FI112031B

FI112031B - Biologisesti aktiivisen tuotteen uusi käyttö

Info

Publication number: FI112031B
Application number: FI20020360A
Authority: FI
Inventors: Olli Tossavainen; Annika Maeyrae-Maekinen; Riitta Korpela; Mirkka Narva
Original assignee: Valio Oy
Priority date: 2002-02-25
Filing date: 2002-02-25
Publication date: 2003-10-31
Also published as: FI20020360A0; JP4242293B2; RU2004128448A; JP2005517424A; AU2002352303A1; WO2003070267A1; EP1485119A1

Description

112031

Biologisesti aktiivisen tuotteen uusi käyttö Keksinnön ala

Keksintö liittyy mineraalien hyväksi käytettävyyden tehostamiseen ja 5 luuston vahvistamiseen biologisesti aktiivisten peptidien ja niitä sisältävien tuotteiden avulla. Peptidit ja niitä sisältävät tuotteet ovat käyttökelpoisia mm. erilaisten luun mineraalien absorptioon liittyvien häiriöiden ja sairauksien ennaltaehkäisemiseksi ja hoitamiseksi. Tuote, jolla on korkea lyhytketjuisten peptidien pitoisuus ja korkea kalsiumpitoisuus, on todettu erityisen tehokkaaksi 10 keksinnön mukaiseen käyttöön.

Keksinnön tausta

Ravinnon proteiinit ovat elimistölle välttämättömien aminohappojen ja typen lähde. Lisäksi ravinnon proteiinit sisältävät peptidejä, jotka saattavat 15 olla elimistön toimintojen merkittäviä säätelijöitä. Biologisesti aktiiviset peptidit voivat vaikuttaa mm. ravintoaineiden imeytymiseen (fosfopeptidit ja kasomor-fiinit), hormonien eritykseen (kasomorfiinit) sekä immuniteettiin (immunopepti-dit, kasokiniinit, kasomorfiinit). Ravinnosta maidon kaseiini on biologisesti aktiivisten peptidien merkittävin lähde (Schlimme E. & Meisel H. Bioactive pepti-20 des derived from milk proteins. Structural, physiological and analytical aspects.

,. Die Nahrung 1995; 39:1-20; Steijns J. Dietary proteins as the source of new • · '··' health promoting bio-active peptides with special attention to glutamine pep- :.i : tide. Food Tech Europe 1996; March/April: 80-84).

j \ ; Fosfopeptidien on todettu vaikuttavan kivennäisaineiden imey- 25 tymiseen kehossa. Fosfopeptidit muodostuvat pääasiassa a- ja β-kaseiinista ; trypsiinin aiheuttaman proteolyysin kautta. Lee on tutkimusryhmineen havain- : nut, että dieetti, joka sisälsi kaseiinia 200 g/kg, lisäsi fosfopeptidien muodos tumista (Lee Y et ai. Phosphopeptides and soluble calcium in small intestine of :· rats given a casein diet. Br J Nutr 1980; 43:457-67). Kun kaseiinia annettiin ai- > > . 30 noana ravinnonlähteenä, ei fosfopeptidejä kuitenkaan muodostunut. Tutkijat I t päättelivät, että fosfopeptidien muodostuminen vaatii kaseiinin lisäksi myös I 1 i muita ravinnon lähteitä, kuten tärkkelystä tai rasvaa. Tämä saattaisi johtua sii-tä, että muut ravintoaineet lisäävät proteolyyttisten entsyymien aktiivisuutta : X ohutsuolessa.

‘11. 35 Eläinkokeiden perusteella maidon kaseiinista muodostuneet fosfo- “ peptidit lisäävät liukoisen kalsiumin määrää suolessa ja saattavat siten paran- 112031 2 taa kalsiumin imeytymistä (ks. mm. Lee Y et ai. Phosphopeptides and soluble calcium in small intestine of rats given a casein diet. Br J Nutr 1980; 43:457-67; Lee Y et al. Intestinal absorption of calcium in rats given diets containing casein or amino acid mixture: the role of casein phosphopeptides. Br J Nutr 5 1983; 49:67-76; Li Y et al. Indirect effect of casein phosphopeptides on cal cium absorption in rat ileum in vitro. Reprod Nutr Dev 1989; 29:227-233; Mykkänen HM, Wasserman RH. Enhanced absorption of calcium by casein phosphopeptides in rachitic and normal chicks. J Nutr 1980; 110:2142-2148; Tsu-chita H at al. The effect of casein phosphopeptides on calcium utilization in 10 young ovaryectomized rats. Z Ernahrungswiss 1993; 32:121-130; Yuan YV, Kitts DD. Calcium absorption and bone utilization in spontaneously hypertensive rats fed on native and heat-damaged casein and soya-protein. Br J Nutr 1994; 71:583-603), ja elimistön kalsiumtilaa (Tsuchita H et al. ibid.). Kaikki tulokset eivät tosin tue tätä väitettä (ks. esimerkiksi Brommage R et al. Influence 15 on casein phosphopeptides and lactulose on intestinal calcium absorpition in adult female rats. Lait 1991; 71:173-180).

Ihmisillä fosfopeptidien vaikutusta kalsiumin imeytymiseen on selvitetty muutamassa tutkimuksessa. Hansenin ym. randomisoidussa cross-over-tutkimuksessa 22 terveelle aikuiselle annettiin riisi- tai kokojyväpohjaista las-20 tenruokaa, johon oli lisätty 0, 1 tai 2 grammaa fosfopeptidejä ja leimattua kalsiumia. Kalsiumin imeytyminen tutkittiin radioisotoopin retention avulla, ja sen '· ' todettiin lisääntyvän fosfopeptidien ansiosta noin 30 % riisipohjaista ruokaa ·’ saaneilla koehenkilöillä. Kokojyväpohjaista ruokaa saaneilla fosfopeptidit päin- : ' vastoin eivät lisänneet kalsiumin imeytymistä, mikä tutkijoiden mukaan saattoi : 25 johtua ruoan korkeasta fytaattipitoisuudesta (Hansen M et al. Casein phos- : phopeptides improve zinc and calcium absorption from rice-based but not from ; whole-grain infant cereal. J Pediatr Gastrolog Nutr 1997; 24:56-62). Heaney t ·» ym. antoivat 35 terveelle naiselle ravinnon mukana 250 g leimattua kalsiumia ;v, sekä 87,5 mg fosfopeptidejä tai plaseboa. Kalsiumin imeytyminen parani mer- 30 kittävästi niillä fosfopeptidejä saaneille naisilla, joilla kalsiumin imeytyminen oli ‘ ' muuten heikkoa. Naisilla, joilla kalsiumin imeytyminen oli runsasta, ja plaseboa * * · v : saaneilla henkilöillä fosfopeptidit eivät merkittävästi lisänneet kalsiumin imey- : ": tyrnistä (Heaney RP et al. Effect of caseinophosphopeptide on absorbability of ; I·, coingested calcium in normal postmenopausal women. J Bone Miner Metab 35 1994; 12.77-8I).

112031 3

Fosfopeptidien käytöstä saattaisi olla hyötyä esimerkiksi vauvoille, vanhuksille ja sairauksissa, joissa mineraalien, erityisesti kalsiumin imeytyminen on huonontunut tai tarve lisääntynyt. Fosfopeptidien lisääminen elintarvikkeisiin voisi olla turvallinen keino lisätä kalsiumin imeytymistä (Hansen M et ai.

