CN107418905A - 一株冷水鱼益生菌乳酸乳球菌菌株及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株冷水鱼益生菌乳酸乳球菌菌株及其用途。本发明从辽宁省本溪山区半野生虹鳟幼鱼的肠道粘膜中分离鉴定了一株对冷水鱼具有抗病毒特性及免疫调节和增强免疫功能特性的菌株：HZC32。根据菌落的形态特征观察及16SrDNA碱基序列测定和同源性分析，菌株鉴定结果为：HZC32属于乳酸乳球菌，保藏编号为：CGMCC No.10705。体外细胞实验证明：乳酸乳球菌HZC32菌株与病毒感染的EPC细胞共培养，具有体外抗IHNV在EPC细胞增殖的特性。动物实验证明：乳酸乳球菌HZC32菌株对冷水鱼具有免疫调节和增强免疫功能的特性，且HZC32菌株单独饲喂对冷水鱼也具有抗IHNV感染的特性。由此可见：本发明的乳酸乳球菌HZC32菌株在冷水鱼抗病毒方面以及免疫调节和增强冷水鱼免疫功能方面有一定应用前景。

Description

一株冷水鱼益生菌乳酸乳球菌菌株及其用途

技术领域

本发明涉及一株益生菌菌株及其用途，特别涉及一株冷水鱼(虹鳟)益生菌乳酸乳球菌HZC32菌株及其用途，本发明属于微生物技术领域。

背景技术

益生菌是人和动物肠道、呼吸道、生殖道及皮肤黏膜系统的正常菌群，许多研究成果发现乳酸菌和肠黏膜共同组成保护屏障，防止病毒、细菌等的入侵，人类越来越清晰地认识到益生菌对人类和动物生命健康的强大作用，大量现代免疫学研究结果已经证实益生菌(尤其是乳酸菌)对动物细胞免疫、体液免疫及肠黏膜局部免疫的调节功能，以及对免疫系统发育和免疫稳态的必不缺少的决定作用；具有抑制肿瘤和抗癌作用等，使益生乳酸菌近年来一度成为现代功能食品、动物饲料添加剂、粘膜免疫疫苗、医学领域的研究热点之一，甚至成为现代固有免疫学领域的研究热点。

益生菌还可以调节黏膜的菌群分布，促使某些病原体发生凝聚，并阻止其粘附在黏膜上，以防止其进一步的侵入，并且益生菌吸附在黏膜表面(包括肠黏膜和呼吸道黏膜)，能够降解粘性蛋白并利用这种内源性的营养可以基本保持数量稳定，这种粘附可以与黏膜免疫系统发生相互作用，可以有效地刺激黏膜免疫系统，起到免疫调节作用，从而使黏膜免疫系统处于合适的稳定的激活状态(免疫稳态)，非常有利于抵御外来病毒或细菌的入侵。因此通过乳酸菌的合理存在和适当刺激，可以提高黏膜免疫系统的防御功能，从而有效的阻止病毒的吸附和侵入。

众多的研究报道证实，存在于胃肠道黏膜、口腔呼吸道黏膜及生殖道表面的益生菌作为一种活的常驻菌体对肠道黏膜及呼吸道黏膜具有双重的保护作用，一方面它可以在黏膜表面内附着定植，维护胃肠道及呼吸道黏膜微生物菌群平衡；另一方面益生菌可直接于宿主的免疫系统尤其是宿主的黏膜免疫系统发生相互作用诱发黏膜免疫；并能够刺激脾脏、胸腺及法氏囊等免疫中枢器官的发育，还可以促进巨噬细胞活力或发挥佐剂作用；通过影响黏膜系统细胞因子等合成和分泌，从而增强T、B细胞对抗原刺激的反应性能，有效发挥特异性免疫增强作用；黏膜表面常驻益生菌可以活化黏膜内的相关淋巴组织，增加sIgA生物合成，提高消化道黏膜及呼吸道黏膜免疫功能，通过诱导淋巴细胞和巨噬细胞产生细胞因子，发挥免疫调节作用，从而增强机体免疫功能。

