CN103919815A - 一种使用益生菌制备用于清除尿毒素的组合物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于清除尿毒素的益生菌组合物，该益生菌组合物选自：胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum BCRC12251)、副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei BCRC12188)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus BCRC13869)所组成群组中的任一者，及药学上可接受的载剂、赋形剂、稀释剂、辅剂等；此外，本发明更提供一种用于清除尿毒素的益生菌组合物，该组合物包括：胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum BCRC12251)、副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei BCRC12188)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles BCRC13869)，及药学上可接受的载剂、赋形剂、稀释剂、辅剂等。另本发明也涉及借由该组合物或益生菌用以清除尿毒素的新颖用途；该尿毒素特别指的是亲蛋白质尿毒素(protein-bound uremic toxins)。

Description

一种使用益生菌制备用于清除尿毒素的组合物的用途
技术领域
本发明涉及益生菌组合物的制备方法及其用途，特别指一种使用益生菌制备用于清除尿毒素的组合物的用途。
背景技术
慢性肾病变(chronic kidney disease，CKD)指的是肾脏功能逐渐丧失的一种疾病，是一个全球性的健康问题，且此病对患者的生活也有很大的影响。慢性肾病变患者失去肾功能之后，原本应该由肾脏排泄或代谢的物质会逐渐堆积在体内，导致血液中这些物质的浓度增加，因此造成各种器官的毒性；肾衰竭患者体内的尿毒滞留物质(uremic retention solutes，URMs)，指的就是会被健康肾脏排除，但是在慢性肾病变疾病发展的过程中逐渐堆积在血液或组织中的各种分子，这些尿毒滞留物质会引起尿毒症(uremia)，因此也被称作尿毒素(uremictoxin)。欧洲毒素工作小组(European Toxin Work Group)依照洗肾时(dialysis)会影响到移除这些滞留物质(URMs)的特征，将URMs分成3类，区分为(1)水溶性小分子化合物(small water-soluble molecules，<500Da):可以很轻易地通过任何透析过滤器；(2)大分子化合物(larger molecules，≧500Da):依照滤膜的特征，透析过滤器对这些大分子的通过是有限制的，有时这些大分子也会被称作中分子化合物(middle molecules)；(3)亲蛋白质化合物(protein-bound solutes):亲蛋白质化合物的透析移除，很大程度上是依赖其结合态和游离态之间的平衡，吸附技术(adsorptive techniques)也会影响其功效。
尿毒滞留物质(URMs)的分类可以帮助医学界进一步了解各种尿毒素的特性，以及研究发展更好的治疗方式；长期以来大部分的研究都专注于水溶性小分子化合物(small water-soluble molecules)对肾脏疾病的影响，甚至以其作为评估治疗的依据，但是随着越来越多的研究报告被发表，新的观念逐渐形成，现在认为亲蛋白质化合物(protein-bound solutes)对肾脏疾病的影响更为重要，因此其对肾脏疾病患者治疗的效果也必须重新评估。
亲蛋白质尿毒素(protein-bound uremic toxins)
亲蛋白质尿毒素和尿毒症候群(uremic syndrome)有关，并且也可能和慢性肾病变(CKD)的高致死率有关；因此许多研究开始致力于降低血清中亲蛋白质尿毒素的浓度，其降低的方法有两种:(1)减少肠道对亲蛋白质尿毒素的吸收；(2)改善血液中亲蛋白质尿毒素的清除率。
硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate,IS)和硫化对甲酚(p-cresyl sulfate)是两种很重要的亲蛋白质尿毒素；在研究亲蛋白质尿毒素于血液透析(hemodialysis)、血液透析过滤(hemodiafiltration)或腹膜透析(peritoneal dialysis)时的行为时，硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate)和硫化对甲酚(p-cresyl sulfate)是最被广泛使用的标记分子(marker molecules)；此外硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate)和硫化对甲酚(p-cresyl sulfate)也被认和尿毒症候群(uremic syndrome)的形成，有直接的关联。
