CN103283974A - 一种保加利亚乳杆菌活菌制剂的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种保加利亚乳杆菌活菌制剂的生产方法，属于微生物技术领域，具体涉及一种保加利亚乳杆菌微生态制剂的液体厌氧发酵生产方法。它包括以下步骤：采用保加利亚乳杆菌作为发酵菌种，接种于经过优化的液体培养基中，在温度为37~42℃的条件下培养12~14h，放罐并测定活菌数，用植物淀粉吸附发酵液，经干燥后粉碎和包装，制成活性稳定的保加利亚乳杆菌制剂。本发明的优点：用普通发酵罐即可完成保加利亚乳杆菌的高密度发酵，操作简单，效果稳定，能耗低；不用离心机和冷冻干燥机等设备，降低了生产成本，提高了生产效率。

Description

一种保加利亚乳杆菌活菌制剂的生产方法

 

技术领域

本发明涉及微生物发酵工程领域，具体地说是一种液体培养基经保加利亚乳杆菌厌氧发酵制备益生菌饲料添加剂的方法。

 

背景技术

保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）是一种被冠以国名的细菌，属于乳杆菌属德式乳杆菌的一个亚种，革兰氏阳性的厌氧性细菌。菌体长2~9μm，宽0.5~0.8μm，单个菌体呈长杆状或成链状，两端钝圆，不具运动性，也不会产生孢子。在牛奶上培养时，其菌落为无色到淡白色，通常呈不光棉花状，直径1~3mm。该亚种最初由保加利亚微生物学家赛德蒙·格里戈罗夫（Stamen Grigorov）在1905年时确定并以其祖国的名字命名，1984年时韦斯等人又将其确认为德式乳杆菌的亚种。保加利亚乳杆菌外观为长杆形，能产生大量的乳酸，最适宜的生长温度为40℃左右。

    近年来乳酸菌的生理活性正日益引起人们的重视。大量研究表明，保加利亚乳杆菌对人体具有多方面的保健作用，如调节机体胃肠道正常菌群、保持体内微生态平衡、提高食物消化率和生物价、改善便秘、降低胆固醇水平、改善肝功能、缓解乳糖不耐症、控制内毒素、抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生、制造营养物质、刺激组织发育等。保加利亚乳杆菌作为乳杆菌属乳酸菌的典型代表，具有乳酸菌普遍生理功能，主要包括以下几个方面：

（1）维持微生态平衡和肠管机能功能：微生物生态系统是人体最大、最复杂的微生态系统，其中存在着大量不同类型、含量不一的各种细菌，其数量约10倍于人体细胞。在正常生理状况下，肠道含有400~500种不同类型的细菌，其重量约为1~2kg，其中包括有害菌和有益菌，有害菌能通过代谢产生酚、吲哚、亚硝酸、亚硝胺和偶氮化合物等有毒物质，加速人体衰老和诱发癌症发生。

乳酸菌是肠道清道夫，能在肠内定居，使肠道菌的构成发生有益变化，促进体内消化酶的分泌和肠道蠕动，清除肠道垃圾，抑制腐败菌的繁殖和作用。保加利亚乳杆菌发酵产生的乳酸、醋酸等有机酸刺激胃分泌，抑制有害菌生长，清理肠道，可以防便泌，乳酸又能促进肠道蠕动，避免体内毒素堆积，防止细胞老化。对溃疡性肠炎、细菌性下痢有显著治疗效果，并可有效缓解便秘症状。

   （2）产生特殊酶系，促进机体健康：乳酸菌可利用本身所特有的某些酶类补充宿主在消化酶上的不足，帮助分解上消化道未被充分水解吸收的营养物质，有利于宿主进一步吸收利用，包括增加机体必需的维生素、氨基酸、无机盐类（如钙、磷、铁、钴等）的吸收和利用。同时，通过产生某些酶修饰毒素受体，减少毒素与肠道粘膜受体的结合，促进机体健康。