5 1997, ibid.).

Biologisesti aktiivisten peptidien joukossa on myös verenpaineeseen vaikuttavia peptidejä. ACE eli angiotensiini l:ä muuttava entsyymi on avainentsyymi verenpaineen säätelyssä. Se muuttaa angiotensiini l:n angiotensiini ll:ksi, mikä supistaa voimakkaasti verisuonia. ACE-inhibiittorit voivat 10 estää tämän vaikutuksen ja siten toimia verenpainetta alentavina aineina. ACE-inhibiittoreina toimivia peptidejä esiintyy sekä maidon kaseiinissa että kalan ja maissin proteiineissa (Schlimme et ai. 1995, ibid.). Alan kirjallisuudessa verenpaineeseen vaikuttavina peptideinä on esitetty mm. Asp-Glu-Leu-GIn-Asp-Lys-lle-His-Pro-Phe-Ala-GIn-Thr-GIn-Ser-Leu-Val-Tyr-Pro-Phe-Gly-Pro-15 Ile-Pro-Asn-Ser ja Leu-Leu-Tyr-GIn-GIn-Pro-Val-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Pro-Phe-Pro-lle-lle-Val (Yamamoto N et ai. Antihypertensive effect of the peptides derived from casein by an extracellular proteinase from Lactobacillus helveticus CP790. J Dairy Sci 1994; 77:971-922), Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp (Maryama S et al. Angiotensin l-converting enzyme inhibitory activity of the C-terminal 20 hexapeptide of asi-casein. Agric Biol Chem 1987; 51:2557-61), ja Phe-Phe-Val-Ala-Pro (Maryama S et al. Agric Biol Chem 1985; 49:1405).

• · *··;' Myös hapatettujen maitotuotteiden on raportoitu sisältävän peptide- :.i.; jä, joilla on verenpainetta alentava vaikutus. Peptidien on arveltu muodostuvan * · : \; maitotuotteisiin maitohappobakteerien ja erityisesti niiden solunulkoisten pro- 25 teinaasien aiheuttaman maitoproteiinien hydrolyysin tuloksena.

Yamamoto et al. kuvaavat julkaisussa J. Biochem. 114 (1993) 740 mikro-organismista Lactobacillus helveticus CP790 peräisin olevan pro- *»· teinaasin puhdistamista ja karakterisointia. Yamamoto et al. ovat myös rapor-toineet tutkimuksesta, jossa asi- ja β-kaseiinia hydrolysoitiin mainitulla pro- • · '..! 30 teinaasilla ja saadut peptidit tutkittiin ACE:ta inhiboivan vaikutuksensa suhteen *;· (J Dairy Sci 1994; ibid.). Tutkittuja peptidejä oli yhteensä 25, ja ne olivat mole- •»* _ v : kyylikooltaan ja vaikutukseltaan hyvin erilaisia. Tehokkaimmat olivat kolme β- : ‘ ’ ‘: kaseiinista saatua, 8, 18 ja vastaavasti 27 aminohappoa sisältävää peptidiä.

; Tutkimuksessa verrattiin myös Lactobacillus helveticus -kannalla CP790 ja sen \‘.Y 35 proteinaasi-aktiivisuuden suhteen vajavaisella variantilla CP791 fermentoidun maidon ACE-aktiivisuutta, jolloin edellinen todettiin tehokkaaksi spontaanisti 112031 4 korkeaa verenpainetta kehittävissä SHR-rotissa, mutta ei tavallisessa rotta-kannassa, kun taas jälkimmäiseltä puuttui täysin aktiivisuus.

Nakamura et ai. kuvaavat julkaisussa J Dairy Sei 1995; 78:777 -783 Lactobacillus helveticusta ja Saccharomyces cerevisiaeta sisältävän ha-5 patteen käyttöä kahden ACE-inhibiittorin valmistuksessa. Rasvaton maito fer-mentoitiin mainitulla hapatteella, minkä jälkeen ACE-inhibiittorit puhdistettiin kromatografisesti ja analysoitiin. Aktiiviset yhdisteet olivat molemmat tripepti-dejä, Val-Pro-Pro ja Ile-Pro-Pro.

US-patentissa 5,449,661, Nakamura et ai., kuvataan tripep-10 tidisekvenssin Val-Pro-Pro sisältävän peptidin valmistusta ja käyttöä korkean verenpaineen alentamiseen. Peptidi valmistetaan fermentoimalla rasvatonta maitojauhetta Lactobacillus helveticus -kannalla JCM-1004, minkä jälkeen peptidi puhdistetaan kromatografisesti ja kylmäkuivataan.

Kansainvälisessä patenttihakemuksessa W099/16862, Yamamoto 15 et ai., kuvataan Lactobacillus helveticus -kantaa CM4, FERM BP-6060, joka kykenee tuottamaan suuren määrän tripeptidiä Val-Pro-Pro ja/tai Ile-Pro-Pro ja jolla on korkea solunulkoinen proteaasiaktiivisuus. Julkaisussa kuvataan myös fermentoituja maitotuotteita, jotka sisältävät edellä mainittuja tripeptidejä ja bakteeria, sekä menetelmää näiden valmistamiseksi fermentoimalla tripepti-20 disekvenssit sisältäviä tuotteita mainitulla bakteerilla.

ACE-inhibiittoreina toimivilla peptideillä on arvioitu mahdollisesti ··' olevan vaikutusta immuniteettiin sen perusteella, että bradykiniineillä, joiden : toimintaa ACE-inhibiittorit stimuloivat, on kyky lisätä makrofagien ja lymfosyyt- tien toimintaa (Migliore-Samour D et ai. Biologically active milk peptides impli-' 25 cated in immunomodulation. J Dairy Res 1989; 56:357-362). Näiden peptidien vaikutusta mineraalien imeytymiseen ei ole tutkittu eikä kuvattu alan kirjaili- * suudessa.

Luun heikkoon mineraalitasoon liittyvät vammat ja taudit yleistyvät : v. koko ajan. Niitä esiintyy kaikissa ikäryhmissä. Ongelma on suurin vanhemmilla 30 ihmisillä, joilla yleinen metabolian heikentyminen, vähäinen liikunta ja niukka tärkeiden ravintoaineiden, vitamiinien ja mineraalien saanti, sekä erityisesti

* · I

· kalsiumin imeytymisen heikkeneminen voi aiheuttaa osteoporoosia. Väestön ikääntyessä pelätään, että luun mineraalitason heikentymiseen liittyvien tautien ja vammojen esiintyvyys tulee lisääntymään entisestään. Myös postmeno-35 pausaalisilla naisilla kalsiumin imeytyminen on heikentynyt. Muuttuneiden ravitsemus-, liikunta- ja muiden kulttuuritapojen myötä on myös pelättävissä, että 112031 5 ajan myötä ongelma pahenee ja siirtyy aina nuorempiin väestöryhmiin. Esimerkiksi laktoosi-intoleranteilla, vegaaneilla ja laihduttajilla kalsiumin saanti jää alle suositusrajojen. Toisen riskiryhmän muodostavat ne, joiden kalsiumin tarve on lisääntynyt, kuten nuoret tytöt sekä imettävät ja raskaana olevat naiset.

