CN102326678A - 一种五联复合益生活菌粉末制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种五联复合益生活菌粉末制剂及其制备方法，其由如下菌种组成：粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、双歧杆菌(Bifidobacterium animals V9)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei zhang)，其中重量份比例为：粪肠球菌0.5％-1.5％；酿酒酵母0.5％-1.5％；枯草芽孢杆菌0.5％-1.5％；动物双歧杆菌1％-3％；干酪乳杆菌1％-3％；本发明采用液体发酵，直接真空冷冻干燥，更好的保护了益生菌的活性，节能省时，可操作性强，连续生产有保证，尤其适合GMP要求的生产管理。
Description
技术领域
本发明涉及一种活菌粉末制剂及其制备方法，是一种微生态制剂，具体为一种五联复合益生活菌粉末制剂及其制备方法。属于微生态制剂领域。
背景技术
抗生素应用于禽蓄养殖业作为生长促进剂来提高饲料收益、减少畜禽患病率已经有多年，但是长期使用抗生素引来了抗生素残留、病原菌耐药性、肠道正常菌群生态平衡遭破坏、二重污染等诸多弊端，威胁人和动物的健康。发达国家已在八十年代末开始逐渐禁止抗生素使用，但我国还有很多抗生素仍然应用在畜牧养殖业。因而，研制一种应用于畜禽养殖领域的无残药、无污染、不产生抗药性、替代抗生素、预防动物疾病的微生态制剂尤为重要。
微生态制剂是一种活菌制剂，目前国内应用在畜禽类养殖业的微生态制剂种类较少，而且添加的益生菌种类单一、活性成分低、对复合微生态制剂的研究很少，且用于微生态制剂菌株的稳定性不高、耐受性较差，所以贮藏运输过程中活菌数大量死亡，货架期短等。本发明的目的在于研究开发一种活性益生菌含量较高、提高饲料收益、预防畜禽动物腹泻、调节肠道免疫力的复合微生态制剂。芽孢杆菌由于其具有物理性质稳定、作用方式独特、应用效果显著、无污染、无残留等优良特性，作为饲料添加剂主要是通过调节动物自身微生物平衡而发挥其生理作用；酵母菌培养物能提高动物干物质采食量、促进粗饲料的纤维降解率，改善反刍动物瘤胃的内环境、刺激某些瘤胃细菌的生长、减轻动物的应激等作用；乳酸杆菌不仅可以改善机体代谢，促进畜禽生长，提高畜禽的生产性能，还可以改善动物健康水平，预防疾病及提高动物免疫力等。根据以上微生态理论，经过抑菌、共生、拮抗、喂养效果等试验，开发了一种新型复合益生菌活菌制剂。发明添加了两株具有自主知识产权的干酪乳杆菌(CGMCC No.1697)、双歧杆菌(CGMCCNo.4473)，且其中经过大量试验验证此两株菌均具有较强的耐酸、耐胆盐、调节肠道正常菌群失调的作用。其中双歧杆菌对腹泻动物的保护性作用、且具有调节肠道菌群的作用、对便秘和急慢性腹泻患者治疗效果显著。其中干酪乳杆菌zhang对细胞免疫、体液免疫和肠粘膜局部免疫有增强功能。
技术方案
本发明的目的在于提供一种粉末制剂及其制备方法。
本发明针对目前复合益生菌制剂的现有技术的不足，提出一种用于畜禽用的五联复合益生活菌制剂；将干酪乳杆菌、双歧杆菌经过三级液体培养高密度发酵、添加一定量保护剂、真空冷冻干燥等特殊工艺后制成冻干菌粉以提高活菌制剂的稳定性；将干酪乳杆菌、双歧杆菌作为主要添加菌种与双歧因子低聚糖有机结合起来，充分利用两种菌株改善肠道微生态环境的益生作用。
本发明的技术解决方案是：本发明提供一种五联复合益生活菌粉末制剂，其中，其由如下菌种组成：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌，其中重量份比例为：
粪肠球菌 0.5％-1.5％，
酿酒酵母 0.5％-1.5％，
枯草芽孢杆菌 0.5％-1.5％，
双歧杆菌 1％-3％，
干酪乳杆菌 1％-3％，其它成份为辅料。
其中，还包括乳糖及双歧因子低聚糖，其中，乳糖10％-15％、低聚糖74％-86％。
