CN102660478A - 一种唾液乳杆菌及其冻干制剂与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了唾液乳杆菌及其冻干制剂与应用，涉及动物益生菌菌株及其冻干制剂。本发明所提供的唾液乳杆菌名称为唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius ZLS006，其保藏号为：CGMCC No.5761。本发明还提供了一种由唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius ZLS006制备得到的冻干制剂，该冻干制剂经试验证明能够提高猪群饲料转化效率，增加猪群粪中乳酸菌活菌数，降低大肠杆菌含量，并具有提高机体免疫力的作用。

Description

一种唾液乳杆菌及其冻干制剂与应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株猪源唾液乳杆菌菌株及其冻干制剂与应用。

背景技术

动物肠道内存在着约30个属500多种微生物，相互依赖，相互竞争，共同维持着肠道的微生态平衡。但长期以来，抗生素作为饲料添加剂的大量使用，在抑制和杀灭病原菌的同时也抑杀了动物机体内正常共生的菌群，使肠道长期处于失衡状态，对动物的健康甚至人类的健康构成直接的威胁。因此，加速开发安全、优质、高效的绿色饲料添加剂已迫在眉睫。近年来的科学研究发现，在饲料中添加益生菌活菌制剂可以起到促进动物生长、抑制病原菌繁殖及提高机体免疫能力等功能，该类添加剂也越来越受到人们的关注。目前，美国食品药物管理局（FDA）和美国饲料控制官员协会（AAFCO）公布了可以直接饲喂的微生物菌种有43种，我国对饲用微生物的研究起步较晚，可饲用菌种较少，农业部1126号公告中公布的允许使用的菌种仅有16种，因此，研究开发新型的益生菌菌种有着广阔的应用前景。

研究表明，同源性菌群对宿主的益生作用优于异源菌群（Timmerman等，2006），即理想的菌株应该来自同种动物的消化道，同时，作为益生菌菌株还必须具有生长速度快，产酸能力强以及较强的耐胃酸、耐肠胆盐等特性，这样才能保证益生菌能够以足够活菌含量到达动物肠道后并快速生长繁殖，净化肠道环境，真正发挥其益生作用。依据上述筛选原则，本发明分离得到一株性能优良的乳酸杆菌-唾液乳杆菌，目前，国内关于唾液乳杆菌的研究主要集中于人类发酵食品方面，而作为动物饲用方面的报道较少，本发明对该菌进行了分离筛选、增殖培养、冻干工艺制备及动物应用试验等系统的研究，从而验证了其高效性和实用性，并为益生菌菌种的开发和推广应用奠定基础。

发明内容

本发明提供一株乳杆菌，该乳杆菌生长、产酸、耐酸耐胆盐等性能优良，并提供适合该菌株的冻干保护剂配方从而制备得到冻干制剂，使其能够应用于实际动物饲料中，并充分发挥其优良益生菌作用。

一种唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）菌株，名称为唾液乳杆菌Lactobacillussalivarius ZLS006，其保藏号为：CGMCC No.5761。

本发明还提供一种唾液乳杆菌冻干制剂，其特征在于采用所述的唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius ZLS006菌株，其保藏号为：CGMCC No.5761。

所述唾液乳杆菌活菌数为3.5×10⁹cfu/g。

本发明还提供了所述唾液乳杆菌冻干制剂的制备方法，包括如下步骤：

将唾液乳杆菌菌种进行发酵培养，得到发酵液，将所述发酵液离心分离菌体，得到菌泥，向所述菌泥中加入冻干保护剂，混匀、冻干，即得到所述唾液乳杆菌冻干制剂。

所述发酵培养的培养基由如下质量百分比的物质组成：以MRS培养基为基础，其中蛋白胨0.6~1.2%，酵母浸粉0.3~0.6%，牛肉膏0.6~1.2%，葡萄糖1.6~2.2%。

