CN110408573A - 一种鼠李糖乳杆菌yfi-6及其在抗大鲵虹彩病毒中的应用 - Google Patents

一种鼠李糖乳杆菌yfi-6及其在抗大鲵虹彩病毒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及水产抗病毒微生态制剂技术领域，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌YFI‑6及其在抗大鲵虹彩病毒（GSIV）中的应用。本发明所述鼠李糖乳杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2019655本发明中的鼠李糖乳杆菌YFI‑6发酵上清液，能在降低大鲵虹彩病毒（GSIV）对宿主细胞的感染活性，抑制GSIV病毒入侵对细胞的感染。对细胞无毒副作用。饲料添加鼠李糖乳杆菌YFI‑6菌体可有效降低大鲵感染GSIV的死亡率，可以用于预防和治疗大鲵病毒性出血病。

Description

一种鼠李糖乳杆菌YFI-6及其在抗大鲵虹彩病毒中的应用
技术领域
本发明涉及水产抗病毒微生态制剂技术领域，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌YFI-6及其在抗大鲵虹彩病毒中的应用。
背景技术
中国大鲵(Andriasdavidianus)，俗称“娃娃鱼”，属于两栖纲(Amphibia)、有尾目(Caudata)、隐鳃鲵科(Cryptobranchidae)、大鲵属(Andrias)，是现存个体最大、寿命最长的有尾两栖动物。中国大鲵是我国珍稀的名贵特产，属于国家二级保护动物，已被收录于《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录Ⅰ中。近年来，由于大鲵养殖规模逐渐扩大，养殖人员对大鲵疾病的认知尚浅，导致大鲵的各种病害日趋严重。这不仅致使宝贵的大鲵资源和养殖经济得到损失，同时还制约了大鲵集约化养殖产业的健康发展。病毒性疾病是对大鲵养殖危害最为严重的一种疾病，病原传播速度快且得不到有效的治疗，死亡率90％以上。耿毅等(2010)首次报道了在人工养殖大鲵中蛙病毒可导致很高的发病率和死亡率。随后科研人员先后分离出大鲵病毒性疾病病原，并确认其为虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)的成员。主要症状表现为：头部肿大，背部及腹部出血，有血斑；四肢肿胀、溃疡。解剖发现胃苍白无食，肾脏及肝脏出血。
水产养殖过程中如何预防和治疗病害的发生长久以来都是困扰水产养殖业发展的一个重要问题。当前，用于防治水产养殖动物病害的方法主要有药物防治和疫苗免疫两种。然而药物防治引起的副作用、药物残留、耐药性以及水体污染等一系列问题逐渐受到社会各界的普遍重视，除此之外，药物防治针对病毒性疾病的治疗效果不十分明显；受敏感细胞系缺乏、病毒变异、免疫方式不便的影响，渔用疫苗的发展受到影响。因此，需要不断寻求可控制病毒性疾病的有效方法，益生菌因其无毒、无抗药性、无残留、抗菌、抗病毒、促生长、绿色安全的优点受到广泛关注。
近年来，诸多的研究者认为水产养殖过程中乳酸菌在一定程度上有望成为药物的替代品用于各种疾病的预防与治疗，为病害防控方案提供新策略。杨勇等(2006)证明乳酸菌代谢产物对鳗弧菌的生长具有非常显著的抑制作用，抑制效率在90％以上。Gildberg等(1998)用含有大西洋鳕鱼内脏提取出来的乳酸菌的饲料喂鳕鱼苗，3个月后将鱼苗放养在带有强致病弧菌的环境中，能够提高抗病率。已有资料显示乳酸菌不仅有抗菌活性，还具有抗病毒活性。Ang等(2016)发现干酪乳杆菌能够通过抑制柯萨奇病毒的侵染来防治手足口病。目前，乳酸菌在水产养殖过程中被广泛应用，但关于乳酸菌抑制水产病原菌和病毒的研究还较少。
本发明首次从养殖水体中筛选出一株鼠李糖乳杆菌YFI-6可以对大鲵虹彩病毒具有抑制作用，为该病毒的防治提供了新思路。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种鼠李糖乳杆菌YFI-6，所述的菌株的保藏编号为：CCTC C NO：M2019655。
本发明的另一个目的在于提供了鼠李糖乳杆菌YFI-6的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
本发明的鼠李糖乳杆菌YFI-6自水产养殖区域池塘水样品中分离得到，具体是用生理盐水将养殖池塘水样品稀释后，涂布到BHI固体平板上，最后将平板倒置，于恒温培养箱中30℃培养24h。挑选不同形态的菌落接种于普通肉汤平板上分离纯化，并且对不同的菌进行抗病毒功能的测定，最终获得了一株可抗大鲵虹彩病毒(GSIV)的菌株，命名为YFI-6，菌株YFI-6经生理生化特征测定和16S rDNA序列同源性分析，鉴定为鼠李糖乳杆菌。
