CN115216434B - 一株唾液乳杆菌菌株及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）菌株及其用途。所述的唾液乳杆菌菌株命名为XP132，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏号是CGMCC No.24532。研究表明该菌株具有独特的抗菌特性，同时还具有耐酸、耐胆盐等特性，仅口服该菌株可抑制沙门氏菌感染引发的疫病，尤其是对鸡白痢沙门氏菌的感染有特效，可以使部分鸡白痢阳性种鸡抗体转阴，显示了唾液乳杆菌XP132株对鸡白痢沙门氏菌的强大杀灭作用，在鸡白痢的净化中将发挥重要保护作用。本发明公开的唾液乳杆菌菌株可作为益生菌株添加于食品、饲料或药物中，以实现其对动物的抗细菌感染及保健作用等，有望作为替代抗生素的抗菌治疗制剂，尤其是在动物遭受细菌感染时，保护效果更佳。

Description

一株唾液乳杆菌菌株及其用途
技术领域
本发明涉及一株唾液乳杆菌新菌株，还涉及该唾液乳杆菌新菌株在抗菌制剂中的用途，本发明属于生物技术领域。
背景技术
唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）是乳杆菌属的重要成员之一，大多数为任何动物的消化道益生菌之一。近年来，益生菌、中药等成为当前替代抗生素的热门候选物。益生菌由于其天然、安全、免疫调节等特性被人们公认为食品级安全菌，广泛地应用于与人类健康密切相关的行业，如食品发酵、食品加工及医药等，且由于其相对于抗菌肽、噬菌体、酶制剂等抗生素替代物而言，具有生产周期短、成本低、安全性更好、生产工艺成熟、应用方式灵活等优点成为养殖业青睐的替抗制剂的首选。益生菌产生的有机酸、细菌素、肽类、酶类等产物能够有效地抑制病原菌如沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌的增殖。同时其菌体可作为肠道优势菌群，进入宿主的肠道后，通过附着于肠粘膜上皮细胞复合糖受体而构成生理性生物屏障，阻止病原菌对肠道的侵袭及定植，从而维持肠道菌群平衡。通过在基础日粮里添加益生菌不仅可以提高动物的免疫力，抑制肠道中致病菌的生长从而起到替代抗生素的作用，其代谢产物也能将饲料中难以消化的大分子纤维素等有机物降解为有利于动物机体消化及吸收的小分子成分，提高饲料的转化率，促进机体对营养物质的消化吸收，增强畜禽生产性能。
益生菌能保护机体免疫系统，有效抵抗病原体的侵袭，提高机体免疫力，其抗菌机制主要有一下四个方面：一，对病原菌竞争性抑制作用，与病原菌互相竞争在机体中的黏附位置，进而起到抑制病原菌生长作用；二，直接分泌抗菌物质，如乳酸、乙酸等有机酸，过氧化氢和抗菌肽等小分子多肽类物质，直接抑制病原菌生长；三，调节宿主免疫反应增强免疫应答，平衡先天性免疫和适应性免疫反应；四，通过产生有机酸等酸性物质降低机体pH值，使人体营造出一个酸性抗菌的微环境。乳酸菌抑制病原菌作用主要体现在乳酸菌的生长代谢过程中，可通过核糖体合成机制产生一组具有广谱抑菌活性的多肽前体、多肽、或蛋白质等物质，即细菌素。根据细菌素热敏感性、分子量及修饰氨基酸种类的不同，将乳酸菌细菌素分为三类；I类细菌素为羊毛硫抗生素；II类细菌素为分子量小的热稳定的非羊毛硫抗生素（SHSP）；Ⅲ类细菌素为热不稳定的蛋白质（LHLP）。乳酸菌所产生的细菌素具有广谱抗菌作用，可以抑制多种病原菌，腐败菌甚至真菌的生长。研究表明，通过乳酸菌在肠道内的定植，可以有效抑制大肠杆菌和沙门氏菌的侵入，防止因病原菌引起的肠道感染、腹泻等疾病。Castillo NA与Perdigon G等人利用小鼠模型，感染前7天给予小鼠干酪乳杆菌CRL431，干酪乳杆菌CRL 431是一种益生菌，作用于细胞的先天和适应性免疫应答，降低肠型血清型伤寒沙门氏菌感染的严重程度，持续给药减少了病原体在肠道内的数量以及在该器官外的扩散，抗感染效果极佳，最终得出结论，干酪乳杆菌CRL 431对肠杆菌血清型伤寒沙门氏菌感染的预防和治疗效果明显。