CN109423451A - 一种酿酒酵母菌株ksa01及其用途 - Google Patents

一种酿酒酵母菌株ksa01及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)菌株KSA01及其用途，所述酿酒酵母菌菌株KSA01是从构树叶或桑树叶的青贮发酵物中分离得到，已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13989，所述酿酒酵母菌菌株KSA01在改善动物胃肠道、促生长、提高免疫力、生产性能方面具有显著的优势，且同时具有安全高效、无残留、无毒副作用的特点，可作为饲用抗生素的替代品。

Description

一种酿酒酵母菌株KSA01及其用途
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种酿酒酵母菌株KSA01及其用途。
背景技术
我国养殖业发展迅速，生产规模不断扩大，畜禽产品总量大幅增加。然而在养殖过程中，畜禽经消化道感染或经外物传染的病毒性、细菌性疾病和肠道疾病爆发频率增加，而大规模的养殖更是增大了疫情爆发扩散的风险，严重制约了养殖业的健康发展。
为了畜禽养殖业的健康发展，人们通常选择在畜禽饲料中添加抗生素，提高畜禽的抗病力、改善生产性能和防治畜禽疾病。但随着抗生素长期广泛的在畜禽养殖中乱用和滥用，不仅导致了严重的病原菌耐药性和可抗药基因转移问题，引起人和动物机体免疫力下降、二次用药量增加、双重和内源性感染、致敏等一系列问题，而且还造成了药物残留等公共卫生隐疾。由抗生素乱用和滥用引发的动物源性食品安全隐患备受消费者关注和重视，尤其在生猪养殖产业中，抗生素的滥用降低了生猪产品的品质，无法满足人们对绿色食品的需求，严重影响了生猪产品的出口。因此，研制和应用无毒无公害的新型绿色饲料添加剂，部分或完全替代抗生素在饲料添加剂及畜禽疾病防治中的应用已成为当前饲料学科及兽医学工作的一项重要内容。
大量试验表明，在单胃动物或反刍动物饲料中添加酿酒酵母或其培养物，具有改善动物的胃肠道环境、提高动物的生产能力和免疫力的作用。酵母菌作为一种真核单细胞微生物，具有繁殖快、培养条件简单、不产生毒素等一系列优点，因此，将其开发出具有单细胞蛋白且能增强畜禽免疫力的双重功能饲料具有更广阔的应用前景。为此，本发明提供一株酿酒酵母，能够提高畜禽的抗病力、改善生产性能和防治畜禽疾病，可以有效替代饲用抗生素。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种酿酒酵母菌株KSA01及其用途。
为此，本发明提供了一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株 KSA01，从构树叶或桑树叶的青贮发酵物中分离得到。
所述的酿酒酵母菌株KSA01，于2017年4年7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13989。
本发明提供了一种含有所述的酿酒酵母菌株KSA01的菌剂。
本发明提供了一种制备所述的酿酒酵母菌株KSA01的菌剂的方法，将所述的酿酒酵母菌株KSA01进行液体发酵培养，取发酵液即得。
所述的方法，包括如下步骤：
(1)将所述的酿酒酵母菌株KSA01依次在斜面固体培养基、液体培养基中培养活化，得到活化的所述的酿酒酵母菌株KSA01的菌液，备用；
(2)将步骤(1)中的菌液接种到种子培养基中进行扩大培养，得到扩大培养液；
(3)取步骤(2)中获得的扩大培养液接种到液体发酵培养基中发酵，即得。
所述的方法，在所述步骤(1)中，将所述的酿酒酵母菌株KSA01接种到斜面固体培养基上，在28-32℃下培养36-60小时，然后将酿酒酵母菌株KSA01从所述固体斜面培养基上转接到所述液体培养基中，在28-32℃、 160-220转/分钟下摇床培养15-25小时。
所述的方法，在所述步骤(2)中，将所述的菌液按体积百分比0.5-1.5％的接种量接种到液体种子培养基中，在28-32℃、160-220转/分钟下摇床培养16-20小时，获得一级液体种子培养液，将所述一级液体种子培养物按体积百分比0.5-1.5％的接种量接种到液体种子培养基中，在培养温度 28-32℃、搅拌速度200-400转/分钟下培养16-20小时，控制溶氧≥20％，获得二级液体种子培养液，即得所述扩大培养液。
