CN115651860B

CN115651860B - 凝结芽孢杆菌bc-hyc株及其应用

Info

Publication number: CN115651860B
Application number: CN202210990381.7A
Authority: CN
Inventors: 崔德凤; 张永红; 童津津; 姚华; 乔富强; 许光勇; 卢天航
Original assignee: Beijing University of Agriculture
Current assignee: Beijing University of Agriculture
Filing date: 2022-08-18
Publication date: 2024-07-05
Anticipated expiration: 2042-08-18

Abstract

本发明新分离得到一株凝结芽孢杆菌BC‑HYC株，其具有耐热、耐人工胃、肠液、胆盐等抗逆性，且相比发明人早期分离得到的凝结芽孢杆菌BC‑CUI株具有更好的抗逆性能。试验表明，本发明的凝结芽孢杆菌BC‑HYC株具有较强的产乳酸能力，可以用于乳酸的生产，且其抑菌性能优良，对于多种养殖中常见的病原菌具有较强的抑制能力，能够替代抗生素用于抗菌药物的生产，将其制成菌液后，在攻毒试验中能够有效地预防大肠杆菌K88和/或痢疾志贺氏菌感染导致的仔猪腹泻。

Description

凝结芽孢杆菌BC-HYC株及其应用

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及凝结芽孢杆菌BC-HYC株的分离、鉴定及其应用。

背景技术：

凝结芽孢杆菌是一种兼性厌氧革兰氏阳性菌，类属芽孢杆菌属。菌体表面无鞭毛，呈头发丝状，长约2.5-5.0μｍ，宽约0.6-1.0μｍ；芽孢端生，如“榔头”状；喜中性偏酸pH，最适温度为37-45℃。在其生长过程中可利用多种糖类物质，经同型乳酸发酵生成L-乳酸，具有乳酸菌类同样的保健功效，也具有芽孢杆菌属耐酸（pH＞2.42）、耐热（80℃）、耐盐（1-8％NaCl）、容易培养和耐储存的特点。凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）是分泌乳酸的芽孢杆菌属益生菌，因其具有“二重性”，既具有芽孢杆菌的特点，还具有乳酸菌的优势，作为新型益生菌，已获得包括美国、欧盟等国家的认可，我国于2004年已经批准凝结芽孢杆菌的使用，已被广泛应用于食品、畜牧业、医药行业、水产养殖业。近年来，凝结芽孢杆菌作为可以形成芽孢的益生乳酸菌，因其良好的抗逆性和益生特性成为饲料微生物添加剂的研究热点，在2013年被农业农村部正式列入《饲料添加剂品种目录》。许多研究结果表明凝结芽孢杆菌具有多种生物特性，例如抗菌、调节肠道菌群平衡、抗炎、改善机体免疫功能、促进消化吸收和改善仔猪腹泻等，饲粮中添加单一凝结芽孢杆菌能通过抑制大肠杆菌、沙门氏菌等肠道主要有害菌，显著改善畜禽生长性能；还有研究表明凝结芽孢杆菌可以通过调节肠道菌群平衡、促进肠道健康与营养物质吸收等方面提高蛋禽养殖效益。凝结芽孢杆菌除具备普通乳酸菌的调节肠道内菌群平衡、促进营养物质代谢和提高免疫力的作用外，还具有耐胆盐、耐胃肠消化液、热稳定性等生物特性。在动物饲粮中添加凝结芽孢杆菌，芽孢化的菌体形态，能够顺利通过制粒条件、动物胃液环境，进入十二指肠，然后，芽孢萌发形成营养体，随后进入小肠，开始迅速生长繁殖，并发挥生物学功能。因此，开发抗逆性强且对动物健康有益的菌种以丰富凝结芽孢杆菌的资源库，开发有效的益生菌制剂成为全国高度关注的重大课题。

发明内容：

为了解决以上技术问题，本发明旨在提供一株新的凝结芽孢杆菌BC-HYC株及其应用。

本发明采用如下技术方案：

本发明请求保护凝结芽孢杆菌BC-HYC株，所述凝结芽孢杆菌BC-HYC株于2022年02月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，分类命名为：凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，保藏号为：CGMCC No.24423.