除此之外，真菌感染性疾病是普遍的全球性问题，随着感染人数的增多，已成为威胁人类健康的主要传染疾病之一。其对治疗药物出现的耐药性及药物本身的副作用，迫切需要开发新的安全、有效的替代品。益生菌作为对人体健康有益的微生物，已被实验证明对断发毛癣菌、须癣毛癣菌、酵母菌和霉菌等有明显的抑制作用。研究表明益生菌在繁殖过程中产生的有机酸以及产生的酸性物质使周围环境pH降低能有效地抑制真菌的生长；益生菌培养液的无细胞上清液及其自身具备的粘附性、疏水性等对浅部真菌和深部真菌都具有抑制作用。
近年来随着社会的进步和科技的发展，人们越来越重视对“替抗”（替代抗生素）理念的追求，使得益生菌及其相关产品的市场需求量越来越大，因此由益生菌开发出的功能性产品在未来定会得到更好地发展。有研究表明，益生菌与益生元的配合使用可以起到与抗生素相同甚至更好的应用效果，因此可分离出天然无公害并且广谱抗菌的益生菌菌株，由此开发出可替代抗生素的微生态制剂，从而抑制致病菌在肠道的生长，维持肠道菌群的平衡，增强机体免疫力，保障宿主胃肠道、呼吸道、心脑血管和免疫系统等多方面的健康，对疾病防治具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种唾液乳杆菌新菌株以及所述新菌株在抗细菌感染中的用途。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明菌株分离自中国黑龙江省大兴安岭原始森林野生健康野猪的盲肠粘膜上，经MRS接种培养、分离纯化后分离获得的一株乳酸菌株，经鉴定其属于唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius），命名为XP132，分类命名为唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其微生物保藏号是CGMCC No.24532，保藏日期为2022年3月15日。该菌株的微生物学特征是：革兰氏染色典型阳性，菌体为中等偏大，形态规则的乳杆菌；需氧或兼性厌氧菌，在固体和液体MRS培养基上生长良好；具有耐酸特性，可在pH 4.0的MRS上生长良好；具有耐胆盐特性，可在含50%的鸡胆汁MRS的培养液中存活并生长；具有独特的抗感染特性；可抑制沙门氏菌感染引发的疫病，尤其是对鸡白痢沙门氏菌的感染有特效，可以使部分鸡白痢阳性种鸡抗体转阴，显示了唾液乳杆菌XP132株对鸡白痢沙门氏菌的强大杀灭作用，在鸡白痢的净化中将发挥重要保护作用；该菌培养最适温度为37℃，MRS培养基上菌落为乳白色，边缘整齐，表面光滑湿润，隆起，不透明的中等大小的菌落，有一种酸香的味道。
因此，进一步的，本发明还提出了所述的唾液乳杆菌菌株在制备抗菌制剂中的用途。
其中，优选的，所述的抗菌制剂具有抵抗沙门氏菌、大肠杆菌感染的作用。
其中，优选的，所述的沙门氏菌为鸡白痢沙门氏菌。
其中，优选的，所述的抗菌制剂能够使鸡白痢阳性种鸡抗体转阴，对鸡白痢沙门氏菌的强大杀灭作用，能够达到净化鸡白痢沙门氏菌的目的。
更进一步的，本发明还提出了所述的唾液乳杆菌菌株在制备调节动物肠道菌群或促进动物生长的药物中的应用。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明提出了一种可替代抗生素使用的益生菌株——唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）菌株XP132。研究表明该菌株具有独特的抗菌特性，同时还具有耐酸、耐胆盐等特性，仅口服该菌株可抑制沙门氏菌感染引发的疫病，尤其是对鸡白痢沙门氏菌的感染有特效，可以使部分鸡白痢阳性种鸡抗体转阴，显示了唾液乳杆菌XP132株对鸡白痢沙门氏菌的强大杀灭作用，在鸡白痢的净化中将发挥重要保护作用。本发明公开的唾液乳杆菌菌株可作为益生菌株添加于食品、饲料或药物中，以实现其对动物的抗细菌感染及保健作用等，有望作为替代抗生素的抗菌治疗制剂，尤其是在动物遭受细菌感染时，保护效果更佳。