目前对于尿毒素的清除主要以透析治疗来清除血液中的水溶性小分子化合物类的尿毒素，然而这些方法皆无法有效的清除血液中的亲蛋白质尿毒素；有些研究甚至显示，透析膜对于水溶性小分子化合物类的尿毒素的清除效果很好，但是对于亲蛋白质尿毒素的清除率却非常的低。
此外，Marier et al等人也揭露了一种以口服吸附剂(AST-120,Kremezin;Kureha Corporation,Tokyo,Japan)来治疗慢性肾病变的方法；此方法使用AST-120(一种活性碳吸附剂)，使其在大肠内吸附不同的有机化合物，例如:indoxyl sulfate和p-cresol，以减少身体对于亲蛋白质尿毒素的吸收；但是目前此种口服吸附剂仍在进行临床试验，以确定其最佳效果与适当剂量。
由此可见，上述现有的清除尿毒素的方法仍有诸多缺失，实非一良善的设计，而亟待加以改良。
发明内容
有鉴于此，本案发明人为克服上述现有清除尿毒素的方法所产生的各项缺点，于是发展出一技术，此技术利用益生菌(probiotics)来清除尿毒素，该尿毒素特别指的是亲蛋白质尿毒素，终于成功研发完成本件制备益生菌组合物及其清除亲蛋白质尿毒素的用途。
本发明的目的在于提供一种使用益生菌制备用于清除尿毒素的组合物的用途，以克服目前其他方法，如血液透析，无法有效清除血液中亲蛋白质尿毒素的问题。
本发明提供一种使用益生菌制备用于清除尿毒素的组合物的用途，其中该益生菌组合物可以选自以下群组:胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarumBCRC12251、副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei BCRC12188)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus BCRC13869)或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)中任一者；该益生菌组合物可用于清除血液中的尿毒素(uremic toxins)。
其中，该益生菌组合物以由胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarumBCRC12251)、副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei BCRC12188)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus BCRC13869)所组成的Pm-1益生菌组合物(Probiotic mix-1)，其清除尿毒素的效果较佳；其中该尿毒素为亲蛋白质尿毒素(protein-bound uremic toxins)；该亲蛋白质尿毒素(protein-bound uremic toxins)更进一步为硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate)、对甲酚(p-cresol)或酚(phenol)；Pm-1中益生菌的浓度可为107-1010CFU/mL；Pm-1中各益生菌的组成比例为胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum BCRC12251)的含量为40-60%、副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei BCRC12188)的含量为20-30%、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus BCRC13869)的含量为20%-30%。
虽然目前已有其他的方法来清除血液中的尿毒素，如:血液透析(hemodialysis)和口服吸附剂(AST-120)，但血液透析主要针对的是尿毒素中的小分子化合物，并无法有效的清除血液中的亲蛋白质尿毒素，而口服吸附剂虽然可以减少身体对于亲蛋白质尿毒素的吸收，但是因为目前正在进行临床试验，因此距离其实际的应用仍需等待一段时间；而本发明所提供的Pm-1益生菌组合物，不但具有良好的清除亲蛋白质尿毒素的能力，更拥有比前项技术制备简易和更具经济效益的优点。
