CN104031856B - 干酪乳杆菌及其应用以及功能食品组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），其特征在于，所述干酪乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.6276。本发明还提供了一种功能食品组合物及其制备方法，该方法包括：将本发明提供的干酪乳杆菌的菌体添加到食物中。本发明还提供了如上所述的干酪乳杆菌在制备具有通便功能的功能食品组合物中的应用。本发明提供的干酪乳杆菌具有良好的通便功效。
Description
技术领域
本发明涉及一种干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）及其应用以及一种功能食品组合物及其制备方法，具体地，涉及一种干酪乳杆菌，含有该干酪乳杆菌的功能食品组合物及其制备方法，以及该干酪乳杆菌在制备具有通便功能的功能食品组合物中的应用。
背景技术
在多种肠道疾病中，慢性便秘是影响人群最多、范围最广，但也是最不为人所重视的。在西方国家中慢性便秘是主要的健康问题之一，患病人群达到了30%，单单美国每年就会产生250万的内科门诊病人和92000的住院病人，以及高达几亿美元的泻药消费量。便秘是消化系统常见的病症，在过去并不为人们所重视，在许多医学书籍中，仅作为一种内脏的症状加以介绍。而在治疗方面，只局限于“头痛医头，脚痛医脚”，因此疗效不佳。
大多数便秘患者属单纯的功能性便秘，即由于排便反射失常或阻塞引起的直肠性便秘以及结肠蠕动缓慢引起的结肠性便秘。近年来，功能性便秘已经作为一种独立性疾病出现，对这类便秘的研究和医疗实践进展较快。研究表明，通过口服益生菌，对肠道菌群结构进行平衡和调节，可带来显著的通便效果。
干酪乳杆菌是人体肠道内定植的固有益生菌，是一类发酵碳水化合物并产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌，能够耐受胃酸和胆汁，并可以黏附于肠黏膜而阻止病原微生物的黏附、具有生物屏障、整肠、降低胆固醇、抗癌和增强机体免疫力等多种保健功能。干酪乳杆菌在肠道中通过代谢产生的乳酸，能有效抑制有害细菌的生长和繁殖，维持肠道的生态平衡和正常机能；并能增加肠道的蠕动，作用温和自然，增加粪便含水率，具有润肠通便的作用，对维持胃肠道的正常生理功能具有重要的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有通便作用的干酪乳杆菌。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei），其中，所述干酪乳杆菌的保藏编号为CGMCCNo.6276。
第二方面，本发明提供了一种制备功能食品组合物的方法，其中，所述方法包括：将本发明提供的干酪乳杆菌的菌体添加到食物中。
第三方面，本发明提供了一种由如上所述的方法制备的功能食品组合物。
第四方面，本发明提供了如上所述的干酪乳杆菌在制备具有通便作用的功能食品组合物中的应用。
本发明提供的干酪乳杆菌的活菌体、死菌体以及活菌体和死菌体的混合菌体均具有通便的功效。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏
本发明的干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei），于2012年6月25日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）（保藏单位的缩写为CGMCC），保藏编号为CGMCCNo.6276。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
一方面，本发明提供了一种干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei），其中，该干酪乳杆菌的保藏编号为CGMCCNo.6276。
本发明的干酪乳杆菌分离自广西巴马县长寿老人粪便。
本发明提供的干酪乳杆菌经过培养能够产生大量干酪乳杆菌的活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述干酪乳杆菌增殖即可，例如可以按照107CFU/mL的接种量将干酪乳杆菌的活菌体接种于乳杆菌培养基中，并且在厌氧或好氧条件下，在15-38℃的温度下培养8-72小时后，得到培养液。所述乳杆菌的培养基可以为本领域公知的各种适合乳杆菌培养的培养基，例如可以为乳汁和/或《乳酸菌——生物学基础及应用》（杨洁彬，轻工业出版社，1996年出版）中所述的乳酸菌（MRS）培养基。
