TWI481409B - 一種使用益生菌製備用於清除尿毒素之組合物的用途 - Google Patents

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Description

一種使用益生菌製備用於清除尿毒素之組合物的用途
本發明係關於益生菌組合物的製備方法及其用途，特別指一種使用益生菌製備用於清除尿毒素之組合物的用途。
慢性腎病變(chronic kidney disease，CKD)指的是腎臟功能逐漸喪失的一種疾病，是一個全球性的健康問題，且此病對患者的生活也有很大的影響。慢性腎病變患者失去腎功能之後，原本應該由腎臟排泄或代謝的物質會逐漸堆積在體內，導致血液中這些物質的濃度增加，因此造成各種器官的毒性；腎衰竭患者體內的尿毒滯留物質(uremic retention solutes，URMs)，指的就是會被健康腎臟排除，但是在慢性腎病變疾病發展的過程中逐漸堆積在血液或組織中的各種分子，這些尿毒滯留物質會引起尿毒症(uremia)，因此也被稱作尿毒素(uremic toxin)。歐洲毒素工作小組(European Toxin Work Group)依照洗腎時(dialysis)會影響到移除這些滯留物質(URMs)的特徵，將URMs分成3類，區分為(1)水溶性小分子化合物(small water-soluble molecules，<500Da)：可以很輕易地通過任何透析過濾器；(2)大分子化合物(larger molecules，≧500Da)：依照濾膜的特徵，透析過濾器對這些大分子的通過是有限制的，有時這些大分子也會被稱作中分子化合物(middle molecules)；(3)親蛋白質化合物(protein-bound solutes)：親蛋白質化合物的透析移除，很大程度上是依賴其結合態和游離態之間的平衡，吸附技術(adsorptive techniques)也會影響其功效。
尿毒滯留物質(URMs)的分類可以幫助醫學界進一步了解各種尿毒素的特性，以及研究發展更好的治療方式；長期以來大部分的研究都專注於水溶性小分子化合物(small water-soluble molecules)對腎臟疾病的影響，甚至 以其作為評估治療的依據，但是隨著越來越多的研究報告被發表，新的觀念逐漸形成，現在認為親蛋白質化合物(protein-bound solutes)對腎臟疾病的影響更為重要，因此其對腎臟疾病患者治療的效果也必須重新評估。
親蛋白質尿毒素(protein-bound uremic toxins)
親蛋白質尿毒素和尿毒症候群(uremic syndrome)有關，並且也可能和慢性腎病變(CKD)的高致死率有關；因此許多研究開始致力於降低血清中親蛋白質尿毒素的濃度，其降低的方法有兩種：(1)減少腸道對親蛋白質尿毒素的吸收；(2)改善血液中親蛋白質尿毒素的清除率。
硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate,IS)和硫化對甲酚(p-cresyl sulfate)是兩種很重要的親蛋白質尿毒素；在研究親蛋白質尿毒素於血液透析(hemodialysis)、血液透析過濾(hemodiafiltration)或腹膜透析(peritoneal dialysis)時的行為時，硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate)和硫化對甲酚(p-cresyl sulfate)是最被廣泛使用的標記分子(marker molecules)；此外硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate)和硫化對甲酚(p-cresyl sulfate)亦被認和尿毒症候群(uremic syndrome)的形成，有直接的關聯。
目前對於尿毒素的清除主要以透析治療來清除血液中的水溶性小分子化合物類的尿毒素，然而這些方法皆無法有效的清除血液中的親蛋白質尿毒素；有些研究甚至顯示，透析膜對於水溶性小分子化合物類的尿毒素的清除效果很好，但是對於親蛋白質尿毒素的清除率卻非常的低。
此外，Marieret al 等人亦揭露了一種以口服吸附劑(AST-120,Kremezin；Kureha Corporation,Tokyo,Japan)來治療慢性腎病變的方法；此方法使用AST-120(一種活性碳吸附劑)，使其在大腸內吸附不同的有機化合 物，例如：indoxyl sulfate和p-cresol，以減少身體對於親蛋白質尿毒素的吸收；但是目前此種口服吸附劑仍在進行臨床試驗，以確定其最佳效果與適當劑量。
由此可見，上述習用之清除尿毒素之方法仍有諸多缺失，實非一良善之設計，而亟待加以改良。
有鑑於此，本案發明人為克服上述習用清除尿毒素的方法所產生的各項缺點，於是發展出一技術，此技術係利用益生菌(probiotics)來清除尿毒素，該尿毒素特別指的是親蛋白質尿毒素，終於成功研發完成本件製備益生菌組合物及其清除親蛋白質尿毒素的用途。
本發明之目的在於提供一種使用益生菌製備用於清除尿毒素之組合物的用途，以克服目前其他方法，如血液透析，無法有效清除血液中親蛋白質尿毒素之問題。