本发明还请求保护所述凝结芽孢杆菌BC-HYC株在生产乳酸中的应用。

本发明还请求保护所述凝结芽孢杆菌BC-HYC株在制备抑制病原菌的药物中的应用。

优选的，所述病原菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K88、鸡白痢沙门氏菌和痢疾志贺氏菌中的一种或多种。

本发明还请求保护凝结芽孢杆菌BC-HYC株在制备饲料中的应用，所述饲料是在基础日粮的基础上添加所述凝结芽孢杆菌BC-HYC株菌粉制备得到，饲料中所述凝结芽孢杆菌BC-HYC株的含量≥10¹¹CFU/kg。

基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明新分离得到一株凝结芽孢杆菌BC-HYC株，其具有耐热、耐人工胃、肠液、胆盐等抗逆性，且相比发明人早期分离得到的凝结芽孢杆菌BC-CUI株具有更好的抗逆性能。试验表明，本发明的凝结芽孢杆菌BC-HYC株具有较强的产乳酸能力，可以用于乳酸的生产，且其抑菌性能优良，对于多种养殖中常见的病原菌具有较强的抑制能力，能够替代抗生素用于抗菌药物的生产，将其制成菌液后，在攻毒试验中能够有效地预防大肠杆菌K88和/或痢疾志贺氏菌感染导致的仔猪腹泻。

附图说明：

图1：凝结芽孢杆菌BC-HYC株的分离：A，革兰氏染色结果图；B，平板划线进行纯化。

具体实施方式：

实施例1.

凝结芽孢杆菌BC-HYC株的分离与鉴定。

1.1 凝结芽孢杆菌BC-HYC株的分离：

取北京北农弘益科技发展有限公司的蛋鸡养殖场养殖的健康仔鸡的肠道内容物5g，置于100mL已灭菌的富集培养基（MRS液体培养基中添加山梨酸钾1g/L，a-甲基葡萄糖苷10g/L）中，置于42℃恒温培养箱中培养72h，每24h摇晃一次，得到富集液。将富集液在90℃水浴作用15min，之后进行10倍梯度稀释，选取10倍、100倍和1000倍三个稀释度的稀释液，分别吸取100μL在MRS平皿中进行涂布，每个稀释度3个重复，42℃倒置培养24h。挑取疑似菌落进行革兰氏染色，镜检，分离得到一株革兰氏阳性、杆状、由芽孢的细菌，对其进行3次平板划线纯化菌株，取单菌落保存（见图1）。

1.2 凝结芽孢杆菌BC-HYC株的鉴定：

1.2.1生化鉴定：

根据《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌鉴定手册》，对凝结芽孢杆菌BC-HYC株进行吲哚试验、55℃生长、7%氯化钠生长、柠檬酸盐利用、V-P试验、明胶液化、硝酸盐还原、酪氨酸水解、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇发酵和溶菌酶生长等生化试验。具体结果见下表1。

表1 凝结芽孢杆菌BC-HYC株生理生化特征

注释：“+”表示阳性；“—”表示阴性。

1.2.2 16S rDNA序列测定

利用细菌16s rDNA通用引物（上游引物为5´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´、下游引物：5´-GGTTACCTTGTTACGACTT-3´）扩增细菌的16s rDNA片段，测序后得到序列片段，所得序列与Genbank 中的16s rDNA序列进行分析比对，结果显示该菌与NCBI公布的凝结芽孢杆菌DSM2314（CP033687）的同源性高达98.8%，结合生理生化试验结果，进一步将该分离菌鉴定为凝结芽孢杆菌。

1.2.3 菌株的保藏

对于分离得到的菌株于2022年02月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保存，命名为BC-HYC株，分类命名为：凝结芽孢杆菌 Bacillus coagulans，保藏号为：CGMCC No.24423，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

实施例2.