所述发酵培养的培养基优选为由如下质量百分比的物质组成：以MRS培养基为基础，其中蛋白胨1.0%，酵母浸粉0.6%，牛肉膏1.2%，葡萄糖1.6%。

所述发酵培养的接种量为1%～3％，发酵温度为37℃，发酵时间为20～24h。

所述发酵培养的发酵罐的装液量为50％，培养转速为100r/min，pH6.5，罐压维持在0.05MPa；发酵结束后，采用管式离心机19000rpm连续离心，收取菌泥，加入冻干保护剂，冻干保护剂体积与离心前发酵液体积相等，混匀，置于冻干机中冻干23h，收取冻干粉。

所述冻干保护剂由如下重量百分比的物质组成：12%脱脂乳，5%糊精，2%聚乙烯吡咯烷酮，4%乳糖，0.1%谷氨酸钠，0.1%半胱氨酸，0.3%乙酸钠，其余为水。

所述唾液乳杆菌的冻干制剂在动物饲料添加剂中的应用也属于本发明的保护范围。其中

动物包括但不限于猪、牛、羊、鸡等动物，其优选猪。

本发明还提供一种唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）冻干保护剂，由如下重量百分比的物质组成：12~16%脱脂乳，5~10%糊精，2~4%聚乙烯吡咯烷酮，4~6%乳糖，0.1~0.5%谷氨酸钠，0.1~0.5%半胱氨酸，0.3~0.8%乙酸钠，其余为水。

本发明所提供的唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）冻干保护剂，优选为由如下重量百分比的物质组成：12%脱脂乳、5%糊精、2%聚乙烯吡咯烷酮、4%乳糖、0.1%谷氨酸钠、0.1%半胱氨酸和0.3%乙酸钠，其余为水。

本发明从健康仔猪盲肠黏膜分离筛选得到一个唾液乳杆菌菌株，保藏号为CGMCCNo.5761。该菌株能够提高猪群饲料转化效率；增加猪群粪便中有益菌活菌数，降低有害菌含量，并具有刺激机体特异性免疫应答，加强机体免疫力的功能，是优良的益生菌候选材料。

基于对唾液乳杆菌在动物肠道中的益生功能，为了使唾液乳杆菌在动物饲料中得到良好的应用并充分发挥其益生菌的作用，本发明提供了一种制备唾液乳杆菌冻干制剂的保护剂配方。该冻干菌保护剂对唾液乳杆菌的冻干保护率达到85.16%；使其在常温保存3个月后，菌存活率达到80.35%。本发明进一步提供了制备唾液乳杆菌冻干制剂的方法，特别是中式生产的参数。

本发明提供的菌剂在动物饲喂试验中发挥出优良的益生作用，见实施例2的数据。

由于本发明提供的唾液乳杆菌冻干制剂，虽然仅仅对猪做了试验，但是由于该菌种广泛存在于动物肠道的有益乳酸杆菌，因此，该菌冻干制剂在动物饲料中都可以添加，并不限于添加于猪饲料中。

生物保藏存活信息：存活

菌株命名：唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius ZLS006

保藏号：CGMCC No.5761

保藏日期：2012年02月16日

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

具体实施方法

实施例1、猪源优良乳杆菌的制备

1.1猪源乳酸菌的分离、筛选及鉴定

仔猪剖杀，无菌刮取黏膜1g，置于盛有9ml无菌生理盐水的带有玻璃珠的三角瓶中，充分震荡摇匀，然后吸取1.0ml菌液于盛有9.0ml无菌生理盐水的试管中，此稀释度为10^-1，重复以上过程，依次制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的菌液。选择10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度，吸取0.1ml菌液分别滴于MRS培养基平板上，置于厌氧罐中于37℃培养24～48h，挑取形态不同的菌落在MRS培养基上划线接种做纯培养，而后置于4℃冰箱保存备用。

然后挑取纯培养物进行染色，镜检，选取无芽孢革兰氏阳性杆菌进行接触酶、硝酸盐还原、明胶液化等生化实验，以及糖醇发酵试验，结果与《常见细菌系统鉴定手册》、《乳酸细菌分类及实验方法》对照，以初步确定乳酸菌属，经试验，初步筛选出80株乳酸菌。

