CN110777102A - 一种猪源益生菌复合物的制备和应用 - Google Patents

一种猪源益生菌复合物的制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明有提供了一种猪源益生菌复合物的制备，其特征在于：所述益生菌复合物成分包括枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌；复合物制备步骤如下：步骤a、将枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌活化后，菌液浓度达到对数生长期1‑2×109cfu/ml；步骤b、将步骤a所得的菌液离心，弃上清液，收集菌泥；步骤c、将上述菌泥和保护剂按质量比1：2～5混合均匀，搅拌使保护剂充分与菌体接触，在﹣20℃～‑50℃、50‑80Pa条件下冷冻干燥成粉制剂，即得益生菌复合物。本益生菌复合物来自健康猪肠道并经过分离、训化后得到，具有抗逆性强、不容易失活，能显著提高猪肠道屏障功能和调节肠道菌群的作用，尤其适合断奶仔猪。

Description

一种猪源益生菌复合物的制备和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体的涉及一种猪源益生菌复合物的制备和应用。
背景技术
饲用抗生素在提高饲料利用率、减少疾病发生等方面均起到了一定的积极作用，但随其对畜禽产品质量、生态环境及人体健康产生的危害逐步被认识，寻找绿色无公害饲料添加剂已成为畜牧业迫切需要解决的问题。
猪肠道含有大量的益生菌、致病菌等不同类型微生物，正常情况下肠屏障功能阻止细菌和内毒素侵入机体。目前集约化养猪过程中，存在高密度、机械应激、妊娠等大量不同类型应激因素，首先引起肠道菌群失调，饲料消化吸收利用率降低，排泄物容易引起二次污染，若肠道菌群不及时恢复正常，最终导致病原微生物侵入机体，引发疾病。
枯草杆菌等益生菌可通过优化或调节肠道菌群来缓解应激对肠道的刺激，不仅增强肠道免疫屏障功能，还有促进饲料营养消化吸收作用。此外，大豆皂苷等低聚糖具有选择性促进益生菌增殖、优化肠道菌群、改善肠道微环境功能。双歧杆菌等益生菌可利用低聚糖,而一些有害细菌如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等对大多数益生元很难加以利用低聚糖，大豆皂苷主要存在于豆科植物中，约占大豆干重0.6-6.2％，大豆是猪饲料的主要原料之一，但有关筛选充分利用大豆皂苷益生菌菌种的报道少见。
目前制约益生产品难发挥其应有的作用的因素较多，主要表现为异源菌种适应环境黏附定植和快速繁殖能力差，菌种单一；同源细菌对环境抗逆性差，益生菌在储存加工过程中容易失活，这也是制约当前益生菌制剂推广应用的共性关键技术问题。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种将健康猪肠道益生菌通过微波、大豆皂苷环境训化，制备具有抗逆性强、提高猪肠道屏障功能和免疫功能的同源益生菌复合物方法及应用。
本发明采用的技术方案为：一种猪源益生菌复合物的制备，所述益生菌复合物成分包括枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌；复合物制备步骤如下：
步骤a、将枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌活化后，菌液浓度达到对数生长期1-2×109cfu/ml；
步骤b、将步骤a所得的菌液离心，弃上清液，收集菌泥；
步骤c、将上述菌泥和保护剂按质量比1：2～5混合均匀，搅拌使保护剂充分与菌体接触，在﹣20℃～-50℃、50-80Pa条件下冷冻干燥成粉制剂，即得益生菌复合物。
优选的，所述步骤c中保护剂大豆皂苷、海藻糖和L-盐酸半胱氨酸，其按重量分数比为1：(1～5)：(0.5～3)。
优选的，所述益生菌复合物来源于猪肠道，并经过分离、训化制备得到。