凝结芽孢杆菌BC-HYC株的抗逆性试验。

2.1 发酵液的制备

2.1.1 菌种活化：

将保存的凝结芽孢杆菌BC-HYC株（CGMCC NO.24423）和BC-CUI株（CGMCC NO.6151，记载于本发明人早前的授权专利ZL201310008503.9）分别划线接种到MRS培养基写明，37℃厌氧培养24h。

2.1.2 种子液制备

挑取活化后的单菌落2环接种到MRS培养基，37℃，150rpm摇床培养24h。

2.1.3 发酵液的制备

将种子液按照5%的接种量接种到MRS培养基，37℃，150rpm摇床培养24h，分别得到凝结芽孢杆菌BC-HYC株发酵液、凝结芽孢杆菌BC-CUI株发酵液。

2.2 温度敏感性试验：

取发酵液分别在25℃、80℃、85℃、90℃、95℃和100℃条件下保温处理10min，以25℃处理组作为对照组，对各组菌液进行梯度稀释，均匀涂布在MRS培养基，37℃厌氧发酵48h后进行菌落计数，测定各处理组的活菌数和存活率，各组重复3次试验。具体结果见下表2。

表2 凝结芽孢杆菌BC-HYC株与BC-CUI株的耐热性能比较

基于以上表2的结果可知，本发明分离得到的凝结芽孢杆菌BC-HYC株具有更加优越的耐热性能，其经过95℃的温度处理后，存活率仍高达91.0%，高于本人早先分离的BC-CUI株，相比BC-CUI株提高了11.4%，其更加优越的耐热性能使其应用范围更广，更加适合饲料添加剂和饲料加工过程，避免高温加工对于菌株活性的影响。

2.3 耐人工胃、肠液、胆盐试验：

取发酵液1mL，加入9mL pH=2的人工胃液作为试验组，同时取发酵液1mL，加入9mL生理盐水作为对照组，37℃静置培养4h，对两组发酵液分布进行梯度稀释，而后均匀涂布到MRS培养基，37℃厌氧培养48h后计数。

取发酵液1mL，加入9mL pH=7.6的人工肠液作为试验组，同时发酵液1mL，加入9mL生理盐水作为对照组，37℃静置培养12h，对两组发酵液分布进行梯度稀释，而后均匀涂布到MRS培养基，37℃厌氧培养48h后计数。

存活率（%）=人工胃液（或人工肠液）处理组的活菌数/对照组活菌数×100%。

取发酵液1mL，加入9mL含有0.3%、0.5%、0.7%、1%胆盐溶液中，同时取发酵液1mL，加入9mL 生理盐水作为对照组，37℃静置培养4h，对两组发酵液分布进行梯度稀释，而后均匀涂布到MRS培养基，37℃厌氧培养48h后计数。

存活率（%）=胆盐处理组的活菌数/对照组活菌数×100%。

表3耐人工胃、肠液、胆盐试验结果

基于以上试验可知，本次新分离得到的凝结芽孢杆菌BC-HYC株对于人工胃酸、人工肠液具有较好的耐受能力，人工胃肠液处理后的存活率均高达90%以上，对于胆盐也有较好的耐受性，0.3%的胆盐处理基本不影响凝结芽孢杆菌BC-HYC株的活性，而1%的胆盐溶液处理，其存活率仍高达92.02%。相比而言，本发明所分离得到的凝结芽孢杆菌BC-HYC株相比凝结芽孢杆菌BC-CUI株对于胃酸、肠液、胆盐均具有相对更好的耐受能力。

实施例3：

凝结芽孢杆菌BC-HYC株的益生活性试验。

3.1 菌株安全性实验

3.1.1 溶血试验：

将凝结芽孢杆菌BC-HYC株液体培养基培养24h，采用无菌生理盐水稀释至10⁸CFU/mL，吸取0.1mL稀释菌液至含5%兔血的MRS琼脂平板，涂布均匀。37℃下恒温培养48h，观察有无溶血圈。

