CN103289927A

CN103289927A - 一株唾液乳杆菌菌株及其应用

Info

Publication number: CN103289927A
Application number: CN2013102095660A
Authority: CN
Inventors: 王云峰; 崔红玉; 赵妍
Original assignee: HARBIN ANIMAL BIOLOGICAL PRODUCTS NATIONAL ENGINEERING RESEARCH CENTER CO LTD; Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin National Biological Polytron Technologies Inc; Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2013-05-30
Filing date: 2013-05-30
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2033-05-30
Also published as: CN103289927B

Abstract

本发明公开了一株唾液乳杆菌菌株及其应用。本发明通过将野生鸡粪便在MRS液体选择培养基中细菌增殖富集，分离培养和接种纯化，获得一株唾液乳杆菌菌株（菌株号为HVRIC4），其微生物保藏号是CGMCC No.6786。本发明的唾液乳杆菌具有较强的耐酸、耐胆盐特性。通过体外抑菌试验表明，该菌株对革兰氏阴性大肠杆菌、沙门氏菌及革兰氏阳性葡萄球菌均具有较强的抑菌作用，呈现出广谱的抗菌效果。对SPF鸡具有促进生长的作用，对SPF鸡饲喂本发明菌株可以有效抵抗沙门氏菌和禽传染性喉气管炎病毒的感染，对SPF鸡具有有效的保护作用。

Description

一株唾液乳杆菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株唾液乳杆菌菌株，还涉及该唾液乳杆菌菌株在制备促进动物生长的药物中的应用，属于微生物领域。

背景技术

唾液乳酸杆菌（Lactobacillus salvarius）是乳杆菌属的重要成员之一，大多数为动物体表和内部黏膜表面的益生菌之一。益生性乳杆菌（Lactic acid bacteria，LAB，）是人和动物肠道、呼吸道、生殖道及皮肤黏膜系统的正常菌群，许多研究成果发现乳杆菌和肠黏膜共同组成保护屏障，防止病毒、细菌等的侵入，人类越来越清晰地认识到益生菌对人类和动物生命健康的重要作用，大量现代免疫学研究结果已经证实益生菌（尤其是乳杆菌）对动物细胞免疫、体液免疫及肠黏膜局部免疫的调节功能，以及对免疫系统发育和免疫稳态的决定作用；并具有抑制肿瘤和抗癌作用等，使益生乳杆菌近年来一度成为现代功能食品、动物饲料添加剂、医学领域的研究热点之一，甚至成为现代固有免疫学领域的研究热点。

一系列研究表明，如果没有益生菌，人和动物的免疫系统绝不能发育成为正常的免疫系统。益生乳杆菌不仅可以有效调节黏膜免疫系统、有效促进分泌型sIgA的分泌，而且还可以调节黏膜的菌群分布，促使某些病原体发生凝聚，并阻止其粘附在黏膜上，以防止其进一步的侵入，并且益生菌吸附在黏膜表面（包括肠黏膜和呼吸道黏膜），能够降解粘性蛋白并利用这种内源性的营养可以基本保持数量稳定，这种粘附可以与黏膜免疫系统发生作用，可以有效地刺激黏膜免疫系统，起到免疫调节作用，从而使黏膜免疫系统处于合适的稳定的激活状态（免疫稳态），进而有利于抵御外来病毒或细菌的入侵。因此乳杆菌的合理存在和适当刺激，可以提高黏膜免疫系统的防御功能，从而有效的阻止病毒的吸附和侵入。

存在于胃肠道黏膜、口腔呼吸道黏膜及生殖道表面的益生菌作为一种活的常驻菌体对肠道黏膜及呼吸道黏膜具有双重的保护作用，一方面它可以在黏膜表面内附着定植，维护胃肠道及呼吸道黏膜微生物菌群平衡；另一方面益生菌可直接与宿主的免疫系统尤其是宿主的黏膜免疫系统发生相互作用诱发黏膜免疫；并能够刺激脾脏、胸腺及法氏囊等免疫中枢器官的发育，还可以促进巨噬细胞发挥佐剂作用；通过影响黏膜系统细胞因子等的合成和分泌，从而增强T、B细胞对抗原刺激的反应性能，有效增强特异性免疫作用；黏膜表面常驻益生菌可以活化黏膜内的相关淋巴组织，增加sIgA生物合成，提高消化道黏膜及呼吸道黏膜免疫功能，通过诱导淋巴细胞和巨噬细胞产生细胞因子，发挥免疫调节作用，从而增强机体免疫功能。但是，目前乳杆菌最大的缺点是生命力十分脆弱，无法久存。研究发现，乳杆菌必须在肠道特定部位才能产生功效。而天然乳杆菌不耐高温、胃酸及胆盐的侵蚀，经饲料制粒后大多数乳杆菌会死亡，很难通过胃环境安全到达肠道发挥作用。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明提供了一种唾液乳杆菌，具有耐酸、耐胆盐的特性。