鱼类的免疫系统比较低级，鱼类的固有免疫系统是鱼类抗感染的主要免疫系统，鱼类抗体形成比哺乳动物所需时间长、抗体效价增高较慢，而冷水鱼抗体效价增高则更缓慢些，低温条件会限制抗体的释放，同时鱼类的免疫记忆能力比哺乳动物弱很多。相同免疫原进入途径不同，产生的免疫效应不同。在鱼类初次应答中，鱼类抗体持续时间较长。鱼类具有免疫记忆反应能力，如果想获得较强的再次免疫反应需要经过较长的时间，同时再次应答产生的抗体效价比哺乳动物再次产生抗体效价低。

全世界范围相关研究表明，水产益生菌领域要比陆生动物益生菌的研究和应用要相对晚一些，在水产中益生菌的研究及使用的发展要相对较少，益生菌的使用必将成为促进水产动物生长和控制疾病的重要手段。

近年来，益生菌抗病毒作用的研究已成为热点，抗病毒机制也成为科学家们关注的重点。细胞模型被引用到了益生菌病毒宿主的相互作用的研究当中。

由于受地域气候的影响，冷水鲑科鱼类(大西洋鲑、虹鳟等)大都富含蛋白、不饱和脂肪酸、低胆固醇、无肌间剌、易加工，只能在清冷、无污染的流动水环境中生存的特点，决定了其有机、绿色、无公害的商品性质，成为欧美等发达国家推崇的健康食品，是国际主流养殖和贸易水产品种，但是近年来冷水鱼虹鳟鱼养殖过程中疫病频发，给冷水鱼养殖带来了巨大损失，经国家组织相关部门专家联合攻关，确定其主要病害为传染性造血器官坏死病(infectious hematopoitic necrosis,IHN)，是世界动物卫生组织(OIE)规定必须上报的疾病，为我国规定的二类疫病。如何筛选鱼体自身益生菌，通过益生菌的抗感染作用来缓解IHN给我国冷水鱼养殖业带来的重大损失，为产业健康发展提供保障，成为冷水鱼益生菌研究的重点目标。

黑龙江省具有得天独厚的鲑科鱼种质资源和气候环境，是我国鲑鳟鱼鱼卵和苗种主要生产基地，因此，黑龙江省就具有得天独厚的鲑科鱼类冷水鱼益生菌的种质资源宝库，益生菌的使用已成为促进水产动物生长和控制疾病的重要手段。近年来，益生菌抗病毒作用的研究已成为热点，抗病毒机制也成为科学家们关注的重点。

本发明获得的冷水鱼益生菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)HZC32菌株是乳酸菌属的重要成员之一，体外细胞模型被引用到了益生菌病毒宿主的相互作用的研究当中，动物实验也验证了乳酸乳球菌HZC32菌株对冷水鱼的抗病毒特性以及免疫调节和增强免疫功能特性。

发明内容

本发明的目的在于提供了一株对冷水鱼具有抗病毒特性以及免疫调节和增强免疫功能特性的冷水鱼益生菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)HZC32菌株。

本发明的冷水鱼益生菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)HZC32菌株分离自辽宁省本溪山区半野生虹鳟幼鱼的肠道粘膜，在GM17培养基上生长良好，经划线纯分离获得的一株乳酸乳球菌，命名为HZC32，分类命名为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，于2015年4月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏编号为：CGMCCNo.10705，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