菌株是决定乳酸菌制剂使用效果的关键因素，其中，菌株生长速度快可以使得菌株到达肠道后能够快速生长繁殖，而产酸则可以达到抑制有害菌，净化肠道环境的效果，另外，益生菌在进入肠道后还应具有较强的耐胃酸、耐肠胆盐性能，以保证乳酸菌能够以足够活菌数到达肠道而真正发挥益生作用。依据上述筛选原则，本发明对80株菌进行生长、产酸及耐酸耐胆盐抗逆性试验，筛选出一株性能优良的乳酸菌菌株，筛选结果见表1。

（1）生长试验筛选：

菌株活化后，接种于MRS液体培养基中，培养24h后取一定量菌液测定OD_600nm值，以不接菌为对照，观察菌株生长性能；

（2）产酸试验：

菌株活化后，接种于含有溴甲酚蓝指示剂的MRS液体培养基中，分别培养24、48h测定OD_450nm值，通过菌株产酸使培养基颜色变黄而使OD_450nm值变化来判定菌株产酸情况；

（3）耐酸耐胆盐性能试验：

菌种活化后，接种于MRS液体培养基中培养24h，取3ml发酵液于3000rpm离心5分钟，加入3ml含有0.2%胆盐pH=3的液体培养基中，保温2h，而后以10%接种于新鲜培养基中保温4h，测定OD_600nm值，观察菌株耐酸耐胆盐性能。

经过筛选，Y29生长OD_600nm值、产酸OD_450nm值、及耐酸耐胆盐抗逆性能较好，因此，确定此菌为目的菌株，送至确定菌种为并送至中国工业微生物菌种保藏中心进行鉴定检验。具体结果如下：

中国工业微生物菌种保藏管理中心对该乳酸杆菌为猪源唾液乳杆菌（Lactobacillussaliarius）的鉴定结果为：该猪源唾液乳杆菌生理生化特征如表2所示，其分子生物学鉴定结果见表3和序列表1。将该菌株于2012年02月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）进行了保藏，菌株名称为唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius ZLS006，其保藏号为CGMCC No.5761。

表1 乳酸菌筛选试验结果

表2 猪源唾液乳杆菌生理生化特征

注：表中“＋”表示≥90％菌株阳性，“－”表示≥90％菌株阴性。

表3 唾液乳杆菌分子生物学鉴定

1.2 猪源唾液乳杆菌增殖培养

试验以MRS培养基为基础配方，采用正交试验设计L₁₆(4⁵)优化筛选蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、葡萄糖的最佳用量，维持其他成分不变，其因素水平表见表4，将活化菌种按1%接种量接种于不同培养基中，测定生长OD_600nm值，结果见表5。由表5可以看出，猪源唾液乳杆菌培养基优化后的成分为：以MRS培养基为基础，其中蛋白胨1.0%，酵母浸粉0.6%，牛肉膏1.2%，葡萄糖1.6%。

表4 培养基碳氮源成分优化因素水平表

表5 培养基碳氮源成分优化试验结果

1.3 猪源唾液乳杆菌制剂的制备

1.3.1 冻干保护剂的筛选

将上述筛选得到的唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius ZLS006菌种二级活化后，采用1%接种量接种于MRS液体培养基中37℃培养24h。

优化后的MRS培养基由如下质量百分比的物质组成：蛋白胨1.0%，酵母浸粉0.6%，牛肉膏1.2%，葡萄糖1.6%。将发酵液19000rpm离心10min取菌泥。

菌泥加入到所配得不同组合的保护剂中，制成与离心前发酵液浓度相同的菌悬液，分别进行冻干，冻干方法如下：

冻干步骤：

活菌计数，测定各保护剂的冻干保护率。

冻干保护率计算公式为：冻干保护率（%）=(冻干后菌悬菌粉活菌数×冻干后菌粉重量)/(冻干前菌悬液活菌数×冻干前菌悬液体积)×100。

以12%脱脂奶粉和5%糊精作为基础保护剂，用正交试验（L₉(3⁴)）对多元醇类（A）、糖类（B）、氨基酸类（C）、无机盐类（D）进行了筛选，结果见表6、表7，由结果可知，猪源唾液乳杆菌最佳冻干保护剂为12%脱脂乳+5%糊精+2%聚乙烯吡咯烷酮+4%乳糖+0.1%谷氨酸钠+0.1%半胱氨酸+0.3%乙酸钠，其余为水，效果最好，其冻干保护率达85.16%，活菌数可达3.50×10⁹cfu/g。