附图说明
图1为本发明喂食小鼠不同菌株，该小鼠血液中indoxylsulfate的变化图(Control:对照组、Kefir:新竹组克弗尔、M1:悬浮于PBS的Lb.kefiranofaciens M1、107:BCRC12251与12188的混和菌液1x107CFU/mL、108:BCRC12251与12188的混和菌液1x108CFU/mL)。
图2为本发明的单一菌株12188、12251、13869及EF和混合菌株12251+12188、12251+EF、12188+EF及12251+12188+13869清除indoxyl sulfate效果的比较图。
图3为本发明的动物试验流程图；S31:Cisplatin诱发急性肾脏炎大鼠试验的流程图；S32:Cisplatin诱发急性肾脏炎大鼠试验的分析方法。
图4为本发明试验期间大鼠的体重变化图。(ctrl:对照组，未注射Cisplatin;Cis:正对照组，注射Cisplatin但未喂食益生菌;Cis+Wk:注射Cisplatin和喂食若元锭;Cis+Pm-l:注射Cisplatin和喂食probioticmix-l;Cis+Pm-2:注射Cisplatin和喂食probioticmix-2)
图5为本发明Cisplatin诱发急性肾脏炎大鼠试验中，各组血清与尿液中indoxyl sulfate的浓度。(ctrl:对照组，未注射Cisplatin;Cis:正对照组，注射Cisplatin，但未喂食益生菌;Wk:注射Cisplatin和喂食若元锭;Pm-l:注射Cisplatin和喂食probioticmix-l;Pm-2:注射Cisplatin和喂食probiotic mix-2)
图6为本发明Cisplatin诱发急性肾脏炎大鼠试验中，各组肾脏与肝脏中indoxyl sulfate的浓度。(ctrl:对照组，未注射Cisplatin;Cis:正对照组，注射Cisplatin，但未喂食益生菌;Wk:注射Cisplatin和喂食若元锭;Pm-l:注射Cisplatin和喂食probioticmix-l;Pm-2:注射Cisplatin和喂食probioticmix-2)
图7为本发明Cisplatin诱发急性肾脏炎大鼠试验中，各组血液生化分析值。(*p<0.05，**p<0.01;ctrl:对照组，未注射Cisplatin;Cis:正对照组，注射Cisplatin，但未喂食益生菌;Wk:注射Cisplatin和喂食若元锭;Pm-l:注射Cisplatin和喂食probioticmix-l;Pm-2:注射Cisplatin和喂食probiotic mix-2)
图8为本发明Cisplatin诱发急性肾脏炎大鼠试验中，各组的尿液分析。(ctrl:对照组，未注射Cisplatin;Cis:正对照组，注射Cisplatin，但未喂食益生菌;Wk:注射Cisplatin和喂食若元锭;Pm-l:注射Cisplatin和喂食probiotic mix-l;Pm-2:注射Cisplatin和喂食probioticmix-2；其中图8-E中的c、ab、c、a、bc标示，代表若符号相同则没有统计上的差异。)
附图标记说明
S31 Cisplatin诱发急性肾脏炎大鼠试验的流程图。
S32 Cisplatin诱发急性肾脏炎大鼠试验的分析方法。
具体实施方式
本发明以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
实施例一
本发明实施例一，经由筛选具有较佳尿毒素清除率的益生菌株，来提供一种可用于清除尿毒素的益生菌，
1.益生菌筛选步骤:
(1)取100μL的活化后菌液，接着将菌液分别接种于含不同尿毒素的培养基，然后在0小时、24小时及48小时取样；且培养基中各尿毒素的浓度为:60μg/ml的indoxyl sulfate、200μg/ml的phenol以及500μg/ml的p-cresol；
(2)将取样的样品以高效能液态层析法(high performance liquidchromatography,HPLC)进行益生菌对尿毒素清除率的分析；
(3)被分析的尿毒素为硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate)、对甲酚(p-cresol)或酚(phenol)。
2结果:
(1)硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate)清除率
取样的样品经HPLC分析并换算之后，得到各益生菌株对indoxylsulfate的清除率(如表一所示)；结果显示各益生菌株皆可减少indoxylsulfate的浓度，其中效果最佳者为编号12251的菌株；编号12251号的菌株，其接种48小时后的清除率为19.45%，其次为编号14039及12195号的菌株，其清除率分别为19.18%及18.6%。