本發明提供一種使用益生菌製備用於清除尿毒素之組合物的用途，其中該益生菌組合物可以選自以下群組：胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum BCRC 12251、副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei BCRC 12188)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus BCRC 13869)或糞腸球菌(Enterococcus faecalis )中任一者；該益生菌組合物可用於清除血液中之尿毒素(uremic toxins)。
其中，該益生菌組合物以由胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum BCRC 12251)、副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei BCRC 12188)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus BCRC 13869)所組成的Pm-1益生菌組合物(Probiotic mix-1)，其清除尿毒素的效果較佳；其中該尿毒 素為親蛋白質尿毒素(protein-bound uremic toxins)；該親蛋白質尿毒素(protein-bound uremic toxins)更進一步為硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate)、對甲酚(p-cresol)或酚(phenol)；Pm-1中益生菌的濃度可為107 -1010 CFU/mL；Pm-1中各益生菌的組成比例為胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum BCRC 12251)之含量為40-60%、副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei BCRC 12188)之含量為20-30%、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus BCRC 13869)之含量為20%-30%。
雖然目前已有其他的方法來清除血液中的尿毒素，如：血液透析(hemodialysis)和口服吸附劑(AST-120)，但血液透析主要針對的是尿毒素中的小分子化合物，並無法有效的清除血液中的親蛋白質尿毒素，而口服吸附劑雖然可以減少身體對於親蛋白質尿毒素的吸收，但是因為目前正在進行臨床試驗，因此距離其實際的應用仍需等待一段時間；而本發明所提供的Pm-1益生菌組合物，不但具有良好之清除親蛋白質尿毒素之能力，更擁有較前項技術製備簡易和更具經濟效益的優點。
本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。
實施例一
本發明實施例一，係經由篩選具有較佳尿毒素清除率之益生菌株，來提供一種可用於清除尿毒素之益生菌，
1.益生菌篩選步驟：
(1)取100μ L之活化後菌液，接著將菌液分別接種於含不同尿毒素 之培養基，然後在0小時、24小時及48小時取樣；且培養基中各尿毒素之濃度為：60μg/ml之indoxyl sulfate、200μg/ml之phenol以及500μg/ml之p-cresol；(2)將取樣之樣品以高效能液態層析法(high performance liquid chromatography,HPLC)進行益生菌對尿毒素清除率的分析；(3)被分析的尿毒素為硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate)、對甲酚(p-cresol)或酚(phenol)。
2結果：
(1)硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate)清除率
取樣之樣品經HPLC分析並換算之後，得到各益生菌株對indoxyl sulfate之清除率(如表一所示)；結果顯示各益生菌株皆可減少indoxyl sulfate之濃度，其中效果最佳者為編號12251之菌株；編號12251號之菌株，其接種48小時後之清除率為19.45%，其次為編號14039及12195號之菌株，其清除率分別為19.18%及18.6%。
菌株*：以Bioresource Collection and Research Center(BCRC)購得之菌株(33株，10069,10361,10695,10696,10697,10940,11846,12187,12188,12195,12247,12251,12263,12272,12586,12936,14008,14011,14023,14039,14079,14615,14620,14622,14628,14660,14666,14667,14668,14669,16000,17394,17638)以Lactobacilli MRS培養液(Difco Laboratories,Detroit,MD)活化菌株後備用。
(2)甲酚(p-cresol)之清除率
取樣之樣品經HPLC分析並換算之後，得到各益生菌株對p-cresol之清除率(如表二所示)；於接種培養48 hr後，具有最佳清除率者依次為：14615、14666及12188，且三者對p-cresol之清除率，皆在4%以上。
(3)酚(phenol)之清除率：