5 Myös muut mineraalit vaikuttavat monipuolisesti ihmisen hyvinvoin tiin. Magnesium esimerkiksi välittää lihas- ja hermoärsytyksiä ja toimii luuston ja hampaiden rakennusaiheena. Magnesiumilla on myös todettu immuunivastetta vahvistava vaikutus. Magnesiumin puutostilat ovat harvinaisia, mutta nestehukka saattaa johtaa magnesiumkatoon. Kaliumin tehtäviin kuuluu neste-10 tasapainon säätelyjä lihasten supistus. Kaliumin puutteesta saattaa aiheutua lihasheikkoutta. Tärkeää magnesiumin ja kaliumin saanti on tautitiloissa, joissa esiintyy nestetasapainon häiriöitä tai nestehukkaa, sekä urheilijoilla liikuntasuorituksen jälkeen palautumiseen.

Mineraalien antaminen epäorgaanisia suoloja käsittävien valmistei-15 den muodossa ei ole kovin tehokasta, esimerkiksi epäorgaanisesta kalsiumista ainoastaan noin 40 % absorboituu suolistossa. Lisäksi kehon mineraali-tasapaino on herkkä ja saattaa muuttua hyvinkin jyrkästi, josta syystä tietyn mineraalin antaminen sellaisenaan ei aina ole hyvä vaihtoehto. Esimerkiksi ylenmääräinen kalsiumin lisääminen saattaa huonontaa muiden kivennäisai-20 neiden, kuten esimerkiksi raudan, imeytymistä. Siten on tärkeätä, että samalla kun nostetaan sen mineraalin pitoisuutta, jonka esiintyvyys tai absorboitumi-'···' nen on todettu liian heikoksi tai jonka tarve on lisääntynyt, muiden mineraalien väliset hyvät suhteet voidaan pitää ennallaan tai parantaa. Kivennäisaineiden ; .·’ imeytymiseen vaikuttavien peptidien antaminen sellaisenaan lääkeaineina tai 25 terveysvaikutteisina aineina on tällöin varteen otettava keino.

Lääkehoidon vaihtoehdoksi tai sen lisäksi voidaan myös hyödyntää muita tapoja luuston vahvistamiseksi sekä ennaltaehkäisevänä toimenpiteenä että (re)mineralisaation aikaansaamiseksi. Hyvä tapa on esimerkiksi liikunnan :v. lisääminen. Eräs uusimpia keinoja on terveysvaikutteisten ravintoaineiden 30 käyttäminen osana normaalia ruokavaliota, mikä onkin kuluttajien keskuudes- ’: * * sa tervetullut vaihtoehto. Biologisesti aktiivisten aineiden lisääminen elintarvik- * · * v : keisiin on todettu turvalliseksi keinoksi, ja niinpä mm. kolesteroliin ja veren- : ‘ ‘ ‘: paineeseen alentavasti vaikuttavia tuotteita on jo markkinoilla.

: Mineraalien hyväksikäytettävyyden tehostamiseen, osteoporoosin 35 ennaltaehkäisyyn, lievittämiseen ja parantamiseen, mineraalien imeytymisen ·’ parantamiseen, ja luun metabolian tukemiseen tarvitaan siis uusia keinoja.

112031 6

Sellaiset terveysvaikutteiset tuotteet, joilla on mineraalien imeytymistä ja luun muodostusta tehostava vaikutus, olisivat erittäin tervetullut lisä kaupan valikoimiin. Tärkeää on, että tuotteet eivät sisällä epämieluisia tai jopa haitallisia ainesosia, että niitä on helppo valmistaa teollisessa mittakaavassa, ja että ne 5 ovat kuluttajille miellyttäviä ja tutunomaisia ja siten helppo käyttää esimerkiksi osana normaalia ruokavaliota.

Keksinnön lyhyt kuvaus

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on siten tarjota käytettäväksi 10 tuote, jolla on mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostava vaikutus ja joka siten pystyy ennaltaehkäisemään, lievittämään tai parantamaan mineraalien hy-väksikäytettävyyteen liittyviä häiriöitä, sairastiloja ja vammoja. Erityisen tärkeä on tuotteen vaikutus kalsiumin imeytymiseen, osteoklastien muodostumisen vähenemiseen, osteoblastien ja siten vahvan luuston kehittymiseen ja osteo-15 poroosin ja sen esiasteiden ennaltaehkäisyyn ja lievittämiseen.

Keksinnön mukaisesti käytettävällä tuotteella on korkea mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostavien peptidien pitoisuus. Edullisessa sovel-lusmuodossa tuotteella on lisäksi optimoitu suolapitoisuus, mikä tarkoittaa sitä, että yksiarvoisten kationien määrä on pieni ja hyödyllisten kaksiarvoisten ka-20 tionien määrä on suuri verrattuna vastaavantyyppiseen tunnettuun tuotteeseen.

’··;* Erityisen edullisessa sovellusmuodossa tarjotaan käytettäväksi tuo- tetta, jonka mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostavien peptidien pitoisuus * · · : ',** on korkea ja jonka kalsiumpitoisuus on korkea.

: , , : 25 Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on edelleen tarjota tuote käyt- töön joko sellaisenaan mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostavana aineena • · tai nautittavaksi tarkoitettujen terveysvaikutteisten elintarvikkeiden tai lääkeaineiden valmistuksessa.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on lisäksi tarjota menetelmä • » [..! 30 mineraalien hyväksikäytettävyyden tehostamiseksi ja/tai luuston vahvis- tamiseksi antamalla yksilölle, joka on tällaisen hoidon tarpeessa, mineraalien v ·' hyväksikäytettävyyttä tehostavia peptidejä tai niitä sisältävää tuotetta sellainen ‘ ’ ’: määrä, joka on riittävä halutun vaikutuksen aikaansaamiseksi.

; Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on myös tarjota menetelmä 35 osteoporoosin ennaltaehkäisemiseen, lievittämiseen tai parantamiseen antamalla yksilölle, joka on tällaisen hoidon tarpeessa, mineraalien hyväksikäytet- 112031 7 tävyyttä tehostavia peptidejä tai niitä sisältävää tuotetta sellainen määrä, joka on riittävä halutun vaikutuksen aikaansaamiseksi.

Edelleen esillä olevan keksinnön tarkoituksena on tarjota menetelmä kalsiumin hyväksikäytettävyyden tehostamiseksi antamalla yksilölle tuotet-5 ta, jolla on korkea kaseiinipohjaisten pienimolekyylisten peptidien pitoisuus ja korkea kalsiumpitoisuus, ja joka on valmistettu fermentoimalla kaseiinipitoista lähtöainetta Lactobacillus helveticus -kannalla LBK-16H, DSM 13137, valinnaisesti poistamalla osittain tai kokonaan kaseiini ja/tai muita maidon proteiineja ja/tai laktoosi, riittävä määrä halutun vaikutuksen aikaansaamiseksi.

10 Edullisessa suoritusmuodossa fermentoidulle tuotteelle lisäksi suori tetaan nanosuodatuskäsittely.

Kuvien lyhyt selostus

Kuvassa 1 esitetään keksinnön mukaisesti käytettävän tuotteen ja 15 erilaisten vertailunäytteiden vaikutus rotan luuntiheyteen.

