.

Peptideos obtidos de um leite fermentado porLactobacillus helveticus mostraram in vivo seu efeitoinibidor do ACE (ACEI) e esses peptideos puderam serencontrados no nivel da aorta dos ratos que participaram noestudo (Masuda 0. e outros, 1996. J. Nutr. 126, 3063-8).Outros estudos também mostraram especificamente umadiminuição da pressão arterial em ratos hipertensos emresposta à ingestão de peptideos obtidos de um leitefermentado por L. helveticus (Yamamoto N. e outros, 1994.Biosci. Biotech. Biochem. 58, 776-8).

No homem, o mesmo leite fermentado tambémpermitiu diminuir a pressão arterial sistólica (Hata eoutros; 1996. Am. J. Clin. Nutr., 64, 767-71). Um estudomais recente confirma que os peptideos presentes no produtoAMEAL S® comercializado pela sociedade CALPIS reduzem, demaneira significativa, a pressão arterial em sujeitos quetêm uma pressão arterial superior à normal (Mizuno eoutros, 2005. British Journal of Nutrition; vol 94, edição1, 84-91).

Em um outro estudo recente (Jauhiainen e outros;2005. Am. J. of Hypertension, 18: 1600-1605) é anunciada ahipótese de acordo com a qual o mecanismo de ação acimacitado (inibição do ACE) para explicar o efeito anti-hipertensivo de um leite fermentado por um L. helveticuspoderia, no entanto, não ser o mecanismo de açãodeterminante no homem.

Uma grande maioria dos Lactobacillus helveticus écapaz de produzir os tripeptideos IPP e VPP por fermentaçãode leite, mas as quantidades produzidas podem servariáveis. EP 1 016 709 descreve um meio de produzir ostripeptideos VPP e IPP por fermentação de leite com oauxilio de cepas de bactérias lácticas especificaspertencentes à espécie Lactobacillus helveticus. Noentanto, o produto assim fabricado (leite fermentado)contém uma quantidade muito grande de ácido láctico e éentão caracterizado por uma acidez inaceitável do ponto devista sensorial e gustativo. Além disso, surge o problemada pós-acidificação: mesmo se a fermentação é interrompida(classicamente por resfriamento) em pH organolepticamenteaceitáveis (pH > 4), a acidificação prossegue no friodevido às propriedades intrínsecas dos Lactobacillushelveticus. Isto leva a uma queda do pH do produto, que setorna igualmente inaceitável ao consumo.

A fim de evitar a pós-acidificação, é possívelinterromper a fermentação em um pH aceitável matandoimediatamente a cepa por tratamento térmico (pasteurização,termização): a pós-acidificação é então nula (a acidez doproduto não evolui durante sua conservação). Infelizmente,a quantidade de tripeptídeos é reduzida devido àinterrupção precoce da fermentação. Os produtos assimobtidos só possuem, então, baixos teores de IPP e VPP. Éigualmente possível fermentar o leite pela mesma cepa atése obter uma concentração máxima de tripeptídeos. A grandequantidade de ácido láctico gerada em paralelo deve entãoser retirada por um processo de múltiplas etapas complexo ecaro. Além disso, o processo não é "natural", pois elemenciona etapas de separação. Um processo desse tipo não é,assim, adaptado à escala industrial.

A presente invenção propõe soluções aosinconvenientes do estado da técnica. Em particular, apresente invenção propõe cepas de Lactobacillus helveticusque permitem a preparação de produtos alimentares,notadamente produtos lácteos fermentados, possuindonumerosas propriedades vantajosas:

- Os produtos lácteos de acordo com a invençãopossuem uma acidez perfeitamente controlada, não somente aofinal da fermentação, mas igualmente ao armazenamento. Emparticular, eles não estão sujeitos ao fenômeno de pós-acidif icação . Assim, os produtos lácteos de acordo com ainvenção são organolepticamente muito satisfatórios.

- Os produtos lácteos de acordo coma invenção sãodiretamente consumíveis como probióticos, quer dizer queeles contêm uma quantidade significativa de bactériasvivas, sem nenhum impacto sobre suas qualidades gustativase, notadamente, sem nenhum impacto sobre sua acidez.

- A preparação dos produtos de acordo com ainvenção não necessita de nenhuma etapa de termização, nemnenhuma etapa complexa de purificação. Os processos deacordo com a invenção podem, assim, ser implementados demaneira simples, em instalações de fábricas de laticíniosclássicas, sem grande modificação do equipamento. Por outrolado, os processos de acordo com a invenção sãointeiramente naturais.

- Os produtos alimentares, notadamente lácteos,de acordo com a invenção podem conter teores muito altos detripeptídeos VPP e IPP, e isto, com razões elevadas de (IPP+ VPP) / (ácido láctico). Esses resultados podem serobtidos sem etapa de purificação ou de concentração prévia.

- Os produtos alimentares, notadamente lácteos,de acordo com a invenção, contêm, vantajosamente, umabiomassa grande (i.e., uma grande concentração demicroorganismos vivos).

Por cepa, entende-se, no sentido da presenteinvenção, qualquer cultura, geralmente pura, de ummicroorganismo, obtida a partir de uma única célula ou deuma colônia isolada.

Por variante ou mutante de uma cepa X, entende-sedesignar, no sentido da presente invenção, qualquer cepaobtida a partir de uma cepa de referência X. No presentecontexto, serão utilizados mais particularmente os termos"variante" para designar uma cepa obtida principalmente pormutação e seleção a partir de uma cepa de referência X e"mutante" para designar, mais especificamente, uma cepaobtida por técnicas de mutagênese aleatória ou dirigida(por exemplo, transformação genética com o auxilio devetores), aplicadas à cepa X.

Os mutantes ou as variantes das cepas de acordocom a presente invenção serão afetados pela proteçãoconferida por esta patente a partir do momento em que elespassam a conservar os aspectos essenciais da invenção,notadamente o fenótipo lactose negativa.

Por cepa com "fenótipo lactose negativa",entende-se qualquer cepa que não tenha a capacidade detransformar a lactose em ácido láctico.

Por cepa com "fenótipo frutose negativa",entende-se qualquer cepa que não possua a capacidade demetabolizar a frutose.

Por meio lácteo, entende-se qualquer meiocontendo proteínas de leite, por exemplo, um leite bovinopadronizado com 4% de proteínas com leite em pó bovino(desnatado ou não) ou com leite concentrado.