取樣之樣品經HPLC分析並換算之後，得到各益生菌株對phenol之清除率(如表三所示)；效果最佳之前三株菌為編號12188、12187及12247號之菌株，於接種48小時後其清除率分別為6.83%、6.37%和4.96%。
3.結論：
如綜合比較表表四所示，若標示出各毒素清除效果最佳之前五名，則可以看到編號14615、14666及12188號之三株菌皆對phenol及p-cresol有較佳的效果，而對indoxyl sulfate之清除亦有效果，其效果分別為12.03%、15.15%及13.72%；但對indoxyl sulfate清除效果較佳之菌株，則皆具有較差之phenol及p-cresol清除率。
此外，由表一、表二及表三中，可以發現菌株對indoxyl sulfate之清除率高於對phenol及p-cresol之清除率；於接種48小時後，大部分菌株對indoxyl sulfate之清除率，高於10%，最佳者甚至達18-19%；但對phenol及p-cresol之清除率最佳者，也只達到4-6%；且大部分菌株對phenol及p-cresol之清除率僅有1-2%。因此推測此一差異甚大的清除率，應為尿毒素添加濃度之差異所致；因為於indoxyl sulfate之清除率實驗中，所添加的indoxyl sulfate濃度為60 μg/ml，而phenol及p-cresol清除率實驗中，所添加的濃度為明顯高於60 μg/ml之濃度，其濃度分別為200 μg/ml之phenol以及500 μg/ml之p-cresol；由此可進一步推測，益生菌對尿毒素之清除可能有一定的量，所以不同的毒素起始濃度，會造成其百分比計算後之差異。
未接種菌株之正控制組部分，其濃度則皆有出現些許減少之情形， 這是因為化合物自行揮發或是分解所致，但因減少之量有限，因此並不影響實施例中的分析結果。
負值之清除率推測應為取樣或分析之誤差所致，因為不含尿毒素之負對照組皆沒有分析出含有尿毒素，因此該負值並非由益生菌本身所生產之毒素所造成的。
綜合上述結果，隨後之混菌實驗以及動物試驗，優先選擇Indoxyl sulfate分解力高的12251號菌株和對phenol及p-cresol清除率高的12188號菌株，來進行尿毒素清除率之測試。
實施例二
本發明實施例二，係選用實施例一中具有較佳尿毒素清除率之益生菌株-12251和12188號菌株，來提供一種可用於清除尿毒素之益生菌組合物。
1.小鼠試驗：
(1)小鼠餵飼：
以六週齡BALB/c小鼠，馴養四週後於十週齡時開始進行試驗，在28日實驗期間每日以管餵方式餵食樣品，將小鼠分為五組(每組8隻)，對照組(Control)餵予無菌磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffer saline,PBS)，其中一組餵予新竹組克弗爾(Kefir)，其餘三組則分別餵予懸浮於PBS且濃度為1x108 CFU/mL的Lb.kefiranofaciens M1及濃度分別為1 x 107 和1 x 108 CFU/mL之BCRC 12251與12188之混和菌液各200 μL。
(2)血清取得：
於第0、7、14與21日對小鼠進行臉頰採血(cheek-pouch blood collection)，將血液置於採血管中以6000x g離心90秒後取得血清，測量indoxyl sulfate之濃度。
(3)Indoxyl sulfate清除試驗：
於試驗進行至第28日時，將小鼠禁食20小時後，以管餵方式餵予溶於0.5% methyl cellulose之5mg/mL indoxyl sulfate，依小鼠體重調整最終劑量為50 mg/kg，並分別於管餵後2小時及8小時，對小鼠進行臉頰採血，測量血清中indoxyl sulfate之濃度。
(4)Indoxyl sulfate之分析：
將上述臉頰採血之樣本以HPLC進行indole之分析。研究中以CAPCELL PAK MF Ph-1 SG80管柱(4.6＊ 150mm)搭配保護管柱(4.0＊ 10mm)進行分析；移動相為50mM之醋酸銨溶液(3.854g/1L)，流速1 mL/min，並以螢光檢測器進行檢測；另取indoxyl sulfate以去離子水分別配製不同濃度之標準品，濃度區間為15-120μg/mL，依上述HPLC分析條件檢測，積分後作出檢量線；樣本中的indoxyl sulfate即可對照標準品之檢量線估算。
2.結果：
餵食1 x 108 CFU/mL混菌三周後的小鼠，其血液中indoxyl sulfate的濃度顯著下降(圖一)，但是餵食其他菌株及對照組之小鼠，其血液中indoxyl sulfate的濃度在第2周顯著下降，但第3周又上升，而混菌則無此現象，因此該結果仍需再做一次確認。
在餵食益生菌4周後(表五)，以管餵方式餵予小鼠溶於0.5% methyl cellulose之5mg/mL indoxyl sulfate；於2小時後，有餵食菌株小鼠血液中之indoxyl sulfate的濃度皆低於無餵食的對照組；其中又以餵食克弗爾最低，該結果與未攻毒結果(圖一)並不一致。
3.結論：
結果顯示所有的益生菌株皆可降低小鼠血液中的indoxyl sulfate濃度，但是攻毒及未攻毒結果並不完全一致；且結果可能需要再增加正對照組做比較；由於小鼠採尿及採血都有限制，因此接著要用大鼠重複試驗，並加入採尿的結果和加入正對照組做比較。
實施例三
1.提供一種用於清除尿毒素之益生菌組合物(Pm-1)：