本发明通过以下技术方案实现的：

本发明通过对健康野生鸡粪便进行接种培养、分离纯化后获得一株唾液乳杆菌菌株（菌株号为HVRIC4），其微生物保藏号为CGMCC No.6786；保藏日期：2012年11月7日；其分类命名为：乳杆菌属唾液乳杆菌（Lactobacillus salvarius）；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。

本发明主要通过以下方法从来自于中国新疆天山山脉健康野生鸡的新鲜粪便中分离得到上述唾液乳杆菌菌株：

将采集的野生鸡粪便直接接种于MRS液体选择培养基中进行细菌增殖富集，再接种至MRS固体选择培养基，挑取特征明显的菌落反复划线分离，直至分离出形态、大小一致的菌落，进行革兰氏染色，对菌体形态进行显微观察。反复接种纯化后，即得。

经法国梅里埃公司API50CH鉴定系统进行菌种判定，本发明所分离得到的唾液乳杆菌菌株HVRIC4的分类地位属于：乳杆菌属唾液乳酸杆菌（Lactobacillussalvarius）。

该菌株在MRS平板上的菌落为半球形，表面光滑湿润，呈乳白色，直径约为1-2mm，大小均一；革兰氏染色观察，该菌株为典型革兰氏阳性，显微镜下呈粗短杆状，两端钝圆，无芽孢；在MRS液体培养基中生长良好，呈均匀浑浊生长，12小时在试管底部出现白色沉淀。最适生长温度为37℃至38℃，适宜pH为4.5-7.0，能在质量分数为5%氯化钠肉汤中生长。接触酶、氧化酶阴性，不还原硝酸盐，不液化明胶。

本发明的唾液乳杆菌（Lactobacillus salvarius）HVRIC4菌株可以用于调节动物肠道菌群，促进动物生长。

本发明取得的有益效果如下：

本发明菌株HVRIC4经16S rDNA鉴定为唾液乳酸杆菌（Lactobacillussalvarius）。本发明的唾液乳杆菌具有较强的耐酸、耐胆盐能力，能分别在pH=3的培养液和含4g/L胆盐的培养液中生长。牛津杯法体外抑菌试验表明，该菌株对革兰氏阴性大肠杆菌、沙门氏菌及革兰氏阳性的葡萄球菌均具有较强的抑菌作用，呈现广谱抗菌效果。

该菌株对SPF鸡饲喂试验表明，本发明的唾液乳杆菌HVRIC4长期饲喂对SPF鸡无不良影响，并具有促生长作用；攻毒试验表明，饲喂本发明菌株可以使SPF鸡有效抵抗沙门氏菌和禽传染性喉气管炎病毒的感染，对SPF鸡具有有效的保护作用。

附图说明

图1为唾液乳杆菌（Lactobacillus salvarius）HVRIC4革兰氏染色图；

图2为唾液乳杆菌（Lactobacillus salvarius）HVRIC4耐酸试验；

图3为唾液乳杆菌（Lactobacillus salvarius）HVRIC4耐胆盐试验；

图4为PCR扩增产物唾液乳杆菌（Lactobacillus salvarius）HVRIC416s rDNA基因片段电泳图；

图5为唾液乳杆菌（Lactobacillus salvarius）HVRIC4对SPF鸡促生长试验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1菌株的分离

试验材料：

试验样品：中国新疆天山山脉健康野鸡的新鲜粪便

培养基的配制：

MRS液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温-80lml，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000ml，pH值6.2-6.4，121℃灭菌15min；

MRS固体培养基：MRS液体培养基中加入1.5%琼脂粉121℃灭菌15min配制而成。

试验方法：

将采集的野生新鲜鸡粪便直接接种于MRS液体选择培养基中进行细菌增殖富集，再接种至MRS固体选择培养基，挑取特征明显的菌落反复划线分离，直至分离出形态、大小一致的菌落，进行革兰氏染色，对菌体形态进行显微观察。反复接种纯化后，即得，将所得菌株种命名为HVRIC4。

试验结果：

唾液乳杆菌菌株HVRIC4在MRS平板上的菌落为半球形，表面光滑湿润，呈乳白色，直径约为1-2mm，大小均一；革兰氏染色观察，该菌株为典型革兰氏阳性，染色较深，显微镜下呈粗短杆状，两端钝圆，无芽孢，结果见图1。