所述的方法，在所述步骤(3)中，将所述的扩大培养液按体积百分比 8-12％的接种量接种到发酵培养基中，发酵温度28-32℃，控制pH为4.9-5.1，控制溶氧≥20％，在搅拌速度200-400转/分钟下培养22-26小时。
所述的方法，每升所述种子培养基的组分包括：酵母粉3-7g，蛋白胨 3-7g，质量浓度为85％的浓磷酸1ml，总糖18-22g，其余为水；每升发酵培养基的组分包括：酪蛋白胨1-2g，酵母浸粉2-3g，葡萄糖2-4g，磷酸二氢钾0.2-0.3g，磷酸氢二钾1-2g，其余为水。
所述的酿酒酵母菌株KSA01或所述的酿酒酵母菌株KSA01的菌剂在制备饲料或饲料添加剂中的用途。
本发明提供了一种含有所述的酿酒酵母菌株KSA01或所述的酿酒酵母菌株KSA01的菌剂的微生态制剂。
本发明提供了一种含有所述的酿酒酵母菌株KSA01或所述的酿酒酵母菌株KSA01的菌剂的饲料。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株KSA01，从构树叶或桑树叶的青贮发酵物中分离得到的酿酒酵母菌株KSA01在改善动物胃肠道、促生长、提高免疫力方面具有显著的优势，且同时具有安全高效、无残留、无毒副作用的特点，可替代饲用抗生素。
2.本发明提供的含有所述的酿酒酵母菌株KSA01的菌剂，可用于动物饲料，调节动物免疫力，增强动物的抗病力，提高动物的体质，改善生产性能，如用于猪饲料中，实验证明，相比使用添加抗生素的饲料或添加普通的酿酒酵母的饲料饲喂仔猪和育肥猪，添加本发明所述的酿酒酵母菌株 KSA01的菌剂的饲料饲喂仔猪和育肥猪可以显著地提高仔猪和育肥猪的平均日增重，降低腹泻率和死淘率，提高饲料利用率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中酿酒酵母菌株KSA01的菌落照片图；
图2是本发明实施例1中酿酒酵母菌株KSA01的显微镜下照片图；
图3是本发明实施例1中酿酒酵母菌株KSA0126S rDNA的PCR产物电泳图；
图4是本发明实施例1中酿酒酵母菌株KSA01DNA序列与GenBank中报道的酿酒酵母序列同源性比较；其中U44806为GenBank中收录的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)26S rDNA的基因序列，KSA01为本发明菌株的26S rDNA基因序列；
图5是本发明实验例1中酿酒酵母菌株KSA01的生长曲线图；
图6是本发明实验例2中酿酒酵母菌株KSA01的发酵菌体破碎物稀释倍数与猪外周血单个核细胞的增殖指数关系的柱状图。
具体实施方式
下述实施例中每100mL的YPD液体培养基包括如下组分：蛋白胨2g，酵母提取物1g，葡萄糖2g，余量为蒸馏水；按照上述配方称取各组分并混合，121℃灭菌15min，控制pH为7.0，即得。YPD固体培养基为在每100mL 的YPD液体培养基配方的基础上添加琼脂粉2g,121℃灭菌15min，控制pH 为7.0，即得。
实施例1酿酒酵母菌株KSA01的分离和筛选
本实施例所述的酿酒酵母菌株KSA01的分离和筛选，包括如下步骤：
1、桑树叶或构树叶青贮发酵物的制备：取新鲜构树叶或桑树叶(购自康盛京构(北京)科技有限公司)粉碎，装填入窖，每填入一层，进行压实，窖填装满后，窖体顶面用塑料膜密封，密封后，塑料膜表面覆盖30～ 50厘米厚的土，在25℃～30℃下，发酵25～35天后，即得桑树叶或构树叶为原料的青贮发酵物；在本实施例中选择按上述方法制备的构树叶青贮发酵物在常温下自然晾干，粉碎，过80目筛，备用；
2、在无菌操作下，称取上述粉碎后的构树叶青贮发酵物粉末100g，加入200mL无菌YPD液体培养基，所述YPD液体培养基中含100mg/L氨苄青霉素和100mg/L氯霉素，混合均匀后，在室温下浸泡48h，在无菌条件下采用滤纸过滤浸泡液；
3、取适量的上述浸泡液加入YPD液体培养基中，30℃，180rpm，培养36h，取适量的培养液进行梯度稀释，然后涂布在YPD固体培养基平板上，30℃培养48h。
4、将固体培养基平板上生长的的菌落(如图1所示)与常规酿酒酵母菌落比较，发现固体培养基平板上生长的的菌落具有与常规酿酒酵母菌落类似的表面光滑、菌落呈乳白色、边缘整齐等特征，通过镜检初筛出酿酒酵母，显微镜(S9D，德国徕卡微系统有限公司)下照片图如图2所示。