附图说明
图1为唾液乳杆菌 XP132在固体培养基上的生长特性；
其中，A：在MRS培养基上的菌落形态；B：在GM17固体培养基上的菌落形态；
图2为唾液乳杆菌 XP132体外抗菌特性；
其中，A：XP132对沙门氏菌7904株的抑菌检测；B：XP132对沙门氏菌C79-7株的抑菌检测；C：XP132对沙门氏菌SP7220株的抑菌检测；D：XP132对沙门氏菌SP7808株的抑菌检测；E：XP132对沙门氏菌SP8441株的抑菌检测；F：XP132对沙门氏菌SP9905株的抑菌检测；G：XP132对沙门氏菌Ⅰ型8418株的抑菌检测；
图3为唾液乳杆菌XP132株阻止沙门氏菌水平传播的检测结果；
其中，A：攻毒后，对照组与实验组的抗体阳性率；B：实验组与对照组鸡的体重；C：实验组与对照组鸡的脾脏体重指数；
图4为唾液乳杆菌XP132株口服后能显著降低直接攻沙门氏菌的SPF鸡十二指肠（A）、大肠（B）、小肠（C）、盲肠（D）、肝脏（E）、脾脏（F）中大肠杆菌的含量的结果；
图5为唾液乳杆菌XP132株口服后能显著降低直接攻沙门氏菌的SPF鸡十二指肠（A）、大肠（B）、小肠（C）、盲肠（D）、肝脏（E）、脾脏（F）中沙门氏菌的含量的结果；
图6为唾液乳杆菌XP132株口服后能显著降低与感染沙门氏菌的鸡同居的SPF鸡十二指肠（A）、大肠（B）、小肠（C）、盲肠（D）、肝脏（E）、脾脏（F）中大肠杆菌的含量的结果；
图7为唾液乳杆菌XP132株口服后能显著降低与感染沙门氏菌的鸡同居的SPF鸡十二指肠（A）、大肠（B）、小肠（C）、盲肠（D）、肝脏（E）、脾脏（F）中沙门氏菌的含量的结果；
图8为唾液乳杆菌XP132株阻止沙门氏菌自然感染的检测结果；
其中，A：攻毒后，对照组与实验组的抗体阳性率；B：实验组与对照组鸡的体重；C：实验组与对照组鸡的脾脏体重指数；
图9为唾液乳杆菌XP132株口服后能显著降低自然感染沙门氏菌的鸡十二指肠（A）、大肠（B）、小肠（C）、盲肠（D）、肝脏（E）、脾脏（F）中大肠杆菌的含量的结果；
图10为唾液乳杆菌XP132株口服后能显著降低自然感染沙门氏菌的十二指肠（A）、大肠（B）、小肠（C）、盲肠（D）、肝脏（E）、脾脏（F）中沙门氏菌的含量的结果；
图11为唾液乳杆菌XP132株对广谱各类致病菌的抑菌效果；
其中，A：XP132菌悬液抗产气荚膜梭菌抑菌检测；B：XP132菌悬液抗肠沙抑菌检测：C：XP132菌悬液抗大肠杆菌抑菌检测：D：XP132菌悬液抗金黄色葡萄球菌抑菌检测：E：XP132菌悬液抗李斯特菌抑菌检测：F：XP132菌悬液抗铜绿假单胞菌抑菌检测；G：XP132菌悬液抗阴沟肠杆菌抑菌检测；H：XP132菌悬液抗仔猪腹泻大肠杆菌抑菌检测；
图12为唾液乳杆菌XP132株能显著提高HT27细胞中IL-1β（A）、IL-6（A）、IL-8（C）、INFγmRNA（D）的转录水平的结果；
图13为唾液乳杆菌XP132株可以显著降低HT27细胞致炎模型中IL-1β（A）、IL-6（B）、IL-8（C）、 INFγmRNA（D）的转录水平的结果；
图14为唾液乳杆菌XP132株可以激活干扰素IRF信号通路的结果；
图15为唾液乳杆菌XP132阻止沙门氏菌垂直传播的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 唾液乳杆菌XP132株的分离及鉴定
1、菌株的分离和鉴定
