JP2824821B2 - 乳酸菌及び発酵乳製品 - Google Patents
乳酸菌及び発酵乳製品Info
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Description
存時における酸度の上昇等が抑制された発酵乳製品及び
該発酵乳製品の製造等に利用可能な新規なラクトバチル
ス・ヘルベチカス属乳酸菌に関する。
酵乳製造時の代表的なスターターとして用いられてい
る。ラクトバチルス属等の乳酸桿菌は、ストレプトコッ
カス属およびラクトコッカス属等の乳酸球菌よりも乳酸
酸度が高くなり、乳蛋白質を分解するプロティナーゼ活
性も高いものが多い。特に、ラクトバチルス・ヘルベチ
カスは強い蛋白分解活性を有しており、その菌体外プロ
ティナーゼが乳蛋白質を分解して生成されるペプチド
は、血圧上昇作用の原因物質であるアンギオテンシン変
換酵素(Angiotensin Converting Enzyme 以下ACE
と称す)に対して阻害活性を有することが報告されてい
る。更に、ラクトバチルス・ヘルベチカスによる発酵乳
にも同様の活性が認められる。これらのACE阻害ペプ
チドは、自然発症高血圧ラット(SHR: Spontaneously H
ypertensive Rat)において血圧降下活性を示す事が確
認されている[Nakamura.Yら日本農芸化学会誌、67,289
(1993)]。
は、乳発酵において乳酸の生成量が多く(従ってpHの
低下が著しく)、更に低温保存時にも乳酸酸度が上昇し
易いためにヨーグルト等への利用が困難であり、現在ヨ
ーグルトにはほとんど用いられていない。
酸度上昇は重要な問題であり、酸度上昇を抑える工夫と
して変異処理による育種等の種々の検討がなされている
が、増殖活性の低い変異株が分離され易いために、目的
の変異株が得られていないのが現状である。
(以下ATPaseと称す)が微生物菌体内のpH調整
に関与していることが知られている。即ち、乳酸菌の発
酵における最終代謝産物である乳酸の産生により菌体外
のpHは酸性になるが、ATPaseの働きにより乳酸
菌体内のpHは中性に保たれる。また菌体内pHと菌体
外pHとの差が大きくなるに従いATPaseの発現量
も増大する傾向にある。従って、酸性培地においてこの
ような細胞膜バリアーを破壊し、プロトンの濃度勾配を
なくした条件では、微生物細胞は増殖できないことが確
認されている[Hiroshi Kobayashi,Takashi Suzuki,and
Tsutomu Umemoto;The J. of Biological Chemistry.26
1,2.627-630(1986)]、[NANCY L-NANNEN and ROBERT W.
HUTKINS;J. of Dairy Sci.,74,747-751(1991)]。しかし
これらの報告は、いずれも微生物細胞外pHとATPa
se活性との関係について示されているものであり、微
生物発酵により得られる発酵物の最終的なpHについて
は記載されていない。
菌(Escherchia coli)のネオマイシン耐性変異株が、A
TPase活性も欠損していることが知られている[BAR
RY P. ROSEN;J. of Bacteriology,116,3.1124-1129(197
3)]。しかし、乳酸産生については一切記載されていな
い。
蛋白分解活性及び乳蛋白質に対する基質特異性を有し、
発酵乳中にACE阻害ペプチドを産生させるというラク
トバチルス・ヘルベチカス乳酸菌の特性を維持しつつ、
培養時、培養物の保存時における乳酸酸度の増加が低い
等の特性を有する変異株を利用したラクトバチルス・ヘ
ルベチカス乳酸菌を提供することにある。
存時において乳酸酸度の上昇等が抑制された発酵乳製品
を提供することにある。
を10℃、2週間保存時の乳酸酸度増加量が0.5%以
下を示すこと、細胞膜結合性ATPase活性が5μmo
l・ Pi/min/mg蛋白質以下であること、並びにネオマイシ
ン耐性を有することを特徴とするラクトバチルス・ヘル