5、通过26S rDNA对菌株KSA01进行分子水平的鉴定。利用酵母基因组DNA提取试剂盒(CW0569S，北京康为世纪生物科技有限公司)提取基因组总DNA，以其为模板，通过PCR技术扩增酿酒酵母的26s rDNA。引物序列为：上游引物：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’；下游引物：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’；上述引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。PCR扩增体系如下表1，
表1PCR反应体系
PCR扩增程序如下：95℃变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s， 72℃延伸30s，进行29个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
将上述获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，发现以 KSA01基因组DNA为模板能扩增出约580bp的DNA片段，与预期大小一致(图3)。PCR产物送生工生物工程(上海)有限公司进行测序。利用 GenBank数据库中BLAST软件对测序结果与数据库中已知序列进行比对，发现其与GenBank中收录的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)U44806菌株的26S rDNA的基因序列相似度达99％，可确定测序菌株为酿酒酵母 (图4)。通过上述鉴定，确定其为一株酿酒酵母，命名为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)KSA01，于2017年4年7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13989。
实施例2含有酿酒酵母菌株KSA01的菌剂的制备
本实施例提供了一种含有所述的酿酒酵母菌株KSA01的菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将实施例1分离的酿酒酵母菌株KSA01接于YPD固体斜面培养基，30℃培养48小时，培养结束后，放于4℃冰箱保存，备用；从保存的YPD固体斜面培养基上的酿酒酵母接种到装有50mL的YPD液体培养基的250ml三角瓶中，在30℃下以180转/分钟的速度摇床培养20 小时，得到液体活化培养的菌液；
(2)一级种子培养：按体积百分比1％的接种量将步骤(1)中液体活化培养的菌液转接到装有250mL的YPD液体培养基的三角瓶中，在30℃下以180转/分钟的速度摇床培养18小时，获得一级液体种子培养液；然后按体积百分比1％的接种量将一级种子培养液转接到装有5L种子培养基的10L种子发酵罐中，30℃，以300转/分钟的速度搅拌培养18小时，控制溶氧≥20％，获得二级种子培养液；
(3)液体发酵培养：按体积百分比10％的接种量将二级种子培养液转接到装有50L发酵培养基的100L发酵罐中，发酵温度30℃，pH控制5.0，控制溶氧≥20％，通过搅拌速度300转/分钟变化控制溶氧，搅拌培养24 小时。
所述种子培养基配制成份(1升)：酵母粉5g，蛋白胨5g，质量浓度为 85％的浓磷酸1ml，总糖为20g，余量为蒸馏水，pH5.0。所述总糖为甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜。所述发酵培养基配制成份(1升)：酪蛋白胨1.5g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖3.0g，磷酸二氢钾0.24g，磷酸氢二钾1.6g，余量为蒸馏水， 121℃灭菌15min，即得。
在上述发酵工艺条件下，发酵24小时后，细胞生物量以湿菌体计达到 118g/L。取0.1ml发酵菌液至1ml无菌水中作10-1稀释，同样的作10-2、10-3、 10-4、10-5、10-6、10-7、10-8逐级稀释，分别取10-5、10-6、10-7的稀释液涂布在YPD固体培养基平板上，30℃培养48小时后计数；菌液活菌数＝平板计数×稀释倍数÷0.1ml(个/ml)。得到本实施例酿酒酵母菌株KSA01的发酵液中细胞密度约为3.2×109个细胞/ml发酵液。