该菌株分离自中国黑龙江省大兴安岭原始森林野生健康野猪的盲肠粘膜上，在MRS培养基上生长良好，经划线分离获得的一株乳酸菌株。其微生物学特征是：革兰氏染色典型阳性，菌体为中等偏大，形态规则的乳杆菌；需氧或兼性厌氧菌，在固体和液体MRS培养基上生长良好，该菌培养最适温度为37℃，MRS培养基上菌落为乳白色，边缘整齐，表面光滑湿润，隆起，不透明的中等大小的菌落，有一种酸香的味道。菌株菌落特征如图1A所示。
本发明的一株唾液乳杆菌新菌株，命名为XP132，分类命名为唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius），其微生物保藏号是CGMCC No.24532，保藏日期为2022年3月15日。
2、唾液乳杆菌XP132株的耐酸试验：
将分离获得的菌株Lactobacillus salivariusXP132按MRS液体培养基体积的10%的接种量分别接种于pH值为3.0、4.0、5.0、6.5的MRS液体培养基中，每个酸度梯度设置3个平行对照，37℃静置培养，分别取培养30min、60min、90min、120min的菌液样品测定OD600nm值。试验表明本发明菌株具有较强的抗酸能力，可在pH 4.0的MRS上生长。
3、唾液乳杆菌XP132株的耐鸡胆汁试验：
将分离菌株Lactobacillus salivariusXP132按MRS液体培养基体积的10%的接种量接种于含新鲜鸡胆汁含量分别为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的MRS培养基中，每个浓度设置3个平行试验，37℃静置培养，取培养30 min、60 min、90 min、120 min的菌液样品测定OD600nm值，结果表明该菌株能在含30%的鸡胆汁培养基中很好地生长，具有较强的抗鸡胆汁能力。
4、唾液乳杆菌XP132株在普通GM17培养基上的菌落特征：
实验方法：将Lactobacillus salivariusXP132在GM17固体培养基划线培养，对XP132的菌落形态进行观察。
实验结果：如图1B所示，唾液乳杆菌XP132菌落形态为边缘整齐，表面光滑湿润，隆起，不透明的中等大小的菌落，乳白色，有一种酸香的味道。
实施例2 唾液乳杆菌XP132株的体外抗菌特性
实验方法：将7株标准致病性沙门氏菌株分别划线S-S培养基（硫代硫酸钠固体培养基），挑取单克隆用2×YT液体培养基200rpm/min 37℃培养至OD600nm=1.8-1.9时备用；将XP132接种到MRS液体培养基37℃培养8小时备用；取50μL的沙门氏菌菌液均匀涂布在2×YT固体培养基上；用直径为7.00mm的打孔器打孔后过火焰封底；每个孔加3次XP132菌液或菌液上清，约200μL；将平板倒扣在温箱中，37℃过夜（约24小时）第二天检测测量抑菌环。所用鸡标准沙门氏菌致病菌株分别为：沙门氏菌7904株（标准毒株）、沙门氏菌C79-7株（变异型标准变异致病菌株）、沙门氏菌SP7220株（中间型致病菌株）、沙门氏菌SP7808株（标准型，标准地方流行毒株）、沙门氏菌SP8441株（变异型致病菌株）、沙门氏菌SP9905株（标准型，标准地方流行毒株）、沙门氏菌Ⅰ型8418株（C79-1株，标准型标准经典毒株）。
实验结果：如图2A-G所示唾液乳杆菌XP132体外抗菌的结果，每个板上一共五个孔，每个孔都加的是XP132菌液或上清，中间孔为MRS培养基对照。抑菌环直径分别为：抗沙门氏菌7904株（标准毒株）为23.612±0.8mm、抗沙门氏菌C79-7株（变异型标准变异致病菌株）为22.996±0.8mm、抗沙门氏菌SP7220株（中间型致病菌株）为22.112±0.8mm、抗沙门氏菌SP7808株（标准型，标准地方流行毒株）为28.668±0.8mm、抗沙门氏菌SP8441株（变异型致病菌株）为26.356±0.8mm、抗沙门氏菌SP9905株（标准型，标准地方流行毒株）为22.884±0.8mm、抗沙门氏菌Ⅰ型8418株（C79-1株，标准型标准经典毒株）为22.788±0.8mm。
