CN114317339B - 一种鸽源约氏乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鸽源约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)菌株，保藏号为：CGMCC No.21215。本发明公开的菌株具有优良的抑菌性能，特别是对鸽源鼠伤寒沙门氏菌有显著抑菌效果，本发明提供的菌株及相关的菌剂能够降低童鸽机体炎症反应，减少沙门氏菌的肝脏移位，抑制感染鸽体重的降低，具有良好的开发应用前景。

Description

一种鸽源约氏乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸽源约氏乳杆菌及其应用。

背景技术

鸽肉、鸽蛋营养价值高、肉质口感好，随着生活水平提高，人们对于鸽肉、鸽蛋的需求不断增加，国内鸽子养殖迅速发展起来。但随着养殖规模扩大，鸽病的发生也更为繁杂，其中鸽沙门氏菌病是主要的细菌性疾病，主要由鼠伤寒沙门氏菌引起，不仅可水平传播，也可通过种鸽哺育乳鸽垂直传播，给养鸽业造成巨大经济损失。由于血清型众多，目前还没有商业化的疫苗预防鸽沙门氏菌病，很多养殖户靠使用抗生素来预防和治疗鸽细菌性疾病的发生。抗生素滥用导致了多重耐药菌株的产生，并引发了畜产品安全及环境污染等问题，对动物健康和人类健康造成了很大威胁。农业部第194号公告于2020年7月1日全面禁止了饲料中抗生素的使用。因此，研发新型绿色饲料添加剂来替代抗生素的使用已迫在眉睫。

目前，鸽源鼠伤寒沙门氏菌的防治研究仅集中于中草药等替抗饲料添加剂，但14种报道的中草药仅有4种在体外证实具有明显抑菌作用，而体内试验尚无相关数据。此外，采用中药用于治疗沙门氏菌病成本较高，由于目前鸽饲粮以原粮为主，中药无法直接拌入饲料，且部分中药不溶于水，不易饲喂鸽子。所以亟需开发一种能够抑制鸽源的鼠伤寒沙门氏菌的菌株或制剂。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种鸽源约氏乳杆菌，该菌株来源于乳鸽消化道，其具有较好的、耐酸和耐胆盐性能。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种鸽源约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)菌株，该菌株已于2020年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii BL4026，保藏号为：CGMCC No.21215。

如上所述的鸽源约氏乳杆菌在制备抑制大肠杆菌及鼠伤寒沙门氏菌制品中的应用。

如上所述的鸽源约氏乳杆菌在制备抑制有害菌制品中的应用。

如上所述的鸽源约氏乳杆菌在制备抑制大肠杆菌和/或鼠伤寒沙门氏菌制品中的应用。

如上所述的鸽源约氏乳杆菌在制备预防或治疗沙门氏菌感染制品中的应用。

如上所述的鸽源约氏乳杆菌在制备预防或治疗鸽子被沙门氏菌感染制品中的应用。

如上所述的鸽源约氏乳杆菌在制备鸽子饲料中的应用。

一种鸽饲料，包含如上所述的鸽源约氏乳杆菌。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的鸽源约氏乳杆菌CGMCC No.21215，除了对鸽源大肠杆菌及鼠伤寒沙门氏菌有显著抑菌效果外，还能提高童鸽的生产性能，降低鼠伤寒沙门氏菌的肝脏移位及机体炎症反应，具有良好的开发应用前景，为治疗和预防鼠伤寒沙门氏菌感染的肉鸽或信鸽提供一种新的药物或治疗途径。

附图说明

图1为约氏乳杆菌菌体的平板菌落形态。

图2为约氏乳杆菌菌体的革兰氏染色结果。

图3为菌株生长曲线OD600nm值试验结果。

图4为不同培养时间菌株生长的菌落个数结果。

图5为不同乳杆菌对于抑制沙门氏菌和大肠杆菌的以10为底对数图。

图6为鸽源约氏乳杆菌对感染沙门氏菌童鸽肝脏细菌移位的影响。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1乳酸菌菌株的分离、鉴定、获得