实施例3含有酿酒酵母菌株KSA01的菌剂的制备
本实施例提供了一种含有所述的酿酒酵母菌株KSA01的菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将实施例1分离的酿酒酵母菌株KSA01接于YPD固体斜面培养基，28℃培养60小时，培养结束后，放于4℃冰箱保存，备用；从保存的YPD固体斜面培养基上的酿酒酵母接种到装有50mL的YPD液体培养基的250ml三角瓶中，在28℃下以220转/分钟的速度摇床培养15 小时，得到液体活化培养的菌液；
(2)一级种子培养：按体积百分比1.5％的接种量将步骤(1)中液体活化培养的菌液转接到装有250mL的YPD液体培养基的三角瓶中，在32℃下以160转/分钟的速度摇床培养20小时，获得一级液体种子培养液；然后按体积百分比1.5％的接种量将一级种子培养液转接到装有5L种子培养基的10L种子发酵罐中，28℃，以400转/分钟的速度搅拌培养16小时，控制溶氧≥20％，获得二级种子培养液；
(3)液体发酵培养：按体积百分比8％的接种量将二级种子培养液转接到装有50L发酵培养基的100L发酵罐中，发酵温度28℃，pH控制为5.0，控制溶氧≥20％，通过搅拌速度400转/分钟变化控制溶氧，搅拌培养22 小时。
所述种子培养基配制成份(1升)：酵母粉3g，蛋白胨7g，质量浓度为 85％的浓磷酸1ml，总糖为18g，余量为蒸馏水，pH5.0。所述总糖为甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜。所述发酵培养基配制成份(1升)：酪蛋白胨1g，酵母浸粉 3g，葡萄糖2g，磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钾1g，余量为蒸馏水，121℃灭菌15min，即得。
在上述发酵工艺条件下，发酵24小时后，细胞生物量以湿菌体计达到 118g/L。取0.1ml发酵菌液至1ml无菌水中作10-1稀释，同样的作10-2、10-3、 10-4、10-5、10-6、10-7、10-8逐级稀释，分别取10-5、10-6、10-7的稀释液涂布在YPD固体培养基平板上，30℃培养48小时后计数；菌液活菌数＝平板计数×稀释倍数÷0.1ml(个/ml)。得到本实施例酿酒酵母菌株KSA01的发酵液中细胞密度约为3.2×109个细胞/ml发酵液。
实施例4含有酿酒酵母菌株KSA01的菌剂的制备
本实施例提供了一种含有所述的酿酒酵母菌株KSA01的菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将实施例1分离的酿酒酵母菌株KSA01接于YPD固体斜面培养基，32℃培养36小时，培养结束后，放于4℃冰箱保存，备用；从保存的YPD固体斜面培养基上的酿酒酵母接种到装有50mL的YPD液体培养基的250ml三角瓶中，在32℃下以160转/分钟的速度摇床培养25 小时，得到液体活化培养的菌液；
(2)一级种子培养：按体积百分比0.5％的接种量将步骤(1)中液体活化培养的菌液转接到装有250mL的YPD液体培养基的三角瓶中，在28℃下以200转/分钟的速度摇床培养16小时，获得一级液体种子培养液；然后按体积百分比0.5％的接种量将一级种子培养液转接到装有5L种子培养基的10L种子发酵罐中，32℃，以200转/分钟的速度搅拌培养20小时，控制溶氧≥20％，获得二级种子培养液；
(3)液体发酵培养：按体积百分比12％的接种量将二级种子培养液转接到装有50L发酵培养基的100L发酵罐中，发酵温度32℃，pH控制为5.0，控制溶氧≥20％，通过搅拌速度200转/分钟变化控制溶氧，搅拌培养20 小时。
所述种子培养基配制成份(1升)：酵母粉7g，蛋白胨3g，质量浓度为 85％的浓磷酸1ml，总糖为22g，余量为蒸馏水，pH5.0。所述总糖为甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜。所述发酵培养基配制成份(1升)：酪蛋白胨2g，酵母浸粉 2g，葡萄糖4g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钾2g，余量为蒸馏水，121℃灭菌15min，即得。