(1)該組合物包括：胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum BCRC 12251)、副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei BCRC 12188)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus BCRC 13869)； (2)該組合物可進一步包含藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑、輔劑等；(3)該Pm-1中之各益生菌的濃度為109 CFU/mL；(4)該Pm-1中各益生菌的組成比例為：40-60%之胚芽乳酸桿(Lactobacillus plantarum BCRC 12251)、20-30%之副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei BCRC 12188)、20%-30%之嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus BCRC 13869)；(5)該Pm-1益生菌組合物可用於清除血液中之親蛋白質尿毒素。
2.益生菌清除尿毒素之效果
(1)單一菌株清除indoxyl sulfate的效果：
從12種不同之活化後菌液(其中12251及12188號菌株，為實施例一中對尿毒素清除效果較佳之菌株)中，各取100μ l，分別接種於含不同尿毒素之培養基，並在0小時、48小時及96小時取樣，將菌液樣本以12000 rpm離心5分鐘後，取上清液並經0.22μ m孔徑之過濾膜(Pall，NY,USA)過濾。無益生菌但是含indoxyl sulfate之MRS培養液做為正對照組；益生菌培養於不含indoxyl sulfate之MRS培養液做為負對照組(NC,negative control)。
將上述之0小時、48小時及96小時取樣之樣品以HPLC進行indole之分析；樣品經HPLC分析並換算之後的結果如表六所示，其中以各組之0小時樣品當作初始濃度，再分別計算48及96小時之清除率，結果發現菌株EF、12188、12251以及13869對於硫酸吲哚酚(Indoxyl sulfate)具有較佳之清除率。
NC＊ ：負對照組(negative control)。
(2)混合菌株清除indoxyl sulfate的效果：
圖二為單一菌株12188、12251、13869及EF和混合菌株12251+12188、12251+EF、12188+EF及12251+12188+13869清除IS效果的比較圖；其中以各組之0小時樣品當作indoxyl sulfate之初始濃度，再分別計算48及96小時之清除率，結果發現12251+12188+13869及12251+EF有最佳清除indoxyl sulfate的效果。
實施例四 阿樂癌注射液(Cisplatin)誘發急性腎臟炎大鼠試驗
1.使用之混合益生菌組合物：
將體外試驗篩選出來的兩組具有較佳indoxyl sulfate清除率之混合益生菌，以Cisplatin誘發之急性腎臟炎動物模式驗證其功效；表七所示為前次體外實驗中具有較佳indoxyl sulfate清除率之混合益生菌組合物，可分為probiotic mix-1(Pm-1)以及probiotic mix-2(Pm-2)。
2.動物實驗：
以14週齡的公SD大鼠為實驗對象，連續餵食SD大鼠5天混菌，並於餵食混菌的第二天以腹腔注射Cisplatin(10mg/kg大鼠體重)，來引起大鼠之腎臟受損，然後每兩天抽一次血，測量血液中indoxyl sulfate之濃度及血液腎功能生化值；腹腔注射後4天，從大鼠體內取出腎臟，進行組織切片，及測量各器官之indoxyl sulfate之濃度。
實驗共分為5個試驗組：
(1)控制組：未注射Cisplatin，僅注射磷酸鹽緩衝溶液(phosphate-buffered saline,PBS)的大鼠；(2)正對照組：注射Cisplatin，但未餵食益生菌組合物的大鼠；(3)試驗組1：注射Cisplatin，且餵食益生菌組合物12251+12188+13869(probiotic mix-1)的大鼠；(4)試驗組2：注射Cisplatin，且餵食混菌12251+EF(probiotic mix-2)的大鼠；(5)若元錠：注射Cisplatin，且餵食若元錠的大鼠。詳細動物實驗之流程請參照圖三。
3.實驗結果：
(1)體重變化(見圖四)：
在四天的實驗期後，施打PBS之控制組的體重相較於實驗起始前並無顯著變化(98.43±6.39%)，而施打Cisplatin之試驗組之體重則是有顯著的下降(88.33±4.77%：p<0.01)；且接受若元錠(86.39±4.23%)、pm-1(86.39±8.98%)與pm-2(86.65±2.27%)餵食之大鼠，則是無法回復因施打Cisplatin所造成之體重下降。
(2)血清及尿液中的indoxyl sulfate濃度(見圖五)：
接受Cisplatin注射的大鼠之血清indoxyl sulfate濃度可達395.51±184.55μg/mL，由此可以得知該急性腎損傷之動物模式已被完整的建立；在實驗組中，僅有得到pm-1益生菌組合物餵食之大鼠，其體內因為急性腎損傷所致之高indoxyl sulfate濃度(130.69±68.07μ g/mL；p<0.05)，有 觀察到顯著的下降；而在接受若元錠與pm-2益生菌組合物餵食之大鼠身上，雖然可以觀察到血清中indoxyl sulfate濃度的下降趨勢，但在統計上並無顯著之差異。