实施例3 唾液乳杆菌XP132在鸡白痢净化中的应用——可完全阻断沙门氏菌水平传播的特性
实验方法：将沙门氏菌强阳性鸡与阴性鸡同居，10只鸡/平米，饮水为一个水阀、饲料为同一个料槽，同居实验组每日饲喂XP132菌液，拌料口服，连续检测4周，检测XP132阻止沙门氏菌水平传播的效果。
实施方案：①同居实验组：16只SPF鸡，随机选择5只鸡进行鸡白痢沙门氏菌标准株C79-1攻毒1×109CFU/只（仅一次攻毒，一周后此5只鸡抗体为强阳性（++++）），5只攻毒鸡与其余11只鸡同居（饮水为一个水阀、饲料为同一个料槽），塑料网上平养；本笼16只鸡每日伴料饲喂XP132菌液（1×109CFU/只/日），连续饲喂至第四周，观察饲喂XP132对沙门氏菌水平传播影响。②同居对照组：16只SPF鸡，随机选择5只鸡（有编号）进行鸡白痢沙门氏菌（Sal）标准株C79-1攻毒（一周后此5只鸡抗体为强阳性（++++）），5只攻毒鸡与其余11只阴性鸡同居，正常饲喂至第四周，观察水平传播情况。感染后每周采集血清采用平板凝集实验检测血清中鸡白痢抗体效价，计算抗体转阳率；直至4周后全部扑杀，各组取肝脏及肠道内容物（十二指肠、空小肠、回盲肠、盲大肠），分别根据沙门氏菌显色培养基说明书进行沙门氏菌属细菌的分离，平板上的紫红色菌落为沙门氏菌属细菌（包含伤寒沙门、副伤寒沙门氏菌、乳糖阳性沙门及非运动性沙门等），采用沙门氏菌显色培养基平板，进行沙门氏菌属致病菌的分离，计数后计算沙门氏菌属致病细菌的含量（CFU/g）。
实验结果：
图3~图7为XP132阻止沙门氏菌水平传播的研究的结果。如图3A，攻毒二周后：对照组11只同居阴性鸡有5只鸡抗体转阳，转阳接近50%；口服XP132组全部为阴性。攻毒三周后：对照组11只同居阴性鸡有6只鸡抗体阳性，转阳接近60%；口服XP132组全部为阴性。攻毒四周后：对照组11只同居阴性鸡有7只鸡抗体阳性，转阳接近70%；口服XP132组全部为阴性，即口服XP132 可以完全阻断沙门氏菌水平传播。如图3B，实验组与对照组相比，对鸡的体重无显著影响。如图3C，口服XP132显著提高了脾脏体重指数，提示口服XP132提高了动物免疫器官的发育。
如图4，口服XP132能显著降低直接攻沙门氏菌的SPF鸡十二指肠（A）、大肠（B）、小肠（C）、盲肠（D）、肝脏（E）、脾脏（F）中大肠杆菌属的含量。
如图5，口服XP132能显著降低直接攻沙门氏菌的SPF鸡十二指肠（A）、大肠（B）、小肠（C）、盲肠（D）、肝脏（E）、脾脏（F）中沙门氏菌属的含量。
如图6，口服XP132能显著降低同居的SPF鸡十二指肠（A）、大肠（B）、小肠（C）、盲肠（D）、肝脏（E）、脾脏（F）中大肠杆菌属的含量。
如图7，口服XP132能显著降低同居的SPF鸡十二指肠（A）、大肠（B）、小肠（C）、盲肠（D）、肝脏（E）、脾脏（F）中沙门氏菌属的含量。
综上结果说明：（1）鸡白痢强阳性鸡可造成快速的水平传播，2至3周可将同居阴性鸡50%以上转阳。（2）但口服XP132，在4周内就可有效阻断鸡白痢沙门氏菌100%以上的水平传播。（3）口服XP132能显著降低直接攻沙门氏菌的和同居的SPF鸡十二指肠、大肠、小肠、盲肠、肝脏、脾脏中大肠杆菌属、沙门氏菌属的含量。调节并优化了肠道菌群，有利于动物健康并提高动物免疫力。可见唾液乳杆菌XP132在鸡白痢净化中的具有巨大作用，可以完全阻断水平传播，阻断了鸡白痢净化后的返阳现象，为鸡白痢的完全净化提供了有力的保障。
实施例4 唾液乳杆菌XP132在预防鸡白痢的发生中的应用——唾液乳杆菌XP132阻断沙门氏菌自然感染的特性
实验方法：仿效自然感染途径每日攻毒沙门氏菌，连续饲喂四周，观察同时饲喂XP132对鸡抗体阳性转化情况，检测XP132阻止沙门氏菌仿效自然感染的效果。