其中，添加的粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌均购自中国微生物菌种保藏管理中心。
其中，添加的双歧杆菌为动物双歧杆菌V9，菌种保藏号为：CGMCCNo.4473，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为：2010.12.14。
其中，添加的干酪乳杆菌为干酪乳杆菌zhang，菌种保藏号为：CGMCCNo.1697，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为：2006.4.21。
其中，所添加的动物双歧杆菌、干酪乳杆菌是经过三级发酵培养、加入保护剂、真空冷冻干燥、过筛后得到的冻干菌粉。
上述的三级发酵培养，其特征在于培养基成份为：葡萄糖、大豆蛋白胨、酵母粉、乙酸钠的重量百分比分别为10％-20％，其它均为1％-4％，其余为水。
真空冷冻干燥前需加入一定量保护剂，保护剂为脱脂奶粉、乳糖、抗坏血酸、谷氨酸钠。其中脱脂奶粉的重量百分比为保护剂总重量的10％以上，乳糖的重量百分比为保护剂总重量的5％以上，其余均为1％-5％。
粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌活菌数添加量分别≥106cfu/g，动物双歧杆菌、干酪乳杆菌的添加量分别≥108cfu/g。
上述的辅料为：矫味剂和双歧因子低聚糖，所述的矫味剂为：乳糖。
制备方法如下：将原料及辅料过40目筛后，配料混匀10min～15min后，按剂量无菌包装制成。
本发明所述方法详述如下：
本发明由五种益生菌及一种益生元组成，用于维持或调节动物肠道微生态环境及肠道菌群失调，提高免疫力，促进生长。该复合益生活菌制剂作为微生态制剂使用，是一种粉末制剂，由以下成分组成：粪肠球菌，酿酒酵母，枯草芽孢杆菌，双歧杆菌，干酪乳杆菌，低聚糖及乳糖。
本发明的配方中所添加的动物双歧杆菌、干酪乳杆菌是经过三级发酵培养、添加一定量的保护剂、真空冷冻干燥、过筛后得到的冻干菌粉。
本发明的产品的优点
本发明是一种五联复合益生活菌制剂，该复合益生活菌制剂是经液体高密度发酵、真空冷冻干燥制粉、混和制成。经过抑菌试验、相互拮抗和共生试验，由益生能力强的又能互利共生的粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌组成。双歧杆菌、干酪乳杆菌具有调节肠道微生态环境、增强机体免疫力、预防及治疗急慢性腹泻等诸多益生特性。添加一定量的双歧因子低聚糖等益生元物质能促进益生菌活菌数量的增加或使其活性的增强。
本发明采用液体发酵，工艺过程简单，直接真空冷冻干燥，益生菌活菌数高，可操作性强，连续生产有保证，适合GMP要求的生产管理。
本发明的动物双歧杆菌、干酪乳杆菌是具有自主知识产权的菌株。
本发明涉及的菌种菌株其分类学等特征参见如下文献信息：
粪肠球菌，拉丁名称Enterococcus faecalis；参见CICC编号23658所公开的信息；以及《中国微生态学杂志》2010年22卷07期“粪肠球菌聚集物质的研究进展”。
酿酒酵母，拉丁名称Saccharomyces cerevisiae；其分类学特征和其他特征参见《微生物学通报》2000.27(2)，“酿酒酵母属的分类学研究进展”，白逢彦。
枯草芽孢杆菌的拉丁学名Bacillus subtilis(Ehrenberg)Cohn；其分类学特征和等参见《安徽农业科学》200836(27)，“枯草芽孢杆菌的应用研究进展”，惠明等。
动物双歧杆菌，拉丁名称Bifidobacterium animals V9，参见《Journal ofBacteriology》(JB)，2010.8.第4080-408页“Complete genome sequence ofprobiotic Bifdobacterium animalis subsp.lactis strain V9”；以及《微生物学报》2009，49(2)，481-488，“蒙古族儿童源益生特性双歧杆菌的分离及鉴定”高鹏飞等。
