CN113262242B - 一种乳双歧杆菌jybr-190在排除体内重金属产品中的应用 - Google Patents
一种乳双歧杆菌jybr-190在排除体内重金属产品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种乳双歧杆菌JYBR‑190在排除体内重金属产品中的应用，该乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)JYBR‑190于2019年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCC NO.18092。该菌株JYBR‑190为益生菌，且该菌株通过调整人体菌群平衡，使得在将其应用于排除体内毒素时，具有高效、安全、无毒副作用的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物应用技术领域，具体涉及一种乳双歧杆菌JYBR-190在排除体内重金属产品中的应用。
背景技术
重金属是一类对人体具有严重毒害的金属元素，主要对机体的组织脏器、神经系统可造成严重损害，研究表明，血铅超标可导致胎/婴幼/少儿的神经系统和智力发育受阻，造成智商的明显下降。重金属元素砷以化合物形式广泛存在于地表、水、大气、土壤、食物及生物体内；汞可以离子形式存在于机体当中，导致机体消化功能紊乱、对食物的吸收率下降，进而使体重降低；另外，汞还可随着血液循环流经全身各处，并蓄积于肝脏等靶器官，损伤肝组织，汞还可参与自由基链式反应，产生大量自由基，这些自由基可结合体内 GSH-Px、SOD 的中心作用位点，改变酶活性位点，导致抗氧化活性丧失，最终导致机体产生氧化损伤及脂质过氧化物和大量丙二醛累积。可见，无论是职业接触还是环境污染，重金属都可对人类产生一定的危害。
目前用于治疗铅中毒的药物主要是螯合型驱铅剂，例如：二巯基丁二酸钠（NaDMS）、依地酸钙钠（Na2Ca-EDTA）、钙促排灵（Ca-DTPA）等，螯合型驱铅剂的作用原理是通过巯基或羧基等形成配位化合物来达到驱铅目的，然而这些药物在临床应用存在一定的副作用，如依地酸钙钠长期使用后排毒率下低，且部分患者会出现短暂的头晕、关节酸痛、腹痛、恶心、乏力等症状；在大剂量使用时患者会出现肾小管水肿等损伤。目前对急性汞中毒的临床治疗，一般是采用金属离子螯合剂二巯基丙磺酸钠（DMPS），此药物虽能与汞离子结合，但其在体内还会同时结合Ca2+、Zn2+等有益金属离子，造成体内有益金属离子的流失，导致金属离子的稳态失衡，进而影响身体健康；临床治疗最常使用的排砷药物是巯基类药物，但这种药物使用时需要住院治疗，且该药物的不良反应较多，导致许多砷中毒的患者不能积极地进行排砷治疗。
体内微生物是一个平衡、稳定的生态系统，在重金属进入人体后，会抑制微生物的生长繁殖，使得人体代谢发生紊乱；药物治疗虽然具有一定的改善作用，但是也不可避免的会对人体产生毒副作用，因此，随着人们健康意识的增强，对药物使用安全的关注度也越来越高，因此，提供一种价廉、高效、无不良反应且能适用于大多数患者的治疗药物具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明提供了一种乳双歧杆菌JYBR-190在排除体内重金属产品中的应用，该菌株 JYBR-190于2019年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.18092；该菌株 JYBR-190为一株益生菌，使用后可调节人体菌群平衡，因此，在将其应用于排除体内毒素时，具有高效、安全、无毒副作用的优点。
本发明的技术方案如下：
一株乳双歧杆菌JYBR-190，该菌株 JYBR-190于2019年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCC NO.18092。
上述乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)JYBR-190分离自新疆伊犁州牧民家里自然发酵的酸奶。
使用上述乳双歧杆菌JYBR-190制备菌粉的方法为：
（1）将乳双歧杆菌JYBR-190接种到MRS液体培养基中，在37℃条件下，厌氧培养24小时，获得MRS菌液；
（2）将MRS菌液进行离心、洗涤，然后重悬，调整浓度为1.0-2.0×1010cfu/mL，冻干，获得冻干粉；
（3）将冻干粉与低聚异麦芽糖混合，获得菌粉。