鼠李糖乳杆菌YFI-6属于乳杆菌属，适合生长温度为37，℃经乳酸细菌培养基(MRS)培养48h后形成白色，圆形，表面光滑湿润，边缘整齐、凸起的菌落；不能利用乳糖，但可代谢单糖。
该菌株已于2019年8月19日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YFI-6，保藏编号：CCTCC NO：M2019655，地址：中国武汉武汉大学。
鼠李糖乳杆菌YFI-6的应用，包括利用鼠李糖乳杆菌制备成治疗或预防大鲵病毒性出血病药物，或制备成治疗或预防由大鲵虹彩病毒(GSIV)感染引起的疾病的药物，或是制备成大鲵虹彩病毒抗病毒剂，或是制备成水产动物饲料添加剂。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明中用益生菌鼠李糖乳杆菌YFI-6进行抗大鲵虹彩病毒对细胞感染，鼠李糖乳杆菌YFI-6作为潜在的抗病毒微生态制剂与传统的抗病毒化学药物相比较具有如下优点：
1、无毒副作用、无残留、抗菌、抗病毒、促生长、绿色安全。
2、具有使用方便、安全、无免疫应激、经济效益高等优点
3、通过口服的方式进入鱼体，抑制大鲵虹彩病毒的入侵和增殖，有效预防和治疗大鲵病毒性出血病。本发明中鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清，先加发酵上清后加GSIV稀释液、同时加发酵液和GSIV稀释液2种方式对病毒有直接抑制作用，抑制率分别为36％、29％。鼠李糖乳杆菌YFI-6pH7.0发酵上清液，对细胞无毒副作用。
4、饲料添加鼠李糖乳杆菌YFI-6菌体可有效降低大鲵感染GSIV的死亡率。
附图说明
图1为各组大鲵呼吸爆发力水平示意图。
图2为各组大鲵血清溶菌酶水平示意图。
图3为各组大鲵补体C3水平示意图。
具体实施方式
本发明实施例中试验方法和条件如无特别说明，均为常规方法。这些实施例仅用于说明本发明，本发明的保护范围不受这些实施例的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
菌株YFI-6分离鉴定
1、菌株YFI-6分离及鉴定
鼠李糖乳杆菌YFI-6从水产养殖区域池塘水样品中分离得到。具体是用0.85％的无菌生理盐水将养殖池塘水样品连续10倍倍比稀释6次，用移液枪分别在各个浓度梯度稀释液中吸取溶液100μL到BHI固体平板上，用涂布棒涂匀、编号，并做3个重复。涂布均匀后在超净工作台中放置5～10min，使培养基表面菌液被充分吸收。最后将平板倒置，于恒温培养箱中30℃培养24h。挑选不同形态的菌落接种于普通肉汤平板上分离纯化，并且对不同的菌进行抗病毒功能的测定，最终获得了一株可抗大鲵虹彩病毒的菌株，命名为YFI-6。
2、YFI-6菌株的鉴定
1)、生理生化特征
取经MRS固体培养基纯培养的菌株YFI-6，单菌落划线接种于BUG鉴定平板上，30℃培养16h-24h，待菌落大小适宜时取Biolog细菌鉴定试剂盒IF-A接种液，将管外壁擦拭干净，置入Biolog浊度仪中调整其读数为100％T；用无菌棉签蘸取适量的单菌落至接种液中，使浊度仪读数在92％T-98％T之间，用8孔移液枪将混合液以每孔100μL体积转移至GENⅢ鉴定板中，然后将鉴定板装载于Biolog系统中培养，系统自动读数并输出鉴定结果。生理生化特征见表1。
表1菌株YFI-6的生理生化特征
2)菌株YFI-6的分子生物学鉴定。
扩增菌株16SrRNA的基因采用通用引物，16SF(27F)：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，16SR(1492R)：GGTTACCTTGTTACGACTT，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。菌株YFI-5经生理生化特征测定和16S rDNA序列同源性分析，鉴定为鼠李糖乳杆菌。
鼠李糖乳杆菌YFI-6属于乳杆菌属，革兰阳性厌氧菌，无质粒；不能利用乳糖，但可代谢单糖，适合生长温度为37℃，经乳酸细菌培养基(MRS)培养48h后形成白色，圆形，表面光滑湿润，边缘整齐、凸起的菌落。LGG为革兰阳性厌氧菌，无质粒；不能利用乳糖，但可代谢单糖。
该菌株已于2019年8月19日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YFI-6，保藏编号：CCTCC NO：M2019655，地址：中国武汉武汉大学。
实施例2：
鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清液抗病毒谱检测