ベチカス乳酸菌(以下乳酸菌Aと称す)が提供される。
乳酸菌を用いて発酵処理したことを特徴とする発酵乳製
品が提供される。
ルベチカス乳酸菌の変異株であって、親株の乳酸菌が有
する菌学的性質に変化はなく、特に、菌体外プロテアー
ゼ活性の強さ、並びに基質に対する特異性には変化がな
いが、以下の(1)〜(3)の点において、親株と相違する特
異的性質を有する。(1)培養物を10℃、2週間保存時
の乳酸酸度増加量が0.5%以内を示すこと、(2)細胞
膜結合性ATPase活性が5μmol・Pi/min/mg蛋白質
以下であること、並びに(3)ネオマイシン耐性を有する
こと。
は、10℃、2週間保存時において、乳酸酸度上昇が
0.5%以内、好ましくは0.4%以内であれば、他の
条件における乳酸酸度増加量は特に限定されるものでは
ないが、培養時の場合、最終乳酸酸度が0.5〜1.2
%、特に0.6〜1.0%の範囲であるのが好ましく、
一方10℃、1週間保存時においては、好ましくは乳酸
酸度上昇が0.4%以内、特に好ましくは0.2%以内
を示すのが望ましい。
は、培地中のpHにより変化するが5μmol. Pi/min/mg
蛋白質以下である。該細胞膜結合性ATPase活性
の測定は、例えば各細胞からNeuらの方法[Neu, H.
C & Heppel. L. A. J. Biol.Chem. 240. 3685(1965)]
に従い浸透圧ショックにより蛋白質を抽出し、250m
Mトリス塩酸(pH6.5)、25mM塩化マグネシウ
ム、25mMアデノシントリフォスフェートナトリウム
および16.5μg/mlウシ血清アルブミン(BS
A)の溶液10μlに抽出液40μlを加え37℃で1
分間反応させた後、5μlの0.1N塩酸を加えて反応
を停止させ、その後、生成された無機リン酸の濃度を商
品名「P−テストワコー」(和光純薬工業(株)製品)
により測定し、また、抽出液中の蛋白質濃度をブラッド
フォードの方法[Bradford.M. M.(1976) Anal. Bioche
m. 72, 284 (1976) ]により測定する方法等により行な
うことができる。
マイシンを含む培地で培養した際に死滅せずに増殖性を
示すものであれば良い。
学的性質を維持しており、且つ(1)〜(3)の特異的な性質
を有するものであれば特に限定されるものではなく、具
体的には、工業技術院生命工学工業技術研究所にFER
M−P13914(以下CPN4と称す)として寄託さ
れているラクトバチルス・ヘルベチカス乳酸菌等を挙げ
ることができる。
(臨床検査18.1163(1974))による同定の結果、親株であ
るラクトバチルス・ヘルベチカスJCM1003と菌学的性質は
同様であるが、ネオマイシン耐性、低ATPase活
性、更に低pH領域における低い増殖性の点において明
らかに親株と異なる性質を有しており、pH感受性変異
株であることが確認できた。その具体的菌学的性質を表
1に示す。
あるラクトバチルス・ヘルベチカス乳酸菌を、以下の方
法等により変異させることにより得ることができる。
ベチカス(Lactobacillus helveticus)であれば特に限
定されない。
カス乳酸菌を、各菌株の増殖性の良い培地、例えば、ブ
リッグス・リバー・ブロス(Briggs Liver Broth)、M
RS培地、BL培地、GAM培地等で増殖培養し、対数
増殖期に集菌する。この際各培地における乳酸菌の添加
量は、約1×106cells/mlであるのが好ましく、ま
た培養条件としては、培養温度30〜45℃で、3〜2
4時間培養するのが好ましい。
y,116,1124-1129(1973)]により、ATPase活性の
低い株を分離するためには、ネオマイシン耐性株の中か
らの分離が効果的とされているので、好ましくはこの方
法に従って、ネオマイン5〜100μg/mlを含む前
記増殖用培地を含む寒天培地に接種しネオマイシン耐性
株を選択する。
るには、例えば紫外線照射や化学変異誘起剤等の前処理
を行うこともできる。前記紫外線照射の処理条件は、波
長500nm以下、照射時間数秒〜30分、照射距離1