與正常小鼠相比較，急性腎損傷大鼠，其尿液中的indoxyl sulfate濃度並未顯著增加，但有趣的是接受若元錠與pm-1餵食大鼠之尿液indoxyl sulfate濃度，皆高於控制組以及正對照組；但由於個體間之差異大，因此並無統計上之顯著差異；而餵食pm-2之大鼠，其尿液indoxyl sulfate濃度則無影響。
(3)臟器IS濃度(見圖六)：
在經Cisplatin注射所致之急性腎損傷的大鼠上，可以觀察到其腎臟以及肝臟中累積的indoxyl sulfate量顯著高於控制組(p<0.05)；雖然餵食pm-1與pm-2可以降低急性腎損傷所致之腎臟與肝臟中的indoxyl sulfate累積，但由於大鼠個體差異大，標準偏差大，因此與正對照組無顯著差異。
(4)血液生化值分析(見圖七)：
A.血液尿素氮(圖七A)
血液尿素氮為臨床上最常使用之腎功能指標之一，當腎臟排除毒素之功能受損時，血液尿素氮會因為無法排除而累積於體內。於本實施例中可見Cisplatin處理後之急性腎損傷大鼠之血液尿素氮濃度，有顯著之增加(177.75±34.06 mg/dL；p<0.005)；但是Pm-1、Pm-2及若元錠，皆無法降低大鼠體內因急性腎損傷所致之高血液尿素氮濃度。
B.肌酸酐(圖七B)
肌酸酐亦為臨床上最常使用之腎功能指標之一，可反應腎絲球之受損情形；於本實施例中可見Cisplatin處理後之急性腎損傷大鼠之肌酸酐濃度，有顯著之增加(4.45±1.16mg/dL；p<0.01)；但是Pm-1、Pm-2及若元錠，皆無法降低大鼠體內因急性腎損傷所致之高肌酸酐濃度。
C.尿酸(圖七C)
腎臟代謝功能失常時，會引起尿酸在體內之蓄積；於本實施例中，各處理組間皆無顯著之差異(p>0.05)。
D.鈣(圖七D)
腎臟若是調節電解質的功能受損時，有時會造成低鈣血症；但是於本實施例中所使用之急性腎損傷動物模式中，並無觀察到低鈣血症之發生；相反的，可以觀察到血鈣濃度有顯著之提升(p<0.05)，由此可以推知，注射Cisplatin會造成腎臟調節電解質之改變，但不會造成低鈣血症；而在試驗組中，餵食pm-1及pm-2益生菌組合物，可降低因急性腎損傷所造成之血鈣濃度升高，且pm-2可顯著的降低因急性腎損傷所造成之血鈣濃度升高(p<0.05)。
E.鎂(圖七E)
臨床上在急性腎衰竭恢復期時會進入多尿期，而在此時會發生低鎂血症；在本實施例中，注射Cisplatin後並無出現低鎂血症，顯示尚未進入急性腎損傷之多尿期；且各處理組間，彼此皆無 顯著差異，唯餵食若元錠之大鼠，具有較高之血鎂濃度，但並無統計上顯著之差異(p>0.05)。
F.血氨(圖七F)
血氨濃度之異常升高，在臨床上主要是與肝臟及代謝疾病有關，而低血氨則是與高血壓及一些藥物的使用相關；在本實施例中發現，Cisplatin會引起低血氨之現象；而若元錠(p<0.05)以及pm-1(p<0.01)益生菌組合物，則可以顯著回復因cisplatin所致之低血氨現象；然而餵食pm-2益生菌組合物之大鼠，則無觀察到顯著之差異。
(5)尿液分析(圖八’)
A.尿膽紅素
尿中若測得膽紅素則代表有肝臟疾病、膽管阻塞以及腎小球嚴重受損等疾病；本實施例中，控制組與各處理組皆未檢出尿膽紅素，因此代表各處理組大鼠之肝臟與膽囊皆未受損。
B.尿膽素元
尿膽素元之升高代表有肝臟疾病或膽管阻塞等疾病；本實施例中，控制組與各處理組之尿膽素元值皆在正常範圍內，因此代表各處理組大鼠之肝臟與膽囊皆未受損。
C.亞硝酸鹽
當泌尿道感染時，細菌會將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽；本實施例中，控制組與各處理組皆未檢測出亞硝酸鹽，因此代表各處理組之大鼠，皆無發生泌尿道感染。
D.尿葡萄糖(圖八A)
當腎臟受損時，尿中會測得葡萄糖的增加；如圖七A所示，當以Cisplatin引起大鼠之急性腎毒性時，尿中葡萄糖量會增加；但是，不管是餵食若元錠或是益生菌組合物，皆無法降低因Cisplatin所增加之尿中葡萄糖。
E.尿蛋白(圖八B)
腎臟的受損，尤其是腎絲球或腎小管之病變與受損，皆會造成尿蛋白之增加；如圖七B所示，Cisplatin會引起尿蛋白量的增加；且餵食若元錠或是益生菌組合物，皆無法降低由Cisplatin所引起之尿蛋白增加。
F. pH值(圖八C)
在臨床上，飲食或是腎臟發炎會引起尿中pH值之降低；本實施例中，Cisplatin會引起尿中pH值之降低；且pm-2益生菌組合物可回復，因Cisplatin所造成之尿中pH值降低，但在統計上並無顯著之差異；而其它處理組則是無影響。
G.尿比重(圖八D)
尿比重會因腎臟疾病、腎臟髓質受損、尿崩症與過多水分攝取而降低；會因脫水或利尿劑之處理而升高；但是在本實施例中，控制組與所有處理組之尿比重皆無差異。
H.尿血(圖八E)
腎臟與泌尿系統之疾病或是發炎皆可造成尿中測得血液之存在；本實施例中，可以觀察到若元錠以及pm-2益生菌組合物可 顯著(p<0.05)降低由Cisplatin所引起之尿血。
I.尿白血球(圖八F)
尿中白血球之成因，可能是由腎臟與泌尿系統受到感染或是由毒物造成之腎間質受損所引起的；本實施例中，若元錠或是益生菌組合物，皆無法降低由Cisplatin所造成之尿白血球增加。
