CN102839136B - 一种约氏乳杆菌及其制剂与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种约氏乳杆菌及其制剂和用途，还公开了本发明菌株的优化培养基及菌株冻干制剂的制备方法。本发明的约氏乳杆菌ZLJ010的微生物保藏编号为CGMCC No.5762。本发明菌株遗传基础明确，具有生长好、产酸、耐酸、耐热和抑菌能力强的特性。本发明菌株冻干制剂作为母猪的饲料添加剂，可以改善母猪的肠道健康，降低粪便中有害菌数量，提高机体的免疫力，提高母猪的生产性能。

Description

一种约氏乳杆菌及其制剂与应用

【技术领域】

本发明属微生物领域，特别涉及一种约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）ZLJ010菌株及其制剂在畜禽微生物饲料添加剂中的应用。

【背景技术】

在养猪生产中，母猪占有很重要的地位，母猪的健康状况和繁殖性能直接影响猪场的生产水平和经济效益。有资料分析，每头母猪年提供仔猪的数量越多，仔猪分摊的母猪生产成本就越低，年提供16头仔猪的生产成本，要比提供22头仔猪的多52%。因此，通过技术创新，提高母猪的繁殖性能具有重要意义。若有针对性地研发出高效益生菌制剂，调控好母猪肠道菌群平衡，促进饲料营养的吸收和新陈代谢，减少粪便中有害菌的排出量，就有可能提高胎儿及哺乳仔猪的成活率和增重速度，从而提高母猪的窝产仔数、窝断奶头数及断奶窝重等繁殖指标。

但目前国内外关于益生菌的研究与应用多集中在仔猪上，很少见在母猪上的研究与报道。而实际生产中，母猪承担着复杂而繁重的繁殖仔猪任务，再加之当前的集约化饲养方式限制了母猪的自由活动，很容易引起母猪肠道菌群失调、免疫力下降、体况变差、出现便秘和厌食等情况，严重者还影响母猪下一个繁殖周期的生产；另外，新生仔猪通过母猪产道、采食母乳、环境接触等在肠道内定植多种菌群，如果母猪肠道菌群失调，会有大量的有害菌随粪便排出，这就增加了仔猪接触有害菌的几率，进而影响哺乳仔猪的身体健康和增重速度。

约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）是乳酸杆菌属（Lactobacillus）中的种群之一，是安全级（generally regarded as safe,GRAS）的有益菌。张凤华等从小鸡肠道中分离出一株约氏乳杆菌（HN/0711），但没有报道其特性；孙晓雯等从猪粪中分离到一株约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii Sun001），发现该菌在pH2.5的模拟胃液中处理3h，存活率仅为68.8%；苗玉和等从仔猪肠道中分离到一株约氏乳杆菌（LY7株），发现该菌在37℃、pH 5.7、接种量2%、培养18h后的活菌数达到4.7×10⁸CFU/mL；申请号为201110416416.8，发明名称为约氏乳杆菌及其菌剂、应用和预混料中公开了以约氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、短小芽孢杆菌制成的混合菌剂在仔猪饲养中的应用。显然这些研究还是初步的，如何制备出能够在母猪养殖生产中效果好且使用方便的益生菌制剂，尚需要进一步研究。

【发明内容】

本发明针对母猪饲喂，提供了一种可培养、生长好，且具有较强的产酸、耐酸、耐热及具有抑菌作用的约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）ZLJ010，同时对其培养基、冻干制剂和生产工艺进行优化。

本发明提供了一种约氏乳杆菌ZLJ010菌株，其微生物保藏编号为：CGMCC No.5762。

所述约氏乳杆菌ZLJ010具有以下特性：

①在35℃下培养16h后，进入生长稳定期；

②在35℃下培养30h后，pH达到3.85；

③在人工胃液及人工肠液中处理2～4h，活菌数在10⁹CFU/mL以上；

④在65℃下处理30～60s，存活率在70.9%以上。

约氏乳杆菌ZLJ010在制备抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌药物或试剂中的用途。

约氏乳杆菌ZLJ010的培养基：

蔗糖20g、大豆蛋白胨20g、牛肉膏20g、酵母浸粉7.5g、无水乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g、K₂HPO₄·3H₂O 2g、MgSO₄·7H₂O 0.58g、MnSO₄·H₂O 0.19g、吐温-801mL、蒸馏水1000mL。