表一硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate)清除率
菌株*:以Bioresource Collection and Research Center(BCRC)购得的菌株(33株，10069,10361,10695,10696,10697,10940,11846,12187,12188,12195,12247,12251,12263,12272,12586,12936,14008,14011,14023,14039,14079,14615,14620,14622,14628,14660,14666,14667,14668,14669,16000,17394,17638)以Lactobaci11i MRS培养液(Difco Laboratories,Detroit,MD)活化菌株后备用。
(2)甲酚(p-cresol)的清除率
取样的样品经HPLC分析并换算之后，得到各益生菌株对p-cresol的清除率(如表二所示)；于接种培养48hr后，具有最佳清除率者依次为:14615、14666及12188，且三者对p-cresol的清除率，皆在4%以上。
表二甲酚(p-cresol)的清除率
(3)酚(phenol)的清除率:
取样的样品经HPLC分析并换算的后，得到各益生菌株对phenol的清除率(如表三所示)；效果最佳的前三株菌为编号12188、12187及12247号的菌株，于接种48小时后其清除率分别为6.83%、6.37%和4.96%。
表三酚(phenol)的清除率
表四Indoxyl sulfate、p-cresol及phenol的清除率比较表
3.结论:
如综合比较表四所示，若标示出各毒素清除效果最佳的前五名，则可以看到编号14615、14666及12188号的三株菌皆对phenol及p-cresol有较佳的效果，而对indoxyl sulfate的清除也有效果，其效果分别为12.03%、15.15%及13.72%；但对indoxyl sulfate清除效果较佳的菌株，则皆具有较差的phenol及p-cresol清除率。
此外，由表一、表二及表三中，可以发现菌株对indoxyl sulfate的清除率高于对phenol及p-cresol的清除率；于接种48小时后，大部分菌株对indoxyl sulfate的清除率，高于10%，最佳者甚至达18-19%；但对phenol及p-cresol的清除率最佳者，也只达到4-6%；且大部分菌株对phenol及p-cresol的清除率仅有1-2%。因此推测此一差异甚大的清除率，应为尿毒素添加浓度的差异所致；因为于indoxyl sulfate的清除率实验中，所添加的indoxyl sulfate浓度为60μg/ml，而phenol及p-cresol清除率实验中，所添加的浓度为明显高于60μg/ml的浓度，其浓度分别为200μg/ml的phenol以及500μg/ml的p-cresol；由此可进一步推测，益生菌对尿毒素的清除可能有一定的量，所以不同的毒素起始浓度，会造成其百分比计算后的差异。
未接种菌株的正控制组部分，其浓度则皆有出现些许减少的情形，这是因为化合物自行挥发或是分解所致，但因减少的量有限，因此并不影响实施例中的分析结果。
负值的清除率推测应为取样或分析的误差所致，因为不含尿毒素的负对照组皆没有分析出含有尿毒素，因此该负值并非由益生菌本身所生产的毒素所造成的。
综合上述结果，随后的混菌实验以及动物试验，优先选择Indoxylsulfate分解力高的12251号菌株和对phenol及p-cresol清除率高的12188号菌株，来进行尿毒素清除率的测试。
实施例二
本发明实施例二，选用实施例一中具有较佳尿毒素清除率的益生菌株—12251和12188号菌株，来提供一种可用于清除尿毒素的益生菌组合物。
1.小鼠试验:
(1)小鼠喂饲:
以六周龄BALB/c小鼠，驯养四周后于十周龄时开始进行试验，在28日实验期间每日以管喂方式喂食样品，将小鼠分为五组(每组8只)，对照组(Control)喂予无菌磷酸盐缓冲溶液(phosphatebuffer saline,PBS)，其中一组喂予新竹组克弗尔(Kefir)，其余三组则分别喂予悬浮于PBS且浓度为1x108CFU/mL的Lb.kefiranofaciensM1及浓度分别为1x107和1x108CFU/mL的BCRC12251与12188的混和菌液各200μL。
(2)血清取得﹕
于第0、7、14与21日对小鼠进行脸颊采血(cheek-pouchblood collection)，将血液置于采血管中以6000x g离心90秒后取得血清，测量indoxyl sulfate的浓度。