实施方案：①饲喂XP132实验组：10只SPF鸡，每日进行鸡白痢沙门氏菌（Sal）标准株C79-1攻毒1×105CFU/只（每日一次攻毒），同时每日伴料饲喂XP132（1×109CFU/只/日），连续饲喂至第四周，观察饲喂XP132对攻毒鸡的保护效果。②PBS对照组：10只SPF鸡，每日进行鸡白痢沙门氏菌标准株C79-1攻毒1×105CFU/只（每日一次攻毒），正常饲喂至第四周，观察抗体转阳情况。感染后每周采集血清采用平板凝集实验检测血清中鸡白痢抗体效价，计算抗体转阳率；直至4周后全部扑杀，各组取肝脏及肠道内容物（十二指肠、空小肠、回盲肠、盲大肠），分别根据沙门氏菌显色培养基说明书进行沙门氏菌属细菌的分离，平板上的紫红色菌落为沙门氏菌属细菌（包含伤寒沙门、副伤寒沙门氏菌、乳糖阳性沙门及非运动性沙门等），采用沙门氏菌显色培养基平板，进行沙门氏菌属致病菌的分离，计数后计算沙门氏菌属致病细菌的含量（CFU/g）。
实验结果：图8~图10为XP132阻止沙门氏菌自然感染的研究的结果。
如图8A所示，攻毒一周后：对照组和口服XP132实验组全部为阴性。攻毒二周后：对照组1只鸡抗体转阳；转阳10%，口服XP132组全部为阴性。攻毒三周后：对照组4只鸡抗体阳性，转阳40%，口服XP132组全部为阴性。攻毒四周后：对照组7只鸡抗体阳性，转阳70%；口服XP132组全部为阴性。如图8B所示，口服XP132与对照组相比，对鸡的体重变化无显著影响，表明XP132安全。如图8C所示，口服XP132能显著提高了脾脏体重指数。
如图9，口服XP132能显著降低自然感染的SPF鸡十二指肠（A）、大肠（B）、小肠（C）、盲肠（D）、肝脏（E）中大肠杆菌属的含量，脾脏（F）中未检出大肠杆菌。
如图10，口服XP132能显著降低同居的SPF鸡十二指肠（A）、大肠（B）、小肠（C）、盲肠（D）、肝脏（E）中沙门氏菌的含量，脾脏（F）中未检出沙门氏菌含量。
综上结果显示：（1）口服XP132可有效阻止仿效鸡白痢沙门氏菌污染饲料的自然感染。（2）仿效自然感染的情况下，主要在3至4周抗体转阳，感染鸡成为新的传染源，口服XP132可有效切断传播途径。（3）口服XP132能显著降低自然感染沙门氏菌的SPF鸡十二指肠、大肠、小肠、盲肠、肝脏中大肠杆菌、沙门氏菌的含量。
实施例5 唾液乳杆菌XP132株对广谱致病菌的抑菌效果
实验方法：将8株致病菌株用2×YT液体培养基200rpm/min 37℃培养至OD600nm=1.8-1.9时备用；将菌种XP132接种到MRS液体培养基37℃培养8小时备用；取50μL的致病菌菌液均匀涂布在2×YT固体培养基上；用直径为7.00mm的打孔器打孔后过火焰封底；每个板上一共五个孔，每个孔加3次XP132菌液或上清，中间孔为MRS培养基对照，约200μL；将平板倒扣在温箱中，37℃过夜（约24小时）第二天检测测量抑菌环。所用致病菌分别为：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、仔猪腹泻大肠杆菌、肠道沙门氏菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、李斯特菌。
实验结果：唾液乳杆菌XP132对广谱致病菌抗菌的结果如图11、表1所示，抑菌环直径分别为：抗金黄色葡萄球菌为17.872±0.8mm、抗铜绿假单胞菌为13.62±0.8mm、抗仔猪腹泻大肠杆菌为14.724±0.8mm、抗沙门氏菌肠道沙门氏菌为16.752±0.8mm、抗产气荚膜梭菌为13.82±0.8mm、抗大肠杆菌为14.12±0.8mm、抗阴沟肠杆菌为14.316±0.8mm、抗李斯特菌为16.452±0.8mm。
表1唾液乳杆菌XP132对广谱致病菌抗菌的结果
Figure 626080DEST_PATH_IMAGE001