在上述发酵工艺条件下，发酵24小时后，细胞生物量以湿菌体计达到 118g/L。取0.1ml发酵菌液至1ml无菌水中作10-1稀释，同样的作10-2、10-3、 10-4、10-5、10-6、10-7、10-8逐级稀释，分别取10-5、10-6、10-7的稀释液涂布在YPD固体培养基平板上，30℃培养48小时后计数；菌液活菌数＝平板计数×稀释倍数÷0.1ml(个/ml)。得到本实施例酿酒酵母菌株KSA01的发酵液中细胞密度约为3.2×109个细胞/ml发酵液。
实施例5含有酿酒酵母菌株KSA01的菌剂的饲料
本实施例提供了一种含有酿酒酵母菌株KSA01的菌剂的饲料，包括如下步骤：
向实施例2制备的含有酿酒酵母菌株KSA01的菌剂中加入干燥淀粉，按照每0.5L的酿酒酵母菌株KSA01的菌剂加入1kg干燥淀粉，搅拌均匀并均匀成颗粒后，经干燥获得含水量低于10％的酿酒酵母添加饲料，命名为酿酒酵母KSA01添加饲料。
实验例
实验例1酿酒酵母菌株KSA01生长曲线
将本发明的酿酒酵母菌株KSA01与普通酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(购于ATCC，编号ATCC22575)进行生长活性对比，具体步骤如下：
将本发明实施例1分离筛选得到的酿酒酵母菌株KSA01与购买的普通酿酒酵母ATCC 22575分别接种到YPD斜面固体培养基活化，然后再分别将酿酒酵母菌株KSA01和酿酒酵母ATCC 22575从所述固体斜面培养基上转接到新制备的YPD斜面固体培养基活化，将活化后的酿酒酵母菌株 KSA01和酿酒酵母ATCC22575分别以1％的接种量(约2×106cfu/mL)接种于装有100mL YPD液体培养基的250mL三角瓶中，30℃，180转/分钟摇床培养，每2小时取样，测定600nm处吸光值，以培养时间为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，绘制生长曲线。结果如图5所示，为酿酒酵母CGMCC No.13989与普通酿酒酵母生长曲线，每隔2h测定菌体密度(n＝3,*P<0.05)，本发明的酿酒酵母菌株KSA01的增殖速度、最大生物量与酿酒酵母ATCC22575相比无显著性变化，表明本发明的酿酒酵母菌株KSA01生长稳定。
实验例2酿酒酵母刺激猪外周血单个核细胞增殖试验
比较本发明实施例1分离筛选得到的酿酒酵母菌株KSA01和购买的普通酿酒酵母ATCC22575对于猪外周血单个核细胞增殖的影响，包括如下步骤：
1)取实施例2中制备的所述的酿酒酵母菌株KSA01的菌剂100ml，以3000转/分钟离心5min，弃上清，用10ml PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎，功率为300w，工作7s，间歇7s，破碎70次，破碎后的细胞悬液，在4℃、以10000转/分钟的速度离心30min，取上清，十倍梯度稀释，得到酿酒酵母菌株KSA01的发酵菌体破碎物，备用；取酿酒酵母ATCC 22575按照实施例2制备的所述的酿酒酵母ATCC 22575的菌剂100ml，按照上述步骤实施，得到酿酒酵母ATCC22575的发酵菌体破碎物，备用。
2)通过颈静脉采血方法，用真空枸橼酸钠抗凝管采集50日龄猪新鲜抗凝全血，在无菌条件下利用密度梯度离心法分离获得猪外周血单个核细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基调整细胞浓度，以2×105个细胞/孔加入96孔细胞培养板中；设置实验组：向细胞培养板中加入经十倍梯度稀释后的酿酒酵母(KSA01或ATCC 22575)发酵菌体破碎物10μL；设阳性对照孔，每孔加10μL浓度为2.5μg/mL的聚羟基脂肪酸酯(PHA)；设阴性对照孔，每孔加10μL的PBS缓冲液。每孔终体积为200μL，每个处理设3个复孔。
3)将上述加样96孔培养板置于细胞培养箱以37℃、5％CO2条件下培养72h。待培养时间结束后，向各细胞培养孔加入30μL浓度为5mg/ml的 MTT溶液，继续培养4h。1000rpm离心10min，弃上清，每孔加入120μL 二甲基亚砜(DMSO)，室温震荡10min。通过酶标仪(FLUOSTAR OMEGA
，德国BMG LABTECH公司)以测定波长570nm和参比波长630mm 测定各实验孔的吸光值(OD)。以增殖指数表示酿酒酵母刺激猪外周血单个核细胞增殖能力。增殖指数＝实验组吸光值/阴性对照组吸光值。