一种约氏乳杆菌冻干制剂，包括约氏乳杆菌ZLJ010和冻干保护剂。

所述约氏乳杆菌冻干制剂的优化方案为：

脱脂乳15.70g、海藻糖7.68g、L-半胱氨酸1.60g、乳糖4g、L-赖氨酸0.5g、谷氨酸钠1g、糊精5g、甘油1mL、蒸馏水100mL。

约氏乳杆菌冻干制剂的制备方法，包括如下工艺步骤：

①菌种活化：将于-70℃下保存的约氏乳杆菌ZLJ010以1%的接种量接种于液体培养基中，在35℃下培养18h后，为一级种子液；一级种子液再以1%的接种量接种于液体培养基中，于35℃下培养18h，为二级种子液，待用；

②扩大培养：将约氏乳杆菌ZLJ010的二级种子液以1%的接种量接种，在35℃下培养22h；

③离心：离心分离步骤②中扩大培养制得的发酵液，得到菌泥；

④乳化：将保护剂和菌泥混合均匀，采用高剪切分散乳化机乳化20min，制成菌悬液；

⑤真空冷冻干燥：乳化后的菌悬液先预冻2h，然后在冷凝温度为-50℃、真空度9Pa的条件下真空冷冻干燥20h，得冻干粉；

⑥冻干制剂：定时收取冻干粉，粉碎、分装，铝箔袋真空贮藏。

约氏乳杆菌ZLJ010在制备动物饲料添加物、动物用医疗组合物中的应用。

本发明提供的约氏乳杆菌ZLJ010具有以下特性：

①可培养、生长好：在35℃下培养16h后，进入生长稳定期；培养30h后，pH达到3.85；

②耐酸：在人工胃液及人工肠液中处理2～4h，活菌数在10⁹CFU/mL以上；

③耐热：在65℃下处理30～60s，存活率在70.9%以上；

④抑菌作用：对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌具有抑制作用。

本发明提供的约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii），保藏名称为：约氏乳杆菌ZLJ010，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏编号为CGMCC No.5762；保藏日期为2012年02月16日，菌种名称为：约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii，生物保藏存活信息：存活。

本发明优化了约氏乳杆菌ZLJ010的培养基配方：蔗糖20g、大豆蛋白胨20g、牛肉膏20g、酵母浸粉7.5g、无水乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g、K₂HPO₄·3H₂O2g、MgSO4·7H2O 0.58g、MnSO₄·H₂O 0.19g、吐温-801mL、蒸馏水1000mL。利用该培养基配方，可使该菌的培养效率大幅提高，活菌数不低于2.0×10⁹CFU/mL，是普通培养基效果的3～4倍。

本发明还筛选出了约氏乳杆菌ZLJ010的最优冻干保护剂配方：脱脂乳15.70g、海藻糖7.68g、L-半胱氨酸1.60g、乳糖4g、L-赖氨酸0.5g、谷氨酸钠1g、糊精5g、甘油1mL、蒸馏水100mL。利用该保护剂配方，可使该菌的冻干存活率达到87%以上，冻干粉活菌数达到6.0×10⁹CFU/g以上，是普通冻干保护剂效果的5～8倍。减少了约氏乳杆菌的冻干损失，提高了冻干粉的活菌数，降低了菌剂的单位生产成本。

在母猪怀孕90d至母猪哺乳25d断奶这个特殊的生理阶段，在日粮（粉料）中添加约氏乳杆菌ZLJ010冻干制剂，使日粮中的活菌数达到6.0×10⁹CFU/kg，母猪的窝产活仔数提高了7.71%（0.81头），窝断奶仔猪数提高了9.33%（0.88头），活仔率提高了3个百分点，仔猪25d断奶个体重提高了0.14kg，母猪的便秘率下降，母猪粪便中的有害细菌数量大幅度下降，其中：大肠杆菌数量下降了54.67%，金黄色葡萄球菌数量下降了35.91%，母猪的血清IgG含量提高了14.68%，母猪血清中的结合珠蛋白水平降低了11.29%，饲喂约氏乳杆菌制剂后，改善了母猪的健康状况，有利于繁殖潜能的发挥。