J.酮體(圖八G)
在臨床上，尿中酮體之升高，可由禁食過久、酒精性或糖尿病所引起之酮酸中毒及甲狀腺機能亢進與發燒等所造成；本實施例中發現，Cisplatin可升高尿中酮體量，而若元錠與pm-2益生菌組合物，則可回復由Cisplatin所造成之尿酮體增加，但在統計上並無顯著之差異；而在其它處理組則是無影響。
4.結論：
(1)Cisplatin：
由腹腔注射Cisplatin所引起之腎臟受損，會顯著降低大鼠體重，並顯著提升血液中、腎臟及肝臟IS的濃度，以及顯著增加血液中尿素氮、肌酸酐和尿酸濃度，同時減少血氨含量，此外，也會顯著增加尿液中尿葡萄糖、尿蛋白、pH值、尿血、尿白血球及酮體濃度。
(2)Pm-1益生菌組合物：
可以顯著降低因腎臟受損所引起之血液indoxyl sulfate濃度的增加，增加尿液中indoxyl sulfate排出濃度，並具有降低腎臟及肝臟中indoxyl sulfate濃度的趨勢；此外，也可以顯著的回復因Cisplatin所致之低血氨現象，及降低因急性腎損傷所造成之血鈣濃度升高。
(3)Pm-2益生菌組合物：
雖無法降低因腎臟受損所引起血液indoxyl sulfate濃度的增加，但是仍顯示出具有降低腎臟及肝臟中indoxyl sulfate濃度的趨勢，並且可以顯著降低因腎臟受損所引起的尿血，此外，亦可回復由Cisplatin所造成之尿酮體增加，及顯著降低因急性腎損傷所造成之血鈣濃度升高。
由上述實施例可知，本發明所製成的Pm-1益生菌組合物，可以有效的清除尿毒素，且該尿毒素特別指的是親蛋白質尿毒素，如：indoxyl sulfate、p-cresyl sulfate和phenol；此外，Pm-1還可有效降低因腎臟受損所引起之血液indoxyl sulfate濃度的增加、增加尿液中indoxyl sulfate排出濃度，並可以降低腎臟及肝臟中之indoxyl sulfate濃度；除上述優點外，和其他既有之清除尿毒素之方法，該Pm-1益生菌組合物亦具有製備容易、使用簡易、低成本和高經濟效益之優點。
上述實施例及圖式僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以之限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利範圍所作之均等變化與修飾，皆應屬本發明專利涵蓋之範圍內。
綜上所述，本案所提供之一種使用益生菌製備用於清除尿毒素之組合物的用途確屬創新，並能較習用之清除尿毒素之方法增進上述多項功效，應已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請 貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明。
S31‧‧‧Cisplatin誘發急性腎臟炎大鼠試驗之流程圖
S32‧‧‧Cisplatin誘發急性腎臟炎大鼠試驗之分析方法
圖一為本發明餵食小鼠不同菌株，該小鼠血液中indoxyl sulfate的變化圖(Control：對照組、Kefir：新竹組克弗爾、M1：懸浮於PBS的Lb.kefiranofaciens M1、107： BCRC 12251與12188之混和菌液1 x 107 CFU/mL、108： BCRC 12251與12188之混和菌液1 x 108 CFU/mL)。
圖二為本發明的單一菌株12188、12251、13869及EF和混合菌株12251+12188、12251+EF、12188+EF及12251+12188+13869清除indoxyl sulfate效果的比較圖。
圖三為本發明的動物試驗流程圖；S31：Cisplatin誘發急性腎臟炎大鼠試驗之流程圖；S32：Cisplatin誘發急性腎臟炎大鼠試驗之分析方法。
圖四為本發明試驗期間大鼠之體重變化圖。(ctrl：對照組，未注射Cisplatin；Cis：正對照組，注射Cisplatin但未餵食益生菌；Cis+Wk：注射Cisplatin和餵食若元錠；Cis+Pm-1：注射Cisplatin和餵食probiotic mix-1；Cis+Pm-2：注射Cisplatin和餵食probiotic mix-2)
圖五為本發明Cisplatin誘發急性腎臟炎大鼠試驗中，各組血清與尿液中indoxyl sulfate之濃度。(ctrl：對照組，未注射Cisplatin；Cis：正對照組，注射Cisplatin，但未餵食益生菌；Wk：注射Cisplatin和餵食若元 錠；Pm-1：注射Cisplatin和餵食probiotic mix-1；Pm-2：注射Cisplatin和餵食probiotic mix-2)
圖六為本發明Cisplatin誘發急性腎臟炎大鼠試驗中，各組腎臟與肝臟中indoxyl sulfate之濃度。(ctrl：對照組，未注射Cisplatin；Cis：正對照組，注射Cisplatin，但未餵食益生菌；Wk：注射Cisplatin和餵食若元錠；Pm-1：注射Cisplatin和餵食probiotic mix-1；Pm-2：注射Cisplatin和餵食probiotic mix-2)
圖七為本發明Cisplatin誘發急性腎臟炎大鼠試驗中，各組血液生化分析值。(＊ p<0.05，＊＊ p<0.01；ctrl：對照組，未注射Cisplatin；Cis：正對照組，注射Cisplatin，但未餵食益生菌；Wk：注射Cisplatin和餵食若元錠；Pm-1：注射Cisplatin和餵食probiotic mix-1；Pm-2：注射Cisplatin和餵食probiotic mix-2)