结果如图6所示，本发明中所述的酿酒酵母菌株KSA01的发酵菌体破碎物刺激猪外周血单个核细胞的增殖指数要显著高于相同稀释倍数的酿酒酵母ATCC 22575的发酵菌体破碎物(P<0.05)，且增殖指数随发酵菌体破碎物稀释倍数的增大而降低(P<0.05)。酿酒酵母ATCC 22575的发酵菌体破碎物仅显示出较低的增殖指数。因此，本发明所述的酿酒酵母菌株KSA01 发酵菌体破碎物在体外有促进猪外周血淋巴细胞增殖的能力。
实验例3仔猪饲养试验
试验动物：28日龄杜洛克×长白×大白三元杂交断奶仔猪184头，根据窝源、体重、性别随机分为4个处理组，每个处理组设2个重复组，每个重复组23头仔猪，公母比例均衡。4个处理组分别为抗生素组、对照酿酒酵母ATCC22575组、酿酒酵母KSA01组、酿酒酵母ZKJM2-1(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6761)组。
添加饲料：抗生素(所述抗生素包括氟苯尼考、青霉素、卡那霉素、氨基比林、地塞米松，上述均购自浙江康牧药业有限公司)；酿酒酵母KSA01 添加饲料；取酿酒酵母ATCC22575按照实施例2制备的含有酿酒酵母ATCC 22575的菌剂，然后按照实施例5制备的酿酒酵母ATCC 22575添加饲料；取酿酒酵母菌株ZKJM2-1按照实施例2制备的含有酿酒酵母菌株ZKJM2-1的菌剂，然后按照实施例5制备的酿酒酵母ZKJM2-1添加饲料。
饲喂方法：参考NRC(1998)猪营养需要标准，抗生素对照组饲喂添加抗生素的基础日粮(所述基础日粮购自大北农饲料科技公司，猪用复合预混合饲料仔猪4％复合预混料)，对照酿酒酵母ATCC22575组饲喂添加酿酒酵母ATCC 22575添加饲料的基础日粮，酿酒酵母KSA01组饲喂添加酿酒酵母KSA01添加饲料的基础日粮，酿酒酵母ZKJM2-1组饲喂添加酿酒酵母ZKJM2-1添加饲料的基础日粮。在含抗生素的基础日粮中，抗生素的添加量为每100kg基础日粮中添加氟苯尼考15g、青霉素20g、卡那霉素15g、氨基比林100g、地塞米松0.4g；除了抗生素添加饲料，其他的添加饲料的添加量均为5％，即每100kg基础日粮中，含有5kg的添加饲料和95kg的基础日粮。
试验地点：河南漯河莲花镇半李村万豪牧业有限公司养猪场
试验期：试验期为35天，仔猪断奶时即28日龄开始至63日龄时结束。
日常管理：半开放式猪舍，干粉状饲料，自由采食和饮水，常规程序免疫消毒。
平均采食量(千克/头·日)：以组为单位，准确记录每天的投料量，次日清晨清料槽，计算每日采食量。将整个饲喂周期的每日采食量进行加和，获得总消耗饲料量。平均采食量的计算方法为：总消耗饲料量/(试验猪头数×试验天数)。
平均日增重(千克/头·日)：以组为单位，计算方法为(试验结束窝重-试验开始窝重)/试验猪头数/试验天数。
料肉比：平均采食量/平均日增重。
平均日腹泻率(％)：以组为单位，每日至少3次随时观察腹泻，记录腹泻的猪只数，试验结束计算平均日腹泻率。计算方法为试验期腹泻猪只数/(试验猪头数×试验天数)×100％。
死淘率(％)：以组为单位，记录死亡的猪只数，试验结束计算成活率。计算方法为淘汰猪头数/试验猪头数×100％。
试验结果如下表1，在饲料中添加酿酒酵母KSA01添加饲料与添加抗生素组相比，仔猪日增重显著提高12.2％，饲料效率提高5.81％，平均日腹泻率降低到4.1％，死淘率为零，免疫力、抗病力显著提高，生产性能有较大提高，为仔猪以后的生长打下良好的生长基础，因此，本发明的酿酒酵母KSA01可以作为饲用抗生素的替代品在仔猪饲料中添加。同时，本发明的酿酒酵母KSA01与对照酵母ATCC 22575组相比，饲料效率、日增重提高、腹泻率和死淘率指标优势明显，如酿酒酵母KSA01组平均日日增重提高12.2％，显著高于对照酿酒酵母ATCC22575组的2.4％，酿酒酵母KSA01 组平均日腹泻率4.1％低于对照酿酒酵母ATCC22575组的6.3％，酿酒酵母 KSA01组死淘率为零，而对照酿酒酵母ATCC 22575组死淘率为6.5％。与酿酒酵母ZKJM2-1组相比，饲料效率、日增重提高、腹泻率指标优势明显，如酿酒酵母KSA01组平均日日增重提高12.2％，显著高于酿酒酵母 ZKJM2-1组的7.0％，酿酒酵母KSA01组平均日腹泻率4.1％低于酿酒酵母 ZKJM2-1组的5.3％，酿酒酵母KSA01组死淘率为零。综上说明，本发明的酿酒酵母KSA01相对于其他的酿酒酵母在提高仔猪免疫力、抗病力、提高动物的体质和改善生产性能方面具有显著的技术效果。