0〜30cmで行うのが好ましい。また変異株を効率的
に選択するためには、増殖用培地中に対数増殖期の生菌
を懸濁し、生菌率0.1〜1.0%となるような条件で
紫外線照射するのが好ましい。更に化学変異誘起剤によ
る処理は、例えばニトロソグアニジン(N−メチル−
N′−ニトロ−ニトロソグアニジン)、エチルメタンス
ルホン酸、メチルメタンスルホン酸、5−ブロモウラシ
ル等を使用し、例えばニトロソグアニジンを使用する場
合には、好ましくは処理pH5.0〜8.0、特に好ま
しくはpH6.0〜7.0の増殖用培地中に対数増殖期
の生菌を懸濁し、ニトロソグアニジン濃度を30〜10
00μg/ml、特に100〜300μg/mlとし、
処理温度を室温〜50℃、特に30〜37℃として、処
理時間10〜60分間、特に15〜30分間処理するの
が好ましい。
選択株の中から、増殖能の低いものを除き、更にpH
4.5以下においてのみ増殖能の低い細胞株を選択す
る。更に、ここで選択された低pH領域における増殖活
性低下株は、脱脂粉乳等の乳培地にて例えば30〜45
℃で1〜3日間培養し、最終pHが親株より高い細胞
株、即ち最終的な乳酸酸度の上昇が低い細胞株を選択す
る。ここで前記培養後の最終pH3.4〜3.8の変異
株を最終的に選択し、乳培地において例えば30〜45
℃で、3〜24時間培養し、最終的に前記親株の菌学的
性質を維持し、前記(1)〜(3)の特性を有する細胞株を選
択することのより乳酸菌Aを得ることができる。
いて発酵処理したものであれば特に限定されるものでは
なく、例えばヨーグルト、乳酸発酵飲料、チーズ等を挙
げることができ、それぞれ公知の方法により得ることが
できる。この際乳酸菌Aは、公知の乳酸菌例えばストレ
プトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermo
philus)、ラクトコッカス・ラクテス(Lactococcus lac
tis)、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacteriu
m longum)等を併用して用いることができる。発酵乳製
品を調製するには、前記乳酸菌Aを用いる以外は、公知
の方法等により得ることができる。
乳酸菌は、長期低温保存した際の乳酸酸度の上昇を抑制
することができるヨーグルト等の発酵乳製品の製造に利
用することができる。また本発明の発酵乳製品は、前記
乳酸菌を使用するので、長期低温保存した際の乳酸酸度
の上昇を抑制することができる他、発酵終了直後の風味
を維持しながら、発酵乳中に血圧低下作用を有する。
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
−1003(以下親株と称す)1×106細胞/mlをブ
リッグス・リバー・ブロス(Briggs Liver Broth)に接
種して37℃で20時間培養した。更に新しい同培地で
37℃にて6時間再培養し、対数増殖期のものを集菌
し、紫外線照射処理(15ワット紫外線ランプ、照射時
間30秒、照射距離20cm)を行なった。次にネオマ
イシン5μg/mlを含むブリッグス寒天培地上に、生
菌数が1×106細胞となるように接種し、37℃、2
日間培養した。比較的大きいコロニーを形成するもの5
0株を選び、次いでpH6.5及びpH4.5に調整し
たブリッグス寒天培地上にレプリカし、pH6.5の培
地上で親株と同程度の増殖を示し、pH4.5の培地上
では親株に比較して増殖性の悪いもの15株を選択し
た。次に、これら15株を、9%脱脂粉乳に接種し、3
7℃で3日間培養して最終pHを比較した結果、親株に
比較して高い最終pHであった1株(以下CPN4と称
す)を選択した。更にこれら変異株CPN4及び親株に
ついて、それぞれ3日間培養後の最終pH、濁度(59
0nmの吸光度)を測定した。結果を表2に示す。
ブリッグス培地で37℃、6時間培養し、各細胞からN
euらの方法[Neu, H. C & Heppel. L. A. J. Biol.