    （3）抗肿瘤，增加免疫功能：乳酸菌对使机体致癌的肠中亚硝胺有98％的高吸收率，可减少肠癌的发生。乳酸菌菌体抗原及代谢物还通过刺激肠粘膜淋巴结，激发免疫活性细胞，产生异性抗体和致敏淋巴细胞，调节机体的免疫应答，防止病原菌侵入和繁殖，为致病细菌的侵入和繁殖设置一道屏障。

    （4）提高营养利用率、促进营养吸收：乳酸菌的菌体蛋白可增加蛋白质含量。它能将食物中的大分子蛋白质都分降解为小分子肽和游离氨基酸，利于胃肠消化吸收。

    乳酸菌可分解乳糖成为葡萄糖和半乳糖，进而进一步分解为小分子化合物，有助于儿童脑及神经系统的发育；在代谢过程中消耗部分维生素，有利于增加肠内维生素的稳定性；产生有机酸使钙、磷、铁等元素处于易吸收的离子状态，提高利用率。

（5）降低胆固醇：乳酸菌菌体成分或菌体外代谢有抗胆固醇因子，其代谢能显著减少肠管对胆固醇的吸收，同时，乳酸菌吸收部分胆固醇并将其转变为胆酸盐排出体外。

发展绿色无公害饲料添加剂是21世纪饲料工业的重要研究方向，饲用微生物制剂是实现这一目标的主要途径。国内外均有大量饲养和临床实验证明，乳酸菌作为饲料添加剂具有增质量、提高饲料转化率、预防疾病及降低病死率等效果。BAIRD用乳杆菌饲喂断奶仔猪和生长育肥猪，实验证明均能增加日增重和提高饲料转化率。保加利亚乳杆菌作为重要的益生菌已被广泛应用于饲料加工业，在微生态制剂等领域的应用愈来愈受到人们的重视。保加利亚乳杆菌能够改善机体代谢，促进畜禽生长，提高畜禽的生产性能，并能改善动物的健康水平，提高机体免疫力和预防疾病。

将保加利亚乳杆菌经过高密度液体发酵，获得高菌体密度的发酵培养液，经植物淀粉吸附后，干燥，粉碎，制成的保加利亚乳杆菌微生态制剂应用于畜牧养殖，能够调节动物肠道菌群平衡，提高抗病能力。

以往的保加利亚乳杆菌的发酵方式主要存在以下问题和不足：（1）采用厌氧培养罐或通过持续通入二氧化碳或氮气维持其厌氧环境来进行，原料不能重复使用，操作较复杂，成本较高；（2）大量采用胰化蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏及其酶解产物等作为培养基主要营养成分，生产成本高；（3）液体发酵产物的后处理需要高速冷冻离心机进行离心和低温冷冻干燥，工艺复杂，成本高昂，产量低；（4）发酵产物的活菌密度不够高。

发明内容

本发明的目的是提供一种保加利亚乳杆菌活菌制剂的制备方法，以克服现有的保加利亚乳杆菌活菌制剂的制备方法上存在的上述不足。

实现本发明目的的技术方案如下：

一种保加利亚乳杆菌活菌制剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）配制培养基；

（2）溶解上罐的培养基，装上pH电极并调整pH值，然后将培养基装入发酵罐中；

（3）对发酵罐中的培养基加温灭菌；

（4）接种保加利亚乳杆菌种子菌：在发酵罐降温后加入无机盐溶液，然后加入液体石蜡及接入种子菌；

（5）控温发酵；控制pH值和温度，在保温的状态下发酵；

（6）放罐并测定发酵液菌数；

（7）用玉米粉、小麦粉或者大豆粉及其组合物吸附发酵液；

（8）将吸附后的混合物干燥和粉碎，即获得粉状制剂。

与现有技术相比，本发明的技术优势：

（1）直接利用普通发酵罐即可进行生产，操作简单，质量稳定，成本低廉，易于产业化生产；

（2）产品发酵周期明显缩短,产品到达终点酸度或pH值的时间为12～14小时，而传统的保加利亚乳杆菌单独发酵达到同样的酸度或pH值需要48小时甚至更长时间；生产周期大大缩短短，易于产业化，从而可将保加利亚乳杆菌广泛应用于畜牧养殖业；