(3)Indoxyl sulfate清除试验﹕
于试验进行至第28日时，将小鼠禁食20小时后，以管喂方式喂予溶于0.5%methyl cellulose的5mg/mL indoxyl sulfate，依小鼠体重调整最终剂量为50mg/kg，并分别于管喂后2小时及8小时，对小鼠进行脸颊采血，测量血清中indoxyl sulfate的浓度。
(4)Indoxyl sulfate的分析﹕
将上述脸颊采血的样本以HPLC进行indole的分析。研究中以CAPCELL PAK MF Ph-1SG80管柱(4.6*150mm)搭配保护管柱(4.0*10mm)进行分析；移动相为50mM的醋酸铵溶液(3.854g/1L)，流速1mL/min，并以荧光检测器进行检测；另取indoxylsulfate以去离子水分别配制不同浓度的标准品，浓度区间为15-120μg/mL，依上述HPLC分析条件检测，积分后作出检量线；样本中的indoxyl sulfate即可对照标准品的检量线估算。
2.结果:
喂食1x108CFU/mL混菌三周后的小鼠，其血液中indoxyl sulfate的浓度显著下降(图1)，但是喂食其他菌株及对照组的小鼠，其血液中indoxylsulfate的浓度在第2周显著下降，但第3周又上升，而混菌则无此现象，因此该结果仍需再做一次确认。
在喂食益生菌4周后(表五)，以管喂方式喂予小鼠溶于0.5%methylcellulose的5mg/mL indoxyl sulfate；于2小时后，有喂食菌株小鼠血液中的indoxyl sulfate的浓度皆低于无喂食的对照组；其中又以喂食克弗尔最低，该结果与未攻毒结果(图1)并不一致。
表五小鼠喂食菌株4周后供毒，2小时后小鼠血液中indoxyl sulfate的变化
indoxyl sulfate浓度(ug/mL) 2hr
Control 298.7423
Kefir 252.8100
M1 260.5693
107 264.1978
108 263.9259
3.结论:
结果显示所有的益生菌株皆可降低小鼠血液中的indoxyl sulfate浓度，但是攻毒及未攻毒结果并不完全一致；且结果可能需要再增加正对照组做比较；由于小鼠采尿及采血都有限制，因此接着要用大鼠重复试验，并加入采尿的结果和加入正对照组做比较。
实施例三
1.提供一种用于清除尿毒素的益生菌组合物(Pm-1):
(1)该组合物包括：胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum BCRC12251)、副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei BCRC12188)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus BCRC13869)；
(2)该组合物可进一步包含药学上可接受的载剂、赋形剂、稀释剂、辅剂等；
(3)该Pm-1中的各益生菌的浓度为109CFU/mL；
(4)该Pm-1中各益生菌的组成比例为:40-60%的胚芽乳酸杆(Lactobacillusplantarum BCRC12251)、20-30%的副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracaseiBCRC12188)、20%-30%的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus BCRC13869)；
(5)该Pm-1益生菌组合物可用于清除血液中的亲蛋白质尿毒素。
2.益生菌清除尿毒素的效果
(1)单一菌株清除indoxyl sulfate的效果:
从12种不同的活化后菌液(其中12251及12188号菌株，为实施例一中对尿毒素清除效果较佳的菌株)中，各取100μl，分别接种于含不同尿毒素的培养基，并在0小时、48小时及96小时取样，将菌液样本以12000rpm离心5分钟后，取上清液并经0.22μm孔径的过滤膜(Pall，NY,USA)过滤。无益生菌但是含indoxyl sulfate的MRS培养液做为正对照组;益生菌培养于不含indoxyl sulfate的MRS培养液做为负对照组(NC,negative control)。
将上述的0小时、48小时及96小时取样的样品以HPLC进行indole的分析；样品经HPLC分析并换算之后的结果如表六所示，其中以各组的0小时样品当作初始浓度，再分别计算48及96小时的清除率，结果发现菌株EF、12188、12251以及13869对于硫酸吲哚酚(Indoxyl sulfate)具有较佳的清除率。
表六Indoxyl sulfate的清除率