1、乳酸菌菌株的分离

采集4日龄乳鸽嗉囊内新鲜鸽乳，称取5g，置于盛有25ml无菌生理盐水的离心管中，充分震荡摇匀，然后吸取0.1ml菌液于盛有0.9ml无菌生理盐水的试管中，此稀释度为10^-1，重复以上过程，依次制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7的菌液。选择10^-5、10^-6、10^-7三个稀释度，吸取0.1ml菌液分别滴于上述培养基平板上，采用厌氧罐37℃培养24h，挑取典型菌落进行16SrDNA鉴定。

将分离鉴定获得7种乳酸菌株分别编号为S011、S028、S029、S031、S034、S035、S043。分别以1％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养，分别在培养的第0，3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，60，72h，测定pH变化，结果如表1所示。

表1.不同株乳酸菌在不同培养时间下的pH变化

注：表中pH值为两次读数的平均值

结果表明所有菌株随着培养时间增加pH逐渐降低，约于24h后维持相对稳定，其中编号为S034的菌株的pH值自培养第9h最低，且持续维持最低至第48h，并在第48h降至最低(pH＝3.74)，而其他菌株pH值都在4以上。筛选编号为S034的产酸能力最强的菌株，同时，发明人研究发现S034为鸽乳中数量最多的一株约氏乳酸菌，及其进行理化检测，将菌株经两次划线纯化培养，呈表面光滑并凸起的乳白色菌落，如图1所示；革兰氏染色后油镜下观察，两个单菌落紧密排列并呈现阿拉伯数字8的形状，单个菌落大小约为15μm，如图2所示。

2、乳酸菌菌株的耐酸耐胆盐试验

将编号为S034菌株活化后，以1％接种量接种于pH＝6.5的MRS液体培养基中，37℃静置培养3h后，取一定量菌液涂板测定菌落个数作为对照。同时以1％接种量接种于pH＝3.0的MRS液体培养基中，37℃静置培养3h后，取一定量菌液涂板测定菌落个数。计算菌株耐酸性能，结果见表2。

表2.耐酸试验

菌株活化后，以1％接种量接种于不含胆碱的MRS液体培养基中，37℃静置培养3h后，取一定量菌液涂板测定菌落个数作为对照。同时以1％接种量分别接种于含有1、2及3g/L胆碱的MRS液体培养基中，37℃静置培养3h后，取一定量菌液涂板测定菌落个数。计算菌株耐胆盐性能，结果见表3。

表3.耐胆盐试验

约氏乳杆菌的鉴定

将编号为S034菌株(本实验室编号为L.johnsonii BL4026)送至中国工业微生物菌种保藏管理中心进行了鉴定，其生理生化特征结果见表4；分子生物学鉴定，测定的菌株16srDNA的序列如SEQ ID NO.1所示，确定该菌株为约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)。将该菌株于2020年11月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)进行了保藏，菌株名称为约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii BL4026，其保藏号为CGMCCNo.21215。

表4 S034菌株(鸽源约氏乳杆菌)生理生化特征

注：表中“+”表示≥90％菌株阳性，“－”表示≥90％菌株阴性。

SEQ ID NO.1：GATTTTAGTGCTTGCACTAAATGAAACTAGATACAAGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAAGAGACTGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGGATAACAACACTAGACGCATGTCTAGAGTTTGAAAGATGGTTCTGCTATCACTCTTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGATAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGGTAGTGAAGAAAGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATTACTTAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGTGCAGGCGGTTCAATAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGGAGAATTGCATCAGAAACTGTTGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCAGTGCAAACCTAAGAGATTAGGTGTTCCCTTCGGGGACGCTGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGAAGCGAACCTGCGAAGGCAAGCGGATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTCTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGATAACCT。