Kuvassa 2 esitetään keksinnön mukaisesti käytettävän tuotteen ja erilaisten vertailunäytteiden vaikutus rotan luunmineraalipitoisuuteen.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 20 Esillä olevan keksinnön mukaisesti on havaittu, että nämä tavoitteet voidaan saavuttaa käyttämällä mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostavia peptidejä tai niitä sisältävää tuotetta. Mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostavina peptideinä pidetään ennen kaikkea di- - tetrapeptideja ja näiden seok-siä. Näitä peptidejä voidaan edullisesti valmistaa kaseiinista tai kaseiinipitoi-25 sesta lähtöaineesta fermentoimalla. Erityisen edullisesti käytetään menetel-; .: mää, jossa biologisesti aktiivisia peptidejä sisältävä tuote muodostetaan fer- mentoimalla, minkä jälkeen se konsentroidaan ja koostumus viimeistellään nanosuodattamalla. Edulliseksi mainittu menetelmä antaa erinomaiset mah- : ·, ·. dollisuudet käyttää erityyppisiä lähtöaineita ja muokata lopputuotteen koostu- » · ‘ · · *, 30 musta halutun tyyppiseksi, kuten seuraavassa yksityiskohtaisesti kuvataan.

Keksintö koskee kaseiinipohjaisten pienimolekyylisten peptidien lle-: Pro-Pro ja/tai Val-Pro-Pro käyttöä valmistettaessa mineraalien hyväksikäytet- ,,,: tävyyttä tehostavaa tuotetta.

> * · 112031 8

Keksintö koskee edelleen sellaisen tuotteen käyttöä, jolla on korkea kaseiinipohjaisten pienimolekyylisten peptidien Ile-Pro-Pro ja/tai Val-Pro-Pro pitoisuus, valmistettaessa mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostavaa tuotetta.

5 Edullisesti kaseiinipohjaiset pienimolekyyliset peptidit käsittävät di- - tetrapeptidejä ja näiden seoksia. Erityisen edullisesti sekä IPP:n että VPP:n ja kalsiumin pitoisuudet ovat korkeat.

Keksintö koskee edelleen sellaisen tuotteen käyttöä, jolla on korkea kaseiinipohjaisten pienimolekyylisten peptidien pitoisuus ja korkea kalsium-10 pitoisuus, ja joka on valmistettu fermentoimalla kaseiinipitoista lähtöainetta maitohappobakteerilla ja mahdollisesti nanosuodattamalla saatu peptidejä sisältävä fermentoitu tuote, valmistettaessa mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostavaa lopputuotetta.

Edullisena sovellusmuotona keksintö koskee hapatetun koostu-15 muksen, joka sisältää kaseiinipohjaisia pienimolekyylisiä peptidejä Ile-Pro-Pro ja/tai Val-Pro-Pro, mineraaleja ja elävää maitohappobakteeria, käyttöä valmistettaessa mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostavaa tuotetta.

Kuvataan myös menetelmää mineraalien hyväksikäytettävyyden tehostamiseksi ja/tai luuston vahvistamiseksi antamalla yksilölle mineraalien hy-20 väksikäytettävyyttä tehostavia peptidejä tai niitä sisältävää tuotetta sellainen määrä, joka on riittävä halutun vaikutuksen aikaansaamiseksi.

;* Yksilö on ensisijaisesti ihminen. Keksinnön mukaisesti käytettävien * » ·' tuotteiden myönteisistä vaikutuksista hyötyvät luonnollisesti myös eläimet, eri- : . tyisesti lemmikkieläimet ja tuotantoeläimet. Näistä voidaan esimerkkeinä mai- ,,,; 25 nita koirat, kissat, kaniinit, hevoset, lehmät, siat, vuohet, lampaat ja siipikarja.

Mineraalien hyväksikäytettävyyden tehostamisella tarkoitetaan tä-män julkaisun puitteissa monipuolista vaikuttamista, joka käsittää erityisesti mineraalien imeytymistä ja vaikutusta luusoluihin.

Biologisesti aktiivisia peptidejä käytettäväksi mineraalien hyväk-,’·>·, 30 sikäytettävyyden tehostamiseen esillä olevan keksinnön mukaisesti voidaan *” siis muodostaa fermentoinnilla. Fermentoinnissa lähtöaineena voidaan käyttää

* I I

v : mitä tahansa tuotetta, joka sisältää haluttujen biologisesti aktiivisten peptidien sekvenssejä osana omaa peptidi- tai proteiinisekvenssiään. Edullisesti käyte-: tään maidon proteiinia, erityisesti kaseiinia, sellaisenaan tai erilaisten valmis- '·>[ 35 teiden muodossa. Lähtöaineeksi soveltuvat edullisesti myös erilaiset kaseiinia sisältävät maitotuotteet, kuten rasvaton tai rasvapitoisuudeltaan vaihteleva 112031 9 maito sellaisenaan tai vastaavan maitojauheen muodossa ja hapatetut maitotuotteet, kuten piimä, kirnupiimä, jogurtti, viili, tuorejuustot, jne.

Fermentointi voidaan suorittaa millä tahansa maitohappobakteerilla, joka kykenee tuottamaan mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostavia pieni-5 molekyylisiä peptidejä lähtöaineesta. Sopivia maitohappobakteereja voi löytyä mm. sukuihin Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus ja Bifidobacterium kuuluvista lajeista. Maitohappobakteereista proteolyyttisin on Lactobacillus helveticus, ja tätä pidetään siten erityisen sopivana tähän tarkoitukseen. Edullinen Lactobacillus helveticus -kanta on L helveticus LBK-16H, 10 DSM 13137, joka on yksityiskohtaisesti kuvattu patenttijulkaisussa WO 01/32836. Maitohappobakteereja voidaan käyttää puhdasviljelminä tai sekavil-jelminä, erikseen tai tavanomaisesti käytettyjen ja kaupallisesti saatavien ha-patteiden kanssa. Maitohappobakteereja voidaan myös käyttää yhdessä muiden mikro-organismien kanssa. Mikrobiyhdistelmien osalta valitaan tarkoituk-15 senmukaisesti sellaisia yhdistelmiä, joilla saadaan lopputuotteeseen paras mahdollinen maku ja joilla kontaminaatioriski väistyy.

Fermentointiolosuhteet valitaan fermentoinnissa käytettävän kannan vaatimusten mukaisesti siten, että muodostuu halutun vaikutuksen aikaansaamiseksi riittävä määrä biologisesti aktiivisia peptidejä. Sopivien olo-20 suhteiden, kuten esimerkiksi lämpötilan, pH:n ja ilmastuksen valinta kuuluvat alan ammattimiesten tietotaitoihin. Lämpötila voi olla esimerkiksi 30 - 45 °C.

Fermentoinnin annetaan jatkua, kunnes haluttu määrä biologisesti aktiivisia peptidejä on muodostunut. Aikaa tähän kuluu normaalisti noin 20 - 30 h, edullisesti 22 - 24 h.

: 25 Fermentoinnissa muodostuu erilaisten peptidien seos. Kun fermen- tointi kestää riittävän kauan, saadaan pääasiassa suhteellisen pieniä di- ja tri- • · . * *. peptidejä, kuten esimerkiksi Val-Pro-Pro (VPP) ja Ile-Pro-Pro (IPP).