在母猪妊娠后期和哺乳期日粮中添加约氏乳杆菌制剂后，母猪的肠道健康改善，粪便中有害菌数量下降，机体免疫力提升，母猪生产能力提高，有利于猪场生产成本的降低和生产效益的提高。

附图说明

图1约氏乳杆菌ZLJ010菌体及菌落图片，图1a为MRS培养基，于37℃下，培养48h后的菌体形态（革兰氏染色），图1b为MRS培养基，于37℃下，培养48h后的菌落形态；

图2约氏乳杆菌ZLJ010培养过程OD_600nm变化曲线；

图3约氏乳杆菌ZLJ010培养过程pH变化曲线。

【具体实施方式】

实施例1分离、筛选与鉴定猪源约氏乳杆菌ZLJ010

从北京某标准化种猪场内，采集健康的妊娠后期和哺乳期母猪新鲜粪便，放入无菌袋中，立刻用冷藏盒带回实验室。称取1g粪样加入已灭菌的99mL无菌生理盐水中，混匀。取1mL悬液，用无菌生理盐水分别稀释为10^-5、10^-6、10^-7，各取0.1mL分别涂布于MRS固体培养基、SL固体培养基和LBS固体培养基上，37℃厌氧培养。48h后挑取疑似乳杆菌的乳白色菌落，进行厌氧纯培养。48h后，挑取半个培养后的菌落进行H₂O₂酶试验和革兰氏染色镜检，凡是革兰氏染色阳性、H₂O₂酶试验阴性、菌体形态为杆状的菌株可初步确定为乳杆菌。然后将剩下的半个菌落进行划线培养，直至确定为纯菌，然后对分离得到的116株菌进行分类编号，并进行冷冻保存。

对分离得到的116株菌，通过产酸、耐酸和耐胆盐试验，筛选出了综合特性最好的一株乳杆菌，送到中国微生物菌种保存中心进行鉴定。中国工业微生物菌种保藏管理中心对该菌株进行了形态学特征、生理生化特征和pheS基因序列系统发育分析，鉴定为：约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）。该菌株的理化特征见表1，DNA序列见序列表1。

菌株的菌体和菌落形态见图1。在MRS固体培养基上，该菌菌落呈乳白色、不规则、凸起、湿润、液滴状、不透明、边缘不整齐。菌体呈杆状，0.68×1.46～3.65μm，单个、成对或成链状排列；革兰氏染色阳性。

表1约氏乳杆菌ZLJ010的生理生化特征

注：表中“＋”表示≥90％菌株阳性，“-”表示≥90％菌株阴性，“+^w”表示偏阳性。

菌种ZLJ010保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏信息如下：

菌株名称：约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii

保藏名称：约氏乳杆菌ZLJ010

保藏日期：2012年02月16日

生物保藏存活信息：存活

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所

邮政编码：100101

保藏编号：CGMCC No.5762

实施例2测定约氏乳杆菌ZLJ010的生物特性

2.1生长曲线

采用OD_600nm和pH值为指标，测定了约氏乳杆菌ZLJ010的生长特性。结果见图2约氏乳杆菌ZLJ010培养过程OD_600nm变化曲线，图3约氏乳杆菌ZLJ010培养过程pH变化曲线。

由图2、图3可知，约氏乳杆菌ZLJ010在4～12h期间，菌液OD_600nm值迅速增加，pH值迅速下降；12~16h期间，菌液OD_600nm和pH值变化逐渐减小，说明已经达到对数生长末期；16h以后OD_600nm和pH值变化不明显，表明该菌进入了生长稳定期。