Por produto lácteo, no sentido da presenteinvenção, entende-se além do leite, qualquer produtoderivado do leite, tal como a nata, o sorvete, a manteiga,o queijo, o iogurte, o leite fermentado; os produtossecundários, como o soro de leite, a caseína, assim comodiversos alimentos preparados contendo como ingredienteprincipal o leite ou constituintes do leite. Dentre osprodutos lácteos, os produtos lácteos fermentadoscompreendem entre outros os iogurtes, os leitesfermentados, os queijos brancos, os kefirs, os queijos, osprodutos lácteos probióticos e, mais geralmente, qualquerproduto lácteo que tenha sofrido pelo menos uma etapa defermentação. O referido leite é, geralmente, leite de vaca,mas pode, igualmente, ser leite de outros mamíferos, como acabra, a ovelha, a égua, o camelo fêmea, a búfala.Por produto alimentar, no sentido da presenteinvenção, entende-se qualquer produto destinado à nutriçãohumana ou animal. Em particular, os produtos alimentarescompreendem produtos destinados à alimentação doslactentes, das crianças, dos adolescentes e dos adultos. Osprodutos alimentares de acordo com a invenção podem conter,no todo ou em parte, pelo menos um produto lácteofermentado de acordo com a invenção. Os produtosalimentares de acordo com a invenção podem igualmenteconter outros ingredientes habitualmente utilizados naindústria agro-alimentar, tais como aditivos, conservantes,frutas ou extratos de frutas, aromatizantes, corantes,agentes de textura, cereais, pedaços de chocolate, etc.

Por fermento, entende-se, no sentido da presenteinvenção, qualquer composição contendo pelo menos uma cepaviva de microorganismo suscetível de fermentar um meiodado. Dentre os fermentos, os fermentos lácteos sãocomposições contendo pelo menos uma cepa viva demicroorganismo suscetível de fermentar um meio lácteo.

De acordo com um modo de realização, a presenteinvenção refere-se a uma cepa de Lactobacillus helveticusque não tem a capacidade de transformar a lactose em ácidoláctico. A presente invenção refere-se igualmente a umacepa de Lactobacillus helveticus que não tem a capacidadede transformar a lactose em ácido láctico, e que possuipelo menos uma mutação no operão lactose.

De acordo com um modo de realização, a referidamutação no operão lactose é uma mutação pontualintroduzindo um códon de terminação (codon stop). De acordocom um modo de realização ainda mais preferencial, areferida mutação pontual introduzindo um códon determinação está situada no gene IacL do operão lactose. Pormutação pontual, entende-se qualquer substituição denucleotideo intervindo na seqüência, em comparação com umaseqüência dita "do tipo selvagem". O versado na técnicasabe identificar um códon de terminação (igualmente chamadode códon sem sentido), e que corresponde geralmente emtermos de ARNm a um dos tripletos: UAA, UAG, UGA.

Assim, as cepas Lactobacillus helveticus deacordo com a invenção não têm a capacidade de degradar alactose (não há transformação da lactose em ácido láctico).

De fato, as cepas de acordo com a invenção possuem umfenótipo lactose negativa. Por outro lado, elas são capazesde crescer na presença de glicose como fonte de carbono(fermentação da glicose em ácido láctico) e de metabolizarcertos componentes do leite, notadamente as proteínas.

Assim, as cepas de acordo com a invençãopermitem, vantajosamente, uma fermentação com pH totalmentecontrolado: o pH final após fermentação é perfeitamentecontrolado de acordo com a quantidade de glicoseinicialmente contida no meio de fermentação. Isto resultado fato que uma quantidade dada de glicose resulta demaneira quase estequiométrica ,na mesma quantidade de ácidoláctico. Além disso, o emprego das cepas de acordo com ainvenção evita qualquer fenômeno de pós-acidificação.Assim, graças às cepas de acordo com a invenção, é possívelobter produtos alimentares particularmente satisfatórios noplano organoléptico.

De maneira vantajosa, de acordo com um modo derealização, as cepas de Lactobacillus helveticus de acordocom a invenção são tais que um meio lácteo a 4,0% deproteínas totais contendo 1,0% (p/p) de glicose fermentadopelas referidas cepas de Lactobacillus helveticus duranteum tempo máximo de fermentação de 30h, a uma temperaturaentre 30 e 45°C, possua um pH superior ou igual a 4,0;preferencialmente superior ou igual a 4,1;preferencialmente superior ou igual a 4,2;

preferencialmente superior ou igual a 4,3;

preferencialmente superior ou igual a 4,5.

Esta vantagem é então particularmente marcada nocaso das cepas de Lactobacillus helveticus hiperprodutorasem tripeptideos IPP e/ou VPP: não é, de forma alguma,exigida a escolha de um compromisso entre:

- uma grande produção em tripeptideos no momentoda fermentação (necessitando de um tempo de fermentação tãolongo quanto possível), e

- propriedades organolepticamente aceitáveis(necessitando de uma acidificação limitada e,consequentemente, não apenas um tempo de fermentação tãocurto quanto possível, a fim de limitar a produção de ácidoláctico por fermentação, mas igualmente umatermização/pasteurização a fim de evitar o fenômeno de pós-acidificação).

De fato, vantajosamente de acordo com a presenteinvenção, a produção de tripeptideos VPP e/ou IPP e aprodução de ácido láctico são parcialmente desassociadas: aprodução de ácido láctico é apenas função da quantidade deglicose inicialmente presente no meio de fermentação, e nãomais função do tempo de fermentação.

Um meio de expressar a concentração emtripeptideos de maneira simples consiste em expressar emconcentração equivalente VPP [VPPeq].

Ela é expressa em mg/kg:

<formula>formula see original document page 9</formula>

Assim, de acordo com um modo de realização, ascepas de Lactobacillus helveticus de acordo com a invençãosão vantajosamente capazes, por fermentação, de produzir ostripeptideos de seqüência IPP e/ou VPP em uma quantidade depelo menos 25 mg, preferencialmente pelo menos 30 mg,preferencialmente pelo menos 35 mg, preferencialmente pelomenos 40 mg, preferencialmente pelo menos 45 mg,preferencialmente pelo menos 50 mg, preferencialmente pelomenos 55 mg, preferencialmente pelo menos 60 mg,preferencialmente pelo menos 65 mg, preferencialmente pelomenos 70 mg, preferencialmente pelo menos 75 mg, maispreferencialmente pelo menos 80 mg de VPP eq por kg deproduto fermentado. Tais quantidades de VPP e/ou IPP sãogeralmente obtidas por fermentação por uma cepa de acordo com a invenção a uma temperatura entre 30 e 4 5 °C,preferencialmente entre 31 e 44°C, preferencialmente entre32 e 4 3 °C, preferencialmente entre 33 e 42°C,preferencialmente entre 34 e 41°C, preferencialmente entre35 e 40°C, e mais preferencialmente a 37°C, de um meiolácteo contendo uma quantidade de glicose superior a 3%(p/p) e com um teor total em proteínas superior ou igual a2% (p/p), preferencialmente entre 2 e 10% (p/p), maispreferencialmente entre 2,5 e 6% (p/p) e ainda maispreferencialmente igual a 4% (p/p).