* a

Fermentoinnin jälkeen solususpensio kerätään talteen. Sitä voidaan ... käyttää sellaisenaan tai peptidit voidaan erottaa ja puhdistaa siitä tavanomai- 30 siä menetelmiä käyttäen. Solususpensiota voidaan myös konsentroida, esi- * · '*·* merkiksi haihduttamalla tai kuivaamalla osittain tai kokonaan, kuten levittämäl- lä se levylle, kuivaamalla ja lopuksi jauhamalla hyvin säilyvän kuivan jauheen saamiseksi.

« ·

Solususpension jatkokäsittely nanosuodattamalla on osoittautunut 35 hyväksi keinoksi, joka mahdollistaa mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehosta- • t 1 · 10 112031 vien peptidien ja halutun kivennäisainekoostumuksen muodostamisen samaan lopputuotteeseen.

Tietyissä tapauksissa voi olla tarkoituksenmukaista altistaa fermen-toitu tuote esikäsittelyyn, esimerkiksi poistaa siitä kaseiini tai kaikki maidon 5 proteiinit, ennen nanosuodatusta. Esikäsittelyyn soveltuvat menetelmät ovat alalla tunnettuja ja käsittävät mm. erilaisia saostus- ja suodatusmenetelmiä. Eräs käyttökelpoinen menetelmä käsittää fermentoidun tuotteen pH:n säätämisen alueelle, jossa kaseiini saostuu, esimerkiksi arvoon noin 4,6 noin 37 °C:n lämpötilassa, minkä jälkeen saostunut kaseiini erotetaan esimerkiksi rah-10 kaseparaattorilla, kaseiininerotusseulalla, dekantterilla, laskeuttamalla tai muulla sopivalla menetelmällä. Toinen menetelmä käsittää hapatetun tuotteen ultrasuodatuksen pH:ssa 3 - 3,5, jolloin kaikki proteiinit pidättyvät kalvolle ja permeaattina saadaan lähes proteiinitonta heraa. Yhteissaostusta, jolla saadaan lähes proteiinitonta, peptidit sisältävää heraa, voidaan aikaansaada esi-15 merkiksi CaCI2-lisäyksellä, lämpökäsittelyllä tai happolisäyksellä. Tarvittaessa mahdollinen kaseiinipöly poistetaan sentrifugikäsittelyllä. Muitakin aineita, kuten laktoosia, voidaan poistaa ennen nanosuodatusta esimerkiksi entsymaattisesti hydrolysoimalla tai fermentoimalla.

Fermentointituote, joka mahdollisesti on esikäsitelty tarkoi-20 tuksenmukaisella tavalla, kuten edellä kuvatun mukaisesti saatu hera, altiste- ... taan sitten haluttaessa nanosuodatuskäsittelyyn. Nanosuodatuskalvona voi- • · daan käyttää tavanomaista NF-kalvoa, kuten esimerkiksi Nanomax-50 (Millipo- :..v re) tai Desal 5 (Desal Inc. USA), ja olosuhteet valitaan kalvonvaimistajien vaa- »1 1 ί V timusten ja ohjeiden mukaisesti. Nanosuodatuskalvotyypin ja prosessiolosuh- 25 teiden valinnalla voidaan vaikuttaa merkittävästi saatavan tuotteen koostu-: mukseen, etenkin suola- ja sokerikoostumukseen.

Nanosuodatuskäsittely suoritetaan haluttuun kuiva-ainepitoisuuteen i« · tai tilavuuskonsentrointisuhteeseen, mikä yleensä on mahdollisimman korkea. Kuiva-ainepitoisuus on suuruusluokkaa noin 20 - 40 % ja tilavuus- * » 30 konsentrointisuhde noin 5 - 20. (Hera)tiiviste voidaan laimentaa vedellä, jolloin suoloja ja maitohappoa voidaan poistaa tiivisteestä enemmän nanosuodatuk-v ·1 sessa. Tämä on yksinkertainen ja tehokas keino säätää suolojen määrää tiivis- : ' ’: teessä halutulle tasolle.

; Fermentoinnissa muodostuneet, mineraalien hyväksikäytettävyyttä 35 tehostavat pienikokoiset peptidit, kuten noin 350 D:n kokoiset tripeptidit IPP ja * · ·’ VPP, pidättyvät täysin nanosuodatuskalvon avulla. Nanosuodatusmenetelmä 11 112031 tarjoa mahdollisuuden laktoosin poistamiseen myös kokonaan; laktoosi voidaan pilkkoa entsymaattisesti ennen nanosuodatusvaihetta, jolloin monosak-karidit poistuvat suurelta osin. Nanosuodatuksessa myös maitohappo, pienet typpiyhdisteet, kuten urea, ja yhdenarvoiset suolat läpäisevät kalvon. Na-5 nosuodatuksen avulla tuotteen peptidipitoisuus siten kasvaa. Konsentroinnin myötä myös sen kaksiarvoisten ionien, erityisesti haluttujen kalsium- ja magnesium-ionien pitoisuus kasvaa, kun taas yksiarvoisten ionien, kuten natrium-, kalium- ja kloridi-ionien suhteellinen osuus laskee. Varsinkin natrium-ioneilla tiedetään olevan merkittävä vaikutus kehon nestetasapainoon, ja näiden hai-10 tallisten ionien määrän lasku voidaan siten pitää hyvin merkittävänä etuna. Tiettyjen kaksiarvoisten ionien, erityisesti kalsium-ionien, tiedetään vaikuttavan mm. luun mineralisoitumisen tehostumiseen, ja näiden korkea pitoisuus pidetään siten hyvin suotavana.

Tiettyjen valittujen mineraalien pitoisuutta tuotteessa voidaan myös 15 nostaa lisäämällä siihen haluttua mineraalia esimerkiksi sopivan suolan muodossa. Tällaisina mineraaleina mainittakoon erityisesti kalsium ja magnesium.

Edellä kuvatun kaksivaiheisen, fermentointiin ja nanosuodatukseen perustuvan menetelmän fermentointivaiheessa muodostettuun esivalmis-teeseen sisältyvien ainesosien käyttäytyminen nanosuodatusvaiheessa on esi-20 tetty taulukossa 1. Kyseessä on esimerkinomaisesti esitetty koostumus, joka on muodostettu fermentoimalla rasvatonta maitoa Lactobacillus helveticus -kannalla. Kuten edellä esitetystä kuvauksesta käy selkeästi ilmi, myös muita y;\: tuotteita voidaan käyttää lähtöaineina. Lisäksi fermentointiolosuhteet, valinnai- : nen nanosuodatuskäsittely ja mahdolliset muut esi- ja lisäkäsittelyt vaikuttavat 25 lopputulokseen, joten lopputuotteiden koostumus (ja nanosuodatustulokset) .'. : luonnollisesti vaihtelevat ja voivat poiketa tässä annetuista. 1 * < » · · · > · 12 112031

Taulukko 1

Biologisesti aktiivisia peptidejä sisältävän heran aineosien käyttäytyminen na-nosuodatuksessa.