优选的，所述益生菌复合物从猪肠道的分离步骤包括：
步骤A、从健康猪肠道取一定量内容物，加入生理盐水，以220r/min速度摇床震荡30min，得到第一混悬液，再取上述混悬液加入生理盐水稀释、摇床震荡，重复以上稀释过程5-8次，取最终稀释混悬液1mL加至碳酸钙MRS培养基中，37℃温度下培养48h，得到益生菌MRS培养液；
步骤B、取上述益生菌MRS培养液，以600w 450MHz微波炉辐照30s，得第二混悬液，取第二混悬液0.1～20mL，加至碳酸钙MRS培养基37℃培养48h，重复以上辐照和培养5～15次，得到最终辐照后混悬液；
步骤C、再取上述最终辐照后混悬液加入生理盐水，混匀，加至碳酸钙MRS培养基37℃培养48h，重复以上辐照和培养过程3～6次，分别吸取10-5、10-6、10-7三个稀释梯度的混悬液，分别与冷却至45℃含有碳酸钙MRS培养基混合均匀，待其完全凝固，37℃培养48h；从接种三种浓度混悬液的细菌培养物中选取边缘整齐且有明显溶钙圈或表面褶皱凸起的单个菌落，革兰氏染色镜检；
步骤D、将革兰氏染色镜检检测出的阳性杆菌接种于MRS固体培养基，37℃培养48h，观察待检菌株培养性状并进行镜检；重复上述培养操作，直至得到纯化菌株，经16srDNA测序和同源性分析，获得植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌菌种。
优选的，所述益生菌复合物从猪肠道的分离后的训化步骤包括：将植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌分别接种于含大豆皂苷0.5～2.0％MRS培养液，37℃培养24h；反复接种培养10～25次后，接种MRS平板培养基；再将单个菌落接种于含大豆皂苷0.5～2.0％MRS培养液，37℃培养24h。
优选的，所述益生菌复合物应用于提高猪肠道屏障功能和免疫功能。
优选的，所述猪为断奶仔猪。
优选的，所述步骤A中第一混悬液与生理盐水的体积比为1:9，内容物与生理盐水的质量比为1:9；所述步骤C中最终辐照后混悬液与生理盐水的体积比为1:9。
本发明获得的有益效果为：本益生菌复合物来自健康猪肠道并经过分离、训化后得到，具有抗逆性强、不容易失活，能显著提高猪肠道屏障功能和调节肠道菌群的作用，尤其适合断奶仔猪。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
一种猪源益生菌复合物的制备，所述益生菌复合物成分包括枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌；复合物制备步骤如下：
步骤a、将枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌活化后，菌液浓度达到对数生长期1-2×109cfu/ml；
步骤b、将步骤a所得的菌液离心，弃上清液，收集菌泥；
步骤c、将上述菌泥和保护剂按质量比1：2～5混合均匀，搅拌使保护剂充分与菌体接触，在﹣20℃～-50℃、50-80Pa条件下冷冻干燥成粉制剂，即得益生菌复合物。
所述步骤c中保护剂大豆皂苷、海藻糖和L-盐酸半胱氨酸，其按重量分数比为1：(1～5)：(0.5～3)。
所述益生菌复合物来源于猪肠道，并经过分离、训化制备得到。
所述益生菌复合物从猪肠道的分离步骤包括：
步骤A、从健康猪肠道取一定量内容物，加入生理盐水，以220r/min速度摇床震荡30min，得到第一混悬液，再取上述混悬液加入生理盐水稀释、摇床震荡，重复以上稀释过程5-8次，取最终稀释混悬液1mL加至碳酸钙MRS培养基中，37℃温度下培养48h，得到益生菌MRS培养液；
步骤B、取上述益生菌MRS培养液，以600w 450MHz微波炉辐照30s，得第二混悬液，取第二混悬液0.1～20mL，加至碳酸钙MRS培养基37℃培养48h，重复以上辐照和培养5～15次，得到最终辐照后混悬液；