De acordo com um modo de realização, as cepas deLactobacillus helveticus de acordo com a invenção possuemadicionalmente um fenótipo frutose negativa. A combinaçãodos fenótipos lactose negativa e frutose negativa éparticularmente vantajosa.

De fato, a frutose tem um grande poder adoçante,e é um ingrediente útil nos produtos alimentares. Assim, sea frutose não pode ser degradada pela cepa de Lactobacillushelveticus, o produto alimentar conserva excelentespropriedades organolépticas. Além disso, uma cepa ao mesmotempo lactose negativa e frutose negativa só poderágerminar em um meio contendo glicose. Assim, o pH finalserá vantajosamente melhor controlado no caso onde oproduto alimentar contém uma preparação de fruta(s),notadamente pedaços e/ou sucos de fruta(s).

De acordo com um modo de realização, a cepa deacordo com a invenção é escolhida dentre:

1-3504 depositada na CNCM em 14/10/05;

1-3505 depositada na CNCM em 14/10/05;

1-3508 depositada na CNCM em 14/10/05;

e as cepas variantes ou mutantes destas.

De acordo com um outro modo de realização, apresente invenção refere-se à utilização de uma cepa deLactobacillus helveticus de acordo com a invenção, para apreparação de um produto alimentar ou farmacêutico,notadamente de um produto lácteo fermentado.

De maneira vantajosa, de acordo com um aspecto dainvenção, o referido produto alimentar ou farmacêuticopossui propriedades anti-hipertensivas.

A presente invenção refere-se igualmente a umproduto alimentar, notadamente produto lácteo fermentado,compreendendo pelo menos uma cepa de Lactobacillushelveticus de acordo com a invenção.

De maneira vantajosa, de acordo com um modo derealização, o referido produto alimentar contém pelo menosIO6, preferencialmente pelo menos 107, preferencialmentepelo menos IO8 UFC/mL de bactérias Lactobacillus helveticusvivas. Assim, o produto alimentar de acordo com a invençãocontém uma grande biomassa.

De acordo com um modo de realização, o referidoproduto alimentar contém pelo menos 25 mg,preferencialmente pelo menos 30 mg, preferencialmente pelomenos 35 mg, preferencialmente pelo menos 40 mg,preferencialmente pelo menos 45 mg, preferencialmente pelomenos 50 mg, preferencialmente pelo menos 55 mg,preferencialmente pelo menos 60 mg, preferencialmente pelomenos 65 mg, preferencialmente pelo menos 70 mg,preferencialmente pelo menos 75 mg, mais preferencialmentepelo menos 80 mg de VPPeq por kg de produto alimentar.

De acordo com um modo de realização, o produtoalimentício de acordo com a invenção compreendeadicionalmente preparações de fruta(s), notadamente pedaçose/ou sucos de fruta(s).

De acordo com um modo de realização, o produtoalimentício de acordo com a invenção possui um pH superiorou igual a 3,85; preferencialmente superior ou igual a3,90; preferencialmente superior ou igual a 3, 95;preferencialmente superior OU igual a 4, 00;preferencialmente superior OU igual a 4, 05;preferencialmente superior OU igual a 4,10;preferencialmente superior OU igual a 4 ,15; maispreferencialmente superior ou igual a 4,20.

Vantajosamente de acordo com um modo derealização, o produto alimentício de acordo com a invençãopossui propriedades anti-hipertensivas.

De acordo com um outro aspecto, a presenteinvenção refere-se a um processo de preparação de umproduto alimentício.

De acordo com um modo de realização, o referidoprocesso compreende as seguintes etapas:

- selecionar uma matéria-prima contendo proteínasde leite, notadamente proteínas contendo as seqüênciaspeptídicas IPP e/ou VPP. Isto pode, por exemplo, ser doleite contendo 2-10% (p/p) de proteínas totais.

- selecionar pelo menos uma cepa de Lactobacillushelveticus de acordo com a invenção,

inocular a referida matéria-prima com a referida cepa;- fermentar a referida matéria-prima em presençade 1-3% (p/p) de glicose durante 12-30 horas a 30-45°C, eem presença da referida cepa.

De acordo com um modo de realização, o processode acordo com a invenção é vantajosamente desprovido dequalquer etapa de termização após a fermentação. Istopermite conservar bactérias vivas no produto alimentício(probiótico).

De acordo com um modo de realização, a presenteinvenção refere-se a uma utilização de estreptozotocinapara a obtenção de cepas Lactobacillus helveticus possuindoum fenótipo lactose negativa.

A presente invenção fornece igualmente umprocesso de obtenção de tais cepas de Lactobacillus15 helveticus.

De acordo com um modo de realização, o referidoprocesso de obtenção de cepas Lactobacillus helveticuspossuindo um fenótipo lactose negativa, compreende asseguintes etapas:

- fornecer pelo menos uma cepa de Lactobacillushelveticus;

- colocar em contato a referida pelo menos umacepa com uma quantidade eficaz de estreptozotocina empresença de lactose;

- isolar a ou as colônias de fenótipo lactosenegativa.

A população de células de Lactobacillushelveticus capaz de sobreviver em presença deestreptozotocina é, de fato, vantajosamente extremamenteenriquecida em células lactose negativa.

De acordo com um modo de realização, uma etapa deteste colorimétrico em um meio contendo Xgal e/ou Sgal e/ouqualquer outro composto ligado por uma ligação β-galactosidica à galactose e que se torna localizável após aruptura desta ligação pelo microorganismo, é acrescentadaao referido processo de obtenção das cepas de acordo com ainvenção. 0 IPTG pode ser igualmente acrescentado pararealizar este teste uma vez que este composto agirá como umindutor do transportador da lactose ou como um indutor dautilização da lactose pelo microorganismo.

A titulo de exemplo, o referido processo pode serconduzido da seguinte maneira:

- Primeira repicagem das cepas Lactobacillushelveticus iniciais (cepas mães), em caldo MRS (Man RogosaSharp) neutro, à noite, a 35-40°C;

Segunda repicagem em MRS neutro.

Incubação até a obtenção de uma biomassasuficiente, por exemplo, 10-30h, a 35-40°C.

Inoculação de MRS contendo uma concentração delactose permitindo obter uma biomassa suficiente, porexemplo, 2-7% (p/p); incubação com acompanhamento da DO a580 nm.

-A estreptozotocina é preparadaextemporaneamente, e é acrescentada no curso dafermentação, de forma a ter uma concentração final que sejabactericida para a cepa considerada. Esta concentração édependente de cepa.