乳酸乳球菌HZC32菌株具有如下特性：

微生物特征是：需氧或兼性厌氧菌，在固体和液体GM17培养基上生长良好，在GM17培养基上菌落为乳白色，边缘整齐，表面光滑湿润，隆起，不透明的较大菌落，有一种奇特的酸香或奶酪香的味道；革兰氏染色典型阳性，菌体为中等偏大的形态不规则的球菌；该HZC32菌株具有典型的嗜冷特性，在4℃可以生长，在14℃-18℃之间生长良好，超过20℃不生长；该HZC32菌株具有耐酸特性，可在pH4.0的GM17培养基上生长，在pH5.0-6.0之间生长良好；该HZC32菌株具有耐胆盐特性，在胆酸盐浓度为0.0％～0.2％的GM17培养基上快速增殖，在胆酸盐浓度为0.3～0.5％的GM17培养基上仍可以较快增殖。

本发明乳酸乳球菌HZC32菌株的16SrDNA序列与目前发表的乳酸乳球菌的16SrDNA序列相似性达98％以上，根据16SrDNA序列分析，乳酸乳球菌HZC32菌株被鉴定为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，其16SrDNA序列如核苷酸序列中SEQ ID NO：1所示。

体外细胞实验证明：本发明筛选到的乳酸乳球菌HZC32菌株与病毒感染的EPC细胞(鱼上皮细胞)共培养，具有体外抗传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)在EPC细胞增殖的特性。动物实验证明：本发明筛选到的乳酸乳球菌HZC32菌株对冷水鱼具有免疫调节和增强免疫功能的特性，且本发明筛选到的乳酸乳球菌乳酸乳球菌HZC32菌株单独饲喂对冷水鱼也具有抗IHNV感染的特性。

因此，进一步的，本发明还提出了所述的冷水鱼益生菌乳酸乳球菌菌株在制备冷水鱼饲料添加剂中的应用。以及

所述的冷水鱼益生菌乳酸乳球菌菌株在制备冷水鱼抗传染性造血器官坏死病病毒疫苗制剂中的应用。以及

所述的冷水鱼益生菌乳酸乳球菌菌株在制备冷水鱼疫苗免疫调节剂或免疫增强剂中的应用。以及

所述的冷水鱼益生菌乳酸乳球菌菌株在制备冷水鱼活载体疫苗中的应用。

在本发明中，优选的，所述的冷水鱼益生菌乳酸乳球菌菌株单独使用或与冷水鱼饲料、冷水鱼疫苗联合使用。

在本发明中，优选的，所述的冷水鱼疫苗免疫调节剂或免疫增强剂是通过提高冷水鱼补体蛋白C3、IL-1β、TNF-α、IL-2、补体蛋白C4、主要组织相容性复合体MHC、IgM以及总补体ACH50的水平进而达到调节或增强冷水鱼免疫功能的目的。

在本发明中，优选的，所述的冷水鱼益生菌乳酸乳球菌菌株作为外源蛋白分泌表达的活载体宿主菌株。

综上，本发明分离得到的一株冷水鱼益生菌乳酸乳球菌菌株对冷水鱼具有抗病毒特性以及免疫调节和增强免疫功能特性，在冷水鱼抗病毒方面以及免疫调节和增强冷水鱼免疫功能方面有一定应用前景。

附图说明

图1为本发明乳酸乳球菌HZC32菌株的形态特征图，其中，A图为乳酸乳球菌HZC32菌株的菌落特征图，B图为G染色显微镜下乳酸乳球菌HZC32菌株的形态特征图；

图2为本发明乳酸乳球菌HZC32菌株在不同pH值的GM17液体培养基中的增殖曲线图；

图3为本发明乳酸乳球菌HZC32菌株在不同胆酸盐浓度的GM17液体培养基中的增殖曲线图；

图4为本发明乳酸乳球菌HZC32菌株与EPC细胞(鱼上皮细胞)共培养体外抗病毒特性试验结果图，其中，＊＊：P<0.01；

图5为本发明乳酸乳球菌HZC32菌株对冷水鱼免疫调节和增强免疫功能的特性试验结果图，其中，＊：P<0.05，＊＊：P<0.01，＊＊＊＊：P<0.0001。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1本发明乳酸乳球菌HZC32菌株的分离、纯化及鉴定