Chem. 240. 3685(1965)]に従い浸透圧ショックにより
蛋白質を抽出し、以下の方法により活性測定した。酵素
活性は250mMトリス塩酸(pH6.5)、25mM
塩化マグネシウム、25mMアデノシントリフォスフェ
ートナトリウムおよび16.5μg/mlウシ血清アル
ブミン(BSA)の溶液10μlに、抽出液40μlを
加えて、37℃で10分間反応させた後、5μlの0.
1N塩酸を加えて反応を停止させた。その後、生成され
た無機リン酸の濃度を商品名「P−テストワコー」(和
光純薬工業(株)製品)により測定した。また、抽出液
中の蛋白質濃度をブラッドフォードの方法[Bradford.
M. M.(1976) Anal.Biochem. 72, 284 (1976) ]により
測定した。ATPase活性を上記条件において測定
し、一定蛋白質当りに含まれる酵素の無機リン酸の生成
量(mol・ Pi/min/mg 蛋白質)で示した(表3)。ま
た、各菌株のネオマイシン耐性度を最小成育阻止濃度を
測定することにより求めた。これらの結果を表3に示
す。
株は、高いレベルのATPase活性が確認された。し
かし、CPN4株は親株に比べて低いATPase活性
を示した。
中で再度37℃、30時間培養し、これら変異株の発酵
乳中のペプチド量及びACE阻害活性が親株と同程度で
あるかどうかを以下に示す方法により詳細に測定した。
また、参考に各菌株の菌体外プロテアーゼ活性を測定
し、最終pHを再度確認した。これらの測定結果を表4
に示す。
ushman. D. W &Cheung.H.S.Pharmacol.,20 1637(197
1)]に基づいて行った。即ち、各種発酵乳を15000
回転、5分間の遠心分離により上清(ホエー)を調製
し、その後1N水酸化ナトリウム溶液を用いてpHを中
性とし、80μlを試験管に移し、次に基質として0.
1Mホウ酸緩衝液(0.3M NaClを含む、pH
8.3)で5mMに調整したヒプリル・ヒスチジル・ロ
イシン(Hip-His-Leu, シグマ社製品)0.2mlを加
えて、更に酵素溶液(0.1unit/ml、シグマ社製
品)20μlを添加して37℃で30分間反応させた。
その後、1N塩酸を250μl加えて反応を停止させた
後、1.7mlの酢酸エチルを加えて約20秒間撹拌し
た。次いで3000回転で10分間遠心分離し、酢酸エ
チル層1.4mlを回収し、120℃で40分間加熱し
て溶媒を除去した。溶媒除去後、蒸留水1mlを加え
て、約20秒間撹拌し抽出されたヒプリル酸の吸光度
(228nm)を測定した。酵素活性1ユニットはAC
E活性の50%阻害を与える量として下記式により算出
した。
y. Sci. 66 1219(1883)]により行った。検量線の作成
は、スタンダードとしてカゼインのトリプシン分解物を
用いた。
ning.S.Anal.Biochem.143 3410]をもとにYamamotoらの
方法[Yamamoto.N.らJ.of Biochem.(1993)In Press]に
従って行った。即ち、各種菌株を9%脱脂粉乳中でpH
6.0に維持して培養し、対数増殖期中期で集菌した。
クエン酸ナトリウムを終濃度1%になるように添加し、
乳培地を透明化し、5000回転、10分間の遠心分離
を行い菌体を回収した。次に、50mMβ−グリセロリ
ン酸により菌体を洗浄後、菌体を50mMトリス塩酸緩
衝液(pH7.8)に懸濁し、菌体表面の酸素活性を測
定した。0.4%フルオレセイン−イソチオシアネート
−カゼイン(シグマ社製)20μlに菌体懸濁液30μ
lを加え42℃で1時間インキュベートし、5%トリク
ロロ酢酸溶液を120μl加え室温にて約20分間放置
し、15000回転、10分間の遠心分離を行った。上
清60μlを3mlの500mMトリス塩酸緩衝液(p