步骤C、再取上述最终辐照后混悬液加入生理盐水，混匀，加至碳酸钙MRS培养基37℃培养48h，重复以上辐照和培养过程3～6次，分别吸取10-5、10-6、10-7三个稀释梯度的混悬液，分别与冷却至45℃含有碳酸钙MRS培养基混合均匀，待其完全凝固，37℃培养48h；从接种三种浓度混悬液的细菌培养物中选取边缘整齐且有明显溶钙圈或表面褶皱凸起的单个菌落，革兰氏染色镜检；
步骤D、将革兰氏染色镜检检测出的阳性杆菌接种于MRS固体培养基，37℃培养48h，观察待检菌株培养性状并进行镜检；重复上述培养操作，直至得到纯化菌株；
所述益生菌复合物从猪肠道的分离后的训化步骤包括：将植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌分别接种于含大豆皂苷0.5～2.0％MRS培养液，37℃培养24h；反复接种培养10～25次后，接种MRS平板培养基；再将单个菌落接种于含大豆皂苷0.5～2.0％MRS培养液，37℃培养24h。
所述益生菌复合物应用于提高猪肠道屏障功能和免疫功能；所述猪为断奶仔猪。
所述步骤A中第一混悬液与生理盐水的体积比为1:9，内容物与生理盐水的质量比为1:9；所述步骤C中最终辐照后混悬液与生理盐水的体积比为1:9。
具体实施时：
1.益生菌复合物菌种筛选
1.1细菌分离鉴定
细菌分离培养：步骤A、从健康藏香猪肠道取10g内容物，加入90mL生理盐水，摇床(220r/min)震荡30min，得到第一混悬液。再取1mL第一混悬液加入9mL生理盐水稀释、摇床震荡；重复以上稀释过程6次，取最终稀释混悬液1m L，加至碳酸钙MRS培养基37℃培养48h，得到益生菌MRS培养液。
步骤B、取上述益生菌MRS培养液20mL，以600w 450MHz微波炉辐照30s，得第二混悬液，取第二混悬液1mL，加至碳酸钙MRS培养基37℃培养48h，重复以上辐照和培养10次，得到最终辐照后混悬液；
步骤C、再取上述最终辐照后混悬液1mL加入9mL生理盐水，混匀，加至碳酸钙MRS培养基37℃培养48h，重复以上辐照和培养过程6次，分别吸取10-5、10-6、10-7三个稀释梯度的混悬液，分别与冷却至45℃含有碳酸钙MRS培养基混合均匀，待其完全凝固，37℃培养48h；从接种三种浓度混悬液的细菌培养物中选取边缘整齐且有明显溶钙圈或表面褶皱凸起的单个菌落，革兰氏染色镜检；
步骤D、将革兰氏染色镜检检测出的阳性杆菌接种于MRS固体培养基，37℃培养48h，观察待检菌株培养性状并进行镜检；重复上述培养操作，直至得到纯化菌株；
生化试验：无菌挑取MRS固体培养基上纯化的单个菌落至葡萄糖、乳糖、半乳、果糖、蔗糖、麦芽糖、鼠李糖、阿拉伯糖、山梨醇、纤维二糖、甘露醇、棉籽糖、木糖、七叶灵14种细菌微量生化发酵管，然后进行接触酶试验、硝酸盐还原试验，37℃厌氧培养24h后观察实验结果。参照《伯杰细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》进行结果判定。
16S rDNA PCR扩增：按照DNA抽提试剂盒说明书提取DNA。
以DNA为模板PCR扩增16S r DNA序列。引物序列为27F 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和1492R5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT－3'，
由奥美德诺(北京)基因科技有限公司合成，预扩增片段长度为1500bp左右。PCR扩增体系(总体积为25μL):2×预混酶(含染料)12.5μL，10μmol/L上下游引物各0.5μL，DNA模板3μL，无核酸酶水8.5μL。PCR扩增程序:95℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃再延伸7min；4℃冷藏。取5μL PCR扩增产物加到1.0％琼脂糖凝胶加样孔(含5％荧光染色剂溴化乙锭)中进行电泳，电泳条件为电压110V、电泳液1×TAE缓冲液。电泳结束后，将通过凝胶成像仪观察胶板目的基因条带。利用Gen Bank进行同源性比对分析，确定分离菌株的类别。