GM17固体培养基配方(g/L)：大豆胨5.0、蛋白胨2.5、酪蛋白胨2.5、酵母浸粉2.5、牛肉粉5.0、乳糖5.0、抗坏血酸钠0.5、β-甘油磷酸钠19.0、硫酸镁0.25、琼脂15，溶解后110℃灭菌15分钟，调节pH7.2，倾注平板备用。

GM17液体培养基配方(g/L)：大豆胨5.0、蛋白胨2.5、酪蛋白胨2.5、酵母浸粉2.5、牛肉粉5.0、乳糖5.0、抗坏血酸钠0.5、β-甘油磷酸钠19.0、硫酸镁0.25，溶解后110℃灭菌15分钟，调节pH7.2，备用。

(1)菌株的分离纯化

来自辽宁本溪天然无污染的自然水域现地采集实验幼鱼，应尽量减少虹鳟鱼应激，迅速进行体表消毒，对幼鱼鱼体进行解剖、用灭菌的棉拭子采集口腔、鳃、肛门和肠管的上部、中部、下部黏膜等部位反复擦拭涂抹，用采集的棉拭子分别在(1)MRS培养基组：MRS肉汤固体培养基平板上进行涂板；(2)GM17培养基组：GM17固体培养基平板上进行涂板；(3)LB培养基组：LB固体培养基平板上进行涂板。将三种平板一式两份分别静置培养于4℃、15℃、20℃、30℃、37℃培养箱中培养72小时。挑取根据菌落形态挑取特征明显的菌落进行再次划线纯化培养，再次挑取特征明显的菌落进行反复多次划线纯化培养至分离菌落形态、大小均一致，挑取单菌落进行革兰氏染色观察，将确定为单一纯种接入相对应的液体培养基中培养，获得了纯化的分离菌菌株。为了获得耐低温嗜冷菌株，对分离纯化得到的菌株选用最适生长培养基(乳酸乳球菌HZC32菌株最适培养基为GM17培养基)进行温度梯度筛选，所选择温度为37℃、30℃、20℃、15℃、4℃，发现乳酸乳球菌HZC32菌株在4℃可以生长，在14℃-18℃之间生长良好，超过20℃不生长。其培养特征是：需氧或兼性厌氧菌，在固体和液体GM17培养基上生长良好，在GM17培养基上菌落为乳白色，边缘整齐，表面光滑湿润，隆起，不透明的较大菌落，有一种奇特的酸香或奶酪香的味道；革兰氏染色典型阳性，菌体为中等偏大的形态不规则的球菌，最后将该GM17的纯培养物保种。该乳酸乳球菌HZC32菌株菌落特征如图1A所示，G染色显微镜观察如图1B所示。

(2)菌株的生理生化特征

该乳酸乳球菌HZC32菌株具有典型的嗜冷特性，在4℃可以生长，在14℃-18℃之间生长良好，超过20℃不生长；该HZC32菌株具有耐酸特性，可在pH 4.0的GM17培养基上生长，在pH5.0-6.0之间生长良好；该HZC32菌株具有耐胆盐特性，在胆酸盐浓度为0.0％～0.2％的GM17培养基上快速增殖，在胆酸盐浓度为0.3～0.5％的GM17培养基上仍可以较快增殖。该乳酸乳球菌HZC32菌株生理生化特征为：甘油(+)；赤癣醇(－)；D-阿拉伯糖(－)；L-阿拉伯糖(－)；核糖(－)；D-木糖(+)；L-木糖(－)；阿东醇(－)；半乳糖(+)；葡萄糖(+)；果糖(+)；甘露糖(+)；山梨糖(－)；鼠李糖(－)；卫茅醇(－)；肌醇(－)；甘露醇(+)；山梨醇(－)；α-甲基-D-甘露糖苷(+)；α-甲基-D-葡萄糖苷(+)；N-乙酰-葡糖胺(+)；苦杏仁苷(－)；熊果苷(－)；七叶灵(－)；柳醇(－)；纤维二糖(+)；麦芽糖(+)；乳糖(－)；蜜二糖(－)；蔗糖(－)；海藻糖(－)；菊糖(－)；松叁糖(－)；棉子糖(－)；淀粉(－)；糖原(－)；木糖醇(－)；拢牛儿糖(－)；D-松二糖(－)；D-来苏糖(－)；D-塔格糖(－)；D-岩糖(－)。(注：(+)表示可利用；(－)表示不能利用)。