优选的，在步骤（1）中，所述MRS液体培养基包括蛋白胨 10g、牛肉粉 5g、长歧杆菌粉4g、K2HPO4·7H2O 2g、柠檬酸三铵2g、三水醋酸钠 5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·4H2O 0.05g、蒸馏水 1000mL。
优选的，在步骤（1）中，所述乳双歧杆菌JYBR-190接种于MRS液体培养基中的接种量为1%。
将上述菌粉在排除体内毒素的产品中进行应用，具有安全、高效、无毒副作用的优点。
进一步的，所述重金属为铅、汞、砷中的一种或多种组合。
进一步的，所述菌粉中的活菌数为50亿/g、150亿/g、250亿/g、500亿/g或1000亿/g。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供的乳双歧杆菌JYBR-190，为益生菌，分离自新疆伊犁州牧民家里自然发酵的酸奶，该菌株 JYBR-190于2019年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCCNO.18092。
2、乳双歧杆菌JYBR-190，能够有效排除体内毒素，尤其对重金属毒素，效果更为显著；且该菌株能够拮抗铅的致死效应，有效提高铅中毒的存活率。结合实施例结果可以看出，随着剂量增加，存活率显著提高。
3、乳双歧杆菌JYBR-190，能够降低慢性铅中毒中的铅含量；对慢性汞中毒具有良好的排除效果且具有修复受损肝脏的效果；可有效控制机体的血砷水平，使砷随尿液排除。
附图说明
图1为试验例1中JYBR-190小鼠血液中汞含量的影响；与空白组相比，#:P＜0.05；与模型组相比，*:P＜0.05。
图2为试验例1中JYBR-190小鼠肝脏中汞含量的影响；与空白组相比，#:P＜0.05；与模型组相比，*:P＜0.05。
图3为试验例1中JYBR-190小鼠肝脏中ALT含量的影响；与空白组相比，#:P＜0.05；与模型组相比，*:P＜0.05。
图4为试验例1中JYBR-190小鼠肝脏中AST含量的影响；与空白组相比，#:P＜0.05；与模型组相比，*:P＜0.05。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种乳双歧杆菌JYBR-190，该菌株 JYBR-190的筛选过程如下：
（1）MRS平板培养基制备：蛋白胨10g、牛肉粉5g、长歧杆菌粉4g、K2HPO4·7H2O 2g、柠檬酸三铵2g、三水醋酸钠5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·4H2O0.05g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，混匀后，于121℃条件下灭菌20min，放凉，待用；
（2）菌株的分离和鉴定：
1）无菌条件下称取新疆伊犁州牧民家里自然发酵酸奶5g，将酸奶加入到45mL含有玻璃珠的浓度为0.85%的灭菌生理盐水中，混合均匀，制得母液；
2）在转速为1500转/分钟的条件下将母液振荡10分钟，然后在无菌条件下取1mL母液按10倍梯度进行稀释，形成稀释液；选择10-7、10-8、10-9三个梯度的稀释液，待用；
3）取0.1mL 10-7、10-8、10-9的稀释液，采用涂布法分别涂布到MRS平板培养基上，涂抹均匀，每个稀释度的稀释液做两份，同时以生理盐水做空白对照组；平板倒置于厌氧培养罐中37℃培养72h，观察菌落形态；聚落形态大且呈乳白色，即可初步判定为乳双歧杆菌；命名为JYBR-190；
4）利用基因组DNA试剂盒提取JYBR-190的基因组DNA，然后进行PCR扩增16srDNA片段，引物序列为：27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，得到扩增产物；随后将扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，通过测序检测16SrDNA的全长，在Eztaxon数据库进行Blast比对，进行同源性比较，该菌种属于双歧杆菌属（Bifidobacterium），为动物双歧杆菌乳亚种，其分类单元为：Bacteria;Actinobacteria;Bifidobacteriales;Bifidobacteriaceae;Bifidobacterium.，该菌株JYBR-190于2019年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCC NO.18092。