3.1.2 小鼠毒性试验：

以凝结芽孢杆菌BC-HYC株液体培养基培养24h，4℃冰箱保存备用。选取20只健康小鼠，其中10只为对照组，饮用洁净的纯净水；另外10只为试验组，每头饮用水中添加凝结芽孢杆菌BC-HYC株培养液，使得饮用水中的菌浓度约为10⁸CFU/mL，连续10天，记录试验期间小鼠的生长情况以及10天后小鼠内脏器官是否出现病变情况。

在溶血试验中，凝结芽孢杆菌BC-HYC株涂布含5%兔血的MRS琼脂平板，观察无溶血环形成。在小鼠毒性试验中，连续喂养10天，对照组和试验组的小鼠均无死亡，无异常表现，解剖后各器官、消化道均未见异常和病变。以上结果表明凝结芽孢杆菌BC-HYC株对小鼠安全、无毒副作用。

3.2 抑菌活性试验：

抑菌活性试验用菌株：金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、大肠杆菌K88（CGMCC1.2385）、鸡白痢沙门氏菌（CVCC533）、痢疾志贺氏菌（CGMCC1.1869）均由北京农学院实验室购买、保存和提供。

本发明采用牛津杯法对常见致病菌进行抑菌测定，具体方法如下：

（1）在装有10mL营养肉汁培养基的试管中活化常见的致病菌：金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、大肠杆菌K88（CGMCC1.2385）、鸡白痢沙门氏菌（CVCC533）、痢疾志贺氏菌（CGMCC1.1869），37℃恒温、振荡培养24h；

（2）双层平板的制备：取直径90mm的平板，注入灭菌的营养琼脂15mL，水平放置使之凝固，作为底层，另取营养琼脂（冷至50℃左右）与37℃ 24 h培养的指示菌液适量（50mL培养基加5mL）混匀，吸取15 mL浇在底层培养基上，水平放置使之凝固，作为菌层；

（3）加样品：用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯，打开皿盖，在每个培养皿中放置 3个牛津杯，分别用于加入 100 µL 的金霉素、土霉素、凝结芽孢杆菌菌液。然后，37℃恒温培养 24 h，之后测定抑菌圈直径（Diameter of Inhibition Zone，DIZ）。以抑菌圈直径最大值和最小值的平均值确定抑菌圈直径，并用于抑菌作用判定和抑菌效果比较分析。具体结果如下表4所示：

表4：抑菌活性试验测定结果

依据所用牛津杯的直径值（7.8 mm），将牛津杯外径的约 2 倍 16.0 mm 区分为“敏感”与“高敏感”，因此判定设定标准：“不敏感”，DIZ=7.8 mm；“敏感”，7.8 mm<DIZ ≤16.0 mm；“高敏感”，DIZ>16.0 mm。

基于以上试验可知，本发明凝结芽孢杆菌BC-HYC株对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K88、鸡白痢沙门氏菌和痢疾志贺氏菌均具有很好的抑菌活性，且相比本发明人早期分离得到的凝结芽孢杆菌BC-CUI株具有更好的抑菌活性。由此可见，本发明的凝结芽孢杆菌BC-HYC株具有相对较高的抑菌活性，可以用于制备抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K88、鸡白痢沙门氏菌和痢疾志贺氏菌等病原菌的药物的生产。

3.4 产酶能力测定：

3.4.1粗酶液的制备：分别取凝结芽孢杆菌BC-HYC株、凝结芽孢杆菌BC-CUI株、凝结芽孢杆菌CGMCC 1.10823（购自CGMCC，由北京农学院保存和提供）单菌落接种于MRS种子培养基中，37℃下180rpm摇床培养24h，按1％接种量转接至发酵培养基，37℃下180rpm摇床培养48h，制得发酵液。发酵液中芽孢形成率达到90％以上，取发酵上清液，10000rpm离心5min，保留上清液；冰浴条件下向粗酶液中加入60％的硫酸铵粉末，4℃条件下沉淀得粗酶液中的蛋白，得到沉淀物；所得沉淀物用Tris-HCl缓冲液复溶，4℃条件下透析得到浓缩酶液。