(3)菌株的16srDNA序列分析

利用16srDNA通用引物，得到16srDNA的PCR产物，将纯化后的PCR产物进行测序，结果发现：菌株HZC32的16SrDNA序列(SEQ ID NO:1所示)与目前发表的乳酸乳球菌的16SrDNA，同源性达到98％以上。综合形态特征与16SrDNA序列鉴定，菌株HZC32为乳酸乳球菌。

上述筛选到的菌株命名为HZC32，分类命名为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，于2015年4月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏编号为：CGMCC No.10705，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

实施例2本发明乳酸乳球菌HZC32菌株的嗜冷特性研究

该乳酸乳球菌HZC32菌株独特的嗜冷特性：

(1)实验方法：配制固体和液体GM17培养基，将乳酸乳球菌HZC32菌液在培养基上划线，分别设置14℃、20℃、25℃、30℃和37℃共5个培养温度进行培养，连续观察4天。

(2)实验结果：在14℃-18℃之间生长良好(见表1)，在固体和液体GM17培养基上生长良好，在GM17培养基上菌落为乳白色，边缘整齐，表面光滑湿润，隆起，不透明的较大菌落，有一种奇特的酸香或奶酪香的味道；该菌具有典型嗜冷特性：在4℃可以生长，在14℃-18℃之间生长良好，超过20℃不生长。

表1

温度	4℃	14℃	18℃	20℃
					菌株生长状况	生长良好(√)	生长良好(√)	可以良好(√)	不生长(×)

实施例3本发明乳酸乳球菌HZC32菌株的耐酸特性研究

该乳酸乳球菌HZC32菌株独特的耐酸特性：

(1)实验方法：该乳酸乳球菌HZC32菌株在15℃培养条件，观察菌株在不同pH(pH3.0、pH4.0、pH5.0、pH6.0以及pH6.5)的GM17液体培养基中的生长情况。

(2)实验结果：该乳酸乳球菌HZC32菌株在不同pH的培养基中具有良好的适应性，pH为4.0时的酸性GM17培养基中可以增殖；在pH为5.0的偏酸性GM17培养基中增殖较快；pH值为6.5的近中性GM17培养基中迅速增殖。见图2的增殖曲线，表明该乳酸乳球菌HZC32具备在肠道低pH环境下的耐受能力，乳酸乳球菌HZC32菌株具备在肠道酸性环境定殖的能力。

实施例4本发明乳酸乳球菌HZC32菌株的耐胆酸盐特性研究

该乳酸乳球菌HZC32菌株独特的耐胆酸盐特性：

(1)实验方法：该乳酸乳球菌HZC32菌株在15℃培养条件，观察菌株在含不同胆酸盐浓度(胆酸盐浓度0.10％、0.20％、0.30％、0.40％以及0.50％)的GM17液体培养基中的生长情况。

(2)实验结果：在含胆酸盐浓度为0.0％～0.2％的GM17培养基下可以快速增殖；在含胆酸盐浓度为0.3～0.5％的GM17培养基仍可以较快增殖。见图3的增殖曲线，表明乳酸乳球菌HZC32菌株具备在肠道高胆酸盐中定殖的能力。