挑取平板复壮的鼠李糖乳杆菌YFI-6一个单菌落接种于150ml MRS液体培养基中，37℃培养24h，5000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，储存于无菌离心管中4℃保存备用。分别检测鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清液对鲤疱疹病毒II型(CyHV-2)、大鲵虹彩病毒(GSIV)、草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)的抑制效果。
本实施本实施例所用的细胞是鲫脑组织细胞系(GiCB，CCTCC NO：C2013179)、草鱼肾脏细胞系(CIK)、鲤上皮瘤细胞系(EPC)。
本实施例中加入的鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清液体积为每孔100μL，加入的100TCID50/0.1ml的病毒液与发酵上清液的体积相同。
分别将鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清液与CyHV-2同时接入长成单层的96孔培养板中的GiCB细胞，鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清液与GSIV接入长成单层的96孔培养板中的EPC细胞，鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清液与GCRV接入长成单层的96孔培养板中的CIK细胞，鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清液与SVCV接入长成单层的96孔培养板中的EPC细胞，对照组只接入等量病毒，共培养90min，弃混合液并用PBS洗涤，加入细胞维持液继续培养。光学倒置显微镜下观察细胞病变(CPE),根据CPE数量判断鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清液的抗病毒效果。见表2。+表示具有抗性，-表示无抗性。
表2鼠李糖乳杆菌YFI-6的抗病毒谱
实施例3：
鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清液在抗大鲵虹彩病毒(GSIV)中的应用：
挑取平板复壮的鼠李糖乳杆菌YFI-6一个单菌落接种于150ml MRS液体培养基中，37℃培养24h，5000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，储存于无菌离心管中4℃保存备用，用于本实施例及实施例4。
本实施例所用的细胞是鲤上皮瘤细胞系(EPC)，所用的细胞维持液为10％FBS的M199培养基；
本实施例中加入的鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清液体积为每孔100μL，加入的100TCID50/0.1ml的大鲵虹彩病毒液与发酵上清液的体积相同；
病毒滴度检测：向96孔细胞培养板中加入密度为1×104/孔的EPC细胞100μL，25℃培养16～24h。待细胞生长至80％～90％时，向其中接种稀释度为101～1010的病毒液100μL/孔，每个稀释度设置8个平行孔，25℃培养箱中培养2h。孵育结束后，将病毒液回收，用M199培养基漂洗孔内细胞2次，添加100μL细胞维持液继续培养96h。实验设置3组平行，每隔24h观察记录各稀释度单层细胞的CPE现象，并记录相应病变孔数，按照Reed-Muench法计算大鲵虹彩病毒的半数组织细胞感染量(tissue culture infective dose，TCID50)。
实验分组如下：
1组：用鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清液预处理组，再接入病毒：鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清液接种于长成单层的96孔培养板的细胞中共培养2h，洗涤后以100TCID50/0.1ml的GSIV感染单层细胞，置培养箱中吸附90min，洗涤后加入细胞维持液，继续培养。
2组：鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清液和GSIV同时接入细胞：与100TCID50/0.1mlGSIV等体积混合后加入长成单层的96孔培养板的细胞中，共培养90min，弃混合液并用PBS洗涤，加入细胞维持液继续培养。
3组：先加病毒感染细胞，再接入鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清液：以100TCID50/0.1ml GSIV感染长成单层的96孔培养板的细胞，培养箱中吸附90min后洗涤，再加入鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清液，置温箱培养90min后PBS洗涤，加入细胞维持液继续培养。