- Após a incubação a 35-40°C, as culturas sãolavadas duas vezes com triptona sal.

- Os resíduos são recuperados na triptona sal, emseguida, caldos de MRS neutros são recolocados em cultura.

Incubação a 35-40°C, até que se tenha umcrescimento da cepa.

- Isolamentos são, em seguida, realizados no MRSneutro + Xgal + IPTG, em seguida incubados a 35-40°C sobCO2. Esta etapa é um teste colorimétrico que permitedeterminar se uma cepa bacteriana é lactose positiva oulactose negativa: Se a cepa for capaz de utilizar a lactosecomo fonte de carbono, haverá produção de uma substânciaazul, a colônia será, consequentemente, azul e no casocontrário (cepa lactose negativa), ela será branca.

- As colônias brancas são repicadas em MRS neutroe incubadas a 35-40°C.

A invenção será adicionalmente descrita com oauxilio dos exemplos a seguir, os quais são nãolimitativos.

EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO

EXEMPLO 1: Obtenção de cepas possuindo umfenótipo lactose negativa

Material e métodos

Cepas iniciais (cepas ditas "mães")

1-3431 depositada na CNCM em 25/05/05

1-3434 depositada na CNCM em 25/05/05

1-3435 depositada na CNCM em 25/05/05

Teste de sensibilidade à estreptozotocina

Em um primeiro momento, é verificado que as cepasmães são sensíveis ao antibiótico utilizado, aestreptozotocina. A densidade óptica (DO) a 580 nm érealizada em culturas a 42°C em caldo MRS (Man RogosaSharp) neutro. Quando esta atinge 0,1, a estreptozotocina éacrescentada em um tubo a fim de se ter 50 μg/mL ao final(por exemplo, 100 μΐ de uma solução a 5 mg/ml por 10 ml demeio).

Seleção de cepas lactose negativa

As etapas a seguir são realizadas a fim de seobter cepas Lactobacillus helveticus lactose negativa:

Primeira repicagem das cepas Lactobacillushelveticus iniciais (cepas mães) a partir das cúpulas doestoque de trabalho, em caldo MRS neutro, à noite, a 370C.- Segunda repicagem a 1% em MRS neutro.

- Incubação, 16h, a 37°C.

- Inoculação de 10 ml de MRS a 5% (p/p) delactose, a 1% e incubação a 40°C com acompanhamento da DO a 580 nm.

A estreptozotocina é preparadaextemporaneamente, e é acrescentada ao final de 2hl5 ou de4h de fermentação, de forma a ter uma concentração final de50 pg/ml.

- Após as 7h30 de incubação a 40°C, as culturassão lavadas duas vezes com triptona sal.

- Os resíduos são recuperados em 2 ml de triptonasal, em seguida, caldos de MRS neutros são inoculados a 10%.

- Incubação a 37 °C, até que se tenha umcrescimento da cepa.

- Isolamentos são, em seguida, realizados em MRSneutro + Xgal + IPTG, em seguida incubados a 37°C sob CO2.

Esta etapa é um teste colorimétrico que permite determinarse uma cepa bacteriana é lactose positiva ou lactosenegativa: Se a cepa for capaz de utilizar a lactose comofonte de carbono, há uma produção de uma substância azul, acolônia será, consequentemente, azul e no caso contrário(cepa lactose negativa), ela será branca.

As colônias brancas são repicadas em MRS neutroe incubadas a 37°C.

Resultados

Este procedimento permitiu obter as cepas vivas,possuindo um fenótipo lactose negativa que, em seguida,foram o objeto de depósitos junto à CNCM (Coleção Nacionalde Culturas de Microorganismos), rua du Docteur Roux n°28,75724 Paris, França, em conformidade com as disposições doTratado de Budapeste:1-3504 depositada na CNCM em 14/10/05;proveniente da cepa mãe 1-3431

1-3505 depositada na CNCM em 14/10/05;proveniente da cepa mãe 1-3434

1-3508 depositada na CNCM em 14/10/05;proveniente da cepa mãe 1-3435

0 fenótipo lactose negativa das cepas obtidas éde novo confirmado em um meio gelose de MRS neutro + Xgal +IPTG (teste de coloração dito "branco/azul").

EXEMPLO 2: Cepas possuindo um fenótipo Lactosenegativa

A cepa 1-3504, depositada em 14/10/05 junto àCNCM (Coleção Nacional de Culturas de Microorganismos), ruadu Docteur Roux n°28, 75724 Paris, França, em conformidadecom as disposições do Tratado de Budapeste, é uma cepa deLactobacillus helveticus possuindo as seguintespropriedades:

- Lactose negativa; Frutose negativa

- produção de IPP e VPP: vide Figuras 4 e 5

- propriedades de acidificação: vide figura 1

- inibição da ACE: vide Figura 6

A cepa 1-3505, depositada em 14/10/05 junto àCNCM (Coleção Nacional de Culturas de Microorganismos), ruadu Docteur Roux n°28, 75724 Paris, França, em conformidadecom as disposições do Tratado de Budapeste, é uma cepa deLactobacillus helveticus possuindo as seguintespropriedades:

- Lactose negativa; Frutose negativa

- produção de IPP e VPP: vide Figura 5

- propriedades de acidificação: vide figura 2

A cepa 1-3508, depositada em 14/10/05 junto àCNCM (Coleção Nacional de Culturas de Microorganismos), ruadu Docteur Roux n°28, 75724 Paris, França, em conformidadecom as disposições do Tratado de Budapeste, é uma cepa deLactobacillus helveticus possuindo as seguintespropriedades:

- Lactose negativa; Frutose negativa

- produção de IPP e VPP: vide Figura 5

- propriedades de acidificação: vide figura 3

1. Medida das propriedades de acidif icação dasdiferentes cepas variantes

As propriedades de acidificação são avaliadascomo a seguir:

Um meio contendo 120g de leite em pó desnatado(PLE) em 930ml de água é pasteurizado 10 min a 95°C. Estemeio é inoculado a 0,5%, em seguida submetido à fermentaçãoa 37 0C em presença de diferentes concentrações de glicose.(A abreviação Gx indica uma concentração de x% (p/p) deglicose no meio antes da fermentação) 0 pH é entãocontrolado em função do tempo, para diferentes cepas, Umaextração de meio fermentado efetuada a 30h de fermentaçãoserá utilizada para as medidas de produção dos tripeptideosIPP e VPP, assim como para as medidas de atividade ACEIcujos resultados serão indicados abaixo.