实施例2鸽源约氏乳杆菌的生理特性

1、生长曲线

将上述获得的编号为S034(即BL4026，也就是CGMCC No.21215)的鸽源约氏乳杆菌菌株活化后，以1％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养，分别在培养的第0，3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，60，72h，测定OD值并取一定量菌液涂板测定菌落数，绘制生长曲线。在生长72h之内，随培养时间的不同，其600nm处的吸光度值如图3所示。随培养时间的不同，菌落个数如图4所示。由结果可知，生长30h，菌落数最多。

2、抑菌效果

将鸽源大肠杆菌(分离自1年龄种鸽的腹泻粪便，编号为BE0007，由北京市农林科学院畜牧所实验室分离并保藏)及鼠伤寒沙门氏菌(分离自15日龄病死鸽肝脏，编号为PS42，由北京市农林科学院畜牧所实验室分离并保藏)活化两次后，将活化后菌液浓度均调至2×10⁸CFU/mL，对照组将大肠杆菌及鼠伤寒沙门氏菌分别按1％浓度接种至2管5mL无菌新鲜MRS培养基中，试验组将大肠杆菌及鼠伤寒沙门氏菌分别按1％浓度接种至6管5mL编号分别为S011、S028、S029、S031、S034、S035乳酸菌株的MRS培养基(包含4mL无菌新鲜MRS培养基+1mL乳酸菌发酵液，菌体个数为1×10⁹CFU)中，同时放入37℃培养箱中静置培养24h，然后分别用生理盐水倍比稀释，涂板记录对照组及试验组大肠杆菌及鼠伤寒沙门氏菌个数，最后计算鸽源约氏乳酸菌(S034号乳酸菌，即BL4026)对大肠杆菌及鼠伤寒沙门氏菌生长的抑制情况，结果如图5所示。结果说明，本发明获得的鸽源约氏乳酸菌对大肠杆菌及鼠伤寒沙门氏菌具有较好的抑制效果。

实施例3鸽源约氏乳杆菌在肉鸽生产中的应用效果

1、鸽源约氏乳杆菌液的制备

试验期间，对鸽子每天灌服新鲜菌液，菌液具体制备方法：提前一天将鸽源约氏乳杆菌(BL4026)，按1％接种量加入含有100mL、pH6.5的无菌MRS培养基中，培养温度为37℃，静置培养30h。培养结束后，采用冷冻离心机6000rpm离心5min，收取菌泥，用无菌PBS悬起，调整菌液浓度为1×10⁹CFU/mL。

2动物试验

选取健康28日龄童鸽72只，初始体重保持一致，无明显差异(P＞0.05)，随机分成3组，每组6个重复，每个重复4只鸽子。3组鸽子饲喂相同的饲粮，对照组及试验1组灌服PBS1mL，试验2组灌服含有鸽源约氏乳酸菌的PBS溶液1mL(鸽源约氏乳酸菌1×10⁹CFU/mL)，试验第5-7，及8-11天，对照组灌服营养肉汤，试验1和2组均灌服含有鼠伤寒沙门氏菌(沙门氏菌1×10⁹CFU/mL)的营养肉汤。鸽群自由采食，自由饮水，常规免疫。其他饲养管理和免疫程序均按规模化鸽场统一进行。

3、体重增加

所有试验童鸽初始体重保持一致，无明显差异(P＞0.05)，而试验后，感染鼠伤寒沙门氏菌后的童鸽体重显著降低(P＜0.05)，添加乳酸菌后童鸽体重较感染组提高了5％，说明鸽源约氏乳杆菌能够缓解沙门氏菌对童鸽体重的负面作用。具体结果如表5所示。

表5鸽源约氏乳杆菌对感染沙门氏菌童鸽体重的影响

表中数据为均值±标准误。

4、血液生化指标

采用血生化分析仪对试验后鸽子的血浆进行了白细胞分型测定，具体结果如表6所示。由结果可知，沙门氏菌感染显著增加了中性粒细胞比例，但乳酸菌的添加显著抑制了中性粒细胞比例的增加，降低了机体的炎症反应。