表6 猪源唾液乳杆菌保护剂筛选正交试验设计表

表7 猪源唾液乳杆菌保护剂筛选正交试验结果

1.3.2 贮存稳定性能

将1.3.1 节中采用最佳配冻干保护剂配方制备得到的猪源唾液乳杆菌制剂用铝箔袋真空包装后，常温保存1，2，3个月后，取菌粉，用无菌生理盐水进行梯度稀释后，采用MRS培养基测定活菌数。结果表8显示，唾液乳杆菌制剂常温保存3个月后，活菌数仍可保持在2.81×10⁹cfu/g。

表8 猪源唾液乳杆菌制剂贮存性能测定

1.3.3中试生产

方法Ⅰ

将猪源唾液乳杆菌采用50L发酵罐扩大培养，发酵罐工作参数分别为：发酵罐温度为37℃，培养基采用优化培养基（蛋白胨1.0%，酵母浸粉0.6%，牛肉膏1.2%，葡萄糖1.6%），接种量1％，装液量为50％，转速为100r/min，最初pH6.5，自始至终维持罐压在0.05MPa，发酵周期为20h。发酵结束后，采用管式离心机19000rpm连续离心，收取菌泥，加入到与离心前发酵液体积相等的冻干保护剂（12%脱脂乳+5%糊精+2%聚乙烯吡咯烷酮+4%乳糖+0.1%谷氨酸钠+0.1%半胱氨酸+0.3%乙酸钠，其余为水）中，置于中试冻干机中冻干23h后收取冻干粉，并进行粉碎，分装于铝箔袋中抽真空保存。

方法Ⅱ

将猪源唾液乳杆菌采用50L发酵罐扩大培养，发酵罐工作参数分别为：发酵罐温度为37℃，培养基采用优化培养基（蛋白胨1.0%，酵母浸粉0.6%，牛肉膏1.2%，葡萄糖1.6%），接种量2％，装液量为50％，转速为100r/min，最初pH6.5，自始至终维持罐压在0.05MPa，发酵周期为22h。发酵结束后，采用管式离心机19000rpm连续离心，收取菌泥，加入到与离心前发酵液体积相等的冻干保护剂（12%脱脂乳+5%糊精+2%聚乙烯吡咯烷酮+4%乳糖+0.1%谷氨酸钠+0.1%半胱氨酸+0.3%乙酸钠，其余为水）中，置于中试冻干机中冻干23h后收取冻干粉，并进行粉碎，分装于铝箔袋中抽真空保存。

方法Ⅲ

将猪源唾液乳杆菌采用50L发酵罐扩大培养，发酵罐工作参数分别为：发酵罐温度为37℃，培养基采用优化培养基（蛋白胨1.0%，酵母浸粉0.6%，牛肉膏1.2%，葡萄糖1.6%），接种量3％，装液量为50％，转速为100r/min，最初pH6.5，自始至终维持罐压在0.05MPa，发酵周期为24h。发酵结束后，采用管式离心机19000rpm连续离心，收取菌泥，加入到与离心前发酵液体积相等的冻干保护剂（12%脱脂乳+5%糊精+2%聚乙烯吡咯烷酮+4%乳糖+0.1%谷氨酸钠+0.1%半胱氨酸+0.3%乙酸钠，其余为水）中，置于中试冻干机中冻干23h后收取冻干粉，并进行粉碎，分装于铝箔袋中抽真空保存。