干酪乳杆菌，拉丁名称Lactobacillus casei zhang，参见《中国乳品工业》2004，(11)“不同地区酸马奶中乳杆菌的分离及其生物学特性的研究”，孟和毕力格，乌日娜等；以及《中国乳品工业》，2005，(06)，乌日娜，张和平，孟和毕力格，“酸马奶中乳杆菌Lb.casei.Zhang和ZL12-1的16S rDNA基因序列及聚类分析”。
具体实施方案
实施例1
将上述原料和辅料过40目筛后，将配料混匀10～15min，按剂量无菌包装制成。
上述的粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、活菌数添加量分别≥106cfu/g，动物双歧杆菌、干酪乳杆菌的添加量分别≥108cfu/g。
实施例2
本发明的一种五联复合益生活菌粉末制剂，重量份比例为：
粪肠球菌 1.5％，
酿酒酵母 1.5％，
枯草芽孢杆菌 1.5％，
动物双歧杆菌 3％，
干酪乳杆菌 3％，
其它成份为辅料，包括乳糖及双歧因子低聚糖，乳糖15％、低聚糖84.5％。
其中，添加的双歧杆菌为动物双歧杆菌V9，菌种保藏号为：CGMCCNo.4473，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为：2010.12.14。
其中，添加的干酪乳杆菌为干酪乳杆菌zhang，菌种保藏号为：CGMCCNo.1697，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为：2006.4.21。
添加的动物双歧杆菌、干酪乳杆菌是经过三级发酵培养、加入保护剂、真空冷冻干燥、过筛后得到的冻干菌粉。三级发酵培养，其特征在于培养基成份为：葡萄糖、大豆蛋白胨、酵母粉、乙酸钠的重量百分比分别为10％-20％，其它均为1％-4％，其余为水。
真空冷冻干燥前需加入一定量保护剂，保护剂为脱脂奶粉、乳糖、抗坏血酸、谷氨酸钠。其中脱脂奶粉的重量百分比为保护剂总重量的10％以上，乳糖的重量百分比为保护剂总重量的5％以上，其余均为1％-5％。
粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌活菌数添加量分别≥106cfu/g，动物双歧杆菌、干酪乳杆菌的添加量分别≥108cfu/g。
制备方法如下：将原料及辅料过40目筛后，配料混匀10min～15min后，按剂量无菌包装制成。
实施例3
本发明的一种五联复合益生活菌粉末制剂，重量份比例为：
粪肠球菌 1％，
酿酒酵母 1.5％，
枯草芽孢杆菌 1.5％，
动物双歧杆菌 3％，
干酪乳杆菌 3％，
其它成份为辅料，包括乳糖及双歧因子低聚糖，乳糖15％、低聚糖75％。
其中，添加的双歧杆菌为动物双歧杆菌V9，菌种保藏号为：CGMCCNo.4473，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为：2010.12.14。
其中，添加的干酪乳杆菌为干酪乳杆菌zhang，菌种保藏号为：CGMCCNo.1697，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为：2006.4.21。
添加的动物双歧杆菌、干酪乳杆菌是经过三级发酵培养、加入保护剂、真空冷冻干燥、过筛后得到的冻干菌粉。三级发酵培养，其特征在于培养基成份为：葡萄糖、大豆蛋白胨、酵母粉、乙酸钠的重量百分比分别为10％-20％，其它均为1％-4％，其余为水。
真空冷冻干燥前需加入一定量保护剂，保护剂为脱脂奶粉、乳糖、抗坏血酸、谷氨酸钠。其中脱脂奶粉的重量百分比为保护剂总重量的10％以上，乳糖的重量百分比为保护剂总重量的5％以上，其余均为1％-5％。
粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌活菌数添加量分别≥106cfu/g，动物双歧杆菌、干酪乳杆菌的添加量分别≥108cfu/g。