H7.8)に加え、蛍光強度を測定した。蛍光強度は励
起波長490nmで生じる525nmの蛍光を測定し
た。活性は上記反応条件で、1%の蛍光強度を生じる酸
素量を1ユニットと定義した。CPN4株は親株と同程
度の菌体外プロテアーゼ活性を示し、ペプチド量、AC
E阻害活性についても、ほぼ同様の値を示した。しか
し、最終pHは、親株に比べ高いことが再確認された。
従って、その発酵乳に親株と同程度のACE阻害活性を
有し、最終pHが親株より高いCPN4株のみが、目的
にかなうものとして選択された。
の10℃における低温保存試験を行った。親株とCPN
4株を牛乳中で37℃で培養し、乳酸産生量が0.6%
となった時点で冷却後、10℃に保存した。保存後、1
週間後、2週間後に各発酵乳のpH、乳酸酸度(%)、
ACE阻害活性及びペプチド量を測定した。結果を表5
に示す。
プチド量及びACE阻害活性に大きい違いはなかった。
一方、親株では乳酸酸度の上昇及びそれに伴うpHの低
下がみられたが、CPN4株では保存期間中において乳
酸酸度の大きい変化はみられなかった。CPN4株の2
週間保存中のpHの変化は0.2、酸度の上昇は0.2
7%であり、酸味の上昇はかなり抑制されていた。
認)以上のようにして得られた変異株CPN4を用い
て、ヨーグルトを作製し(上記低温保存試験における1
0℃、1週間保存のもの)、自然発症高血圧ラット(日
本チャールズリバー(株))に胃ゾンデで経口投与し、
血圧降下値を測定した。コントロールとしては、牛乳を
乳酸で同じ酸度としたものを用いた。18週令雄ラット
(1群5匹)に発酵乳及びコントロール(未発酵乳)そ
れぞれを6ml/kg強制投与し6時間後に血圧を測定
した。血圧測定は、ソフトロン社の装置(型式「Softro
n BP-98A」)を用いて、tail-cuff法で最高血圧を求め
た。結果を表6に示す。
に対して血圧降下活性を示さず、CPN4株発酵乳は強
い血圧降下活性を示すことが確認された。
/mlに、ストレプトコッカス・サーモフィラス ATCC-
144885 または ATCC-19258(Streptococcus thermophil
us ATCC-144885またはATCC-19258)をそれぞれ1×10
5/mlとなるように加えて乳培地中で37℃、24時
間混合培養し乳酸酸度、pH、ペプチド量及びACE阻
害活性を、親株、CPN4、ストレプトコッカス・サー
モフィラス ATCC-144885 または ATCC-19258をそれぞれ
単独で使用した場合と比較した。結果を表7に示す。
も最も高くなったが、CPN4株は最終pHが親株に比
べ、酸度も低かった。一方ストレプトコッカス・サーモ
フィラス ATCC-144885 または ATCC-19258 株単独で発
酵した場合、酸度の上昇は少ないもののペプチド量が少
なくACE阻害活性は低かった。しかし、CPN4株と
ストレプトコッカス・サーモフィラス ATCC-144885また
はATCC-19258の併用においては、いずれの株においても
ACE阻害活性が確認され、酸度の上昇が低かった。ま
た、このような混合培養を行うことでラクトバチルス・
ヘルベチカス単独の場合よりも風味の生成が付加され
た。
Claims (2)
- 【請求項1】 培養物を10℃、2週間保存時の乳酸酸
度増加量が0.5%以下を示すこと、細胞膜結合性アデ
ノシントリホスファターゼ活性が5μmol・ Pi/min/mg蛋
白質以下であること、並びにネオマイシン耐性を有する
ことを特徴とするラクトバチルス・ヘルベチカス乳酸
菌。 - 【請求項2】 請求項1記載のラクトバチルス・ヘルベ
チカス乳酸菌を含む乳酸菌を用いて発酵処理したことを
特徴とする発酵乳製品。
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