1.4猪源唾液乳杆菌制剂的安全性能测定

将上述方法Ⅰ、方法Ⅱ和方法Ⅲ制备得到的猪源唾液乳杆菌制剂送至农业部兽药安全监督检验测试中心（北京）进行了安全性检验，经大鼠、小鼠经口急性毒性试验，结果证明：猪源唾液乳杆菌制剂对于大鼠、小鼠经口LD₅₀大于5000mg/kg体重。说明猪源唾液乳杆菌制剂是安全的。

实施例2、猪源唾液乳杆菌制剂对保育猪和生长猪性能指标的影响

2.1试验动物与分组

选取日龄相近、体重相当的保育猪（杜×长×大三元杂交猪）81头，随机分成3组，每组设3个重复，每个重复9头。1组为对照组，饲喂基础日粮+抗生素（每千克饲料中添加100mg氨苯砷酸），试验1组和试验2组分别在基础日粮中添加0.2%、0.4%猪源唾液乳杆菌制剂（每千克全价饲料中含有7.00×10⁹cfu和1.40×10¹⁰cfu唾液乳杆菌），试验期为60d，前30d饲喂保育阶段日粮，后30d饲喂生长阶段日粮。试验在封闭式猪舍内进行，水泥地面，保育阶段采用网床圈养，生长阶段采用地面圈养，自由采食，以鸭嘴式饮水器提供充足清洁饮水。免疫、驱虫和消毒按猪场规程进行。

2.2试验饲粮设计

供饲日粮参照我国《猪饲养标准》配制，日粮配方及营养水平见表9。

表9 基础日粮配方和营养水平

注：^a预混料为每千克日粮提供：维生素A 13500IU；维生素D₃ 2850IU；维生素E 64mg；维生素K₃ 2.4mg；维生素B₁ 2.4mg；维生素B₂ 6.6mg；维生素B₆ 3mg；维生素B₁₂ 0.045mg；烟酰胺25.5mg；泛酸13.5mg；生物素0.12mg；铜12mg；铁150mg；锌155mg；锰55mg；碘0.5mg；硒0.3mg。

^b预混料为每千克日粮提供：维生素A 5512IU；维生素D₃ 2250IU；维生素E 44mg；维生素K₃3.15mg；维生素B₁ 8.1mg；维生素B₂ 6.4mg；维生素B₆ 3mg；维生素B₁₂ 0.025mg；烟酰胺25mg；泛酸10.8mg；生物素0.12mg；铜12mg；铁100mg；锌100mg；锰10mg；碘0.5mg；硒0.2mg。

2.3方法

试验开始和试验第30d、60d进行个体空腹称重；记录饲料消耗情况，计算日增重、采食量和料肉比。试验期间每日观察猪群生长情况，记录猪群腹泻情况；

分别在试验第30d和第60d时从每组采取新鲜粪样，测定粪中乳酸菌和大肠杆菌活菌数情况，同时从每组随机挑选4头仔猪，前腔静脉采血5mL置于促凝管中，测定血清中IgG含量。数据统计采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析，结果以平均值±标准差表示。

2.4结果与分析

2.4.1猪源唾液乳杆菌制剂对保育猪和生长猪生产性能的影响

由结果表10可知，日粮中添加猪源唾液乳杆菌制剂后，保育猪和生长猪平均日增重均有不同程度的升高，但差异不显著（P>0.05）。另外，在保育猪阶段，试验1组和试验2组均能降低猪群料重比，试验2组达到极显著水平（P<0.01），同时在生长猪阶段，试验组猪群料重比也有降低趋势（P>0.05）。因此证明，猪源唾液乳杆菌在能够很好地促进猪群生长，提高饲料转化效率。

表10 猪源唾液乳杆菌制剂对保育猪和生长猪生产性能的影响

注：同肩标注不同代表差异显著，大写字母不相同表示差异极显著（P<0.01），小写字母不同表示差异显著（P<0.05）。

2.4.2 猪源唾液乳杆菌制剂对保育猪和生长猪粪中乳酸菌和大肠杆菌的影响

由表11可知，在保育猪阶段，添加两个剂量的猪源唾液乳杆菌制剂后，试验猪粪中乳酸菌活菌数有升高趋势，试验2组达到显著水平（P<0.05），而两个试验组猪粪中大肠杆菌活菌含量均显著低于对照组（P<0.05）；