NC*:负对照组(negative control)。
(2)混合菌株清除indoxyl sulfate的效果:
图2为单一菌株12188、12251、13869及EF和混合菌12251+12188、12251+EF、12188+EF及12251+12188+13869清除IS效果的比较图；其中以各组的0小时样品当作indoxyl sulfate的初始浓度，再分别计算48及96小时的清除率，结果发现12251+12188+13869及12251+EF有最佳清除indoxylsulfate的效果。
实施例四
阿乐癌注射液(Cisplatin)诱发急性肾脏炎大鼠实验
1.使用的混合益生菌组合物:
将体外试验筛选出来的两组具有较佳indoxyl sulfate清除率的混合益生菌，以Cisplatin诱发的急性肾脏炎动物模式验证其功效；表七所示为前次体外实验中具有较佳indoxyl sulfate清除率的混合益生菌组合物，可分为probioticmix-1(Pm-1)以及probiotic mix-2(Pm-2)。
表七混合益生菌组合物:
2.动物实验:
以14周龄的公SD大鼠为实验对象，连续喂食SD大鼠5天混菌，并于喂食混菌的第二天以腹腔注射Cisplatin(10mg/kg大鼠体重)，来引起大鼠的肾脏受损，然后每两天抽一次血，测量血液中indoxyl sulfate的浓度及血液肾功能生化值；腹腔注射后4天，从大鼠体内取出肾脏，进行组织切片，及测量各器官的indoxyl sulfate的浓度。
实验共分为5个试验组:
(1)控制组:未注射Cisplatin，仅注射磷酸盐缓冲溶液(phosphate-bufferedsaline,PBS)的大鼠；
(2)正对照组:注射Cisplatin，但未喂食益生菌组合物的大鼠；
(3)试验组1:注射Cisplatin，且喂食益生菌组合物12251+12188+13869(probiotic mix-1)的大鼠;
(4)试验组2:注射Cisplatin，且喂食混菌12251+EF(probiotic mix-2)的大鼠；
(5)若元锭:注射Cisplatin，且喂食若元锭的大鼠。
详细动物实验的流程请参照图3。
3.实验结果:
(1)体重变化(见图四4):
在四天的实验期后，施打PBS的控制组的体重相较于实验起始前并无显著变化(98.43±6.39%)，而施打Cisplatin的试验组的体重则是有显著的下降(88.33±4.77%:p<0.01)；且接受若元锭(86.39±4.23%)、pm-l(86.39±8.98%)与pm-2(86.65±2.27%)喂食的大鼠，则是无法回复因施打Cisplatin所造成的体重下降。
(2)血清及尿液中的indoxyl sulfate浓度(见图5):
接受Cisplatin注射的大鼠的血清indoxyl sulfate浓度可达395.51±184.55μg/mL，由此可以得知该急性肾损伤的动物模式已被完整的建立;在实验组中，仅有得到pm-1益生菌组合物喂食的大鼠，其体内因为急性肾损伤所致的高indoxyl sulfate浓度(130.69±68.07μg/mL;p<0.05)，有观察到显著的下降；而在接受若元锭与pm-2益生菌组合物喂食的大鼠身上，虽然可以观察到血清中indoxyl sulfate浓度的下降趋势，但在统计上并无显著的差异。
与正常小鼠相比较，急性肾损伤大鼠，其尿液中的indoxyl sulfate浓度并未显著增加，但有趣的是接受若元锭与pm-1喂食大鼠的尿液indoxylsulfate浓度，皆高于控制组以及正对照组；但由于个体间的差异大，因此并无统计上的显著差异;而喂食pm-2的大鼠，其尿液indoxyl sulfate浓度则无影响。
(3)脏器IS浓度(见图6):
在经Cisplatin注射所致的急性肾损伤的大鼠上，可以观察到其肾脏以及肝脏中累积的indoxyl sulfate量显著高于控制组(p<0.05)；虽然喂食pm-l与pm-2可以降低急性肾损伤所致的肾脏与肝脏中的indoxyl sulfate累积，但由于大鼠个体差异大，标准偏差大，因此与正对照组无显著差异。
(4)血液生化值分析(见图7):
A.血液尿素氮(图7A)
血液尿素氮为临床上最常使用的肾功能指针之一，当肾脏排除毒素的功能受损时，血液尿素氮会因为无法排除而累积于体内。于本实施例中可见Cisplatin处理后的急性肾损伤大鼠的血液尿素氮浓度，有显著的增加(177.75±34.06mg/dL;p<0.005);但是Pm-1、Pm-2及若元锭，皆无法降低大鼠体内因急性肾损伤所致的高血液尿素氮浓度。
B.肌酸酐(图7B)
肌酸酐也为临床上最常使用的肾功能指针之一，可反应肾丝球的受损情形；于本实施例中可见Cisplatin处理后的急性肾损伤大鼠的肌酸酐浓度，有显著的增加(4.45±1.16mg/dL;p<0.01);但是Pm-1、Pm-2及若元锭，皆无法降低大鼠体内因急性肾损伤所致的高肌酸酐浓度。