实施例2
乳双歧杆菌JYBR-190菌粉的制备过程如下：
（1）从实施例1的MRS平板上挑取新培养的乳双歧杆菌JYBR-190单菌落，接种于MRS液体培养基中，接种量为1%，在37℃条件下培养24h，获得菌液；
其中，MRS液体培养基包括蛋白胨 10g、牛肉粉 5g、长歧杆菌粉4g、K2HPO4·7H2O2g、柠檬酸三铵2g、三水醋酸钠 5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·4H2O 0.05g、蒸馏水 1000mL；
（2）采用无菌操作方式，将菌液经过离心、无菌生理盐水洗涤以后，重新悬浮于10%(w/w)无菌复原脱脂乳中，调整其浓度为1.0×1010cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液经过冷冻干燥后，获得冻干粉；
（3）将冻干粉与低聚异麦芽糖混合，获得菌粉。
将上述冻干粉与低聚异麦芽糖按照1:1的质量比混合，获得活菌数为50亿/g的菌粉；
采用上述菌粉的制备方法及菌粉与低聚异麦芽糖的混合方法，分别制备活菌数为150亿/g、250亿/g、500亿/g、1000亿/g的菌粉。
低聚异麦芽糖：购自保龄宝生物股份有限公司。
试验例1：乳双歧杆菌JYBR-190在排重金属方面的应用
（一）乳双歧杆菌JYBR-190排铅的作用
1 实验方法
1.1 不同剂量的乳双歧杆菌JYBR-190对铅致死效应的拮抗作用
将60只雄性昆明种小鼠，体重范围为35±5.0g，随机分为6组，每组10只，分为空白对照组、模型组、JYBR-190低剂量组（5×107cfu/mL)、JYBR-190中剂量组（5×108cfu/mL)、JYBR-190高剂量组（5×109cfu/mL)，阳性对照组（依地酸二钠钙75mg/kg体质量剂量每天肌内注射）；低中高剂量组的 JYBR-190由实施例2中的菌粉溶于生理盐水制成。
小鼠处理：除空白对照组小鼠外，其余组分别腹腔注射1mmoL Pb/Kg (LD50=0.65mmol Pb/Kg)，隔天注射一次；共注射20次；每次腹腔注射4h后，其余各组按照分组灌胃，同时空白对照组与模型组灌胃等量的生理盐水，胃管注入为0.01mL/g体重。观察40d，记录各组动物的存活数，计算存活率，结果见表1。
表1 急性铅中毒后给药 JYBR-190后小鼠存活率
由表1可知，小鼠腹腔注射醋酸铅造成急性铅中毒后，在灌胃不同剂量的 JYBR-190菌液后，模型组小鼠全部死亡，JYBR-190给药组均可提高小鼠的存活率，且存活率呈剂量依赖性，其中，JYBR-190高剂量组的小鼠存活率最高。
1.2 乳双歧杆菌JYBR-190对小鼠组织铅移动的影响
按照1.1分组处理小鼠，其中小鼠腹腔注射醋酸铅10mg/kg隔日一次，共 10次。各实验组小鼠均饮用无铅水，所有小鼠均于最后一次给药后24h，脱颈处死。解剖后，取肝、肾、左右两侧股骨样品称重后，放入适量浓硝酸，随后室温下放置过夜；然后向浓硝酸中加入体积比为1:3的高氯酸与硝酸的混合液，在 120℃电热板上消化完全；冷却样本后，用2% HNO3定容于10mL容量瓶中，用原子吸收分光光度计测定样本的铅含量，结果表2，如下：
表2 给药JYBR-190后慢性铅中毒小鼠组织铅含量
与模型组相比，*:P＜0.01。
由表2可知，灌胃JYBR-190菌液的小鼠，其肝、肾、骨的铅含量显著低于模型组(P＜0.01)，且三种剂量中，以高剂量组的JYBR-190使小鼠组织铅含量降低最为显著，与阳性对照组效果接近，这说明 JYBR-190菌液有驱铅作用，且驱铅效果呈剂量依赖性。
（二）乳双歧杆菌JYBR-190排汞的作用
1 方法
1.1 动物分组与模型建立
动物分组：将60只雄性昆明种小鼠，体重范围为35±5.0g，随机分为6组，每组10只，分为空白对照组、模型组、JYBR-190低剂量组（5×107cfu/mL)、 JYBR-190中剂量组（5×108cfu/mL)、JYBR-190高剂量组（5×109cfu/mL)和阳性对照组（DMOS 0.8mg/kg）；
模型建立：除空白组小鼠外，其余各实验组小鼠每日自由饮用含50 nmol/L HgCl2的去离子水溶液，28d构建慢性汞中毒小鼠模型，同时各组小鼠每日在同一时间灌胃给药28d；其中，阳性对照组和JYBR-190低、中、高剂量组按照分组灌胃，空白对照组与模型组灌胃等量的生理盐水，胃管注入为0.01mL/（g体重）。