2.2耐酸性试验

2.2.1人工胃液的配制：氯化钠0.2g、胃蛋白酶1g，用pH2.0或pH3.0的稀盐酸溶液100mL充分溶解后，用微孔滤膜过滤除菌，待用。

2.2.2将约氏乳杆菌ZLJ010接种于本发明的液体培养基中，35℃培养24h，取3mL菌液，10000r/min离心5min，弃上清液，分别加入已灭菌的含有生理盐水（pH 6.5）和已过滤除菌的不同pH的人工胃液3mL，37℃保温，在0h、2h、4h取样进行平板菌落计数，结果见表2。

表2约氏乳杆菌ZLJ010对人工胃液耐受性结果（lg CFU/mL)

由表2可知，约氏乳杆菌ZLJ010在pH2.0和pH3.0的人工胃液中，存活率较高，作用2h和4h后，活菌数可保持在10⁹CFU/mL以上。说明约氏乳杆菌ZLJ010有较强的耐酸性，能适应动物的胃酸环境。

2.3耐人工肠液试验

2.3.1人工肠液的配制：磷酸二氢钾0.68g，加蒸馏水溶解，用0.4%的氢氧化钠溶液调节pH值，至体积为100mL，pH6.8。然后加1g胰蛋白酶，充分溶解后用微孔滤膜过滤除菌，待用。

2.3.2将约氏乳杆菌ZLJ010接种于本发明的液体培养基中，35℃培养24h，取3mL菌液，10000r/min，离心5min，弃上清，分别加入已灭菌的含有生理盐水和已过滤除菌的人工肠液（PH6.8）中，37℃保温，在0h、2h、4h取样进行平板菌落计数，结果见表3。

表3约氏乳杆菌ZLJ010对人工肠液耐受性结果（lg CFU/mL)

由表3可知，约氏乳杆菌ZLJ010在人工肠液中作用，其活菌数没有显著变化，活菌数超过10⁹CFU/mL，说明约氏乳杆菌ZLJ010不受人工肠液的影响，能适应动物的肠道环境。

2.4耐热试验

约氏乳杆菌ZLJ010在65℃条件下保持30s、40s、50s和60s时，存活率为87.42%、85.87%、81%和70.9%；在70℃条件下作用30s、40s、50s和60s时，存活率为38.95%、27.79%、7.34%和4.77%；在80℃条件下作用30s，其活性仅有0.1%。由存活率来看，外界温度65℃时，短时间内对该约氏乳杆菌的损伤较小，而70℃以上对该菌损伤较大。

2.5抑菌试验

采用牛津杯法进行抑菌试验，发现该约氏乳杆菌ZLJ010的发酵液对10⁶CFU/mL活性的有害菌——大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有较强的抑制作用，抑菌圈直径分别达到20.1mm、18.7mm和16.0mm。

实施例3制备约氏乳杆菌制剂

乳酸菌制剂以冻干粉的形式添加到猪的日粮中，效果好且方便，一则因为冻干状态的乳酸菌制剂便于储藏，活性稳定；二则因为固态的制剂便于向饲料中添加，利于混合均匀。而在冻干制剂的生产过程中，培养基配方、冻干保护剂以及冻干工艺是三个重要技术环节，直接影响生产过程中的活菌存活率、冻干制剂活菌数以及单位生产成本。本发明对这三个技术环节进行了技术改进，取得了显著效果。

3.1改进约氏乳杆菌ZLJ010的培养基

针对约氏乳杆菌ZLJ010的生物学特性，以MRS培养基为基础配方，采用正交试验设计L₁₆(4⁵)法，对其中的蔗糖、大豆蛋白胨、酵母浸粉和牛肉膏用量进行了优化筛选。最终筛选出效果最佳的培养基配方为：蔗糖20g、大豆蛋白胨20g、牛肉膏20g、酵母浸粉7.5g、无水乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g、K₂HPO₄·3H₂O 2g、MgSO₄·7H₂O 0.58g、MnSO₄·H₂O 0.19g、吐温-801mL、蒸馏水1000mL。将以上成分混合，加热溶解，校正pH6.5，分装，121℃高压灭菌15min。用此培养基培养的约氏乳杆菌，活菌数不低于2.0×10⁹CFU/mL，是普通培养基效果的3～4倍。