C.尿酸(图7C)
肾脏代谢功能失常时，会引起尿酸在体内的蓄积；于本实施例中，各处理组间皆无显著的差异(p>0.05)。
D.钙(图7D)
肾脏若是调节电解质的功能受损时，有时会造成低钙血症；但是于本实施例中所使用的急性肾损伤动物模式中，并无观察到低钙血症的发生;相反的，可以观察到血钙浓度有显著的提升(p<0.05)，由此可以推知，注射Cisplatin会造成肾脏调节电解质的改变，但不会造成低钙血症；而在试验组中，喂食pm-l及pm-2益生菌组合物，可降低因急性肾损伤所造成的血钙浓度升高，且pm-2可显著的降低因急性肾损伤所造成的血钙浓度升高(p<0.05)。
E.镁(图7E)
临床上在急性肾衰竭恢复期时会进入多尿期，而在此时会发生低镁血症；在本实施例中，注射Cisplatin后并无出现低镁血症，显示尚未进入急性肾损伤的多尿期；且各处理组间，彼此皆无显著差异，唯喂食若元锭的大鼠，具有较高的血镁浓度，但并无统计上显著的差异(p>0.05)。
F.血氨(图7F)
血氨浓度的异常升高，在临床上主要是与肝脏及代谢疾病有关，而低血氨则是与高血压及一些药物的使用相关；在本实施例中发现，Cisplatin会引起低血氨的现象;而若元锭(p<0.05)以及pm-l(p<0.01)益生菌组合物，则可以显著回复因cisplatin所致的低血氨现象；然而喂食pm-2益生菌组合物的大鼠，则无观察到显著的差异。
(5)尿液分析(图8)
A.尿胆红素
尿中若测得胆红素则代表有肝脏疾病、胆管阻塞以及肾小球严重受损等疾病；本实施例中，控制组与各处理组皆未检出尿胆红素，因此代表各处理组大鼠的肝脏与胆囊皆未受损。
B.尿胆素元
尿胆素元的升高代表有肝脏疾病或胆管阻塞等疾病；本实施例中，控制组与各处理组的尿胆素元值皆在正常范围内，因此代表各处理组大鼠的肝脏与胆囊皆未受损。
C.亚硝酸盐
当泌尿道感染时，细菌会将硝酸盐还原为亚硝酸盐；本实施例中，控制组与各处理组皆未检测出亚硝酸盐，因此代表各处理组的大鼠，皆无发生泌尿道感染。
D.尿葡萄糖(图8A)
当肾脏受损时，尿中会测得葡萄糖的增加；如图7A所示，当以Cisplatin引起大鼠的急性肾毒性时，尿中葡萄糖量会增加；但是，不管是喂食若元锭或是益生菌组合物，皆无法降低因Cisplatin所增加的尿中葡萄糖。
E.尿蛋白(图8B)
肾脏的受损，尤其是肾丝球或肾小管的病变与受损，皆会造成尿蛋白的增加；如图7B所示，Cisplatin会引起尿蛋白量的增加;且喂食若元锭或是益生菌组合物，皆无法降低由Cisplatin所引起的尿蛋白增加。
F.pH值(图8C)
在临床上，饮食或是肾脏发炎会引起尿中pH值的降低；本实施例中，Cisplatin会引起尿中pH值的降低；且pm-2益生菌组合物可回复，因Cisplatin所造成的尿中pH值降低，但在统计上并无显著的差异;而其它处理组则是无影响。
G.尿比重(图8D)
尿比重会因肾脏疾病、肾脏髓质受损、尿崩症与过多水分摄取而降低;会因脱水或利尿剂的处理而升高；但是在本实施例中，控制组与所有处理组的尿比重皆无差异。
H.尿血(图8E)
肾脏与泌尿系统的疾病或是发炎皆可造成尿中测得血液的存在；本实施例中，可以观察到若元锭以及pm-2益生菌组合物可显著(p<0.05)降低由Cisplatin所引起的尿血。
I.尿白血球(图8F)
尿中白血球的成因，可能是由肾脏与泌尿系统受到感染或是由毒物造成的肾间质受损所引起的；本实施例中，若元锭或是益生菌组合物，皆无法降低由Cisplatin所造成的尿白血球增加。
J.酮体(图8G)
在临床上，尿中酮体的升高，可由禁食过久、酒精性或糖尿病所引起的酮酸中毒及甲状腺机能亢进与发烧等所造成；本实施例中发现，Cisplatin可升高尿中酮体量，而若元锭与pm-2益生菌组合物，则可回复由Cisplatin所造成的尿酮体增加，但在统计上并无显著的差异;而在其它处理组则是无影响。
4.结论:
(1)Cisplatin:
由腹腔注射Cisplatin所引起的肾脏受损，会显著降低大鼠体重，并显著提升血液中、肾脏及肝脏IS的浓度，以及显著增加血液中尿素氮、肌酸酐和尿酸浓度，同时减少血氨含量，此外，也会显著增加尿液中尿葡萄糖、尿蛋白、pH值、尿血、尿白血球及酮体浓度。
(2)Pm-1益生菌组合物:
可以显著降低因肾脏受损所引起的血液indoxyl sulfate浓度的增加，增加尿液中indoxyl sulfate排出浓度，并具有降低肾脏及肝脏中indoxyl sulfate浓度的趋势；此外，也可以显著的回复因Cisplatin所致的低血氨现象，及降低因急性肾损伤所造成的血钙浓度升高。
(3)Pm-2益生菌组合物:
虽无法降低因肾脏受损所引起血液indoxyl sulfate浓度的增加，但是仍显示出具有降低肾脏及肝脏中indoxyl sulfate浓度的趋势，并且可以显著降低因肾脏受损所引起的尿血，此外，也可回复由Cisplatin所造成的尿酮体增加，及显著降低因急性肾损伤所造成的血钙浓度升高。
由上述实施例可知，本发明所制成的Pm-1益生菌组合物，可以有效的清除尿毒素，且该尿毒素特别指的是亲蛋白质尿毒素，如:indoxyl sulfate、p-cresylsulfate和phenol；此外，Pm-1还可有效降低因肾脏受损所引起的血液indoxylsulfate浓度的增加、增加尿液中indoxyl sulfate排出浓度，并可以降低肾脏及肝脏中的indoxyl sulfate浓度；除上述优点外，和其他既有的清除尿毒素的方法，该Pm-1益生菌组合物也具有制备容易、使用简易、低成本和高经济效益的优点。
上述实施例及图式仅为本发明的较佳实施例而已，当不能以之限定本发明实施的范围，即大凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利涵盖的范围内。
综上所述，本案所提供的一种使用益生菌制备用于清除尿毒素的组合物的用途确属创新，并能较现有的清除尿毒素的方法增进上述多项功效，应已充分符合新颖性及进步性的法定发明专利要件，故依法提出申请，恳请贵局核准本件发明专利申请案，以鼓励发明。

Claims (8)

1.一种益生菌株在制备清除尿毒素组合物的应用，其特征在于，该益生菌选自以下群组:胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum BCRC12251)、副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei BCRC12188)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus BCRC13869)的任一组合，及药学上可接受的载剂、赋形剂、稀释剂、辅剂等。 
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述尿毒素为亲蛋白质尿毒素(protein-bound uremic toxins)。 
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述亲蛋白质尿毒素(protein-bound uremic toxins)为硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate)、对甲酚(p-cresol)或酚(phenol)。 
4.一种用于清除尿毒素的益生菌组合物，其特征在于，所述组合物包括：胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum BCRC12251)、副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei BCRC12188)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles BCRC13869)，及药学上可接受的载剂、赋形剂、稀释剂、辅剂等。 
5.根据权利要求4所述的益生菌组合物，其特征在于，所述尿毒素为亲蛋白质尿毒素(protein-bound uremic toxins)。 
6.根据权利要求5所述的益生菌组合物，其特征在于，所述亲蛋白质尿毒素(protein-bound uremic toxins)为硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate)、对甲酚 
(p-cresol)或酚(phenol)。 
7.根据权利要求4所述的益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌的浓度为107-1010CFU/mL。 
8.根据权利要求4所述的益生菌组合物，其特征在于，所述胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum BCRC12251)之含量为40-60%、副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei BCRC12188)的含量20-30%、嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus BCRC13869)的含量为20%-30%。 
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