经细菌培养性状观察及形态学特征检测，从猪肠道分离4株疑似益生菌，菌落具有益生菌特征，镜检为革兰氏阳性杆菌；生化试验反应结果与鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌相符；利用Gen Bank进行同源性比对分析，确定1株为植物乳杆菌，1株为枯草芽孢杆菌。
1.2益生菌菌种驯化选育
将植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌2株益生菌菌悬液分别接种于含大豆皂苷1.0％MRS培养液，37℃培养24h；反复接种培养20次后，接种MRS平板培养基，再将单个菌落接种于含大豆皂苷1.0％MRS培养液，37℃培养24h，依照国家标准GB 4789.2-94进行菌落计数，筛选生长速度快的益生菌的菌株。
表1益生菌驯化选育结果
Figure BDA0002306122000000081
注：同行肩标字母不同的表示差异显著(p<0.05)
试验结果表明，与未经驯化菌株相比，筛选益生菌的菌株生长速度出现显著变化。
2.益生菌复合物的制备
分别将枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌活化后，菌液浓度达到对数生长期1-2×109cfu/ml；将100ml菌液离心，弃上清,收集菌泥；将菌泥和保护剂按1：2混合均匀，使保护剂充分与菌体接触，﹣40℃、50-80Pa条件下冷冻干燥成粉制剂。保护剂主要成分为大豆皂苷、海藻糖、L-盐酸半胱氨酸，混合比例为1：3：1。
3.益生菌复合物功能测定
3.1试验设计选择健康状况良好、体重均匀的“杜×长×大”杂交断奶仔猪18头，随机分为2个组，每组6个重复，单栏饲养。对照组仅饲喂基础饲粮；试验组饲喂向基础饲粮添加0.1％益生菌复合物，其它饲养管理方式均相同。饲养过程中记录并统计断奶猪的腹泻率和疾病防治费。饲喂1个月后，每组随机选择5头猪，前腔静脉采血10ml，宰杀后，取其粪便和5cm十二指肠和空肠。血液4000×g离心10min，取上清，-20℃保存。采用ELISA法测定猪血清总蛋白、血清白蛋白、IL-2含量。利用ELISA法测定十二指肠超氧化物歧化酶的含量，参照国家标准GB 4789.2-94，检测肠道内容物乳酸菌、沙门氏菌、大肠杆菌的含量；利用高效液相色谱方法检测肠道内容物短链脂肪酸的含量；将肠道置于福尔马林，进行常规HE染色，检测肠道绒毛高度、隐窝深度，并求其比值。
3.2试验结果
3.2.1益生菌复合物对断奶仔猪肠道菌群影响
表1：益生菌复合物对断奶仔猪肠道菌群影响
注：同列肩标字母不同的表示差异显著(p<0.05)
断奶仔猪基础日粮添加益生菌复合物后，其肠道乳酸菌数量显著增加，沙门氏菌、大肠杆菌等有害菌群的数量显著减少，肠道短链脂肪酸有增加趋势，但差异不显著，这表明益生菌复合物具有改善断奶仔猪肠道菌群功能。
3.2.2益生菌复合物对猪肠道屏障功能影响
表2：益生菌复合物对断奶仔猪免疫功能影响
Figure BDA0002306122000000092
注：同列肩标字母不同的表示差异显著(p<0.05)
断奶仔猪基础日粮添加益生菌复合物后，其肠道十二指肠绒毛高度与隐窝深度比值和超氧化物歧化酶活性升高；猪血清总蛋白、血清白蛋白含量以及十二指肠肠粘膜IL-2含量增加，这表明益生菌复合物具有改善断奶仔猪肠道结构和免疫功能。
3.2.3益生菌复合物对断奶仔猪免疫功能影响
表3：益生菌复合物对断奶仔猪腹泻率和疾病防治费影响
Figure BDA0002306122000000101
注：同列肩标字母不同的表示差异显著(p<0.05)
断奶仔猪基础日粮添加益生菌复合物能显著降低仔猪腹泻的发生率和疾病防治费，这表明益生菌复合物具有提高养殖效益的功效；这与益生菌复合物具有改善断奶仔猪肠道结构和免疫功能及肠道菌群相符。