1.2 指标检测
在末次灌胃给药后，小鼠禁食24h，称量体质量，每组随机抽取5 只小鼠，摘眼球取血分离血清，测定各组小鼠血清中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)与谷草转氨酶( aspartate transaminase， AST）的水平，并称取肝脏组织质量，然后按下式计算肝脏脏器系数，双道原子荧光光度计测定Hg2＋含量；每组剩余小鼠取全血肝素钠抗凝，测定Hg2 ＋含量，算式为：
肝脏脏器系数（%）=m1/m×100
式中，m1为肝脏鲜质量，单位：g；
m为小鼠体质量，单位：g。
将检测结果进行统计，见表3，同时参照图1、图2、图3和图4，对小鼠的血液中汞含量、肝脏中汞含量、肝脏中ALT含量、肝脏中AST含量进行分析，如下，
表3 JYBR-190对小鼠体质量和肝脏指数的影响
与同指标模型组相比，*p＜0.05
由表3可知，模型组小鼠体质量显著低于空白组（P＜0.05），除 JYBR-190低剂量组外，各灌胃给药组小鼠体质量与空白组无显著差异（P＞0.05）。比较各组肝脏系数，小鼠经慢性汞中毒建模后，模型组小鼠肝脏湿质量及脏器系数指标相较空白组显著升高（P＜0.05）。灌胃JYBR-190后，相较于模型组小鼠，各灌胃给药组小鼠肝脏脏器系数均在不同程度下下降，且呈一定的剂量依赖性关系，其中阳性对照组及 JYBR-190高剂量组小鼠肝脏脏器系数接近正常组小鼠，综合比较各组小鼠肝脏脏器系数，JYBR-190高剂量组对小鼠肝脏脏器系数的改善效果最佳。
如图1-图2所示，模型组小鼠血液及肝脏汞含量显著高于空白组（P＜ 0.05），这说明汞进入机体内可稳定存在于血液及肝脏组织当中，不易被排除。经JYBR-190灌胃给药后，各给药组小鼠血液及肝脏中的汞含量较模型组显著下降（P＜0.05），且JYBR-190对降低血液及肝脏中汞含量的作用效果呈剂量依赖性，随着剂量升高排汞作用增强，高剂量组对降低血液及肝脏汞含量的作用效果显著优于其他剂量组（P＜0.05）。阳性对照组小鼠血液汞含量与JYBR-190中高组无显著性差异（P＞0.05），DMPS降低肝脏汞含量的作用效果与JYBR-190低中高剂量组无显著性差异（P＞0.05）。
如图3-图4所示，与空白组小鼠比较，模型组小鼠经汞染毒后血清中ALT、 AST的活力显著升高（P＜0.05），灌胃给药后，各给药组小鼠血清AST、 ALT活力较模型组显著下降（P＜0.05），且JYBR-190对两项肝功能指标的改善作用呈剂量依赖性，其中，JYBR-190高剂量给药对降低肝功能指标的效果最佳。阳性对照组对慢性汞中毒小鼠肝功能指标改善的作用效果与JYBR-190中、高剂量无显著性差异（P＞0.05）。
（三）乳双歧杆菌JYBR-190排砷的作用
1.1 动物分组与模型建立
动物分组：将60只雄性昆明种小鼠，体重范围为35±5.0g，随机分为6组，每组10只，分为空白对照组、模型组、JYBR-190低剂量组（5×107cfu/mL)、JYBR-190中剂量组（5×108cfu/mL)、JYBR-190高剂量组（5×109cfu/mL)和阳性对照组（二巯基丙磺酸钠，DMPS 5mg/kg）；
模型建立：除空白对照组外，各实验组小鼠腹腔注射亚砷酸钠2mg/kg，对照组注射等量生理盐水，每周连续5d，每天一次，共4周；JYBR-190低、中、高剂量组按照分组灌胃给药，每天早上8点给药，连续6周；对照组、模型组灌胃等量的生理盐水。阳性对照组小鼠肌肉注射5mg/kg的DMPS注射液，用药3d、停药4d为1个周期。
1.2 指标与方法
1.2.1 一般情况
实验期间观察小鼠的饮食饮水、皮毛、精神状态、排泄物等，每周称重1次。
1.2.2 尿砷与血砷测定
分别在染砷前和染砷后的第7、14、21、28d及停砷后的第7、14d的同一时间段，收集6h后的膀胱尿液，并记录尿量，采用二乙基二硫代氨基甲酸银比色法（DDC－Ag）测定小鼠尿砷含量。在染砷后的第14、28d及停砷后14d眼眶取血，用AFS-930双道原子荧光光度计测定血砷含量，结果见表4，
表4 JYBR-190对小鼠不同时间段尿砷的影响
注：与空白对照组比较，#:P＜0.01；与模型组比较，*:P＜0.05，**:P＜0.01
实验期间各组小鼠精神状况良好，皮毛光泽、消化功能及行为能力等未出现任何不良症状，无小鼠死亡；不同时段各实验组间小鼠体重差异不明显。各组小鼠解剖无可见病变，脏器系数差异不明显。