实施例2菌株的生化鉴定

试验材料：牛胆盐试剂：奥博星生物技术有限公司

使用法国梅里埃公司API50CHL试纸条鉴定系统鉴定菌株的生化图谱，依据生化图谱对菌株进行种属鉴定（API50CHL是用于乳酸杆菌和相关菌的鉴定试纸条系统，它是由49种可发酵碳水化合物的API50CH简易培养基组成的试验条。以测定菌制成悬液接种试验条的每一个小管。当培养时，由于发酵碳水化合物产酸，pH下降，使指示剂变色。结果构成菌株的生化图谱，并用于鉴定或分型。共49个生化鉴定试纸条，一个对照条，合计50个试纸条组成），根据API50CH鉴定试剂条使用说明，将分别加入规定浓度（混浊度相当于2McFarland的菌悬液）的乳杆菌的试剂条置于37℃培养箱培养进行孵育，孵育24小时和48小时时分别记录反应结果，根据24小时和48小时反应结果的发酵反应生化图谱，菌株的生化图谱为：对照孔阴性；核糖、D-木糖、L-木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、山梨糖、卫茅醇、山梨醇、α-甲基-D-甘露糖甙、α-甲基-D-葡萄糖甙、苦杏仁甙、熊果甙、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、菊糖、棉子糖、淀粉、拢牛儿糖、D-松二糖、D-来苏糖、D-岩糖、L-阿拉伯糖醇、葡萄糖酸盐、2-酮基-葡萄糖酸盐为阳性；甘油、赤癣醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、阿东醇、β-甲基-D-木糖甙、半乳糖、鼠李糖、肌醇、甘露醇、N-乙酰-葡糖胺、松叁糖、糖原、木糖醇、D-塔格糖、L-岩糖、D-阿拉伯糖醇、5-酮基-葡萄糖酸盐为阴性；应用法国梅里埃公司API50CH鉴定系统的软件进行菌种的判定，该菌株鉴定结果为唾液乳杆菌（Lactobacillus salvarius）。

3.菌株的耐酸试验：

将分离获得的菌株按MRS液体培养基体积的10%的接种量分别接种于pH值为3.0、4.0、5.0、6.5的MRS液体培养基中，每个酸度梯度设置3个平行对照，37℃静置培养，分别取培养30min、60min、90min、120min的菌液样品测定OD₆₀₀nm值，绘制生长曲线。结果表明，本发明菌株具有较强的抗酸能力，试验结果见图2。

4.菌株的耐胆盐试验：

将分离菌株按MRS液体培养基体积的10%的接种量接种于牛胆盐含量分别为0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的MRS培养基中，每个浓度设置3个平行试验，37℃静置培养，取培养30min、60min、90min、120min的菌液样品测定OD₆₀₀nm值，，结果表明分离菌株能在含0.3％的牛胆盐MRS培养基中生长，试验结果表明本发明菌株具有较强的抗胆盐能力，结果见图3。

实施例3菌株的16SrDNA的种属鉴定

1试验材料：

PCR试剂盒购于TaKaRa生物公司；胶回收试剂盒购于爱思进生物技术有限公司；引物由博仕生物公司合成，利用细菌域通用引物27F为SEQ ID No.2；1541R为SEQ ID No.3。

利用细菌域通用引物27F和1541R，以提取的乳杆菌基因组DNA为模板，扩增长度为1441bp的16S rDNA序列，PCR扩增体系为50μL，PCR程序：95℃5min；95℃45s、50℃1min、72℃90s，10个循环；95℃45s、58℃1min、72℃90s，15个循环；95℃45s、55℃1min、72℃90s，10个循环；72℃10min，PCR扩增产物切胶回收后，将片段克隆于pMD18-T载体中，由Invitrogen公司测序，所得序列经NCBI的Blast分析与唾液乳杆菌同源性在99%以上。序列分析结果表明，本发明菌株HVRIC4为唾液乳杆菌。16s rDNA凝胶电泳图，见图4；16srDNA氨基酸序列为SEQ ID No.1。

实施例4菌株的体内益生作用试验

试验材料：SPF鸡：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心

将活化后的菌株，以平板菌落计数法进行菌落计数，60日龄SPF鸡每只鸡口服1mL约含乳杆菌为6～8×10⁸CFU的菌液，隔天口服一次，共6周，并设空白对照组，每日观察健康状况，每周称重。试验结果见图5，结果表明：该菌株促进SPF鸡生长作用显著，SPF鸡体重增重效果显著，说明本发明具有良好的促生长作用。

Claims

1.一株唾液乳杆菌菌株HVRIC4，为唾液乳杆菌(Lactobacillus salvarius)，微生物保藏号为CGMCC No.6786，保藏日期：2012年11月7日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.权利要求1所述的菌株HVRIC4在制备调节动物肠道菌群、促进动物生长的药物中的应用。