Para 1-3504, são apresentados também osresultados da cepa mãe (1-3431, cepa lactose positiva).(vide figura 1)

Para 1-3505, são apresentados também osresultados da cepa mãe (1-3434, cepa lactose positiva).(vide figura 2)

Para 1-3508, são apresentados também osresultados da cepa mãe (1-3435, cepa lactose positiva).(vide figura 3)

Os resultados apresentados nas figuras 1 a 3demonstram que as cepas de acordo com a invenção permitemvantajosamente controlar finamente o pH ao fim dafermentação de acordo com a quantidade de glicoseinicialmente presente no meio. Por outro lado, afermentação por cepas lactose negativa conduzvantajosamente a valores de pH elevados, que darão produtosalimentares organolepticamente aceitáveis.

2. Medida da produção dos tripeptídeos IPP e VPP

Material e método

Uma amostra de meio lácteo extraída em 30 horasde fermentação, tal como descrito precedentemente no ponto1, é utilizada para fazer esta medida.

A análise do conteúdo em peptídeos, notadamente oteor em tripeptídeos IPP e VPP, é conduzida com um métodode cromatografia líquida CLHP associada a um sensor do tipoMS/MS como descrito a seguir:

- Devido às interferências inerentes à análise deamostras complexas, o uso de padrões internos deuteradosacrescentados em quantidade conhecida e controlada nomomento da preparação da amostra é fortemente aconselhado.

- A preparação da amostra é feita por diluição domeio fermentado em uma mistura de água, de metanol e deácido trifluoroacético (50/50/0,1%), contendo 25 ppm depadrão interno VPP deuterado (referido, a seguir, comoVPPd, de fórmula H-Val [D8]-Pro-Pro-OH, MM = 319,45 g/mol,disponível junto à sociedade Bachem Chemicals, França) e 10ppm de padrão interno deuterado (referido, a seguir, comoIPPd, de fórmula H-Ile [D10N15]-Pro-Pro-OH, MM = 336,2g/mol, disponível junto à sociedade NEOMPS, Groupe SNPE,rua de Boulogne n°7, 67100 Strasbourg, França) em umarelação de 1 para 3 (por exemplo, pesagem precisa em umeppendorf de 600 mg de amostra em 1200 mg de mistura ág-ua-metanol-TFA contendo os padrões internos).

Esta amostra diluída é, em seguida,centrifugada a 14000g durante 15 minutos. 0 sobrenadanteclaro obtido, contendo os peptideos gerados durante afermentação, é, em seguida, diluido precisamente ao 1/50 emuma mistura de água-metanol (50/50, v/v) contendo 0,1% deácido trifluoroacético.

-A solução diluída assim obtida é, em seguida,analisada em um sistema cromatográfico CLHP do tipo Agilent1100 (sociedade Agilent Technologies France, rua Galvanin°l 91745 Massy cedex, França), equipado de uma colôniaadaptada para a análise dos peptideos, do tipo WatersBiosuite® (3mm 2,1 χ 150mm, C18 PA-A, WAT186002427, WatersFrance, rua Jacques Monod n°5, 78280 Guyancourt) àtemperatura de 50°C, vazão de 0,25 ml/min. Os peptideos sãoeluídos de forma clássica com um gradiente crescente desolvente B (Acetonitrila + 0,100% de ácido fórmico) nosolvente A (Água + 0,106% de ácido fórmico), em uma duraçãode 35 min a 2 horas em função da resolução cromatográficadesejada. 0 método adaptado à dosagem dos peptideos IPP eVPP utiliza o seguinte gradiente:

- A detecção é feita com o auxílio de um detectorespecífico do tipo MS/MS, por exemplo, com um aparelho comporta iônica como o Esquire3000+ (Bruker Daltonique, rua de1'Industrie, 67166 Wissembourg Cedex), parametrizado emionização por eletrospray no modo positivo, seja para aanálise global do conteúdo peptidico (modo MS-MS), sejapara a quantificação precisa e especifica de um peptideo apartir de seus fragmentos característicos (modo MRM) . Nocaso da dosagem dos peptídeos IPP e VPP, mas também dospadrões internos IPPd e VPPd, esses peptídeos são isoladosa partir de sua massa específica (íons monocarregados 312,2Da para VPP; 326, 2 Da para IPP; 320,2 Da para VPPd; 337,3Da para IPPd) e quantificados a partir da intensidade deseus íons específicos após a fragmentação (fragmentos >= 85Da) .

A integração dos picos cromatográficos de cada umdos peptídeos IPP, VPP e a comparação nas superfícies depico dos padrões internos de concentrações conhecidas IPPde VPPd permite, em seguida, calcular, por regressão linearsimples, o teor inicial da amostra em VPP e IPP (geralmenteexpresso em mg/kg ou ppm).

Resultados

<table>table see original document page 21</column></row><table>

A figura 4 mostra uma comparação da produção emtripeptídeos IPP e VPP da cepa 1-3504 (2% (p/p) de glicosesão acrescentados ao meio) em relação a duas cepas datécnica anterior.

A cepa CM4 da sociedade CALPIS é descrita napatente EP 1 016 709 enquanto que a cepa CNRZ 244 édescrita no pedido de patente WO 2004/060073.É claro nesta figura que a cepa 1-3504 (cepa deacordo com a invenção) possui uma produção de tripeptideosIPP e VPP bem superior àquelas duas cepas precedentes nasmesmas condições.

A figura 5 mostra uma comparação da produção emtripeptideos IPP e VPP das cepas de acordo com a invençãoentre si.

3. Medida da atividade ACEI (Inibição da Enzimade Conversão da Angiotensina)

Material e método

Uma amostra de meio lácteo extraída depois de 30horas de fermentação, tal como descrito precedentemente noponto 1, é utilizada para fazer esta medida. 0 presentemétodo tem como base o método de Cushman e Cheng (Cushman eoutros Biochem. Pharmacol. 1871. 20:1637), adaptado paratorná-lo compatível com amostras do tipo produtos lácteosfermentados.

1. Preparação dos reativos e das soluções

1.1 Tampão borato de sódio 0, IM pH 8,3,adicionado de 0,3M de NaCl

Pesar 6, 1843 g de H3BO3 (Cario Erba ref: 402766). Dissolver em aproximadamente 800 ml de águadesmineralizada, ajustar ao pH 8,3 com uma solução de NaOH,em seguida acrescentar 12,0 g de NaCl (concentração final0,3M) e completar em 1 litro com a água desmineralizada.

1.2 Preparação do substrato HHL: solução deHip-His-Leu a 5mM em um tampão de borato de sódio 0,1M pH8,3 com 0,3M de NaCl

Pesar exatamente 42,'95 mg de peptídeo HHL anidro(N-Hipuril-Histidil-Leucina tetrahidrato PM: 501,5 g,Sigma-Aldrich ref: 53285-250 mg) e dissolver emaproximadamente 15 mL de tampão de borato de sódio 0,1M pH8,3 com 0,3M de NaCl, depois completar em 20 mL com estemesmo tampão.