（3）产品成本与发酵污染风险降低:本发明由于生产周期缩短，生产成本降低，同时，发酵乳基料前期产酸较快、pH值下降迅速，能较好抑制杂菌污染，产品发酵失败风险大大降低；

（4）采用厌氧培养罐或通过持续通入二氧化碳或氮气维持其厌氧环境来进行，原料不能重复使用，操作较复杂，成本较高；用于隔绝空气的液体石蜡可以多次反复使用，大大降低了生产成本；

（5）本发明采用豆饼粉和玉米粉作为发酵培养基的主要成分，与其他发明采用的胰化蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏及其酶解产物等作为主要成分相比，成本大大降低，并且保加利亚乳杆菌菌数含量明显提高，发酵产物活菌浓度可达1.5~2.5×10⁹ CFU/mL；

（6）本发明采用植物淀粉吸附发酵液，后处理工艺不需要用高速冷冻离心机，本发明将植物淀粉吸附混合物直接干燥和粉碎，包装后即制成产品，后处理工艺大大简化，生产成本更低；

（7）国内外有关粉末发酵剂的研制，大多采用真空冷冻干燥法，此方法的优点是菌体细胞存活率高，但是工艺复杂，制作成本高，而吸附后干燥法的生产成本低，操作工艺简单，较易用于大规模的工业化生产和推广应用，适合于我国饲料企业在现有设备条件下生产保加利亚乳杆菌微生态制剂产品。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为本发明的限制。

实施例1保加利亚乳杆菌活菌制剂制备的工艺流程，包括以下步骤：

   （1） 菌种的活化与增值：

本发明采用保加利亚乳杆菌干酪亚种作为发酵菌种，菌种编号：GIM1.189，购于广东省微生物菌种保藏中心；从平板上挑取保加利亚乳杆菌单菌落，接种到装有20mL MRS培养基（蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2~6.6，高温高压灭菌）的试管中，37℃深层静置培养12~16小时，菌液以2%的接种量接种到装有适当体积MRS培养基的三角瓶中，37℃深层静置培养14小时备用；若培养基灭菌后未立即使用，则需在沸水浴中加热10min驱氧后使用；

   （2）配制发酵培养基：

培养基包括的原料及重量份数为：豆饼粉52，玉米粉28，葡萄糖14，酵母浸出粉2，蛋白胨4，原料当以克计，蒸馏水相应以mL计的份数为900，溶解，加入发酵罐内进行115℃，时间为20分钟的高温高压灭菌，在发酵罐降温至35~45℃时，加入无机盐1.0g/1000mL基料，无机盐：CaCl₂ 0.02%，MgSO_4·7H₂O 0.04%，MnSO₄·H₂O 0.04%，为避免形成沉淀，在加入过程中搅拌均匀，然后加入液体石蜡至厚度为2cm；

   （3）控温发酵：接入保加利亚乳杆菌液体种子的接种量为2%，搅拌均匀，起始pH 6.4，发酵过程中控制 pH 6.0~6.8，发酵温度控制在40~42℃，发酵13个小时，放罐，将保加利亚乳杆菌培养物进行菌落计数，经过这样发酵的活菌体浓度达2.3×10⁹CFU/mL；

   （4）用植物淀粉吸附发酵液：以玉米粉、豆饼粉和小麦粉等质量的混合物，作为发酵液的吸附剂来吸附发酵液；

   （5）将植物淀粉吸附的保加利亚乳杆菌发酵液混合物进行烘干干燥，粉碎和包装，制成用于畜禽养殖的微生态饲料添加剂。

 

实施例2  与上述实施例1不同的是：

（1）培养基配方：培养基包括的原料及重量份数为：小麦粉50，玉米粉26，葡萄糖11，酵母浸出粉1.5，蛋白胨3，原料当以克计，蒸馏水相应以mL计的份数为900，溶解，加入发酵罐内进行100℃，时间为30分钟的高温高压灭菌，在发酵罐降温至35~45℃时，加入无机盐1.3g/1000mL基料，无机盐的组成： MgSO_4·7H₂O 0.04%，MnSO₄·H₂O 0.04%，为避免形成沉淀，在加入过程中搅拌均匀，然后加入液体石蜡厚度为1cm；