3.4.2酶活力测定：分别采用购自sigma的淀粉酶试剂盒（MAK0009）、蛋白酶试剂盒（PF0100）；购自南京建成生物工程研究所的二糖酶测定试剂盒（乳糖酶）（比色法）（A082-1-1）测定浓缩酶液中的淀粉酶、蛋白酶和乳糖酶的活力。结果如下：

表5 酶活力测定结果

基于以上试验结果可知，本发明所分离得到的菌株BC-HYC株能够分泌淀粉酶、蛋白酶和乳糖酶，且其中淀粉酶的活力最高，且相比而言，本发明所分离得到的BC-HYC株与早先分离得到的BC-CUI株具有相近的乳糖酶活力，但是BC-HYC株相比BC-CUI株、CGMCC1.10823株具有更高的淀粉酶活力和蛋白酶活力。

3.5 产酸能力测试

在无菌条件下挑取凝结芽孢杆菌单菌落至500mL已经灭菌的MRS培养液内，40℃恒温静置培养，发酵24h，采用液相色谱仪检测发酵液中乳酸、乙酸、丙酸和丁酸等有机酸的含量，具体结果如表6所示。

表6 发酵液中有机酸含量（mg/L）测定结果

基于以上结果可知，本发明所分离得到的BC-HYC株具有较好的产酸能力，其发酵液中乳酸含量达到了98500mg/L，远高于BC-CUI株和CGMCC 1.10823株，而丁酸含量虽然较低，只有9.2mg/L，但是相比另外两株而言，其丁酸含量也高于其他菌株的1倍以上。可见，本发明分离得到的凝结芽孢杆菌具有较好的产酸能力，尤其是乳酸和丁酸产量显著高于其余两株凝结芽孢杆菌。由此可见，本发明的凝结芽孢杆菌BC-HYC株具有良好的产酸能力，可以用于生产乳酸。

实施例4.

凝结芽孢杆菌BC-HYC株在预防仔猪腹泻中的应用。

按照实施例2中“2.1 发酵液的制备”制成凝结芽孢杆菌BC-HYC株发酵液（活菌数≥1×10¹⁰CFU/mL）。选择10头1月龄的断奶的健康“杜×长×大”商品杂交仔猪，体重为8.65±0.90kg。随机分成2组，单笼饲养，室温控制在25℃～27℃，处理组5头仔猪每天饮水中加入1mL本发明的凝结芽孢杆菌BC-HYC株发酵液（活菌数≥1×10¹⁰CFU/mL），对照组5头仔猪饮用自来水作为对照。试验第7天用大肠杆菌K88（CGMCC1.2385）和痢疾志贺氏菌（CGMCC1.1869）的培养液进行攻毒，每头攻毒4mL，其中大肠杆菌K88和痢疾志贺氏菌培养液各2mL，攻毒用培养液中活菌数均≥1×10⁷CFU/mL，早晚各一次，攻毒后处理组和对照组均采用同样的条件进行饲喂，自由采食和饮用自来水。计算各组的腹泻率，其中腹泻率为：攻毒后14d内腹泻的仔猪总头次/70×100%。经计算，处理组的共有10头次腹泻，腹泻率为14.29%，而对照组试验期间共有25头次腹泻，腹泻率为35.71%。由此可见，本发明所制备得到的凝结芽孢杆菌发酵液能够有效地预防大肠杆菌K88和/或痢疾志贺氏菌感染导致的仔猪腹泻。

Claims

1.凝结芽孢杆菌BC-HYC株，所述凝结芽孢杆菌BC-HYC株于2022年02月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，分类命名为：凝结芽孢杆菌 Bacillus coagulans，保藏号为：CGMCC No.24423，所述BC-HYC株能够分泌淀粉酶、蛋白酶和乳糖酶，具有良好的产酸能力。

2.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌BC-HYC株在生产乳酸中的应用。

3.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌BC-HYC株在制备抑制病原菌的药物中的应用，所述病原菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K88、鸡白痢沙门氏菌和痢疾志贺氏菌中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌BC-HYC株在制备预防病原菌感染的药物中的应用，所述病原菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K88、鸡白痢沙门氏菌和痢疾志贺氏菌中的一种或多种。