3.2优化约氏乳杆菌ZLJ010的冻干保护剂

采用响应曲面法，对约氏乳杆菌冻干粉的冻干保护剂成分进行了优化。用Plackett-Burman设计，发现脱脂乳、海藻糖和L-半胱氨酸等物质对约氏乳杆菌ZLJ010的存活率有影响显著，利用最陡爬坡法逼近最大响应区域，由中心组合设计和响应面法分析确定最优冻干保护剂的复配比例，即：脱脂乳15.70g、海藻糖7.68g、L-半胱氨酸1.60g、乳糖4g、L-赖氨酸0.5g、谷氨酸钠1g、糊精5g、甘油1mL、蒸馏水100mL。用该配方，可使约氏乳杆菌ZLJ010的冻干存活率达到87%以上，冻干粉活菌数达到6.0×10⁹CFU/g以上，是普通冻干保护剂效果的5～8倍。

3.3优化约氏乳杆菌ZLJ010的冻干工艺

①菌种活化：将于-70℃下保存的ZLJ010菌种以1%的接种量接种于50mL培养基中，于35℃下培养18h，为一级种子液；一级种子液再以1%的接种量接种于3瓶400mL的液体培养基中，在35℃下培养18h，为二级种子液，待用；

②扩大培养：配制45L液体培养基，分装于三角瓶中，高压灭菌；

将约氏乳杆菌ZLJ010二级种子液，以1%的接种量分别接种于每个三角瓶中，于35℃下培养22h；

或者配制30L液体培养基，装入发酵罐中，高压灭菌，将约氏乳杆菌ZLJ010二级种子液以1%的接种量接种，35℃下培养22h；

③离心：在19000pm条件下以管式离心机分离步骤②中制得的发酵液，得到菌泥；

④乳化：将保护剂和菌泥混合均匀，采用高剪切分散乳化机以4000rpm/min，乳化20min；

⑤真空冷冻干燥：乳化好的菌悬液先预冻2h，然后在冷凝温度为-50℃、真空度9Pa的条件下真空冷冻干燥，时间为20h，得冻干粉；

⑥冻干制剂：定时收取冻干粉，粉碎、分装，铝箔袋真空贮藏。

3.4约氏乳杆菌ZLJ010冻干制剂的耐酸和耐胆盐试验

在225mL的人工胃液（pH2.0）中和225mL的猪胆盐溶液（0.3%）中，分别加入25g的约氏乳杆菌ZLJ010冻干制剂，混合均匀，37℃保温，在0h、2h、4h和6h时，分别取样进行平板菌落计数，结果见表4。

表4约氏乳杆菌ZLJ010冻干制剂耐酸、耐胆盐试验结果（lg CFU/mL)

由表4可见，在2～6h内，约氏乳杆菌ZLJ010冻干制剂在人工胃液（pH2.0）或猪胆盐溶液（0.3%）中的活菌数没有显著变化，均在10⁹CFU/mL以上，说明约氏乳杆菌ZLJ010冻干制剂具有耐酸和耐胆盐特性，能适应动物的胃肠道环境。

3.5约氏乳杆菌ZLJ010冻干制剂的安全性检验

将约氏乳杆菌ZLJ010冻干制剂送至农业部兽药安全监督检验测试中心（北京）进行了安全性检验，经大鼠、小鼠经口急性毒性试验，结果证明：猪源约氏乳杆菌冻干制剂对于大鼠、小鼠经口LD₅₀大于5000mg/kg体重，说明猪源约氏乳杆菌ZLJ010冻干制剂是安全的，可以用于动物饲喂。

实施例4约氏乳杆菌ZLJ010制剂对母猪健康及生产力的影响

4.1试验材料与方法

试验在北京某种猪场进行。

试验期：母猪妊娠第90d至母猪哺乳25d断奶这个特殊的生理阶段。选择健康且体况、胎次、预产期相近的妊娠后期大白猪母猪32头，随机分成2个组（对照组和试验组），每组16个重复，每个重复1头母猪。妊娠后期母猪采用限位栏饲养，每头每日饲喂饲料量3.5kg，每天7:00和14:00饲喂两次，自由饮水；母猪预产期前一周进入产房，产房为高床、漏缝式地板，室内温度18～22℃，仔猪采用保温箱保暖，仔猪哺乳25d后断奶。母猪产仔后的前3d采用限制饲养，分别喂以2.0、2.5和3.0kg/d饲料，3d后自由采食（以吃饱后料槽中略有剩料为准），日喂2次（5:30、13:30），母猪和仔猪均采用鸭嘴式饮水器自由饮水，免疫程序按常规进行。