（2）控温发酵：接入保加利亚乳杆菌液体种子的接种量为3%，搅拌均匀，起始pH 6.3，控制 pH 6.0~6.8，发酵温度控制在38~42℃，发酵12个小时，放罐，将保加利亚乳杆菌培养物进行菌落计数，经过这样发酵的活菌体浓度为2.1×10⁹CFU/mL；

（3）用植物淀粉吸附发酵液：以等质量的玉米粉和小麦粉混合均匀，作为发酵液的吸附剂；

   （4）将植物淀粉吸附的保加利亚乳杆菌发酵液进行烘干干燥，粉碎和包装，制成用于畜禽养殖的微生态饲料添加剂。

Claims (6)

1.一种保加利亚乳杆菌活菌制剂的制备方法包括以下步骤：

   （1） 菌种的活化与增值：

本发明采用保加利亚乳杆菌干酪亚种作为发酵菌种，菌种编号：GIM1.189，购于广东省微生物菌种保藏中心；从平板上挑取保加利亚乳杆菌单菌落，接种到装有20mL MRS培养基（蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2~6.6，高温高压灭菌）的试管中，37℃深层静置培养12~16小时，菌液以2%的接种量接种到装有适当体积MRS培养基的三角瓶中，37℃深层静置培养12~16小时备用，菌种活化一般1~3次；若培养基灭菌后未立即使用，则需在沸水浴中加热10min驱氧后使用；

   （2）配制发酵培养基：

培养基包括的原料及重量份数为：豆饼粉45~55，玉米粉25~30，葡萄糖10~15，酵母浸出粉1~3，蛋白胨2~4，原料当以克计，蒸馏水相应以mL计的份数为800~1000，溶解，加入发酵罐内进行100~121℃，时间为10~30分钟的高温高压灭菌，在发酵罐降温至35~45℃时，加入无机盐0.7~1.5g/1000mL基料，无机盐选自CaCl₂ 、MgSO_4·7H₂O及MnSO₄·H₂O中的两种或者三种，为避免形成沉淀，在加入过程中搅拌均匀，然后加入液体石蜡至厚度为1~2cm；

   （3）控温发酵：接入保加利亚乳杆菌液体种子的接种量为2~4%，搅拌均匀，起始pH 6.4，发酵过程中控制 pH 6.0~6.8，发酵温度控制在37~42℃，发酵12~14个小时，放罐，将保加利亚乳杆菌培养物进行菌落计数，经过这样发酵的活菌体浓度可达1.5~2.5×10⁹CFU/mL；

   （4）用植物淀粉吸附发酵液：以玉米粉、豆饼粉或小麦粉，或者其任意组合，作为发酵液的吸附剂；

   （5）将植物淀粉吸附的保加利亚乳杆菌发酵液混合物进行烘干干燥，粉碎和包装，制成用于畜禽养殖的微生态饲料添加剂。

2.根据权利要求1所述的保加利亚乳杆菌活菌制剂的生产，其特征在于所述的培养基：豆饼粉45~55，玉米粉25~30，葡萄糖10~15，酵母浸出粉1~3，蛋白胨2~4，原料当以克计，蒸馏水相应以mL计的份数为800~1000，溶解，加入发酵罐内进行100~121℃，时间为10~30分钟的高温高压灭菌，在发酵罐降温至35~45℃时，加入无机盐0.7~1.5g/1000mL基料，无机盐选自CaCl₂ 、MgSO_4·7H₂O及MnSO₄·H₂O中的两种或者三种，为避免形成沉淀，在加入过程中搅拌均匀。

3.根据权利要求1所述的保加利亚乳杆菌活菌制剂，其特征在于：培养温度为37~42℃。

4.根据权利要求1所述的保加利亚乳杆菌活菌制剂，其特征在于：种子菌接种量为2~4%的接种量。

5.根据权利要求1所述的保加利亚乳杆菌活菌制剂，其特征在于：所用的菌种为乳杆菌属德氏乳杆菌种保加利亚乳杆菌亚种。

6.根据权利要求1所述的保加利亚乳杆菌活菌制剂，其特征在于：作为饲料添加剂应用于畜禽养殖。