实施例5本发明乳酸乳球菌HZC32菌株的体外抗病毒特性研究

乳酸乳球菌HZC32菌株与EPC细胞(鱼上皮细胞)共培养体外抗病毒特性试验：

(1)实验方法：EPC细胞于试验前7天复苏培养，试验前2天将细胞再次传代于添加10％热灭活胎牛血清的M199培养基中，调整细胞密度为1×10⁷/mL，铺于96孔板中、每孔100μL细胞悬液，培养于28℃、3％CO₂条件下。连续观察细胞生长状态，实验在细胞长满(1.8×10⁶个/孔)后的第二天开始。实验开始前3天进行待测乳酸乳球菌HZC32菌株培养，取出菌液1.5mL测OD₆₀₀值，调整待测菌株达到OD值为1，按感染复数(MOI)为1：40取出300μL菌液于灭菌离心管中，8000g离心2分钟，轻轻吸取菌液培养上清100μL、弃去剩余培养液上清，将剩余菌体以及菌液培养上清100μL加入到200μL细胞培养基中，混匀(细胞培养基含有热灭活胎牛血清、双抗)使菌体-菌体上清-细胞培养基混合液终浓度为含有2％热灭活胎牛血清和1‰双抗。将长满细胞的96孔板中培养液吸去，注意一定要轻柔保证细胞数量一致，每孔加入100μL待测菌株的细菌培养上清与细胞培养基混合液(对照组加入100μL PBS与细胞培养基混合液)，同时在共培养培养基中按1：1000加入IHNV病毒液(效价为10^8.5TCID₅₀)。共培养于含有15℃、3％CO₂条件下共培养24h，分别吸取试验组和对照组的培养上清，测定TCID₅₀值，进行比较。

(2)结果表明：乳酸乳球菌HZC32菌株相互作用实验组，病毒效价为10^7.2TCID₅₀，对照组为10^8.5TCID₅₀，统计分析表明差异极显著(P＜0.01)(见图4)。表明乳酸乳球菌HZC32菌株与EPC细胞(鱼上皮细胞)共培养后可以阻止病毒的增殖，具有体外抗病毒(IHNV)的特性。

实施例6本发明乳酸乳球菌HZC32菌株的免疫调节和增强免疫功能的特性研究

动物实验验证乳酸乳球菌HZC32菌株对冷水鱼的免疫调节和增强免疫功能的特性。

6.1实验动物：

选用虹鳟鱼平均体重为20g幼鱼，试验前一个月分组饲养于15℃恒温供氧循环水族箱中，每一单独水槽中50尾。

6.2实验方法：

试验开始前，对嗜冷益生候选菌株乳酸乳球菌HZC32进行复壮及传代培养，试验前2天进行1：100转接培养，待菌株达到对数期时取出菌液测OD₆₀₀值。虹鳟粉状饲料与菌液，使用小型颗粒饲料机制成包被颗粒饲料，制备好的包被饲料在20℃鼓风恒温培养箱中轻微干燥。每组鱼饲喂含菌2×10⁷cfu/g的颗粒饲料(每日饲喂含菌饲料20g/50尾)，同时设置平行对照组1组(每日饲喂正常饲料20g/50尾)，每组均为50尾。每日记录采食量、及精神状态等，连续饲喂一周后，无菌采集头肾及部分中肾和脾脏分别在置于灭菌的一次性EP管中(管中带有3个灭菌钢珠)，立即用振荡器将组织研磨粉碎，立即10000g相对离心力离心2分钟，立即取上清分别用鱼补体蛋白C3、鱼IL-1βkit、鱼肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA、鱼IL-2kit、鱼补体蛋白C4、鱼MHC-kit、鱼IgM kit、鱼总补体(ACH50)ELISA试剂盒进行虹鳟鱼补体C3、IL-1β、TNF-α、IL-2、补体C4、主要组织相容性复合体(MHC)、IgM、鱼总补体ACH50的绝对含量测定。并将实验组和对照组进行比较。