圖八為本發明Cisplatin誘發急性腎臟炎大鼠試驗中，各組之尿液分析。(ctrl：對照組，未注射Cisplatin；Cis：正對照組，注射Cisplatin，但未餵食益生菌；Wk：注射Cisplatin和餵食若元錠；Pm-1：注射Cisplatin和餵食probiotic mix-1；Pm-2：注射Cisplatin和餵probiotic mix-2；其中圖八-E中之c、ab、c、a、bc標示，代表若符號相同則沒有統計上之差異。)

Claims (8)

  1. 一種使用益生菌製備用於清除尿毒素之組合物的用途，其中該益生菌係選自以下群組：胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum BCRC 12251)、副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei BCRC 12188)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus BCRC 13869)之任一組合，及藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑、輔劑等。
  2. 如申請專利範圍第1項之一種使用益生菌製備用於清除尿毒素之組合物的用途，其中該尿毒素為親蛋白質尿毒素(protein-bound uremic toxins)。
  3. 如申請專利範圍第2項之一種使用益生菌製備用於清除尿毒素之組合物的用途，其中該親蛋白質尿毒素(protein-bound uremic toxins)為硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate)、對甲酚(p-cresol)或酚(phenol)。
  4. 一種用於清除尿毒素之益生菌組合物，該組合物包括：胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum BCRC 12251)、副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei BCRC 12188)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophiles BCRC 13869)，及藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑、輔劑等。
  5. 如申請專利範圍第4項之一種用於清除尿毒素之益生菌組合物，其中該尿毒素為親蛋白質尿毒素(protein-bound uremic toxins)。
  6. 如申請專利範圍第5項之一種用於清除尿毒素之益生菌組合物，其中該親蛋白質尿毒素(protein-bound uremic toxins)為硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate)、對甲酚(p-cresol)或酚(phenol)。
  7. 如申請專利範圍第4項之一種用於清除尿毒素之益生菌組合物，其中該 益生菌的濃度為107 -1010 CFU/mL。
  8. 如申請專利範圍第4項之一種用於清除尿毒素之益生菌組合物，其中該胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum BCRC 12251)之含量為40-60%、副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei BCRC 12188)之含量20-30%、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus BCRC 13869)之含量為20%-30%。
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JP2013096369A JP5671578B2 (ja) 2013-01-10 2013-05-01 尿毒素の除去のために用いられるプロバイオティクス組成物
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI770811B (zh) * 2021-02-05 2022-07-11 國立臺灣大學 一種益生菌、其組合物及用途

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102121010B1 (ko) * 2017-05-15 2020-06-11 가톨릭관동대학교산학협력단 락토바실러스 sp. KCCM 11826P 균주를 이용한 요독물질 축적으로 말미암아 발생하는 질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물
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JP7153274B2 (ja) * 2019-12-25 2022-10-14 京都府公立大学法人 慢性腎臓病進行抑制剤