实施例6唾液乳杆菌XP132株对肠上皮细胞HT27免疫调节作用的特性
实验方法：将HT27在含有10 % FBS、2mM L-谷氨酰胺、150 µg/mL庆大霉素、100mg/mL Normocin、100 U/mL青链霉素的DMEM培养基和37℃、5 % CO2培养条件下连续传代至细胞状态稳定，待细胞贴壁且生长至70 %-80 %时，用0.25 %胰酶-EDTA消化细胞，室温500g水平离心10min，弃上清，用培养基将细胞浓度调至1x106 个/mL,接种于12孔板中，待细胞在37℃、5%CO2的条件下培养24h后，加入50MOI的XP132菌体悬液作用12h；阳性对照孔加入工作浓度为100ng/mL的LPS, 37℃、5 % CO2作用3h。以未作任何处理的细胞为空白对照(Blank control)。之后，收获的细胞沉淀用RNAisoPlus提取RNA,反转录成cDNA后作为模板，经SYBYGreenI荧光定量PCR试剂盒检测细胞中IL-1β、IL-6、IL-8以及INFγ mRNA的转录水平。
实验结果：如图12所示，唾液乳杆菌XP132能显著提高HT27细胞中IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA的分泌，与空白对照组差异显著（P<0.0001；图12A、B、C）；唾液乳杆菌XP132 对细胞中INFγ的分泌无明显作用，与空白对照组相比，两者无明显差异（P>0.05；图12D）。综上结果说明，唾液乳杆菌XP132显著影响HT27细胞中IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA的转录水平，提高免疫反应。
实施例7唾液乳杆菌XP132株对肠上皮细胞HT27抗炎作用的特性
实验方法：将HT27在含有10 % FBS、2mM L-谷氨酰胺、150 µg/mL庆大霉素、100mg/mL Normocin、100 U/mL青链霉素的DMEM培养基和37℃、5 % CO2培养条件下连续传代至细胞状态稳定，待细胞贴壁且生长至70 %-80 %时，用0.25 %胰酶-EDTA消化细胞，室温500g水平离心10min，弃上清，用培养基将细胞浓度调至1x106 个/mL，接种于12孔板中，待细胞在37℃、5%CO2的条件下培养15h后，加入50MOI的XP132菌体悬液作用12h；之后创建HT27细胞致炎模型，即加入工作浓度为100ng/mL的LPS, 37℃、5 % CO2作用3h。以未作任何处理的细胞为空白对照( Blank control)。之后，收获的细胞沉淀用RNAisoPlus提取RNA，反转录成cDNA后作为模板，经SYBYGreenI荧光定量PCR试剂盒检测细胞中IL-1β、IL-6、IL-8以及INFγ mRNA的转录水平。
实验结果：如图13所示，唾液乳杆菌XP132能明显下调IL-1β、IL-6、IL-8、 INF-γ，与LPS对照组相比差异显著（P<0.0001；图13A、B、C、D）。综上结果说明，唾液乳杆菌XP132显著影响HT27细胞在致炎模型下细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8以及INFγ mRNA的转录水平，抑制炎症反应。
实施例8 唾液乳杆菌XP132株对激活NF-kB和IRF信号通路的特性