1.3 Preparação da solução de ACE a 0,1 U/mL

A enzima de conversão da angiotensina sob a formade pó liofilizado (origem: pulmões de coelho, Sigma-Aldrichref. A6778, 0, 25 unidades) é solubilizada em 2,5 mL detampão de borato de sódio 0,1M pH 8,3 para obter umasolução a 0,1 U/mL. A solução assim preparada deve serutilizada, armazenada a 4°C, até no máximo 2 semanas parapreservar uma atividade enzimática suficiente.

2. Preparação das amostras de leite fermentado

É necessário acondicionar a amostra a um pHcompreendido entre 8,0 e 8,5 de forma a ficar próximo do pHót imo da ACE. O leite fermentado é primeiramentecentrifugado, o pH do sobrenadante é, em seguida, ajustadoentre 8,0 e 8,5 (idealmente pH 8,3), depois ultrafiltradocom o auxilio da unidade de filtração Vivaspin com umlimiar de clivagem de 10000 Daltons (Vivascience, França) afim de eliminar os elementos interferentes (proteínasinteiras, sais de cálcio).

O protocolo completo é o seguinte:

- Depositar cerca de 6 mL de leite fermentado emum tubo tipo falcon de 15 mL após ter previamente pesado otubo vazio. Pesar a quantidade de leite fermentadodepositada no tubo.

- Centrifugar em 14000 g durante 10 min a 10°C.

- Recuperar o sobrenadante.

- Quantificar a proporção resíduo/sobrenadante, oque permite, se necessário, determinar o IC50 equivalenteao produto de origem e não a seu único sobrenadante.

- Extrair 2,0 mL de sobrenadante em um tubo deensaio e medir o pH.- Acrescentar o volume necessário de NaOH 2M afim de obter um pH compreendido entre 8,0 e 8,5 (alvo: 8,3)após o acréscimo do tampão de borato, e depois agitar.

- Acrescentar o volume necessário de tampão deborato para diluir o sobrenadante inicial a 1/2 levando emconta o volume exato de NaOH acrescentado (por exemplo:amostra de ensaio de sobrenadante = 2 mL + 250 uL NaOH +1,75 mL tampão borato).

- Verificar que o pH final está compreendidoentre 8,0 e 8,5. Mais à frente, recomeçar acrescentandomais ou menos NaOH. Um precipitado é formado: ele é devidoaos sais de cálcio.

- Ultracentrifugar a amostra em 12000 g durante15 min a 10°C com o auxilio de unidades de filtraçãoVivaspin 10000 Daltons (capacidade 4-6 mL) a fim de obteruma amostra límpida.

3. Medida da inibição da ACE pelas amostras deleites fermentados

A cada série de análise, testes de controle (0 e100% atividade ACE) devem ser preparados. Para cadaamostra, dois ensaios independentes e um branco sãorealizados para cada diluição. Deve-se, na verdade, ajustarao máximo (diluindo) a quantidade de amostra necessáriapara diminuir de 50% a atividade da ACE.

Para isto:

- Depositar 80 \uL da amostra condicionada a um pH8,3 no tubo branco e nos tubos de ensaio.

- Depositar 80 \uL de água desmineralizada nostubos de controle 0 e 100%.

Acrescentar 200 uL da solução de substrato HHLa 5mM em todos os tubos. Agitar.

Colocar os tubos em um banho de águatermostatado a 37°C, deixar se equilibrar na temperatura.- Desencadear a reação enzimática por acréscimo,em cada tubo, de 20 yL da solução de ACE a 0,lU/mL, salvopara os brancos e controle 0% para as quais se devedepositar 20 pL de tampão borato pH 8,3.

- Deixar hidrolisar durante Ih exatamente a 37°C.

- Interromper a reação acrescentando, em cadatubo, 250 pL da solução de HCl 1M.

Tabela recapitulativa da composição dosdiferentes meios reacionais:

<table>table see original document page 25</column></row><table>

A leitura é feita por extração do substratohidrolisado (ácido hipúrico) e sua quantificação com oauxilio de um espectrofotômetro, com o seguinte protocolo:

Acrescentar, em cada tubo, 1,7 mL acetato deetila, agitar.

Centrifugar a 2000 g durante 5 min a 10°C.

Extrair 1 mL exatamente do sobrenadante em ummicrotubo eppendorf.

Evaporar o acetato de etila a 120°C durante 10min em um bloco aquecedor.

Acrescentar exatamente 1 mL de águadesmineralizada, depois agitar 10 seg para retomar o ácidohipúrico.

Ler a absorvância a 228 nm em cubas adaptadas àleitura em UV.Expressão dos resultados:

A porcentagem de inibição da ACE é calculada comoa seguir:

(Abs 100% ctl - Abs 0% ctl)-(Abs am - Abs am branca) χ 100

(Abs 100% ctl - Abs 0% ctl)

com Abs = absorvância a 228 nm após a extração doácido hipúrico

ctl = controleam = amostra

Para um leite fermentado, expressamos o IC50 comosendo a quantidade de sobrenadante deste leite fermentadoque inibe 50% da atividade enzimática da ACE no meioreacional, seja em microlitros de sobrenadante de leitefermentado por mililitro de meio reacional.

Resultados

A figura 6 mostra uma comparação da atividadeinibitória da enzima de conversão da angiotensina dasdiferentes cepas de acordo com a presente invenção com a deoutras cepas da técnica anterior.

Na ordenada é expressa a concentração equivalentede leite fermentado por ml de meio reacional necessáriapara inibir 50% da atividade da enzima de conversão daangiotensina (IC50). Quanto mais elevada for estaconcentração, menos capacidade tem, consequentemente, acepa de inibir a enzima de conversão da angiotensina.

EXEMPLO 3: preparação de um produto lácteo(probiótico) de acordo com a invenção

Um produto lácteo fermentado é obtido comoindicado abaixo.

Leite de grande mistura, previamente desnatado,pré-pasteurizado e resfriado a 40C é padronizado emproteínas (4,0%) com leite em pó desnatado e adicionado comglicose a uma razão de 1,8% (p/p). 0 meio lácteo entãopreparado é submetido a uma pasteurização (95°C - 8 min).Após o resfriamento a 37 °C, o meio lácteo é inoculado comuma cepa de acordo com a presente invenção a uma razão de10 7 UFC/mL e mantido a 37 0C durante toda a duração dafermentação. Quando o pH 3,8 é alcançado, a coalhada éretirada da cuba de fermentação para sofrer filtração(lissage) (por passagem através de um filtro) e resfriadaaté 10°C em um permutador de placa. A coalhada filtrada eresfriada é, em seguida, adicionada de uma preparação defrutas (tendo um pH entre 4 e 4,1) a uma razão de 15% doproduto final, acondicionada em frascos de 110 mL eestocada a 40C durante 28 dias.