制备方法如下：将原料及辅料过40目筛后，配料混匀10min～15min后，按剂量无菌包装制成。
效果实施例：
五联复合益生菌对肉鸡肠道微生物数量的影响
1试验设计
随机选取1日龄AA肉鸡240只，分为4个处理组，1个对照组，3个试验组。每个处理组4个重复，每个重复15只鸡。各处理组日粮及饲养管理条件均相同，但饮水中添加的乳酸菌种类及剂量不相同，添加的乳酸菌包括干酪乳杆菌与动物双歧杆菌V9，五联复合益生菌。其中对照组，不添加益生菌，试验组1～3为复合益生菌添加组，按照试验设计分别添加不同种类及剂量的复合益生菌，详见表1。试验期6周。试验前对周边环境、鸡舍、用具进行消毒处理。试验鸡采用肉鸡笼单层笼养，每一处理的4个重复组按鸡笼的位置不同分开排列，以消除环境因素的影响。鸡笼均采用红外线加热装置自动控温，试验期内保持23h/d恒定光照，在前3d内舍温保持33℃，之后每周降低3℃，直至降到24℃后保持恒定不变。试验期内每天人工清粪一次。每天观察鸡群精神状态，其余管理同肉鸡常规饲养管理。
表1各处理组饮水中添加复合益生菌及其添加量
2测定项目及方法
2.1生长性能的测定
分别在1d，21d和42d称重。记录肉鸡的采食量，计算日增重与料肉比。
计算公式：
日增重＝总增重/试验天数(g/d)
料肉比＝平均日采食量(g)/平均日增重(g)
2.2肠道微生物的测定
试验开始后分别于21和42日龄，每重复组随机抽取2只鸡，每个处理组8个重复，颈静脉放血处死，迅速在冰浴上剖腹取左侧盲肠及回肠中端内容物1g左右，放入已加入9ml稀释液的50ml采样管中，立即送微生物培养室称重并进行细菌分离培养，测定盲肠内容物与回肠内容物中大肠杆菌、总厌氧菌、乳酸菌和产气夹膜梭菌的含量。
3试验结果
3.1五联复合益生菌不同添加量对肉鸡日增重的影响
表2五联复合益生菌不同添加量对肉鸡日增重的影响(g/d)
注：表中同列右肩不含同字母者表示差异显著(P＜0.05)；SEM：平均标准误。以下各表均相同。
由表2 看出，在0-3周龄，试验2组平均日增重显著高于对照组(P＜0.05)，其它各组均不同程度高于不添加乳酸菌的对照组，但各组间差异不显著(P＞0.05)。在4-6周龄，试验2组和试验3组平均日增重都显著高于对照组(P＜0.05)。在试验全期(0-6周龄)，试验2组、试验3组平均日增重都显著高于对照组(P＜0.05)，各组间差异不显著(P＞0.05)。
3.2五联复合益生菌不同添加量对肉鸡料肉比的影响
由表3可以看出，在0-3周龄和4-6周龄，各处理组间料肉比均无显著性差异(P＞0.05)，但添加复合益生菌的各试验组较对照组均有降低趋势。在试验全期(0-6周龄)，试验组的料肉比都显著低于对照组(P＜0.05)。
表3 五联复合益生菌不同添加量对肉鸡料肉比的影响
3.4五联复合益生菌不同添加量对21日龄肉鸡盲肠微生物数量的影响
表4 21日龄盲肠微生物数量log(cfu/g)
由表4看出，在21日龄，试验1组、试验2组、试验3组的盲肠总厌氧菌数量都显著高于对照组(P＜0.05)，各组间无显著差异。试验2组的盲肠乳酸菌数显著高于对照组，其它各组间无显著差异。试验1组的盲肠大肠杆菌数均显著低于对照组(P＜0.05)，其它各组间无显著差异(P＞0.05)。
3.5五联复合益生菌不同添加量对21日龄肉鸡回肠微生物数量的影响
表5 21日龄回肠微生物数量log(cfu/g)
由表5看出，在21日龄回肠中的总厌氧菌，试验1组、2组、3组都显著高于对照组(P＜0.05)，各试验组之间无显著差异。各试验组的回肠乳酸菌数均显著高于对照组(P＜0.05)，各试验组间无显著差异(P＞0.05)。试验1组的大肠杆菌数显著低于对照组(P＜0.05)，其它各组间无显著差异(P＞0.05)。
3.6五联复合益生菌不同添加量对42日龄肉鸡盲肠微生物数量的影响
由表6看出，在42日龄，各处理组的盲肠总厌氧菌数、乳酸菌数均无显著性差异(P＞0.05)。试验3组大肠杆菌数显著低于对照组(P＜0.05)，其它各组间无显著差异(P＞0.05)。试验2组的产气夹膜梭菌数显著低于对照组(P＜0.05)，其它各组间无显著性差异(P＞0.05)。