表1仔猪35天生产性能统计表
实验例4育肥猪饲养试验
试验动物：将常规喂养9周的杜洛克×长白×大白三元杂交断奶仔猪128头，体重、性别随机分为4个处理组，每个处理组设2个重复组，每个重复组16头仔猪，公母比例均衡。4个处理组分别为抗生素组、对照酿酒酵母ATCC22575组、酿酒酵母KSA01组、酿酒酵母ZKJM2-1(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6761)组。
添加饲料：抗生素(所述抗生素包括氟苯尼考、青霉素、卡那霉素、氨基比林、地塞米松均购自浙江康牧药业有限公司)；酿酒酵母KSA01添加饲料；取酿酒酵母ATCC 22575按照实施例2制备的含有酿酒酵母ATCC 22575的菌剂，然后按照实施例5制备的酿酒酵母ATCC22575添加饲料；取酿酒酵母菌株ZKJM2-1按照实施例2制备的含有酿酒酵母菌株ZKJM2-1的菌剂，然后按照实施例5制备的酿酒酵母ZKJM2-1添加饲料。
饲喂方法：参考NRC(1998)猪营养需要标准，抗生素组饲喂添加抗生素的基础日粮(所述基础日粮购自大北农饲料科技公司，猪用复合预混合饲料仔猪4％复合预混料)，对照酿酒酵母ATCC22575组饲喂添加酿酒酵母 ATCC 22575添加饲料的基础日粮，酿酒酵母KSA01组饲喂添加酿酒酵母 KSA01添加饲料的基础日粮，酿酒酵母ZKJM2-1组饲喂添加酿酒酵母 ZKJM2-1添加饲料的基础日粮。在含抗生素的基础日粮中，抗生素的添加量为每100kg基础日粮中添加氟苯尼考15g、青霉素20g、卡那霉素15g、氨基比林100g、地塞米松0.4g；除了抗生素添加饲料，其他的添加饲料的添加量为5％，即每100kg基础日粮中，含有5kg的添加饲料和95kg的基础日粮。
试验地点：河南漯河莲花镇半李村万豪牧业有限公司养猪场
试验期：试验期为60天。
日常管理：半开放式猪舍，干粉状饲料，自由采食和饮水，常规程序免疫消毒。
平均采食量(千克/头·日)：以组为单位，准确记录每天的投料量，次日清晨清料槽，计算每日采食量。将整个饲喂周期的每日采食量进行加和，获得总消耗饲料量。平均采食量的计算方法为：总消耗饲料量/(试验猪头数×试验天数)。
平均日增重(千克/头·日)：以组为单位，计算方法为(试验结束窝重 -试验开始窝重)/试验猪头数/试验天数。
料肉比：平均采食量/平均日增重。
平均日腹泻率(％)：以组为单位，每日至少3次随时观察腹泻，记录腹泻的猪只数，试验结束计算平均日腹泻率。计算方法为试验期腹泻猪只数/(试验猪头数×试验天数)×100％。
死淘率(％)：以组为单位，记录死亡的猪只数，试验结束计算成活率。计算方法为淘汰猪头数/试验猪头数×100％。
试验结果如下表2所示，在饲料中添加酿酒酵母KSA01添加饲料与添加抗生素组相比，育肥猪日增重显著提高9.5％，饲料效率提高3.99％，腹泻率降低到0.52％，死淘率为零，提高抗病力，生产性能有较大提高，因此，本发明的酿酒酵母KSA01可以作为饲用抗生素的替代品在育肥猪饲料中添加。同时，本发明的酿酒酵母KSA01和对照酵母ATCC 22575相比，日增重、饲料效率提高、腹泻率和死淘率指标优势明显，酿酒酵母KSA01组的日增重提高9.5％，而ATCC 22575组的日增重提高仅为3.2％，酿酒酵母 KSA01组腹泻率0.52％，低于ATCC 22575组的1.41％，酿酒酵母KSA01 组死淘率为零，而ATCC 22575组死淘率为6.3％。和酿酒酵母ZKJM2-1组相比，日增重、腹泻率和死淘率指标优势明显，酿酒酵母KSA01组的日增重提高9.5％，而酿酒酵母ZKJM2-1组的日增重提高仅为0.61％，酿酒酵母KSA01组腹泻率0.52％，低于酿酒酵母ZKJM2-1组的1.30％，酿酒酵母 KSA01组死淘率为零，而酿酒酵母ZKJM2-1组死淘率为3.1％。综上说明，本发明的酿酒酵母KSA01相对于其他的酿酒酵母在提高育肥猪免疫力、抗病力、提高动物的体质和改善生产性能方面具有显著的技术效果。
表2生猪60天生产性能统计表