对照组饲喂基础日粮；试验组在基础日粮中添加约氏乳杆菌ZLJ010冻干粉，混合均匀，使每千克饲料中有效活菌数达到6.0×10⁹CFU。日粮的组成及营养水平见表5。

表5母猪妊娠后期和泌乳期日粮组成及营养水平（风干基础）

注：1）妊娠母猪浓缩料为每千克饲料提供Cu 6mg；Fe 100mg；Zn 80mg；Mn 20mg；Se0.3mg；I 0.3mg；VA 4000IU；VD₃ 500IU；VE 60IU；VK 1mg；VB₁ 1mg；VB₂ 4mg；VB₆ 1mg；VB₁₂ 0.02mg；生物素0.2mg；叶酸1.5mg；烟酸12mg；泛酸12mg。

2）哺乳母猪浓缩料为每千克饲料提供Cu 10mg；Fe 120mg；Zn 100mg；Mn 25mg；I 0.5mg；Se 0.3mg；VA 8000IU；VD₃ 1000IU；VE 75IU；VK 1.5mg；VB₁ 1mg；VB₂ 4mg；VB₆ 2mg；VB₁₂ 0.02mg；生物素0.5mg；叶酸3.0mg；烟酸15mg；泛酸12mg。

3）粗蛋白质、钙、总磷和赖氨酸为实测值，其它营养水平数据为计算值。

4.2试验结果

母猪窝产活仔数、仔猪出生重、活仔率、断奶育成率和平均日增重是反映母猪生产能力的重要指标。试验结果见表6、表7。

表6饲粮中添加约氏乳杆菌制剂对母猪生产力的影响

注：①初生仔猪体重小于0.5kg计为弱仔；②同行肩标小写字母不同者，表示差异显著（P<0.05）。

由表6可知，饲粮中添加约氏乳杆菌ZLJ010制剂后，试验组母猪的窝产活仔数提高了7.71%（0.81头），窝断奶仔猪数提高了9.33%（0.88头），活仔率提高了3个百分点，仔猪25d断奶个体重提高了0.14kg，这些繁殖指标的提高，对整个养猪生产将带来显著效益。

表7日粮中添加约氏乳杆菌制剂对母猪肠道及粪便中菌群的影响

注：同行肩标小写字母不同者，表示差异显著（P<0.05）；大写字母不同者，表示差异极显著（P<0.01）。

由表7可见，日粮中添加了约氏乳杆菌ZLJ010制剂后，试验组母猪的便秘率下降了，母猪粪便中的有害细菌数量大幅度下降，其中：大肠杆菌数量下降了54.67%（P<0.01），金黄色葡萄球菌数量下降了35.91%（P<0.05），这对于当前备受关注的养殖环境改善非常有益。

IgG是血清免疫球蛋白的主要成分，是初级免疫应答中最持久、最重要的抗体。结合珠蛋白（Haptoglobin，HP）是动物机体内一种急性期蛋白，是评价动物机体健康状况的直接指标。该指标受饲养管理、饲养密度、环境、动物日龄及健康状况等因素的影响，其值越高，说明机体健康状况越差。在母猪日粮中添加约氏乳杆菌ZLJ010制剂，检测母猪血清中IgG及结合珠蛋白含量，结果见表8。

表8日粮中添加约氏乳杆菌制剂对母猪血清中IgG、结合珠蛋白的影响

注：同行肩标小写字母不同者，表示差异显著（P<0.05）。

由表8可见，试验组母猪的血清IgG含量提高了14.68%（P<0.05），试验组母猪血清中的结合珠蛋白水平比对照组低11.29%。说明饲喂约氏乳杆菌制剂后，母猪的机体免疫力得到了提高，改善了母猪的健康状况，有利于繁殖潜能的发挥。