EP3908260B1 (en) 2020-01-27 2022-09-21 Frimline Private Limited Pharmaceutical composition for reducing protein bound uremic toxins

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2824821B2 (ja) * 1993-11-04 1998-11-18 カルピス株式会社 乳酸菌及び発酵乳製品
JPH09110707A (ja) * 1995-10-12 1997-04-28 Wakamoto Pharmaceut Co Ltd 慢性腎不全改善剤および透析患者のクオリティー オブ ライフ改善剤
US20040197352A1 (en) * 1999-04-30 2004-10-07 Natarajan Ranganathan Methods of improving or augmenting kidney function
US7998470B2 (en) * 1999-04-30 2011-08-16 Kibow Biotech, Inc. Compositions and methods improving renal function
US20040105848A1 (en) * 1999-04-30 2004-06-03 Natarajan Ranganathan Enteric dialysis compositions and methods
US20050074442A1 (en) * 2002-03-13 2005-04-07 Natarajan Ranganathan Compositions and methods for augmenting kidney function
US9980988B2 (en) * 2002-03-13 2018-05-29 Kibow Biotech, Inc. Compositions and methods for augmenting kidney function
JP2004277296A (ja) * 2003-03-13 2004-10-07 Morishita Jintan Kk 乳酸菌含有腸溶性製剤
WO2005032591A1 (en) * 2003-09-30 2005-04-14 Kibow Biotech, Inc. Compositions and methods for augmenting kidney function
DE102004026706A1 (de) * 2004-05-28 2005-12-15 Merck Patent Gmbh Orale Darreichungsform enthaltend probiotische Bakterien
CA2713525A1 (en) * 2008-02-06 2009-08-13 The Procter & Gamble Company Compositions methods and kits for enhancing immune response to a respiratory condition
JP2009102324A (ja) * 2008-11-27 2009-05-14 Morishita Jintan Kk 乳酸菌含有血中アンモニア低減剤
US8372392B2 (en) * 2009-12-23 2013-02-12 Lytone Enterprise, Inc. Lactobacillus paracasei strain LT12 as immunity regulatory agent
ITMI20110791A1 (it) * 2011-05-09 2012-11-10 Probiotical Spa Ceppi di batteri in grado di metabolizzare gli ossalati.

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Rehman A. et al.,"Effects of probiotics and antibiotics on the intestinal homeostasis in a computer controlled model of the large intestine" BMC Microbiology 2012, 12:47 *
Rossi M. et al.,"Pre-, pro-, and synbiotics: do they have a role in reducing uremic toxins? A systematic review and meta-analysis"2012, International Journal of Nephrology, Volume 2012 , Article ID 673631, 20 pages *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI770811B (zh) * 2021-02-05 2022-07-11 國立臺灣大學 一種益生菌、其組合物及用途

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