O produto assim preparado contém tripeptideos deseqüência IPP/VPP a uma razão de 65 mg/kg de equivalente emVPP. O teor em peptideos do produto é vantajosamenteestável durante toda a duração de vida do produto. Adiminuição de pH no curso da estocagem refrigerada évantajosamente desprezível (inferior a 0,1 unidade) e apopulação das cepas de acordo com a invenção permanecevantajosamente compreendida entre 10 7 e 10 8 UFC/mL.

EXEMPLO 4: Identificação de mutações pontuais semsentido no operão lactose de cepas de acordo com a invençãoA partir das seqüências dos operões lactose dascepas DPC4571 e ATCC15009 disponíveis no genbank,oligonucleotídeos (percursores) foram escolhidos em genesque pareciam estar mais conservados. Essesoligonucleotídeos permitiram realizar uma PCR de "longafaixa", depois de começar a seqüenciação do operão lactosede acordo com a invenção. A seqüenciação foi, em seguida,praticada passo a passo, isto é, em função das seqüênciasobtidas, outros percursores serviram para novas reações deseqüência.Uma mutação sem sentido foi identificada na cepa1-3504 em relação à cepa mãe 1-3431: no sentido 5'-3', umabase de citosina é substituída por uma Timina, o que fazaparecer um códon de terminação com 1320 pares de bases docódon de iniciação do gene IacL (que faz cerca de 1900 pbs)codificador para a β-galactosidase.

Fora esta mutação, os operões lactose das duascepas 1-3431 e 1-3504 são idênticos.

Seqüência do operâo lactose da cepa 1-3431(mutação delimitada)

aaatgaaaattcatgatctaactctggattaatgtgataagcgctttcaacatcagtgccccagctgtcaattcctccaacgccgcg

aactgcacctgcaattactaacacggítctgcgaacaagtggtagítcttcaatgttagtagcgttctcaagctccteagcagiata

aggcaaacaactgaaattaaatggttíttctgcttgttgaattgagagactgaacttUcattígtacgatclacattattttgtgtggtttc

acattaatggttaacttcttagtttgcatgtgcattccaímcctgcggaaccaaatactcggtaactggcaaaccatcgatatgga

atttaccttctttagctccagccattctatcaggataagtttcaccggataaaccttcataatcaaatcctgtagcagccgttggcata

atcaalcgaataccaattacaggcaggggtggtaatcccttcttaccataataacgcattgtaaccttaatgigaccgacatcatc

aatatíatagatgatttttgcatttgttgcaggagtagítaaagtttgataggtaaatgaaatttcagcactttttgcatactcgtgattgct

aaatttgttgttaaagggtgcaataggcagttcggcaaagtcatgtctgtctacttítaaatggatatcagtacatttagtaaacatat

cagctccgagccattgagctgcctttagattaaatccactgcctcggtcgttatctgtagttgctcgccaaaaagtaggagtaggta

cacataaagccattccttgccgtgtactíttaacgattcaagtccgccgcgttcaiaactaaagatgíattgaaaatcxtttgccatta

acgccaaatgtggcatccccataaatgataígcaattgattatttgtgtaatccataaíagtatctcacttcctgcatagctggttttggt

íítcíatcgcgaacaítasaccatcgccgaaaatícaiaaíctyaatgacgatca

catgtccactaatítcatcatgaaccaataatgcctgatcgataaagtcccagataaatccaccgaagtattgagggtatttatcaa

gtaatttgatatatgaatccaígccgccgitagaattgcccatgtcatgcatatattcgcattccataaatggctttggiggalcatíttg

caagtattcttcaacctttttaggtggtaaatacatacagcíttcaacatctgaaattttatcttttaattcgggacggígcactacgcctt

catagtgaaciaagcgtgtetcatcgtgagatttgtaaaattcattcattgcgatgatgttgtcíccagcataggattcgtígccaagt

gaccaaaagagaatagaggtgtgattcttgaaagtcicgtagttaítgcgtgctcgatcaaicactgcttctttcgattgcggaatcg

aacctggtacattgtcagaaggttcaatctctcccattttttgccaagíaccatgtgattcaaggttattctcggccatgacafaaatg

ccatttígatcgcaaagataataccacggaatttggtttgggtagtgacatgttcíaacagcattaatattattttcfttaaaagtattaa

tgtcagttgtcaíatcactcattgttatgctgcgaccacgttttgcatcccattcatgtcggttaacíccattgataattaaacgcttgcca

tttaacaaaacaactttttctggactaatttcaattctcctaaagccaaattggaaaggaatcagclctagcaagttttgttgttcaícatcragctccogaaUatttgattcaattcgccctaatrt^aagatcggttttatcggtggcgttggecdaagcatgaccatattraggaaaaagatttgcg^aactagaggcatggatactaaatggacatgcgttgaaggacc^gítagcgttgaaaatggttataaaKgggaaaaalggttttggctaaataeaaaaatgatttaoctgaagcatttttaattgcatdg^^c^aatgtaccaaaagaíactaagatcttaagtattaataatagcaatgtggtteagtatgtttcaccaccactttttaatcaac^gaaatgattgatatggcacrtgatactttgactc^tttgattattcatccagatc^ccaaagattgatatccggatgaacactaatttggtagtacgaaaaagcttcgtta^aagaaaagtaaatttt^aagagaatgtgaaragctcacattctctttttatttac^gttaaraca tíggggaggaaggsaaaagatgaataatcataaaatcícaggaaagcaagtcatttcciatgcgí ccttttgtttggggaaíttaggatacgcagctttttatggcgíaatgagtacgtatttíattatMatcactagtgtt^ataagttaattggdtaatiacrtgcattgatagttítagtaagaaattgtegagtt^aataeiaaaacaagg!gaggcaagtttaag<x;ttggatctttattggaacggt3gct^gtattttcggdtggcacataagagüggattctttttgcaattttaffi^ggi^tggttí^gccttaagtgaggattcacacgc^cgtggtatttatadgcmggggac^tWcaggtgcaattggttggaacggamaactatcattgttgtgccactggtla^cctttgcggcggttaUicaga^gctattctttgtgca^gccaagtaaaaaacaactttaggtcaagtatttggggcaatttcaeataatgatcag^t^trattggctaatgtaatiacaaatggggtaatgttttatctgtaraaattcgt^^ttgocacatíaatcgttttttgc^ttagtccattgtttccaatMa^^tatgattiggcata<^gtfgttcattttc^ttagtaadgttttaacattaacrtgatgccatc^aatatggtcagc^gaoeaatggicgataaattíaccggtgctatttc^acgcgctagtaggatatgtagra^aactgcagcagatagacaagtcac^íattagcaMraatattatggctttatatgtgc^ttttataagcaaggtaactttatctgaaaagaaacacgctcaagtggttgaagaattaaagagcaaacttgcacaagggaagatcgaagatggc^tüacetgcageaaaütaaagS<^adgceatttatg^^tcgatgaaaatggcaaaacatttccággtaaâggcffigcaatcgatccaagcagtgggcaaatttttgccacatttgatggtaaaattaagtttacctttggtaccaagcatgc^tígaaattgtaactgaaaat^gttaatttgcgtggtgaaggatttgagtcatattatgatgat^caaattgttaaasaaggtgaadgctattagaatc^acc^gattlagca^aaaaatggttataaagatacgatagtaatHtctatactcaacctggtagagtagaaaaaatgagtaaaatttcggaaccaggtagaattcaaaattctggtgctattcaagctggtaaagatatDa mesma forma, análises de seqüenciações revelamas seguintes mutações no operão lactose de cepas de acordocom a invenção:

- Cepa 1-3505 por comparação com a cepa 1-3434:

Na cepa 1-3505, uma base adenosina substitui umabase guanina que provoca a aparição de um códon determinação, com 1713 pares de bases do inicio do gene IacLcodificador para a beta-galatosidase.

- Cepa 1-3508 por comparação com a cepa 1-3435:

Na cepa 1-3508, uma base adenosina substitui umabase guanina que provoca a aparição de um códon determinação, com 183 pares de bases do inicio do gene IacLcodificador para a beta-galatosidase.

Claims

1. Cepa de Lactobacillus helveticus que não tem acapacidade de transformar a lactose em ácido láctico.

2. Cepa de Lactobacillus helveticus, de acordocom a reivindicação 1, possuindo pelo menos uma mutação nooperão lactose.

3. Cepa de Lactobacillus helveticus, de acordocom a reivindicação 2, possuindo pelo menos uma mutaçãopontual introduzindo um códon de terminação no operãolactose.

4. Cepa de Lactobacillus helveticus, de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 3, tal que um meiolácteo com 4,0% de proteínas totais contendo 1,0% (p/p) deglicose fermentado pela cepa de Lactobacillus helveticusdurante um tempo máximo de fermentação de 30h, a umatemperatura entre 30 e 45°C, possua um pH superior ou iguala 4,0, preferencialmente superior ou igual a 4,1.

5. Cepa de Lactobacillus helveticus, de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 4, capaz, porfermentação a uma temperatura entre 30 e 45°C, maispreferencialmente entre 32 e 43°C e ainda maispreferencialmente a 37 0C de um meio lácteo contendo umaquantidade de glicose superior a 3% (p/p) e com um teortotal de proteínas superior ou igual a 2% (p/p),preferencialmente entre 2 e 10% (p/p) , maispreferencialmente entre 2,5 e 6% e ainda maispreferencialmente igual a 4%, de produzir os tripeptídeosde seqüência IPP e/ou VPP em uma quantidade de pelo menos-25 mg, preferencialmente pelo menos 50 mg, maispreferencialmente pelo menos 75 mg de VPPeq por kg deproduto fermentado.

6. Cepa de Lactobacillus helveticus, de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 5, que possui adicionalmente um fenótipo frutose negativa.

7. Cepa de Lactobacillus helveticus, de acordocom a reivindicação 1, escolhida dentre:- 1-3504 depositada na CNCM em 14/10/05;- 1-3505 depositada na CNCM em 14/10/05;- 1-3508 depositada na CNCM em 14/10/05;e as cepas variantes ou mutantes derivadasdestas.

8. Utilização de uma cepa de Lactobacillushelveticus conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 7,para a preparação de um produto alimentício oufarmacêutico, notadamente de um produto lácteo fermentado.

9. Utilização, de acordo com a reivindicação 8,tal que o produto alimentício ou farmacêutico possuipropriedades anti-hipertensivas.

10. Produto alimentício, notadamente produtolácteo fermentado, compreendendo pelo menos uma cepa deLactobacillus helveticus conforme uma das reivindicações 1a 7.

11. Produto alimentício, de acordo com areivindicação 10, contendo pelo menos 10^6,preferencialmente pelo menos 10^7, preferencialmente pelomenos 10^8 UFC/mL de bactérias Lactobacillus helveticusvivas.

12. Produto alimentício, de acordo com qualqueruma das reivindicações 10 ou 11, contendo pelo menos 25 mg,preferencialmente pelo menos 50 mg, mais preferencialmentepelo menos 75 mg de VPPeq por kg do produto alimentício.

13. Produto alimentício, de acordo com qualqueruma das reivindicações 10 a 12, compreendendoadicionalmente preparações de fruta(s), notadamente pedaçose/ou suco de fruta(s).

14. Produto alimentício, de acordo com qualqueruma das reivindicações 10 a 13, possuindo um pH superior ouiqual a 3,85, preferencialmente superior ou igual a 4,00,mais preferencialmente superior ou igual a 4,20.

15. Produto alimentício, de acordo com qualqueruma das reivindicações 10 a 14, que possui propriedadesanti-hipertensivas.

16. Processo de preparação de um produtoalimentício compreendendo as etapas a seguir:selecionar uma matéria-prima contendo proteínasde leite, notadamente proteínas contendo as seqüênciaspeptídicas IPP e/ou VPP;selecionar pelo menos uma cepa de Lactobacillushelveticus conforme uma das reivindicações 1 a 7;inocular a matéria-prima com a cepa;fermentar a matéria-prima em presença de 1 a 3%(p/p) de glicose durante 12-30 horas a 30-45°C, e empresença da cepa.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 16,desprovido de qualquer etapa de termização após afermentação.

18. Utilização de estreptozotocina para aobtenção de cepas de Lactobacillus helveticus possuindo umfenótipo lactose negativo.

19. Processo de obtenção de cepas deLactobacillus helveticus possuindo um fenótipo lactosenegativo, compreendendo as etapas a seguir:fornecer pelo menos uma cepa de Lactobacillushelveticus;colocar em contato a, pelo menos uma, cepa comuma quantidade eficaz de estreptozotocina em presença delactose;isolar a ou as colônias de fenótipo lactosenegativo.

20. Processo, de acordo com a reivindicação 19,compreendendo uma etapa de teste colorimétrico em um meiocontendo Xgal e/ou Sgal e/ou qualquer outro composto ligadopor uma ligação β-galactosídica à galactose e que se tornadetectável após a ruptura desta ligação pela cepa deLactobacillus helveticus.