实验方法：J774-DualTM细胞来源于小鼠巨噬细胞样细胞系J774.1， J774-DualTM在生长培养基(DMEM.10 %热灭活的FBS、100 mg/mL Normocin、1%青链霉素)中传代三次，细胞状态稳定后，将细胞在选择培养基(生长培养基、5 ug/mL Blasticidin、 100 ug/LZeocin)下传代三次，用0.25 %胰酶-EDTA消化细胞，室温500 g水平离心10 min,弃上清，将J774-DualTM用生长培养基将细胞浓度调为1x106个/mL，接种于12孔板中，在相应细胞孔中分别加入50 MOI的XP132菌体悬液作用24h。以未作任何处理的细胞为空白对照(Blankcontrol),以加入工作浓度为1 ug/mL LPS的细胞为阳性对照。于37°C、5%CO2刺激24h后，收集上清液。NF-kB信号通路检测的具体步骤为:在96孔板中每孔加入170μQUANTI-BlueTM,再加入30μL唾液乳杆菌XP132刺激J774-DualTM的细胞上清，置于37℃、5% CO24h,用酶标仪测定OD650nm处的吸光值。干扰素IRF信号通路检测的具体步骤为:在96孔白色(不透明)或黑色板中加入20µL唾液乳杆菌XP132刺激J77DuaIM的细胞上清，使用微孔板化学发光检测仪(LB960)检测Lucia荧光素酶的表达，检测到的RLU值越大表明IRF信号通路激活能力越强。
实验结果：如图14所示，NF-kB检测结果显示，与空白对照组比，唾液乳杆菌XP132下调NF-kB信号通路（图14A）；IRF检测结果显示，与空白对照组比，唾液乳杆菌XP132极显著激活IRF信号通路（P<0.0001；图14B）。综上结果，唾液乳杆菌XP132能激活巨噬细胞IRF信号通路。
实施例9 唾液乳杆菌XP132株在预防鸡白痢的发生中的应用——唾液乳杆菌XP132阻断沙门氏菌垂直传播的特性
实验方法：实验开始前一周，对12只6月龄肉种鸡攻毒鸡白痢沙门氏菌标准株C79-1毒株，攻毒量为1×108CFU/只；一周后检测所有鸡沙门氏菌抗体为强阳性。随机分成两组：口服XP132组（n=6）：每日每只鸡通过饲料饲喂1×109CFU发酵液，连续饲喂4周；鸡白痢沙门菌S.pullorum对照组 (n=6):每日饲喂添加等体积的PBS基础日粮。每周采集血清采用平板凝集实验检测血清中鸡白痢抗体效价，计算抗体转阳率。直至4周后全部扑杀，观察饲喂XP132对沙门氏菌水垂直传播影响。
实验结果：
图15为XP132阻止沙门氏菌垂直传播的检测结果。如图15，1周后：实验组6只阳性鸡有1只鸡抗体转阴，转阴接近17%对照组全部为阳性；2周后：实验组6只阳性鸡有2只鸡抗体转阴，转阴率接近34%，对照组全部为阳性；即口服XP132 可以完全阻断沙门氏菌垂直传播。口服唾液乳杆菌XP132株还可以使部分鸡白痢阳性种鸡抗体转阴，显示了唾液乳杆菌XP132株对鸡白痢沙门氏菌具有强大的杀灭作用，这是本发明的唾液乳杆菌XP132株独有的特点，是其它替抗益生菌所未见有报道的。

Claims (6)

1.一株唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）菌株，命名为XP132，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其微生物保藏号是CGMCC No.24532，保藏日期为2022年3月15日。
2.权利要求1所述的唾液乳杆菌菌株在制备抗菌制剂中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的抗菌制剂具有抵抗沙门氏菌、大肠杆菌感染的作用。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的沙门氏菌为鸡白痢沙门氏菌。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的抗菌制剂能够使鸡白痢阳性种鸡抗体转阴，对鸡白痢沙门氏菌的强大杀灭作用，能够达到净化鸡白痢沙门氏菌的目的。
6.权利要求1所述的唾液乳杆菌菌株在制备调节动物肠道菌群或促进动物生长的药物中的应用。
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