5 Kalvo: Nanomax 50, olosuhteet: 40 °C, 30 bar, til.kons.-suhde K=9, pH 4.6.

__Molekyylipaino D Retentio (%) IPP 361,4 100 VPP 347,4 100 maitohappo 90,1 24

Ca 40,1 68

Mg 24,3 72 K 39,1 11

Na 23 10

Cl 35,5 9 P04 95 47

Urea 60,1 ~10 laktoosi__342,3__63_ * I » 10 Tämän julkaisun esimerkissä 2 kuvatulla tavalla valmistettu tuote on todettu soveltuvan erinomaisesti keksinnön mukaiseen tarkoitukseen. Tuot-teen kokonaiskoostumus on suoritetuissa vertailukokeissa todettu optimaali-seksi. Tuotteen fysiologisiin aktiivisuuksiin vaikuttavat monet osatekijät, kuten tuotteen pitkälle suoritettu proteolyysi, jolla saadaan erilaisten aktiivisten pepti-15 dien kirjo, tuotteen erinomainen mineraalipitoisuus, tuotteen sisältämät elävät mikrobisolut sekä tuotteen happamuus. Kaikki näihin ominaisuuksiin voidaan :*.·. vaikuttaa ja niitä voidaan maksimoida valmistusmenetelmän eri parametrejä muuttamalla kulloinkin tarkoituksenmukaisella tavalla. Proteolyysiolosuhteet, T kuten entsyymiaktiivisuus ja reaktioaika, vaikuttavat saatavien peptidien laa- * 1 * v 20 tuun ja määrään. Myös nanosuodatuksella voidaan vaikuttaa näihin, ja erityi- sesti nostaa tuotteen peptidipitoisuutta merkittävästi. Lisäksi voidaan helposti ; . ·, säätää suolojen pitoisuudet ja niiden väliset suhteet halutulle tasolle. Erityisesti

* t I

' -. ‘ voidaan nostaa haluttujen kaksiarvoisten ionien pitoisuutta ja vähentää yksiar- 13 112031 yksiarvoisten ionien pitoisuutta. Myös happamuutta ja mikrobisolujen määrää ja laatua on helppo maksimoida alan ammattimiehen tuntemin tavoin.

Edellä kuvattuja tuotteita voidaan käyttää sellaisinaan halutun vaikutuksen aikaansaamiseksi. Tuotteita voidaan myös kuivata ja käyttää jau-5 heen tai lyofilisoidun valmisteen muodossa. Tuotteita voidaan myös edullisesti käyttää terveysvaikutteisten elintarvikkeiden tai muiden tuotteiden valmistuksessa.

Käsitteellä elintarvike on tässä julkaisussa laaja merkitys kattaen kaikki nautittavaksi tarkoitetut tuotteet, jotka voivat olla kiinteässä, hyytelöidys-10 sä tai nestemäisessä muodossa, ja kattaen sekä valmiit tuotteet että tuotteet, joihin biologisesi aktiiviset peptidit tai niitä sisältävä tuote lisätään nauttimisen yhteydessä, lisäaineeksi tai osaksi tuotetta. Elintarvikkeet voivat olla esimerkiksi meijeriteollisuuden, lihanjalostusteollisuuden, einesteollisuuden, juoma-teollisuuden, leipomoteollisuuden ja makeisteollisuuden tuotteita. Tyypillisiä 15 ovat maitotuotteet, kuten jogurtti, viili, rahka, piimä, kirnupiimä, muut hapan-maitojuomat, tuorejuustot ja kypsytetyt juustot, välipalasnackien täytteet, jne. Toisen tärkeän ryhmän muodostavat juomat, kuten herajuomat, hedelmä-juomat, ja oluet.

Keksinnön mukaisesti biologisesti aktiivisia peptidejä tai niitä sisäl-20 tävää tuotetta käytetään riittävä määrä halutun, kivennäisaineiden imeytymistä tehostavan vaikutuksen aikaansaamiseksi. Käytettäessä edellä kuvatulla kaksivaiheisella menetelmällä saatua tuotetta käyttömäärä riippuu merkittävästi \i.: heran konsentrointiasteesta, ja on esimerkiksi 0,1 - 30 %, edullisesti noin 5 - tl · * 15 % lopputuotteen painosta laskettuna.

: ’ ; 25 Biologisesti aktiivisia peptidejä tai niitä sisältävää tuotetta voidaan lisätä elintarvikkeeseen sen valmistusprosessin aikana tai jo valmistettuun elintarvikkeeseen. Kyseiset elintarvikkeet sisältävät siis mineraalien hyväksi- I i t käytettävyyttä tehostavia peptidejä tai niitä sisältävää tuotetta muiden vastaa-vanlaisiin elintarvikkeisiin sisältyvien ainesosien lisäksi, ja vastaavat maultaan t · 30 ja käyttötavoiltaan täysin näitä tavanomaisia tuotteita.

Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavien esimerkkien , ί ’: avulla. Nämä esimerkit annetaan vain keksinnön valaisemiseksi eikä niitä pidä katsoa sen suojapiiriä mitenkään rajoittaviksi. Viite-esimerkeissä ja kuvissa . X-:llä merkitty tuote on valmistettu esimerkkien 2 ja 5 mukaisesti.

» I » » 35 Μ 112031 14

Viite-esimerkki 1

Eri tuotteiden proteolyysiaste ja kivennäisainepitoisuus

Eri hapanmaitovalmisteiden proteolyysiasteen määrittämiseksi selvitettiin niiden proteiinipitoisuus (proteiini), kokonaistyppipitoisuus (kokN), ei-5 proteiinityppipitoisuus (NPN; mm. urea, aminohapot, pienet peptidit jne.), tikattujen vapaiden aminohappojen määrä (titr.vap.ah.) sekä pH. Proteolyysiasteen voi karkeasti määritellä laskemalla ei-proteiinitypen suhde kokonaistyp-peen (NPN / kokN); titrattujen vapaiden aminohappojen määrä mmol/g proteiinia saadaan laskemalla titr.ah/prot.

10 Tulokset on esitetty taulukossa 2. Niistä ilmenee selvästi Evolus- juoman suurempi proteolyysiaste, ja siten suurempi lyhytkejuisten peptidien määrä, kaupalliseen japanilaiseen Calpis sour milk -tuotteeseen, Calpis Food Industry Co Ltd, verrattuna.

* » ·

* > I

« * t 1 1

* I

* -

X

is 112031 Q- cn r-_ σι cd m- o- co o ro ro’ ro" ro ro' O' o o o·’ -4~t ’+3 +-* 2 03 Q. — * v o F- co co_ eo o oo en oo o· M·" ro' ro" cm" cm" cm" cm"

~ ^ CO

~ ti

_______________ <U

--------- ----

CO

-e CT ro ω | n 5 ? ? ? “ S | S S -5 S E 2 _______________ Q.

C

z ϋ £ .0 , , '«L ®. ^ o CO O CO ~ ^ äv CM CO CO ° OT- ° K ro 1 s Z Ji _______________ rö z -*: Z -55 oocnCDh-ooco o- cm co cd -*: Q. 03 S S (o. q ffl o en id d m- ^ 2 £ o' o" 0 cd" o" o" o" o" o" o' 2 Q_

_______________ Z

:ro" ro 4=! o ω o.