本发明可以进一步分离上述培养液中的干酪乳杆菌的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。
第二方面，本发明提供了一种制备功能食品组合物的方法，其中，所述方法包括：将本发明提供的干酪乳杆菌的菌体添加到食物中。
本发明的发明人在研究中发现，无论是干酪乳杆菌的活菌体还是干酪乳杆菌的死菌体，或是干酪乳杆菌的活菌体和死菌体的混合菌体均具有良好的通便作用，因此本发明提供的制备功能食品组合物的方法包括将干酪乳杆菌的活菌体和/或死菌体添加到食物中。优选地，为了进一步增强通便效果，将干酪乳杆菌的活菌体添加到食物中。
根据本发明，所述干酪乳杆菌的死菌体的制备方法没有特别的限制，例如，可以将上述培养后的干酪乳杆菌的活菌体加热致死，也可以将其辐射致死。所述加热致死的条件可以包括：温度为65-85℃，时间为0.5-1.5h。
根据本发明，尽管将干酪乳杆菌的菌体添加到食物中，即可实现本发明的目的，即起到通便的作用，但优选情况下，以功能食品组合物的总重量为基准，所述干酪乳杆菌的菌体的添加量为105-1010CFU/g，优选为107-1010CFU/g。在上述优选情况下，功能食品组合物的通便作用更显著。
CFU（Colony-FormingUnits，菌落形成单位）指活菌个数。在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，以其表达活菌的数量。本发明中，当干酪乳杆菌的死菌体的浓度以CFU/g表示时，是指将干酪乳杆菌的活菌体致死得到相应数量的死菌体，并将其溶于缓冲液中配制成所需浓度。
本发明中，食物可以是任意类型的食物，例如果汁制品、乳制品、豆制品等。食物也可以根据食用对象的不同而有所不同。所述功能食品组合物中还可以含有常规的添加剂，例如香料、矿物质、维生素、稳定剂、增稠剂、防腐剂等。
第三方面，本发明提供了一种由如上所述的方法制备的功能食品组合物。
符合上述要求的功能食品组合物可以包括干酪乳杆菌的培养液（例如经该干酪乳杆菌发酵制得的发酵乳制品）、分离的干酪乳杆菌的菌体等。
本发明中，功能食品组合物还含有食物，食物如前所述，在此不再赘述。
第四方面，本发明提供了如上所述的干酪乳杆菌在制备具有通便作用的功能食品组合物中的应用。
以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
在下述制备例、实施例和对比例中：
实验动物：Balb/c雄性小鼠，6-8周龄，体质量18-22g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
实验菌株：干酪乳杆菌A为本发明的干酪乳杆菌（该菌株于2012年6月25日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）（保藏单位的缩写为CGMCC），保藏编号为CGMCCNo.6276）。
代田乳酸菌LCS为公认的具有良好通便功能的益生菌菌株，作为本发明的阳性对照菌株，来自养乐多公司。
实验试剂：复方地芬诺酯片（批号1109026），购自常州康普药业有限公司；活性碳粉购自巩义市嵩山滤材活性碳厂；阿拉伯树胶购自广东汕头市西陇化工厂；MRS液体培养基，购于北京奥博星生物技术有限公司；脱脂乳，购自蒙牛乳业（集团）股份有限公司。
试验仪器：高压灭菌锅：型号为ZDX35BI，购自上海申安医疗器械厂；恒温培养箱：型号为DNP9082、电热恒温鼓风干燥箱：型号为DHG-9076A，均购自上海精宏实验设备有限公司；型低温高速离心机：型号为3K30、分析天平：型号为ACCULAB，均购自德国Satorious公司。
制备例
（1）墨汁的配制：准确称取阿拉伯树胶100g，加水800mL，煮沸至溶液透明，称取活性碳（粉状）50g加至上述溶液中煮沸3次，待溶液凉后加水定容到1000mL，于冰箱中4℃保存，用前摇匀。
（2）复方地芬诺酯混悬液（0.05g/100ml及0.025g/100ml）的配制：复方地芬诺酯片，每片含复方地芬诺酯2.5mg，分别取20片、10片用研钵研碎呈粉末后加水至50ml，配制得到复方地芬诺酯混悬液C1（0.05g/100ml）和复方地芬诺酯混悬液C2（0.025g/100ml），临用前配制。