综上，在仔猪和育肥猪基础日粮中添加含有酿酒酵母菌株KSA01的菌剂制备的添加饲料较抗生素组、对照酿酒酵母ATCC22575组、酿酒酵母 ZKJM2-1组显著地提高仔猪和育肥猪的平均日增重、饲料利用率，显著降低腹泻率和死淘率。因此，本发明的酿酒酵母菌株KSA01及其发酵培养液可增强生猪免疫力，调节生猪免疫力，增强生猪抗病能力，提高生猪体质，提高生产性能等方面具有良好的促进作用，可以作为有效的饲用抗生素的替代品，应用效果显著，且具有安全高效、无残留、无毒副作用的特点。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 康盛中科（北京）技术有限公司
<120> 一种酿酒酵母菌菌株KSA01及其用途
<130> HA201701246
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gcatatcaat aagcggagga aaag 24
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ggtccgtgtt tcaagacgg 19

Claims (10)

1.一种酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)菌株KSA01，其特征在于，所述的酿酒酵母菌菌株KSA01从构树叶或桑树叶的青贮发酵物中分离得到。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母菌菌株KSA01，其特征在于，所述的酿酒酵母菌菌株KSA01保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13989。
3.一种含有权利要求1或2所述的酿酒酵母菌菌株KSA01的菌剂。
4.一种制备权利要求3所述的酿酒酵母菌菌株KSA01的菌剂的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的酿酒酵母菌菌株KSA01进行液体发酵培养，取发酵液即得。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将所述的酿酒酵母菌菌株KSA01依次在斜面固体培养基、液体培养基中培养活化，得到含有活化的所述的酿酒酵母菌菌株KSA01的菌液，备用；
(2)将步骤(1)中的菌液接种到种子培养基中进行扩大培养，得到扩大培养液；
(3)取步骤(2)中获得的扩大培养液接种到液体发酵培养基中发酵，即得。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，(1)将所述的酿酒酵母菌菌株KSA01接种到斜面固体培养基上，在28-32℃下培养36-60小时，然后将酿酒酵母菌菌株KSA01从所述固体斜面培养基上转接到所述液体培养基中，在28-32℃、160-220转/分钟下摇床培养15-25小时；
(2)将步骤(1)中的菌液按体积百分比0.5-1.5％的接种量接种到液体种子培养基中，在28-32℃、160-220转/分钟下摇床培养16-20小时，获得一级液体种子培养液，将所述一级液体种子培养液按体积百分比0.5-1.5％的接种量接种到液体种子培养基中，在培养温度28-32℃、搅拌速度200-400转/分钟下培养16-20小时，控制溶氧≥20％，获得二级液体种子培养液，即得所述扩大培养液；
(3)将所述扩大培养液按体积百分比8-12％的接种量接种到发酵培养基中，发酵温度28-32℃，控制pH为4.9-5.1，控制溶氧≥20％，搅拌速度为200-400转/分钟，培养22-26小时。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，每升所述种子培养基的组分包括：酵母粉3-7g，蛋白胨3-7g，质量浓度为85％的浓磷酸1ml，总糖18-22g，其余为水；每升发酵培养基的组分包括：酪蛋白胨1-2g，酵母浸粉2-3g，葡萄糖2-4g，磷酸二氢钾0.2-0.3g，磷酸氢二钾1-2g，其余为水。
8.权利要求1或2所述的酿酒酵母菌菌株KSA01或权利要求3所述的酿酒酵母菌菌株KSA01的菌剂在制备饲料或饲料添加剂中的用途。
9.一种含有权利要求1或2所述的酿酒酵母菌菌株KSA01或权利要求3所述的酿酒酵母菌菌株KSA01的菌剂的微生态制剂。
10.一种含有权利要求1或2所述的酿酒酵母菌菌株KSA01或权利要求3所述的酿酒酵母菌菌株KSA01的菌剂的饲料。
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