^ cm o cm o o o ro M- ro en ~ 2" ,· M- M· CD LO LO CO ID ID ID ID > “2

O o" o" o" o" o" o" o" o' o' Ö" O

: -* -o C

, Q. E

: · : roro --------------- ro . , > .t;

*,,, * e CO

• · ~ 00 in cm en en o co m- 00 cd tn S" jy co cd ro v- V- en co M- co r» ~ > • * O cm" cm" co" co" ro" T-" co" ro" ro" ro" _ “ Sf S--------------- S-| (0 Q-.-t; ... CO :(0 +-

IV g, IS

> o.® o C ^ t . © ^. ro o 2 ·.. ti ro ro S£ • * * P e — «o SB. j= . tt ^ JS C :CT3 , , — S Ό .2, .¾ .s 2, "55 (0 e **» Φ E.C000 .2, p r- • M Ό ^ ^ ο. a o. P c *- e e iS* * . _ *— ro ro *o *u <O ;= o C Φ O ^ : : I o 2 E E E E E Q § =o ro =j -g1 ··* .* o ° § 'a 'cl 'q o E e ^ e ro 3 >>

1 3 £ f f S S S .8 ! ΐ f S

2—0 OOOOO— w en «J. m "rnO^^ n e. 3 > > > > > ro ro U m ro .¾ -o LLI * h UI h ui 111 UI UJ UI O e O < 2 ϊέ 3 * Ϊ 112031 16

Eri hapanmaitovalmisteiden kivennäisainepitoisuuden määrittämiseksi selvitettiin niiden natrium-, kalsium-, magnesium- ja kaliumpitoisuudet. Seerumin korkea natriumpitoisuus on todettu haitalliseksi monessa suhteessa, mm. elektrolyyttitasapainon, korkean verenpaineen ja sydän- ja verisuonitau-5 tien osalta, joten sen vähentäminen ravinnosta on edullista. Muiden mineraalien osalta tilanne on päinvastainen ja pitoisuuden nostaminen on siis edullista. Mittauksen on suoritettu Ympäristölaboratoriossa (Ympäristökeskus, Helsinki). Tulokset on esitetty taulukossa 3. Evolus-tuotteen mineraalisisäitö on optimaalinen keksinnön tarkoitusta varten.

10

Taulukko 3

Eri tuotteiden mineraalipitoisuus

Rasvaton Evolus Lisäys/ Japanilainen piimä vähennys Calpis ____Evoluksessa__ __mg/100 g__mg/100g__%__Mg/100g

Natrium__56__32__- 43__66_

Kalsium__120__200__+ 67__66_

Kalium__190__310__+ 63__94_

Magnesium__14__17__+ 21__6,6 15 Viite-esimerkki 2

Eri tuotteiden vaikutus luustoon

! > I

• Tutkimuksessa selvitettiin veden, maidon, piimän sekä kahden IPP- » · :: ja VPP-peptidejä sisältävän juoman, kaupallisen japanilaisen Calpis sour milk - tuotteen, Calpis Food Industry Company Ltd, sekä esimerkin 2 tuotteen X 20 (Evolus, Valio Oy), vaikutus luustoon.

Tutkimuksissa käytettiin 6-viikkoisia SH-rottia, joille juotettiin yhtä koejuomista ad libitum 14 viikon ajan. Tutkimuksen jälkeen rottien luut irrotet-tiin ja luuntiheydet (BMD, bone mineral density) ja luunmineraalipitoisuudet ' (BMC, bone mineral content) määritettiin Dexalla (dual energy X-ray absorp- 25 tiometry). Dexa on matalaenergiseen röntgensäteilyyn perustuva tekniikka, jol-: la mitataan yleisesti luuntiheyttä.. Tulokset laskettiin Fisher LSD-menetelmällä ; (Sahai H and Ageel M. 2000. The analysis of variance: Fixed, random and mixed models, Birkhäuser, Boston). Kalsiumin ja energian saanti eroaa eri „ 112031 ryhmissä kokeen aikana, ja tästä syystä tulokset on vakioitu näiden muuttujien suhteen. Tulokset on esitetty taulukossa 4 sekä kuvioissa 1 ja 2. Kuviosta 1 ilmenee, että Evolus-juomaa saaneiden rottien luuntiheys on suurempi kuin muilla ryhmillä. Kuviosta 2 ilmenee Evolus-juoman selkeä tehostava vaikutus 5 luunmineraalipitoisuuteen. Luun-mineraalipitoisuudessa on tilastollisesti merkittävä ero Evolus-juomaa ja vettä nauttineiden rottien, sekä myös Evolus-juomaa ja Calpis-juomaa nauttineiden rottien välillä. Tuloksista ilmenee siten selkeäasti, että Evolus-tuotteella on optimaalin koostumus keksinnön mukaiseen tarkoitukseen.

10 Fl-hakemusjulkaisussa 992360 kuvataan vastaavan Evolus- tuotteen valmistusta ja aktiivisuutta verenpainetta alentavana aineena. Kuten julkaisussa kuvataan on ensimmäiset tutkimukset tehty rotilla, minkä jälkeen ne toistettiin ihmisillä. Verenpaineen osalta saatiin molemmissa tutkimuksissa vastaavat selkeät tulokset. Näin ollen ei ole mitään syytä uskoa, ettei nyt me- 15 neillään olevissa jatkotutkimuksissa koskien kivennäisaineiden imeytymistä ihmisillä saataisi samankaltaisia tuloksia kuin edellä kuvatuissa eläinkokeissa.

Taulukko 4

Eri tuotteiden vaikutus luustoon 20 _______ .., Maito Piimä vs Calpis vs Evolus vs Evolus vs Piimä vs * · " ‘ ’__vs vesi__vesi__vesi__vesi__Calpis__maito BMP__0J6__0JB0__0j92__0J1__0J1__0,96 ί BMC 0,74 0,47 0,87 0,008 0,008 0,69 • · · * < · • ·

Esimerkki 1

Keksinnön mukaisesti käytettävän tuotteen valmistaminen 25 Lactobacillus helveticus -kanta LBK 16-H kasvatettiin MRS- /··, liemessä 37 °C:ssa 24 h ja siirrostettiin rekonstituoituun maitoon (10 %) ympin muodostamiseksi. Kahden kasvatuskerran jälkeen ymppi (15%) siirrostettiin v : fermentorialustaan, joka muodostui 9 - 10-prosenttisesta rasvattomasta maito- jauhemaidosta ja joka oli steriloitu 110 °C:ssa 10 min. Fermentointi suoritettiin 30 37 °C:ssa 22 - 24 h, koko ajan voimakkaasti sekoittaen. Tuote voidaan käyttää sellaisenaan, kuivatussa ja/tai jauhetussa muodossa, tai halutut peptidit voidaan eristää siitä käyttäen sinänsä tunnettuja menetelmiä.

is 112031

Esimerkki 2

Keksinnön mukaisesti käytettävän tuotteen valmistaminen

Esimerkin 1 mukaisesti saatu hapatettu tuote altistettiin nano-suodatuskäsittelyyn seuraavasti.

5 Hapatetun piimän pH nostettiin arvoon noin 4,6 KOH:lla ja kaseiini poistettiin vinoseulalla. Jäännöskaseiinipöly poistettiin kirkastussentrifugoi-malla. Heraan lisättiin GLL Conc. -laktaasia (Biocon Ltd., Japani) ja annettiin hydrolysoitua 5 °C:ssa 24 h laktoosin hajottamiseksi monosakkarideiksi. Näin esikäsitelty hera nanosuodatettiin Nanomax-50 -kalvon (Millipore) läpi.

10 Suodatus tehtiin 40 °C:ssa 30 bar paineessa. Heraa suodatettiin kunnes tilavuuskonsentrointisuhde oli 9. Saadun tiivisteen ja siitä muodostetun kuivatun jauheen koostumukset esitetään taulukossa 5.