Claims (8)

1.一种猪源益生菌复合物的制备，其特征在于：所述益生菌复合物成分包括枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌；复合物制备步骤如下：
步骤a、将枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌活化后，菌液浓度达到对数生长期1-2×109cfu/ml；
步骤b、将步骤a所得的菌液离心，弃上清液，收集菌泥；
步骤c、将上述菌泥和保护剂按质量比1：2～5混合均匀，搅拌使保护剂充分与菌体接触，在﹣20℃～-50℃、50-80Pa条件下冷冻干燥成粉制剂，即得益生菌复合物。
2.根据权利要求1所述一种猪源益生菌复合物的制备，其特征在于：所述步骤c中保护剂大豆皂苷、海藻糖和L-盐酸半胱氨酸，其按重量分数比为1：(1～5)：(0.5～3)。
3.根据权利要求1所述一种猪源益生菌复合物的制备，其特征在于：所述益生菌复合物来源于猪肠道，并经过分离、训化制备得到。
4.根据权利要求3所述一种猪源益生菌复合物的制备，其特征在于：所述益生菌复合物从猪肠道的分离步骤包括：
步骤A、从健康猪肠道取一定量内容物，加入生理盐水，以220r/min速度摇床震荡30min，得到第一混悬液，再取上述混悬液加入生理盐水稀释、摇床震荡，重复以上稀释过程5-8次，取最终稀释混悬液1mL加至碳酸钙MRS培养基中，37℃温度下培养48h，得到益生菌MRS培养液；
步骤B、取上述益生菌MRS培养液，以600w 450MHz微波炉辐照30s，得第二混悬液，取第二混悬液0.1～20mL，加至碳酸钙MRS培养基37℃培养48h，重复以上辐照和培养5～15次，得到最终辐照后混悬液；
步骤C、再取上述最终辐照后混悬液加入生理盐水，混匀，加至碳酸钙MRS培养基37℃培养48h，重复以上辐照和培养过程3～6次，分别吸取10-5、10-6、10-7三个稀释梯度的混悬液，分别与冷却至45℃含有碳酸钙MRS培养基混合均匀，待其完全凝固，37℃培养48h；从接种三种浓度混悬液的细菌培养物中选取边缘整齐且有明显溶钙圈或表面褶皱凸起的单个菌落，革兰氏染色镜检；
步骤D、将革兰氏染色镜检检测出的阳性杆菌接种于MRS固体培养基，37℃培养48h，观察待检菌株培养性状并进行镜检；重复上述培养操作，直至得到纯化菌株，经16s rDNA测序和同源性分析，获得植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌菌种。
5.根据权利要求4所述一种猪源益生菌复合物的制备，其特征在于：所述益生菌复合物从猪肠道的分离后的训化步骤包括：将植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌分别接种于含大豆皂苷0.5～2.0％MRS培养液，37℃培养24h；反复接种培养10～25次后，接种MRS平板培养基；再将单个菌落接种于含大豆皂苷0.5～2.0％MRS培养液，37℃培养24h。
6.一种猪源益生菌复合物的应用，其特征在于：所述益生菌复合物应用于提高猪肠道屏障功能和免疫功能。
7.根据权利要求6所述一种猪源益生菌复合物的应用，其特征在于：所述猪为断奶仔猪。
8.根据权利要求4所述一种猪源益生菌复合物的制备，其特征在于：所述步骤A中第一混悬液与生理盐水的体积比为1:9，内容物与生理盐水的质量比为1:9；所述步骤C中最终辐照后混悬液与生理盐水的体积比为1:9。
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Title
靳爱红: "猪源益生菌分离鉴定及复合物筛选", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *

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