4组：加入鼠李糖乳杆菌YFI-6上清液与长成单层的96孔培养板的细胞共培养2h，后加入细胞维持液继续培养。
5组：100TCID50/0.1ml GSIV感染长成单层的96孔培养板的细胞，置温箱中吸附90min后PBS洗涤，加入细胞维持液继续培养。
6组：正常细胞对照。
48h后通过MTT法间接测定鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清液对GSIV的抑制率，
病毒抑制率＝(乳酸菌处理组OD490－病毒对照组OD490)/(细胞对照组OD490－病毒对照组OD490)×100％
具体抑制率如表3所示：
表3鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清液对GSIV抑制率
实施例3：
鼠李糖乳杆菌YFI-6在制备抗大鲵虹彩病毒制剂中的应用：
1)实验前将大鲵(20±2g)在实验室条件下暂养2周，每天8点和18点投喂，投喂量为鱼体重的1％；实验用水为曝气自来水，水温25±1℃，溶解氧＞5mgL-1.pH为7.3±0.5；实验大鲵经检测无病毒和细菌感染。
平均分成8组，每组30尾。分别做以下处理：
1组：大鲵腹腔注射100μlGSIV(107TCID50)，48h后腹腔注射100μl鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清液；
2组：大鲵腹腔注射100μl鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清液，48h后腹腔注射100μlGSIV(107TCID50)；
3组：大鲵同时腹腔注射100μlGSIV(107TCID50)和100μl鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清液的混合液；
4组：大鲵饲喂含鼠李糖乳杆菌YFI-6的饲料2天(107cfu/g)投喂量为鱼体重的1％，然后腹腔注射100μlGSIV(107TCID50)；
5组：大鲵腹腔注射100μlGSIV(107TCID50)，48h后开始饲喂含鼠李糖乳杆菌YFI-6的饲料(107cfu/g)投喂量为鱼体重的1％。
6组：大鲵腹腔注射100μlGSIV(107TCID50)，同时开始饲喂含鼠李糖乳杆菌YFI-6的饲料(107cfu/g)投喂量为鱼体重的1％。
7组：大鲵腹腔注射100μlGSIV(107TCID50)；
8组：大鲵腹腔注射100μl鼠李糖乳杆菌YFI-6发酵上清液处理。
9组：大鲵腹腔注射100μl无菌PBS。
各组大鲵从分组处理日起记录14天内死亡情况内死亡情况(表4)。并于第0日和第14日检测各组大鲵相关免疫指标：呼吸爆发活力(图1)、血清溶菌酶活性(图2)、血清补体C3水平(图3)。
保护率计算公式：
保护率＝(V'－V)/V'×100％
V':大鲵直接注射CyHV-2后死亡率(7组)；
V:乳酸菌处理组死亡率。
呼吸爆发活力检测方法：
呼吸爆发力的测定是按照Anderson描述的方法进行的：NBT还原法(Anderson,Brubacher et al.1998)。
血清溶菌酶活性的测定
血清溶菌酶活性的测定参考Ellis描述的浑浊度法进行测定的(Ellis 1988)。一个溶菌酶活力单位定义为：在530nm的波长下1min可以使吸光率下降0.001的溶菌酶的量。
血清补体C3的测定
血清补体C3水平的测定采用南京建成补体C3测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。结果以mg/mL为单位表示。
表4鼠李糖乳杆菌YFI-6对大鲵保护率

Claims (5)

1.一种分离的鼠李糖乳杆菌，所述鼠李糖乳杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2019655。
2.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌在制备治疗或预防大鲵病毒性出血病药物中的应用。
3.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌在制备治疗或预防由大鲵虹彩病毒感染引起的疾病的药物中的应用。
4.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌在制备大鲵虹彩病毒抗病毒剂中的应用。
5.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌在制备水产动物饲料添加剂中的应用。
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