Taulukko 5 15

Valmistetun tiivisteen ja kuivatun jauheen koostumus

Koostumus Tiiviste Kuivattu jauhe

Kuiva-aine (%) 30,0 94,5

Tuhka (%) 3,69 13,3

Na (mg/kg) 130 470 .V;: K (mg/kg) 1600 5600 : Ca (mg/kg) 10000 36000

Mg (mg/kg) 1700 6300 \'·| Cl (mg/kg) 550 2000 P (mg/kg) 6700 24500 IPP (mg/L) 510 2500 ;v: VPP (mg/L) 540 2700 * * * ,Poistettu kaseiini neutraloitiin kaseinaatiksi ja kuivattiin.

20 Esimerkki 3 t * *

Keksinnön mukaisesti käytettävän tuotteen valmistaminen • Esimerkissä 1 kuvattu fermentointi toistettiin käyttämällä rasvat- > » I · toman maidon sijasta (a) rasvaista maitoa ja (b) kirnumaitoa.

19 112031

Esimerkin 3(b) mukaisen tuotteen pH nostettiin arvoon noin 4,5 ja kaseiini poistettiin rahkaseparaattorilla. Heraan lisättiin laktaasia ja pöly poistettiin baktofuugilla. Hera nanosuodatettiin sitten NF-kalvon (Desal-5, Desal Inc.) läpi, haihdutettiin ja kuivattiin. Saatu nanosuodatustiiviste oli koostumuk-5 seitaan erittäin samankaltainen taulukossa 5 esitetyn kanssa.

Poistetussa kaseiinissa on mukana paljon heraa, joka sisältää yhtä paljon biologisesti aktiivisia peptidejä kuin fermentoitu piimä. Kaseiini käytettiin sellaisenaan rahkassa, johon tällä tavalla saatiin myös biologisesti aktiivisia peptidejä.

10 Esimerkki 4

Keksinnön mukaisesti käytettävän tuotteen valmistaminen

Lactobacillus helveticus -kanta LBK 16-H kasvatettiin MRS-liemessä 37 °C:ssa 24h ympin muodostamiseksi, kuten esimerkissä 1 on kuvattu. Ymppi siirrostettiin fermentorialustaan, joka koostui happosaostetun ka- 15 seiinin (2,8 %) ja glukoosin (2,5 %) vesiliuoksesta. Kaseiini liuotettiin nostamalla pH 10% KOH:lla 6,7:ään. Kasvatus tehtiin 37 °C:ssa 24 h ajan. Tuotteeseen saatiin tuotettua vastaavat määrät biologisesti aktiivisia peptidejä VPP ja IPP kuin maitoa fermentoitaessa, mutta peptidien erottaminen kaseiiniliuoksesta oli helpompaa kuin maidosta.

20 Fermentointiliuoksen pH nostettiin 4,6:een KOH:lla lämpötilan olles sa 37 °C, jolloin kaseiini saostui. Kaseiini erotettiin rahkaseparaattorilla ja saa-'. tava hera otettiin talteen. Hera sisältää peptidejä, maitohappoa ja suoloja, mut- • ta ei lainkaan laktoosia. Heran nanosuodatuksella voidaan poistaa suuri osa Γ heran maitohaposta ja yhdenarvoisista suoloista sekä jäännösglukoosista.

25 Nanosuodatusretentaatti voidaan haihduttaa tiivisteeksi tai kuivata jauheeksi, . · . ; jolloin saadaan hyvin konsentroitu ja pitkään säilyvä biologisesti aktiivisia pep- . · ·, tidejä sisältävä valmiste.

* »

Esimerkki 5 ,, . Hapanmaitotuotteen valmistus : 30 Kivennäisaineiden imeytymistä tehostavia peptidejä sisältävä piimä ' · · ‘ valmistettiin lisäämällä 3,5 % esimerkin 1 mukaisesti saatua peptiditiivistettä kaupallisesti saatavaan piimään. Saadun tuotteen koostumus on esitetty tau-lukossa 6, jossa vertailun vuoksi myös esitetään kaupallisesti saatavan ha-, , panmaitotuotteen, AB-piimän, Valio Oy, koostumus.

’ 35 20 112031

Taulukko 6

Evolus-tuotteen ja kaupallisen hapanmaitotuotteen koostumus __AB-piimä__Evolus-tuote

Kuiva-aine (%) 9,0 9,8

Na (mg/kg) 390 380 K (mg/kg) 1700 1700

Ca (mg/kg) 1200 1510

Mg (mg/kg) 114 170

Cl (mg/kg) 1000 980 VPP (mg/l) 0 19 IPP (mg/l)_ 0_ 18_ 5

Claims

2i 112031 Pate ntti vaati m u kset

1. Kaseiinipohjaisten pienimolekyylisten peptidien lle-Pro-Pro ja/tai Val-Pro-Pro käyttö valmistettaessa mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehosta- 5 vaa tuotetta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että käytetään tuotetta, jolla on korkea kaseiinipohjaisten pienimolekyylisten peptidien lle-Pro-Pro ja/tai Val-Pro-Pro pitoisuus, valmistettaessa mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostavaa tuotetta.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen sellaisen tuotteen käyttö, jolla on korkea kaseiinipohjaisten pienimolekyylisten peptidien pitoisuus ja korkea kalsiumpitoisuus, ja joka on valmistettu fermentoimalla kaseiinipitoista lähtöainetta maitohappobakteerilla, valmistettaessa mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostavaa lopputuotetta.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen sellaisen tuotteen käyttö, jolla on korkea kaseiinipohjaisten pienimolekyylisten peptidien pitoisuus ja korkea kalsiumpitoisuus, ja joka on valmistettu fermentoimalla kaseiinipitoista lähtöainetta Lactobacillus helveticus -kannalla LBK-16H, DSM 13137, valinnaisesti poistamalla osittain tai kokonaan kaseiini ja/tai muita maidon proteiineja ja/tai 20 laktoosi ja nanosuodattamalla saatu peptidejä sisältävä fermentoitu tuote, valmistettaessa mineraalien hyväksikäytettävyyttä tehostavaa lopputuotetta.

5. Hapatetun koostumuksen, joka sisältää kaseiinipohjaisia pienimolekyylisiä peptidejä lle-Pro-Pro ja/tai Val-Pro-Pro, mineraaleja ja elävää ; maitohappobakteeria, käyttö valmistettaessa mineraalien hyväksikäytettävyyt- I » | :25 tä tehostavaa tuotetta. V

· 6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen tuotteen käyttö, tunnettu siitä, että kaseiinipohjaiset pienimolekyyliset peptidit käsittävät ly-hytketjuisten peptidien seoksen. ; v.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen tuotteen käyttö, tunnettu sii- . * · *. 30 tä, että peptidit ovat di- - tetrapeptidejä.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että v : käytetään tuotetta, jolla on korkea lle-Pro-Pro - ja/tai Val-Pro-Pro -pitoisuus ja :korkea kalsiumpitoisuus.

: 9. Jonkin patenttivaatimuksista 1 - 8 mukainen käyttö, tunnettu • “ [ 35 siitä, että sillä tehostetaan kalsiumin hyväksikäytettävyyttä. 22 112031