表6鸽源约氏乳杆菌对感染沙门氏菌童鸽血浆中性粒细胞的影响

注：同行数字肩标小写字母相同表示差异不显著(P>0.05)，小写字母不相同表示差异显著(P<0.05)。表中数据为均值±标准误。

5、沙门氏菌肝脏移位

沙门氏菌肝脏移位是指沙门氏菌穿过肠黏膜屏障，逃避免疫细胞识别后通过血液进入肝脏。对于试验后试验1组(感染)与试验2组(感染+乳酸菌)的具体结果参见图6所示。上述试验结果显示，感染后添加鸽源约氏乳酸菌(BL4026)肝脏移位数量显著降低了85.4％，这说明本发明鸽源约氏乳酸菌(BL4026)在抑制机体沙门氏菌感染具有积极作用。由此，也说明本发明提供的鸽源约氏约氏乳杆菌可作为复合微生态制剂应用于鸽子或其它禽类沙门氏菌感染的防治。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种鸽源约氏乳杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1398

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gattttagtg cttgcactaa atgaaactag atacaagcga gcggcggacg ggtgagtaac 60

acgtgggtaa cctgcccaag agactgggat aacacctgga aacagatgct aataccggat 120

aacaacacta gacgcatgtc tagagtttga aagatggttc tgctatcact cttggatgga 180

cctgcggtgc attagctagt tgataaggta acggcttacc aaggcaatga tgcatagccg 240

agttgagaga ctgatcggcc acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc 300

agcagtaggg aatcttccac aatggacgaa agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa 360

gaagggtttc ggctcgtaaa gctctgttgg tagtgaagaa agatagaggt agtaactggc 420

ctttatttga cggtaattac ttagaaagtc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 480

atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggattt attgggcgta aagcgagtgc aggcggttca 540

ataagtctga tgtgaaagcc ttcggctcaa ccggagaatt gcatcagaaa ctgttgaact 600

tgagtgcaga agaggagagt ggaactccat gtgtagcggt ggaatgcgta gatatatgga 660

agaacaccag tggcgaaggc ggctctctgg tctgcaactg acgctgaggc tcgaaagcat 720

gggtagcgaa caggattaga taccctggta gtccatgccg taaacgatga gtgctaagtg 780

ttgggaggtt tccgcctctc agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt 840

acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 900

tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatccag tgcaaaccta 960

agagattagg tgttcccttc ggggacgctg agacaggtgg tgcatggctg tcgtcagctc 1020

gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtcat tagttgccat 1080

cattaagttg ggcactctaa tgagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac 1140

gtcaagtcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg acggtacaac 1200

gagaagcgaa cctgcgaagg caagcggatc tcttaaagcc gttctcagtt cggactgtag 1260

gctgcaactc gcctacacga agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc acgccgcggt 1320

gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgagagtct gtaacaccca 1380

aagccggtgg gataacct 1398

Claims (8)

1.一种鸽源约氏乳杆菌菌株，其特征在于，该菌株的保藏号为：CGMCC No.21215。

2.根据权利要求1所述的鸽源约氏乳杆菌，其特征在于，所述菌株来源于乳鸽消化道内。

3.根据权利要求1所述的鸽源约氏乳杆菌在制备抑制大肠杆菌和/或鼠伤寒沙门氏菌制品中的应用。

4.根据权利要求1所述的鸽源约氏乳杆菌在制备抑制大肠杆菌及鼠伤寒沙门氏菌制品中的应用。

5.根据权利要求1所述的鸽源约氏乳杆菌在制备预防或治疗沙门氏菌感染制品中的应用。

6.根据权利要求1所述的鸽源约氏乳杆菌在制备预防或治疗鸽子被沙门氏菌感染制品中的应用。

7.根据权利要求1所述的鸽源约氏乳杆菌在制备鸽子饲料中的应用。

8.一种鸽饲料，包含权利要求1所述的鸽源约氏乳杆菌。

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