表6 42日龄盲肠微生物数量log(cfu/g)
3.7五联复合益生菌不同添加量对42日龄肉鸡回肠微生物数量的影响
表7 42日龄回肠微生物数量log(cfu/g)
由表7看出，在42日龄，试验1、2、3组的回肠总厌氧菌数都显著高于对照组(P＜0.05)。试验1、2组的乳酸菌数均显著高于对照组(P＜0.05)，其他各组间无显著差异(P＞0.05)。试验3组的大肠杆菌数显著低于对照组(P＜0.05)。试验2、3组的产气夹膜梭菌数均显著低于对照组(P＜0.05)，各试验组间无显著性差异(P＞0.05)。
4结果初步分析
由以上结果可以初步得出，添加了五联复合益生菌后，试验前期和试验后期各处理组间料肉比无显著差异，但试验前期、全期料肉比均显著低于对照组，其中试验组3(添加量2×108)在试验全期的料肉比明显低于对照组。
添加复合益生菌后，各试验组的盲肠与回肠乳酸菌数、总厌氧菌数均不同程度高于对照组，大肠杆菌数与产气荚膜菌数量均不同程度低于对照组；但对肉鸡盲肠微生物区系影响较小，而对回肠微生物区系影响较大。
本发明实施例所采用的菌种菌株来源于CGMCC(微生物菌种保藏中心)，以及市售商品，商品名分别为“益生菌”，或“粪肠球菌”、“酿酒酵母”、“枯草芽孢杆菌”、“双歧杆菌”、“干酪乳杆菌”等。
Claims (10)
1.一种五联复合益生活菌粉末制剂，其特征在于：其由以下菌种组成，粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌；其中，以所述五联复合益生活菌粉末制剂的重量为100％计，以下菌种的重量比例为，
粪肠球菌 0.5％-1.5％，
酿酒酵母 0.5％-1.5％，
枯草芽孢杆菌 0.5％-1.5％，
双歧杆菌 1％-3％，
干酪乳杆菌 1％-3％，
其它成份为辅料。
2.如权利要求1所述的粉末制剂，其特征在于：还包括乳糖及双歧因子低聚糖；其中，乳糖10％-15％、低聚糖74％-86％。
3.如权利要求1所述的粉末制剂，其特征在于：添加的双歧杆菌为动物双歧杆菌V9，菌种保藏号为CGMCCNo.4473，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为：2010.12.14。
4.如权利要求1所述的粉末制剂，其特征在于：添加的干酪乳杆菌为干酪乳杆菌zhang，菌种保藏号为CGMCC No.1697，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为：2006.4.21。
5.如权利要求3或4所述的粉末制剂，其特征在于：所添加的双歧杆菌、干酪乳杆菌是经过三级发酵培养、加入保护剂、真空冷冻干燥、过筛后得到的冻干菌粉。
6.如权利要求5所述的粉末制剂，其特征在于：所述的三级发酵培养，其特征在于培养基成份为：葡萄糖、大豆蛋白胨、酵母粉、乙酸钠的重量百分比分别为10％-20％，其它均为1％-4％，其余为水。
7.如权利要求5所述的粉末制剂，其特征在于：真空冷冻干燥前需加入一定量保护剂，保护剂成分为脱脂奶粉、乳糖、抗坏血酸、谷氨酸钠；其中脱脂奶粉的重量百分比为保护剂总重量的10％以上，乳糖的重量百分比为保护剂总重量的5％以上，其余均为1％-5％。
8.如权利要求1所述的粉末制剂，其特征在于：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌活菌数添加量分别≥106cfu/g，动物双歧杆菌、干酪乳杆菌的添加量分别≥108cfu/g。
9.如权利要求1所述的粉末制剂，其特征在于：所述的辅料矫味剂和双歧因子低聚糖，该矫味剂为乳糖。
10.如权利要求1-9任意一项所述粉末制剂的制备方法，其特征在于：将原料及辅料过40目筛后，配料混匀10min-15min后，按剂量无菌包装制成。
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