由表4可知，与空白对照组比较，各时段模型组小鼠尿砷含量均升高（P＜0.01）；在染砷21d之后，与模型组比较，JYBR-190中高剂量组小鼠的尿砷含量均升高，染砷28d至停砷7d时，JYBR-190高剂量组小鼠尿砷含量显著高于模型组（P＜0.05）；初步说明高剂量的JYBR-190的排砷作用与DMPS相近。
对小鼠染砷前、染砷14d、28d及停砷14d血液中的砷含量进行测定，见表5，如下，
表5 JYBR-190对小鼠不同时间段血砷的影响
注：与空白对照组比较，#:P＜0.01；与模型组比较，*:P＜0.05。
由表5可知，与空白对照组相比，模型组血砷含量显著升高，（P＜0.01）。停止染砷后血砷含量均有下降，停砷14d时，JYBR-190高剂量组小鼠血砷含量显著低于模型组（P＜0.05），与阳性对照组差异无统计学意义（P＞0.05），这说明高剂量的JYBR-190的排砷作用与DMPS相近。
尽管通过参考优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。
序列表
<110>山东中科嘉亿生物工程有限公司
<120>一种乳双歧杆菌JYBR-190在排除体内重金属产品中的应用
<160> 3
<170>SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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序列表
<110> 山东中科嘉亿生物工程有限公司
<120> 一种乳双歧杆菌JYBR-190在排除体内重金属产品中的应用
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)
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Claims (8)
1.一种乳双歧杆菌JYBR-190在制备排除体内重金属产品中的应用，其特征在于，乳双歧杆菌JYBR-190菌粉在制备排除体内重金属产品中的应用；
该菌株于2019年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCC NO.18092。
2.如权利要求1所述的乳双歧杆菌JYBR-190在制备排除体内重金属产品中的应用，其特征在于，所述重金属为铅、汞、砷中的一种或多种组合。
3.如权利要求1所述的乳双歧杆菌JYBR-190在制备排除体内重金属产品中的应用，其特征在于，所述菌粉的制备过程为：
（1）将乳双歧杆菌JYBR-190接种到MRS液体培养基中，在37℃条件下，厌氧培养24小时，获得MRS菌液；
（2）将MRS菌液进行离心、洗涤，然后重悬，调整浓度为1.0-2.0×1010cfu/mL，冻干，获得冻干粉；
（3）将冻干粉与低聚异麦芽糖混合，获得菌粉。
4.如权利要求3所述的乳双歧杆菌JYBR-190在制备排除体内重金属产品中的应用，其特征在于，在步骤（1）中，所述MRS液体培养基包括蛋白胨10g、牛肉粉5g、长歧杆菌粉4g、K2HPO4•7H2O 2g、柠檬酸三铵2g、三水醋酸钠5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、MgSO4•7H2O 0.2g、MnSO4•4H2O 0.05g、蒸馏水 1000mL。
5.如权利要求3所述的乳双歧杆菌JYBR-190在制备排除体内重金属产品中的应用，其特征在于，在步骤（1）中，所述乳双歧杆菌JYBR-190接种于MRS液体培养基中的接种量为1%。
6.如权利要求3所述的乳双歧杆菌JYBR-190在制备排除体内重金属产品中的应用，其特征在于，在步骤（3）中，菌粉中的活菌数为50亿/g、150亿/g、250亿/g、500亿/g或1000亿/g。
7.如权利要求6所述的乳双歧杆菌JYBR-190在制备排除体内重金属产品中的应用，其特征在于，所述产品为药品。
8.如权利要求1所述的乳双歧杆菌JYBR-190在制备排除体内重金属产品中的应用，其特征在于，该乳双歧杆菌JYBR-190分离自新疆伊犁州牧民家里自然发酵的酸奶。
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| 鼠李糖乳杆菌GG株对铅中毒子代鼠的保护作用;冷星宇等;《实用医学杂志》;20190525(第10期);全文 * |
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