综上所述，在母猪妊娠后期和哺乳期日粮中添加该约氏乳杆菌ZLJ010制剂后，试验组母猪的窝产活仔数、活仔率、窝断奶仔猪数、断奶个体重和机体免疫力水平等指标提高了，母猪肠道健康改善了，表现在母猪便秘率和粪便中的有害菌数量下降了。这些主要性能指标有利于母猪生产成本的降低和生产效益的提高。

序列表1

<110>北京市农林科学院

<120>一种约氏乳杆菌及其制剂与应用

<210>1

<211>484

<212>DNA

<213>约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）

<220>

<221>DNA

<222>(1)..(484)

<400>1

TCCCGGCCTC GTGATATGCA AGCAACTTTC TATATTGATG AGGAAAACTT  50

ACTTAGAACG CAAACGTCAG GAGATCAAGC TAGAGTTTTA GAAAAGCATG  100

ATTTTTCTAA AGGTCCATTA AAGATGGTTG GTCCAGGTAA GGTATATCGT  150

AGAGATGATG ATGATGCAAC TCACTCCCAC CAATTCCAGC AAATGGAAGG  200

CTTAGTAATC GATAAAAATG TTACTATGTC AGACCTTAAG GGAACTCTAG  250

AAATGATTGC CAAGCACGTT TTTGGTCAAG ATCGCAAGAC TCGTCTTCGT  300

CCATCTTACT TCCCATTTAC TGAACCATCA GTTGAAATGG ATGTTTCTTG  350

TTTTAATTGT GATGGTAAGG GGTGTCCAAT TTGTAAGTAT ACTGGCTGGA  400

TCGAAGTACT TGGTGCTGGT ATGGTTCACC CAAATGTTTT AGAAAATGCT  450

GGTGTAGATT CAACAGTCTA TGGTGGTTTT GCTT                   484

Claims (6)

1.一种约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii ZLJ010菌株，其微生物保藏编号为：CGMCC No. 5762；

所述约氏乳杆菌ZLJ010：

①在35℃下培养16h后，进入生长稳定期；

②在35℃下培养30h后，pH达到3.85；

③在人工肠液及人工胃液中处理2～4 h，活菌数在10⁹ CFU/mL以上；

④在65℃下处理30～60 s，存活率在70.9%以上。

2.权利要求1中所述的约氏乳杆菌在制备抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌试剂中的应用。

3.一种约氏乳杆菌冻干制剂，包括保藏号为CGMCC No. 5762的约氏乳杆菌ZLJ010和冻干保护剂。

4.如权利要求3所述的约氏乳杆菌冻干制剂，其特征在于：所述的冻干保护剂的优化方案为：脱脂乳15.70g、海藻糖7.68g、L-半胱氨酸1.60g、乳糖4g、L-赖氨酸0.5g、谷氨酸钠1g、糊精5g、甘油1mL、蒸馏水100mL。

5.一种如权利要求3所述的约氏乳杆菌冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下工艺步骤：

①菌种活化：将于-70℃下保存的约氏乳杆菌ZLJ010以1%的接种量接种于液体培养基中，在35℃下培养18h后，为一级种子液；一级种子液再以1%的接种量接种于液体培养基中，于35℃下培养18h，为二级种子液，待用；

②扩大培养：将约氏乳杆菌ZLJ010的二级种子液以1%的接种量接种，于35℃下培养22h；

③离心：离心分离步骤②中制备的发酵液，得到菌泥；

④乳化：将保护剂和菌泥混合均匀，采用高剪切分散乳化机乳化20 min，得到菌悬液；

⑤真空冷冻干燥：乳化后的菌悬液先预冻2h，然后在冷凝温度为-50℃、真空度9Pa的条件下真空冷冻干燥20 h，得冻干粉；

⑥冻干制剂：定时收取冻干粉，粉碎、分装，铝箔袋真空贮藏。

6.如权利要求1所述的约氏乳杆菌在制备动物饲料添加物、动物用医疗组合物中的应用。