在生长猪阶段，两个试验组猪粪中乳酸菌含量显著高于对照组（P<0.05），而粪中大肠杆菌活菌数均有不同程度的降低，试验2组达到显著水平（P<0.05）。

由此可见，猪源唾液乳杆菌制剂能够增加机体有益菌活菌数，降低有害菌含量，从而维持肠道微生态的平衡。

表11 猪源唾液乳杆菌制剂对保育猪和生长猪粪中微生物的影响(log₁₀cfu/g)

注：同肩标注不同代表差异显著，小写字母不同表示差异显著（P<0.05），小写字母相同表示差异不显著（P>0.05）。

2.4.3 猪源唾液乳杆菌制剂对保育猪和生长猪血清中IgG含量的影响

免疫球蛋白G（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，是初级免疫应答中最持久、最重要的抗体，它不仅能够促进单核巨噬细胞的吞噬作用，还可以和病毒抗原结合使病毒失去感染宿主细胞的能力，从而在抗感染中起到主力军作用。本试验在日粮中添加两个剂量的猪源唾液乳酸菌制剂均能够极显著增加保育猪血清中IgG含量（P<0.01）；而在生长猪试验中，两组试验猪血清中IgG含量均有升高趋势，试验2组达到显著水平（P<0.05）。由此可见，猪源唾液乳杆菌制剂对猪群具有刺激机体特异性免疫应答，加强机体免疫力的功能。

表12 猪源唾液乳杆菌制剂对保育猪和生长猪血清中IgG含量的影响（mg/ml）

注：同肩标注不同代表差异显著，大写字母不相同表示差异极显著（P<0.01），小写字母不同表示差异显著（P<0.05）。

Claims (10)

1.一种唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）菌株，名称为唾液乳杆菌Lactobacillussalivarius ZLS006，其保藏号为：CGMCC No.5761。

2.一种唾液乳杆菌冻干制剂，其特征在于采用权利要求1所述的唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）菌株。

3.权利要求2所述的唾液乳杆菌冻干制剂的制备方法，包括如下步骤：

将唾液乳杆菌菌种进行发酵培养，得到发酵液，将所述发酵液离心分离菌体，得到菌泥，向所述菌泥中加入冻干保护剂，混匀、冻干，即得到所述唾液乳杆菌冻干制剂。

4.根据权利要求3所述的方法，所述发酵培养的培养基由如下质量百分比的物质组成：以MRS培养基为基础，其中蛋白胨0.6~1.2%，酵母浸粉0.3~0.6%，牛肉膏0.6~1.2%，葡萄糖1.6~2.2%。

5.根据权利要求4所述的方法，所述发酵培养的接种量为1%~3％，发酵温度为37℃，发酵时间为20～24h。

6.根据权利要求5所述的方法，所述发酵培养的发酵罐的装液量为50％，培养转速为100r/min，pH6.5，罐压维持在0.05MPa；发酵结束后，采用管式离心机19000rpm连续离心，收取菌泥，加入冻干保护剂，冻干保护剂体积与离心前发酵液体积相等，混匀，置于冻干机中冻干23h，收取冻干粉。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述冻干保护剂由如下重量百分比的物质组成：12%脱脂乳，5%糊精，2%聚乙烯吡咯烷酮，4%乳糖，0.1%谷氨酸钠，0.1%半胱氨酸，0.3%乙酸钠，其余为水。

8.权利要求2所述唾液乳杆菌冻干制剂在动物饲料添加剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述动物指猪。

10.一种唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）冻干保护剂，由如下重量百分比的物质组成：12~16%脱脂乳，5~10%糊精，2~4%聚乙烯吡咯烷酮，4~6%乳糖，0.1~0.5%谷氨酸钠，0.1~0.5%半胱氨酸，0.3~0.8%乙酸钠，其余为水。