（3）干酪乳杆菌A以及代田乳酸菌LCS活菌体菌悬液的制备：将干酪乳杆菌按照107CUF/ml的接种量分别接种于500ml的MRS液体培养基中，37℃培养12h，4500r/min离心15min收集菌体，菌体沉淀重悬于质量分数10重量%的脱脂乳中，分别配制成2×105CFU/g的菌悬液B1、2×107CFU/g的菌悬液B2、2×108CFU/g的菌悬液B3、2×109CFU/g的菌悬液B4和2×1010CFU/ml的菌悬液B5，代田乳酸菌LCS配制成2×109CFU/g的菌悬液D1。
（4）干酪乳杆菌A死菌体菌悬液的制备：将干酪乳杆菌按照107CUF/ml的接种量接种于100ml的MRS液体培养基中，37℃培养12h，70℃灭活1小时，4500r/min离心15min收集菌体，菌体沉淀重悬于质量分数10重量%的脱脂乳中，配制成2×109CFU/g的菌悬液B6。
（5）干酪乳杆菌A死活混合菌体菌悬液的制备：按照（3）和（4）中的方法制备干酪乳杆菌的活菌体和死菌体，并按照1:1的质量比配制成2×109CFU/g的菌悬液B7。
以下实施例和对比例中对动物的处理方式见表1
表1
| 实施例例/对比例编号 | 第一步 | 第二步 | 第三步 |
| 实施例1-7 | 灌服本发明的菌体 | 灌服复方地芬诺酯悬浮液 | 灌服墨汁 |
| 对比例1 | 灌服脱脂乳 | 灌服蒸馏水 | 灌服墨汁 |
| 对比例2 | 灌服脱脂乳 | 灌服复方地芬诺酯悬浮液 | 灌服墨汁 |
| 对比例3 | 灌服LCS | 灌服复方地芬诺酯悬浮液 | 灌服墨汁 |
实施例1-7
实施例1-7用于说明本发明的干酪乳杆菌A的通便作用
（1）将实验动物分为7组，每组12只，体重为18-22g，分两笼饲养，每笼6只。分别给每组实验动物灌服制备例中的菌悬液B1、菌悬液B2、菌悬液B3、菌悬液B4、菌悬液B5、菌悬液B6和菌悬液B7，灌服量为0.1ml/每天每千克小鼠体重。其中，每组中的其中一笼小鼠连续灌服7d，另一笼小鼠连续灌服15d。实验期间实验动物自由饮食，12小时灯照/黑暗循环。
（2）取步骤（1）中每组连续灌服菌体7d的实验动物，对其进行禁食不禁水16小时，然后分别给其灌服10mg/千克小鼠体重的复方地芬诺酯悬浮液C1，0.5小时后再分别给其灌服0.1ml/千克小鼠体重的墨汁，之后将每只实验动物进行单笼饲养，正常饮水进食。从灌胃墨汁开始，记录每只动物排首粒黑便的时间、5h内排黑便粒数、排便总质量。将收集的粪便在105℃烘干至质量恒定，按式（1）计算粪便的含水率，结果见表2。
（3）取步骤（1）中每组连续灌服菌体15d的实验动物，对其进行禁食不禁水16小时，然后分别给其灌服5mg/千克小鼠体重的复方地芬诺酯悬浮液C2，0.5小时后再分别给其灌服0.1ml/千克小鼠体重的墨汁，25min后立即脱颈椎处死小鼠，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲肠部的肠管，置于托盘上，轻轻将小肠拉成直线，定义肠管长度为“小肠总长度”，定义从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”。按式（2）计算墨汁推进率，结果见表3。
对比例1-3
对比例1-3用于说明使用脱脂乳和阳性对照菌株饲喂实验动物
（1）将实验动物分为三组，每组12只，体重为18-22g，分两笼饲养，每笼6只。给其中两组实验动物分别灌服脱脂乳，作为对比例1和对比例2，另一组灌服制备例中的菌悬液D1作为对比例3，灌服量为0.1ml/每天每千克小鼠体重。其中，每组中的其中一笼小鼠连续灌服7d，另一笼小鼠连续灌服15d。实验期间实验动物自由饮食，12小时灯照/黑暗循环。
（2）取步骤（1）中每组连续灌服菌体7d的实验动物，对其进行禁食不禁水16小时，给对比例1中的每只实验动物然灌服10mg/千克小鼠体重的蒸馏水，分别给对比例2和对比例3中的实验动物灌服10mg/千克小鼠体重的复方地芬诺酯悬浮液C1。0.5小时后均再分别给每只实验动物灌服0.1ml/千克小鼠体重的墨汁，之后将每只实验动物进行单笼饲养，正常饮水进食。从灌胃墨汁开始，记录每只动物排首粒黑便的时间、5h内排黑便粒数、质量。收集的粪便在105℃烘干至质量恒定，按式（1）计算粪便的含水率，结果见表2。