6.3实验结果

结果表明：饲喂组采食量和精神状态与对照组无差别，采食量均正常(均在2分钟内全部抢食完)，精神状态均良好；实验组肾脏的C3含量、IL-1β含量、IL-2含量与对照组相比均高于对照组，差异显著(P＜0.05)；肾脏的TNF-α含量、补体C4的含量、IgM含量、总补体ACH50含量与对照组相比均极显著高于对照组，差异极显著(P＜0.01)；肾脏的TNF-α含量、补体C4的含量与对照组相比均极显著高于对照组，差异极显著(P＜0.0001)；实验组脾脏的IL-1β含量与对照组相比均高于对照组，差异显著(P＜0.05)(见图5)。结果表明乳酸乳球菌HZC32菌株对冷水鱼具有极好的免疫调节和增强免疫功能的特性。

实施例7本发明乳酸乳球菌HZC32菌株对冷水鱼的抗病毒特性研究

动物实验验证乳酸乳球菌HZC32新菌株对冷水鱼的抗病毒特性。

7.1实验动物：

选用虹鳟鱼平均体重为20g幼鱼，试验前一个月分组饲养于15℃恒温供氧循环水族箱中，每一单独水槽中50尾。

7.2实验方法：

试验开始前，嗜冷益生候选菌株HZC10进行复壮及传代培养，试验前2天进行1：100转接培养，待菌株达到对数期时取出菌液测OD₆₀₀值。使所取菌悬液细菌达到2×10⁷CFU/mL。虹鳟粉状饲料与菌液，使用小型颗粒饲料机制成包被颗粒饲料，制备好的包被饲料在20℃鼓风恒温培养箱中轻微干燥。每组鱼饲喂含菌2×10⁷cfu/g的颗粒饲料(每日饲喂含菌饲料20g/50尾，每日现用现配)，同时设置平行对照组1组(每日饲喂正常饲料20g/50尾)，每组均为50尾。每日记录采食量、及精神状态等，连续饲喂一周后，进行攻毒(鱼传染性造血器官坏死病病毒IHNV)，攻毒当天禁食一天，各试验组中随机取出40尾试验鱼，使用MS-222(麻醉剂)将试验鱼分批浸泡麻醉，立即用8个LD50剂量的IHNV病毒液进行背鳍注射攻毒，100μL/尾。攻毒后连续观察23d，统计各组的累计死亡数，并计算相对免疫保护率(RelativePercent Survival，RPS)：RPS＝(1-MiMc)×100％，公式中：Mi为免疫组死亡率；Mc为对照组死亡率。

7.3实验结果

结果表明：饲喂乳酸乳球菌HZC32新菌株的实验组可以使冷水鱼虹鳟得到25.0％的攻毒保护，而对照组100％死亡。结果见表2。

表2

Claims (8)

1.一株冷水鱼益生菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株，命名为HZC32，微生物保藏号为CGMCC No.10705，保藏日期为2015年4月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.权利要求1所述的冷水鱼益生菌乳酸乳球菌菌株在制备冷水鱼饲料添加剂中的应用。

3.权利要求1所述的冷水鱼益生菌乳酸乳球菌菌株在制备冷水鱼抗传染性造血器官坏死病病毒疫苗制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的冷水鱼益生菌乳酸乳球菌菌株单独使用或与冷水鱼饲料、冷水鱼疫苗联合使用。

5.权利要求1所述的冷水鱼益生菌乳酸乳球菌菌株在制备冷水鱼疫苗免疫调节剂或免疫增强剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的冷水鱼疫苗免疫调节剂或免疫增强剂是通过提高冷水鱼补体蛋白C3、IL-1β、TNF-α、IL-2、补体蛋白C4、主要组织相容性复合体MHC、IgM以及总补体ACH50的水平进而达到调节或增强冷水鱼免疫功能的目的。

7.权利要求1所述的冷水鱼益生菌乳酸乳球菌菌株在制备冷水鱼活载体疫苗中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的冷水鱼益生菌乳酸乳球菌菌株作为外源蛋白分泌表达的活载体宿主菌株。