（3）取步骤（1）中每组连续灌服菌体15d的实验动物，对其进行禁食不禁水16小时，给对比例1中的实验动物灌服10mg/千克小鼠体重的蒸馏水，分别给对比例2和对比例3中的实验动物灌服10mg/千克小鼠体重的复方地芬诺酯悬浮液C2。0.5小时后均再分别给每只实验动物灌服0.1ml/千克体重的墨汁，25min后立即脱颈椎处死小鼠，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲肠部的肠管，置于托盘上，轻轻将小肠拉成直线，定义肠管长度为“小肠总长度”，定义从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”。按式（2）计算墨汁推进率，结果见表3。
表2
| 实施例/对比例编号 | 排首粒黑便时间（min） | 5h排便质量 | 5h排便粒数 | 粪便含水率 |
| 实施例1 | 102.5 | 0.0467 | 7.6 | 42.8840 |
| 实施例2 | 89.3 | 0.0680 | 10.4 | 43.9572 |
| 实施例3 | 79.7 | 0.1375 | 16.8 | 45.2215 |
| 实施例4 | 70.3 | 0.2054 | 20.1 | 46.1138 |
| 实施例5 | 66.3 | 0.2510 | 24.5 | 47.8296 |
| 实施例6 | 80.3 | 0.1309 | 15.8 | 44.6438 |
| 实施例7 | 74.8 | 0.1562 | 17.9 | 45.8593 |
| 对比例1 | 34.6 | 0.3145 | 32.2 | 50.3110 |
| 对比例2 | 128.3 | 0.0256 | 6.2 | 41.0649 |
| 对比例3 | 72.2 | 0.1965 | 19.5 | 46.0397 |
由上表1可以看出，与对比例1比较，对比例2中的小鼠首次排黑便时间增加，5h内排黑便颗粒数、排便质量和粪便含水率均有极显著性降低，说明便秘小鼠模型成立。
灌服干酪乳杆菌A7d的小鼠，实施例1-7中小鼠排首粒黑便时间显著低于对比例2，实施例1-7中小鼠的排便质量、排便粒数以及粪便含水率均显著高于对比例2。说明本发明提供的干酪乳杆菌具有通便的作用。
其中，饲喂干酪乳杆菌A的活菌体的实施例4与饲喂干酪乳杆菌A的死菌体的实施例6以及饲喂活菌体和死菌体的混合菌体的实施例7相比，小鼠的通便作用更加显著。饲喂本发明干酪乳杆菌A的实施例4中小鼠通便水平优于饲喂公认的具有通便功效的LCS的比对比例3中的小鼠的通便水平。
表3
通过表3可以看出，对比例2的墨汁推进率明显低于对比例1，说明墨汁推进实验小鼠便秘模型造模成功。
灌服干酪乳杆菌A15d的小鼠，实施例1-7中小鼠的墨汁推进率均显著高于对比例2。说明本发明提供的干酪乳杆菌具有通便的作用。
其中，饲喂干酪乳杆菌A的活菌体的实施例4与饲喂干酪乳杆菌A的死菌体的实施例6以及饲喂活菌体和死菌体的混合菌体的实施例7相比，小鼠的墨汁推进率提高更加显著。饲喂本发明干酪乳杆菌A的实施例4中小鼠的墨汁推进率基本上达到了饲喂公认的具有通便功效的LCS的比对比例3中的小鼠的墨汁推进率。
综上所述，本发明提供的干酪乳杆菌的活菌体、灭活后的菌体以及活菌体和死菌体的混合菌体均具有通便的功效，且活菌体的通便作用更加显著。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (8)
1.一种干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)，其特征在于，所述干酪乳杆菌的保藏编号为CGMCCNo.6276。
2.一种制备功能食品组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的干酪乳杆菌的菌体添加到食物中。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述干酪乳杆菌的菌体为干酪乳杆菌的活菌体和/或死菌体。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述干酪乳杆菌的菌体为干酪乳杆菌的活菌体。
5.根据权利要求2-4中任意一项所述的方法，其中，以所述功能食品组合物的总重量为基准，所述干酪乳杆菌的菌体的添加量为105-1010CFU/g。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述干酪乳杆菌的菌体的添加量为107-1010CFU/g。
7.由权利要求2-6中任意一项所述的方法制备的功能食品组合物。
8.权利要求1所述的干酪乳杆菌在制备具有通便功能的功能食品组合物中的应用。
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